KR20200060648A

KR20200060648A - 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20200060648A
Application number: KR1020180145586A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 최은주; 김은지; 김한경; 신건국; 더 바이트 트란; 반 하이 도; 홍 꽝 부이; 최상호; 엄상미
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-06-01
Also published as: KR102153338B1

Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 카나리움 서부라텀의 메탄올 추출물은 염증반응으로 생성되는 사이토카인과 그에 따른 반응물의 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며 또한, 면역 활성에 관여하는 신호전달 단백질의 발현을 억제 시킬 수 있으며, 나아가 상기 추출물의 염증억제 효과는 위염을 유발한 동물실험에서도 확인되었는바 의약품, 의약부외품 소재 개발 및 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising an extract of Canarium subulatum as an active ingredient}

본 발명은 항염증 활성을 갖는 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증 반응(inflammation)은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때, 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소의 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등의 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우의 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복 작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나는 경우 에는 오히려 점막손상을 촉진하고, 일부에서는 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관 질환, 암 등을 유도한다. 즉, 염증 반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응이지만, 지속적이고 과도한 염증반응은 조직을 손상시킨다.

대식세포(macrophage)는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 유해한 환경에서 숙주의 방어기작에 중요한 역할을 하며, 자가면역질환과 같은 다양한 질병의 진행과정에 관여한다. 지질다당류와 같은 염증 자극인자들은 대식세포를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 IL-1β와 같은 다양한 염증성 매개체를 생성하고, 유도형 NO생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 고리형 산소화효소2 (cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 니트릭 옥사이드(nitric oxide, NO) 및 PGE 2 (prostaglandin E 2 )를 생성한다.

한편, Lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 외막 구성성분이며 염증성 인자로 알려져 있으며, 골수에서 생산되는 대식세포(macrophage)는 미량의 LPS에 의해 활성화되고 다양한 사이토카인(cytokine), 과산화 수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 및 니트릭 옥사이드 등의 각종 세포독성물질을 분비하여 면역기구로서 기능한다.

최근 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 기능은 식품이나 식물체도 가지고 있다는 것이 보고되고 있고, 보다 건강하고 오래 살고자 하는 인류의 필요에 따라, 세계적으로 다양한 자원으로부터 다양한 생리기능을 가진 물질을 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중에서도 특히 식물자원에 포함된 화합물에 많은 관심이 집중되고 있다.

대한민국등록톡허공보 10-1049041

본 발명자들은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물의 항염증 효능을 밝히기 위해, 대식세포와 위염 마우스 모델을 이용하여 염증반응에 관여하는 사이토카인과 신호전달 단백질의 활성의 변화를 분석한 결과 표적 단백질을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 염증성 질환은 위염일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 추출물은 메탄올을 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(luteolin), 및 캠페롤 (Kaempferol)로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 일산화 질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS) 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제함으로써, 뉴클리어 팩터 κB(nuclear factor κB, NF-κB)의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 p50 및 p65의 핵 전이(nuclear translocation)를 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 염증성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

카나리움 서부라텀의 추출물은 염증반응으로 생성되는 사이토카인과 그에 따른 반응물의 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며 면역 활성에 관여하는 신호전달 단백질의 발현을 억제 시킬 수 있고, 나아가 카나리움 서부라텀의 메탄올 추출물의 염증억제 효과는 위염을 유발한 동물실험에서도 확인되었는바 의약품, 의약부외품 소재 개발 및 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 카나리움 서부라텀의 메탄올 추출물(이하 Cs-ME)이 세포에서 염증 유발 물질인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, 이하 LPS)에 의해 유발된 니트릭 옥사이드 생성을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 Cs-ME의 복막의 마크로파지(Peritoneal macrophages)에서 LPS에 의한 니트릭 옥사이드 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 Cs-ME가 RAW 264.7 세포 및 복막의 마크로파지에 대하여 세포 독성이 없음을 나타낸 것이다.
도 4는 액체 크로마토그래피를 통한 Cs-ME의 주요 성분 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Cs-ME가 LPS에 의한 유도형 NO 생성 효소(Inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 발현 감소 효과가 있음을 나타낸 것이다.
도 6은 Cs-ME를 RAW 264.7 세포에에 처리한 경우 LPS에 의한 단백질 p50와 p65의 핵 내 이동 양상의 감소효과를 나타낸 것이다.
도 7은 Cs-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질인 IKKα/β 및 IκBα 의 인산화 감소효과를 나타낸 것이다.
도 8은 초기 시간에서 Cs-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질인 Src, 및 Syk의 인산화 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 Src 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME 처리에 의한 신호전달 단백질인 Src 및 p85의 인산화 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 10은 Syk 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME 처리에 의한 신호전달 단백질인 Syk의 인산화 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 11은 급성 위염 동물 모델에서 Cs-ME의 위 염증 감소 효능을 평가한 결과이다.
도 12는 Cs-ME, 퀘르세틴(Quercetin), 및 캠페롤 (Kaempferol)의 RAW264.7 세포에서 니트릭 옥사이드(NO) 생성능 억제 효과를 비교한 결과이다.
도 13은 염증 신호 전달 체계에서 Cs-ME의 표적 단백질인 Src/Syk을 통한 염증 억제 효능을 설명한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는, LPS로 염증 유발된 세포에 Cs-ME를 처리한 경우 용량의존적으로 니트릭 옥사이드 생성이 억제됨을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, RAW 264.7 세포 및 대식세포주에 Cs-ME를 처리한 결과 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 액체 크로마토그래피를 이용하여 Cs-ME의 주요 성분으로 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(luteolin), 및 캠페롤 (Kaempferol)이 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Cs-ME가 LPS에 의한 염증관련 사이토카인인 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 mRNA 발현을 줄이는 효과가 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Cs-ME를 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 LPS에 의한 단백질 p50와 p65의 핵 내 이동 양상의 감소효과가 나타남을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Cs-ME을 처리한 세포 내에서 NF-κB 신호전달 단백질인 IKKα/β, IκBα, Src, Syk 또는 p58의 인산화가 감소함을 확인하였다(실시예 7 내지 10 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Cs-ME의 위염 완화효과는 농도의존적으로 증가하고 특히, 100mg/kg Cs-ME 처리군의 경우, 라니티딘(Ranitidine)처리군보다 더 높은 위염 완화효과를 보임을 확인하였다(실시예 11 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 세포에 Cs-ME를 처리한 경우 캠퍼롤 및 퀘르세틴 각각을 처리한 경우보다 니트릭 옥사이드 생성억제 효과가 더 큰 것을 확인하였다(실시예 12 참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염증성 질환"이란 염증을 주병변으로 하는 질병으로, 염증성 질환의 비제한적인 예로는 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 복막염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 및 신장염 등이 있으며, 바람직하게는 위염 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 카나리움 서부라텀 추출물 획득에 이용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C₁내지 C₄의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게 메탄올을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 99.9% 메탄올을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 카나리움 서부라텀 추출물은 추출 및/또는 분획 과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있으며, 상기 수득한 카나리움 서부라텀 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고에 보관할 수 있다.

대식세포(macrophage)는 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 유해한 환경에서 숙주의 방어기작에 중요한 역할을 하며, 자가면역질환과 같은 다양한 질병의 진행과정에 관여한다. 지질다당류(LPS)와 같은 염증 자극 인자들은 대식세포를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 IL-1β와 같은 다양한 염증성 매개체를 생성하고, 유도형 NO생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 고리형 산소화효소2 (cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화 질소(nitric oxide, NO) 및 PGE 2 (prostaglandin E 2 )를 생성한다.

한편, nuclear factor κB (NF-κB)는 어디에나 존재하고 복합체 현상의 조절을 담당하는 것에 특화된 단백질이다. 어떤 조건에서 신체의 세포신호를 통제하는 중심적 역할을 하며, 특히 다른 기능 중에서도 NF-κB는 염증의 진행을 통제하는데 중요한 역할을 하는 상기 TNF-α 등의 염증 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines), 케모카인 (chemokines), 및 COX-2 등의 유발 효소 (inducible enzymes)를 통제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NFκB는 많은 염증 질환을 치료하는 약에 있어서 중요하면서도 매우 눈에 띄는 치료 타겟을 대표한다고 할 수 있다.

본 발명의 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(luteolin), 및 캠페롤 (Kaempferol)로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 일산화 질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS) 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제함으로써, 뉴클리어 팩터 κB(nuclear factor κB, NF-κB)의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 카나리움 서부라텀 추출물은 p50 및 p65의 핵 전이(nuclear translocation)를 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 카나리움 서부라텀 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형을 가질 수 있다. 상기 카나리움 서부라텀 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험방법

실시예 1-1 카나리움 서부라텀 ( Canarium subulatum ) 추출물의 제조

카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 메탄올 추출물(Cs-ME)을 제조하기 위해, 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum)의 지상부(aerial parts)를 건조시키고, 분쇄하여 미세분말 샘플을 만든 후, 상기 샘플 (125g)을 초음파 분쇄기(sonicator)로 99.9% 메탄올(1,000 ml)을 이용하여 추출물을 추출하였다. 이후, 감압하에서 증발 건조시켜 최종 카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 메탄올 추출물을 얻었다.

실시예 1-2. 세포배양법

뮤린(Murine) 대식세포주인 RAW264.7 세포를 페니실린(penicillin) 100 IU/ml 및 스트렙토마이신(streptomycin) 100 μg/ml과 10%의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm 셀컬쳐디쉬(cell culture dish)에 70-80%의 밀도로 배양하였다. 또한, 인간 세포주인 HEK293 세포는 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml과 10%의 소태아혈청을 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm 셀컬쳐디쉬에 70-80%의 밀도로 배양하였다.

실시예 1-3. 웨스턴 블로팅 (Western blotting)

뮤린 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml과 10%의 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 7X10⁶ cell/ml 농도로 60mm의 디쉬에서 전 배양시켰다. 그 다음, 각 분획물들을 처리하고 일정시간 후 자극제(stimuli, Lipopolysaccharide)로 자극하고 약물에 따른 일정시간 후 세포 들을 모아서 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 사용해 세포를 깨어 웨스턴(western) 표본을 얻어냈다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)을 표준으로 잡고 측정하였다.

상기와 같이 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis)를 실행하고, ? 블로팅(wet blotting) 방법을 사용해 PVDF 멤브레인(membrane)으로 단백질을 블로팅시킨 후 맴브레인을 3% 소혈청알부민을 사용해 블로킹(blocking)시키고, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p50, p65, Lamin A/C, p-IκBα, IκBα, p-IKKα/β, IKKα/β, p-Src, Src, p-Syk, Syk, p-p85, β-actin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 워싱(washing) 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 워싱하였다. 그리고 암실에서 맴브레인에 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 골고루 분주하여 엑스레이필름(X-ray film)으로 감광하였다.

실시예 2. 대식세포 유래 세포독성 물질인 니트릭 옥사이드 (NO) 생성능 측정

마우스 대식세포주인 RAW264.7를 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml)과 10%의 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×10⁶ cell/ml의 농도로 조절한 후, 96 웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 18시간 동안 전배양하였다.

그 다음, 배지를 제거하고 4배 농도로 조제된 Cs-ME 50 μl와 50 μl의 LPS (최종 농도 1 μg/ml) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100μl씩 또 다른 96 웰 플레이트에 옮기고 NO 정량은 Griess 용액 (0.5% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphthylethylenediamine dihydrochloride), 5% 설파닐아마이드(sulfanilamide), 25% H₃PO₄)을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였으며 표준물질로 소듐 니트레이트(sodium nitrite, 0 에서 100 μM)를 사용하여 검량선을 작성하였다.

그 결과, 도 1, 및 도 2에 나타난 바와 같이 LPS만 투여한 경우 니트릭 옥사이드의 생성이 급격히 증가했으나, Cs-ME를 함께 투여한 경우 용량의존적으로 니트릭 옥사이드의 생성이 억제됨을 확인하였다.

실시예 3. Cs-ME 처리한 대식세포주에서 세포 생존률 (cell viability)

MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디피닐테트라졸리움 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide)) 어세이(assay)법을 이용하여 분석하였다. 96-웰 플레이트에 1 × 10⁶ cell/ml의 세포를 플레이팅하고 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다.

그 다음, 10 ㎕ MTT 용액 (스톡(stock)농도 : 5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 포르마잔 크리스탈(formazan crystal) 용해를 위해 각 웰에 100 ㎕ MTT 스토핑 솔루션(stopping solution, 10% 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate) in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 포르마잔으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 RAW 264.7 세포 및 복막의 마크로파지에 Cs-ME를 처리하여도 모두 세포 생존력이 높게 나타나고 있어 세포 독성효과가 유의하게 나타나지 않음을 확인 하였다.

실시예 4. 액체 크로마토 그래피를 통한 Cs-ME의 주요 성분 분석

Cs-ME의 유효성분을 확인하기 위해 AZURA Analytical HPLC system(KNAUER Corp.)을 이용하여 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하였다.

분석 조건(하기 기재)

HPLC System: AZURA Analytical HPLC (KNAUER Corp.)

컬럼(Column) : Phenomenex, Gemini 5μ C18 110A, 250×4.60mm 5μm

용매

용매 A : 0.1% TFA in H₂O

용매 B : 0.08% TFA in 95% MeCN + 5% H₂O

유속 : 1.0㎖/min

파장 : 370nm (Quercetin, Luteolin, Kaempferol)

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 Cs-ME의 주요 성분으로 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(luteolin), 및 캠페롤 (Kaempferol)이 있음을 확인하였다.

실시예 5. 대식세포로부터 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS )의 분비능 측정

사이토카인의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2 x 10⁶으로 24시간 배양하였으며 Cs-ME(50, 100νg/ml)을 30분간 전처리 한 후 LPS(1νg/ml)을 6시간 처리하였다. 그 다음, 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머(primer) 염기서열은 기존문헌을 참조하여 제조하고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR 엠플리케이션(amplication)은 Hipi PCR kit (Elpis biotech)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 센스 및 안티센스 프라이머, 대조군 GAPDH 프라이머를 dNTP 250 uM, Tris-HCL(pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, NgCl₂ 1.5 mM를 포함한 Hipi PCR kit 20ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 45초 간 디네츄어링(denaturing), 55 ℃에서 45초 간 어넬링(annealing) 그리고 72 ℃에서 1분간 익스텐션(extension) 하는 조건으로 시행하며, 총 30 사이클을 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5 % 아가로스 겔에서 전기영동 하였고 분획된 DNA 밴드의 인텐시티(intensity)를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 Cs-ME가 LPS에 의해 발생한 염증관련 사이토카인인 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 mRNA 발현을 줄이는 효과가 있었으며 특히 Cs-ME를 100(μg/ml) 처리한 경우 그 효과가 명확함을 확인하였다.

실시예 6. 전사인자의 핵 내 이동 평가

뮤린 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml과 10%의 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 90%의 밀도로 100mm의 디쉬에서 전 배양시킨다. 이후 Cs-ME를 30분 동안 전처리하고 자극제(리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS))로 자극한 후, 약물에 따른 일정시간 후 아이스-콜드(ice-cold) PBS(phosphate buffered saline)로 워싱 하고 균질화 버퍼(Homogenization buffer) A [20 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 μg/ml 아프로티닌(Aprotinin), 10 μg/ml 류펩틴(Leupeptin)] 300 μl를 이용하여 세포를 모았다.

그 다음, 소니케이터(Sonicator)를 사용하여 아웃풋(Output) 4의 세기로 세포를 깬 후 8000 rpm으로 15분 동안 4 ℃에서 원심분리 하여 상층액 (Cytosol 분획)을 분리하였다. 펠렛 (Nuclear 분획)은 300 μl 균질화 버퍼 B [1% TritonX-100 in 균질화 버퍼 A]로 부유시킨 후 소니케이터를 사용하여 아웃풋 4의 세기로 세포를 깬 다음 얻어진 분획을 SDS-PAGE와 웨시턴 블로팅법을 이용하여 전사인자의 핵 내 이동 수준을 평가하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 Cs-ME를 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 밴드가 미처리군에 비하여 희미하게 나타나는바 LPS에 의한 단백질 p50와 p65의 핵 내 이동 양상의 감소효과가 나타남을 확인하였다.

실시예 7. Cs-ME에 의한 세포 내 NF - κB 신호전달 단백질 IKKα /β, IκBα 의 인산화 감소

Cs-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질인 IKKα/β, IκBα 의 인산화 감소 효과를 확인하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 Cs-ME을 처리한 세포 내에서 인산화된 IKKα/β, IκBα가 Cs-ME 처리전보다 감소함을 알 수 있는바 NF-κB 신호전달 단백질인 IKKα/β, IκBα 의 인산화 감소 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 8. Cs-ME에 의한 세포 내 NF - κB 신호전달 단백질 Src , Syk 의 인산화 감소

Cs-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질인 Src, Syk 의 인산화 감소를 확인하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 Cs-ME에 처리한 경우 인산화된 Src 및 Syk가 감소하여 p-Src 및 p-Syk 밴드가 연하게 나타나고 있는바 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질인 Src 및 Syk 인산화가 감소함을 확인하였다.

실시예 9. Src 과발현을 통한 염증 발생시 Src , p85의 인산화 감소

Src 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME를 처리하면 Src, p85의 인산화 감소가 나타나는지 확인하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 Src 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME을 처리하면 신호전달 단백질인 Src, p85의 인산화 감소 효과가 나타남을 확인하였으며 특히 Cs-ME를 100(μg/ml) 처리한 경우 p-p85의 감소가 급격히 나타남을 확인하였다.

실시예 10. Syk 과발현을 통한 염증 발생시 Syk의 인산화 감소

Syk 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME를 처리하면 Syk의 인산화 정도가 감소하는지 확인하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 Syk 과발현을 통한 염증 발생시 Cs-ME를 처리하면 p-Syk 밴드가 대조군에 비해 용량의존적으로 연해짐을 알 수 있는 바 신호전달 단백질인 Syk의 인산화 감소 효과 있음을 확인하였다.

실시예 11. 급성위염(acute gastritis)유발 동물 모델에서 Cs-ME의 효과

마우스에게 에탄올(Ethanol)과 염산(HCl)을 사용하여 급성위염을 유발시켰다. 먼저 ICR 마우스를 다섯 군으로 분류한 뒤, 한 군은 염증반응을 유도하지 않았고 나머지 네 군은 에탄올과 HCl 로 염증반응을 유도하였다. 그 중 두 군은 Cs-ME를 50mg/kg, 100mg/kg으로, 한 군은 컨트롤 컴파운드인 라니티딘(Ranitidine)을, 나머지는 Cs-ME의 비히클(vehicle)인 CMC 0.5%를 이틀간 주입한 뒤 해부 후 위벽의 상태를 측정, 위염 유발 정도를 정량화하였다.

그 결과, 도 12에 나타나 바와 같이 Cs-ME의 위염 완화효과는 50mg/kg처리군과 100mg/kg처리군을 비교했을 때, 농도의존적으로 증가하였다. 특히, 100mg/kg Cs-ME 처리군의 경우, 라니티딘(Ranitidine)처리군보다 더 높은 위염 완화효과를 보임을 확인하였다.

실시예 12. Cs-ME, 퀘르세틴 ( Quercetin ), 및 캠페롤 ( Kaempferol )의 니트릭 옥사이드(NO) 생성능 비교

Cs-ME을 처리한 경우 퀘르세틴(Quercetin), 및 캠페롤 (Kaempferol) 단독처리인 경우보다 니트릭 옥사이드 생성능 저해 효과가 더 크다는 것을 확인하기 위해 실시예 2의 실험방법에 따라 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 Cs-ME를 처리한 경우 캠퍼롤 및 퀘르세틴 각각을 처리한 경우보다 니트릭 옥사이드 생성억제 효과가 더 큰 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 위염인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 메탄올을 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(luteolin), 및 캠페롤 (Kaempferol)로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 일산화 질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 유도형 NO 생성 효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 IκBα, IKKα/β, Syk, p85 또는 Src의 인산화를 억제함으로써, 뉴클리어 팩터 κB(nuclear factor κB, NF-κB)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카나리움 서부라텀 추출물은 p50 및 p65의 핵 전이(nuclear translocation)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
카나리움 서부라텀(Canarium subulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 염증성 질환은 위염인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.