KR101537468B1 - 필란두스 액시더스 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
필란두스 액시더스 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물이 p85, Src 및 Syk의 인산화 및 IRAK-1 발현을 억제할 뿐만 아니라, AP-1 활성화를 억제하고, NF-κB 활성화를 억제하여 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자 발현을 억제하고, 이로 인해 산화질소(NO) 생성을 억제할 수 있는바, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 독성이 적으며, 효과적으로 염증 및 자가면역 활성에 관여하는 사이토카인과 그에 따른 신호전달 단백질의 발현을 효과적으로 억제하기 때문에, 다양한 염증성 질환에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물이 p85, Src 및 Syk의 인산화 및 IRAK-1 발현을 억제할 뿐만 아니라, AP-1 활성화를 억제하고, NF-κB 활성화를 억제하여 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자 발현을 억제하고, 이로 인해 산화질소(NO) 생성을 억제할 수 있는바, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 독성이 적으며, 효과적으로 염증 및 자가면역 활성에 관여하는 사이토카인과 그에 따른 신호전달 단백질의 발현을 효과적으로 억제하기 때문에, 다양한 염증성 질환에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 필란두스 액시더스 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국부적인 또는 전신적인 방어기작으로 주로 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 및 비만 세포(mast cell)에 의해 조절되어진다. 염증은 주로 면역계를 이루는 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나, 국부적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다. 주요 염증성 질환으로는 위염, 염증성 장염 등의 소화기질환, 치주염 등의 구강 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기질환, 아토피 피부염 등의 피부질환이 포함되며, 기타 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨병, 동맥경화증 등이 있다. 또한 지속적인 염증성 질환은 암을 유발할 수 있다는 연구 결과도 있다. 이러한 염증성 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되고 있는 일반적인 조성물로는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 조성물로 구분되어지며, 이중 대부분이 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많다. 따라서 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 필란두스 속 식물은 전세계적으로 넓게 분포되어 자라고 약 700여종이 최소한 10개의 속으로 나뉘어져 구별된다. 이러한 필란두스 속 식물은 인도, 중국, 태국, 브라질 등에서 민간약재로서 널리 쓰여져 왔는데, 그 효과도 광범위하여 항경련 작용, 진통 작용, 해독작용 등이 있는 것으로 보고되었다. 한편 간염 및 간암을 유발하는 B형 간염 바이러스에 대한 억제제 및 치료제로서의 가능성도 시사되었으며 필란두스 속 식물 중 P. 아마루스 (P amarus), P. 데빌리스 (P. debilis), P. 프라터루스 (P. fraternus), P. 니루리 (P. niruri), P. 우리나리아 (P. urinaria) 등이 효과가 있다는 간접적인 결과도 도출된 바 있다.
상기에서 기재한 바와 같이, 스테로이드성 및 비스테로이드성 조성물의 사용으로 인한 각종 부작용과 같은 문제점을 해결하기 위해, 천연물 추출물을 이용한 염증성 질환 치료제를 개발하는 것이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 등록특허 제10-1248861), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 NF-κB 또는 AP-1(activator protein-1) 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증성 질환은 패혈증, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
더욱이, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물이 p85, Src 및 Syk의 인산화 및 IRAK-1 발현을 억제할 뿐만 아니라, AP-1 활성화를 억제하고, NF-κB 활성화를 억제하여 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자 발현을 억제하고, 이로 인해 산화질소(NO) 생성을 억제할 수 있는바, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 독성이 적으며, 효과적으로 염증 및 자가면역 활성에 관여하는 사이토카인과 그에 따른 신호전달 단백질의 발현을 효과적으로 억제하기 때문에, 다양한 염증성 질환에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 Pa-ME의 산화질소(NO) 생성 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Pa-ME의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Pa-ME의 iducible nitric oxide synthase(iNOS), Cyclooxygenase-2(COX-2), 및 Tumer necrosis factor(TNF-α) 유전자 발현 억제효능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Pa-ME의 p50, c-Fos 및 c-Jun 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Pa-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 IκBα의 인산화의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Pa-ME에 의한 Src, Syk, p85 단백질의 인산화의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Pa-ME에 의한 IRAK1, IRAK4의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Pa-ME의 농도에 따른 Src 단백질의 인산화 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PMA로 활성화한 조건에서 Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 신호전달 단백질 MyD88을 트렌스펙션하여 AP-1 유전자 발현을 유도한 조건에서 Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 신호전달 단백질 MyD88을 트렌스펙션하여 NF-κB 유전자 발현을 유도한 조건에서 Pa-ME의 NF-κB 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 Pa-ME의 인산화 단백질 Src, Syk 인산화력 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 급성 위염 (acute gastritis) 유발에 대한 Pa-ME의 위 손상 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Pa-ME의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Pa-ME의 iducible nitric oxide synthase(iNOS), Cyclooxygenase-2(COX-2), 및 Tumer necrosis factor(TNF-α) 유전자 발현 억제효능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Pa-ME의 p50, c-Fos 및 c-Jun 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Pa-ME에 의한 세포 내 NF-κB 신호전달 단백질 IκBα의 인산화의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Pa-ME에 의한 Src, Syk, p85 단백질의 인산화의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Pa-ME에 의한 IRAK1, IRAK4의 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Pa-ME의 농도에 따른 Src 단백질의 인산화 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PMA로 활성화한 조건에서 Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 신호전달 단백질 MyD88을 트렌스펙션하여 AP-1 유전자 발현을 유도한 조건에서 Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 신호전달 단백질 MyD88을 트렌스펙션하여 NF-κB 유전자 발현을 유도한 조건에서 Pa-ME의 NF-κB 유전자 발현 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 Pa-ME의 인산화 단백질 Src, Syk 인산화력 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 급성 위염 (acute gastritis) 유발에 대한 Pa-ME의 위 손상 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 생물 추출물 소재로서 염증성 질환의 치료 효능을 갖는 천연물 소재를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물이 산화질소(NO) 생성 저해 활성, iNOS, COX-2, TNF-α 유전자 발현 억제 효능 등을 가지는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 또한, 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus)로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수도 있다. 상기 분획 시 온도는 4℃ 내지 120℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 제조하고(실시예 1 참조), 상기 추출물의 활성을 검증한 결과, 상기 추출물이 p85, Src 및 Syk의 인산화, 및 IRAK-1 발현(실시예 6 및 실시예 8 참조)을 억제할 뿐만 아니라, AP-1 활성화를 억제하고(실시예 7 참조), NF-κB 활성화를 억제하여 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자 발현을 억제하고(실시예 5 참조), 이로 인해 염증발생의 주요 원인인 산화질소(NO) 생성을 억제함을 확인하였다(실시예 2 참조).
이에, 본 발명의 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 다양한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 이때, 상기 염증성 질환의 종류에는 이로 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 질병 상태로 진행된 만성 염증, 꽃가루와 같이 일반적으로 무해한 물질에 의한 염증반응, 천식 혹은 류마티스성 관절염과 같은 자가 면역 반응에 의한 염증반응, 패혈증, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환, 만성 염증 질환 등이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 정제, 캅셀제, 크림제 등의 제형으로 제조 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 경구용 제제로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 필란두스 액시더스(
phyllanthus acidus
) 추출물 및 세포 준비
1.1. 필란두스 액시더스(
phyllanthus acidus
) 메탄올 추출물(Pa-ME)의 제조
필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 메탄올 추출물(Pa-ME)을 제조하기 위해, 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus)의 지상부(aerial parts)를 건조시키고, 분쇄하여 미세분말 샘플을 만든 후, 상기 샘플(125g)을 초음파 배스(ultrasonic bath)에서 95% methanol (1,500 ml)을 이용하여 추출물을 추출하였다. 이후, 감압하에서 증발 건조시켜 최종 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 메탄올 추출물 3.2g을 얻었다.
1-2. 세포 배양
필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물의 활성을 측정하기 위한 실험용 세포로서, RAW264.7 세포 및 HEK293 세포를 준비하였다. 보다 구체적으로, Murine 대식세포주인 RAW264.7 세포는 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다. Human 세포주인 HEK293 세포는 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다.
실시예 2. Pa-ME의 산화질소(NO) 생성 저해 활성 측정
염증발생의 주요 원인인 산화질소(NO) 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.
즉, 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×106 cell/ml의 농도로 조절한 후, 96 well plate에 접종하고, 5% CO2 및 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다. 이후 배지를 제거하고 4배 농도로 조제된 Pa-ME 추출물 50 μl와 50 μl의 LPS (최종농도 1 μg/ml) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100μl씩 또 다른 96 well plate에 옮긴 후, Griess 용액 (0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H3PO4)을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 정량을 실시하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 한편, 표준물질로 sodium nitrite (0 에서 100 μM)를 사용하여 검량선을 작성하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, Pa-ME의 농도가 높아질수록, RAW264.7 세포에서 NO의 생성 농도가 낮아진 것을 확인할 수 있고, 상기 결과로부터, Pa-ME는 우수한 NO 생성 억제능을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 3. Pa-ME의 세포 독성 측정
Pa-ME의 세포 독성을 측정하기 위해 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphinyltetrazolium bromide) assay법을 이용하였다. 보다 구체적으로, 96-well plate에 1×106 cell/ml의 RAW264.7 세포를 plating하고 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 이후 10μl MTT 용액 (stock concentration : 5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 formazan crystal 용해를 위해 각 well에 100μl MTT stopping solution (10% Sodium dodecyl sulfate in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 4. Pa-ME의 iducible nitric oxide synthase(iNOS), Cyclooxygenase-2(COX-2), 및 Tumer necrosis factor(TNF-α) 유전자 발현 억제효능 측정
Pa-ME가 염증 반응을 유도하는 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 실시하였다.
즉, 사이토카인 및 염증매개물질 생성 효소의 유전자 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 Pa-ME가 처리된 RAW264.7 cell에 LPS (1 μg/ml)를 6시간동안 추가적으로 처리한 후, Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 하기 표 1에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH를 사용하였다. PCR amplication은 Hipi PCR kit (Elpis biotech)를 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers, 대조군 GAPDH primers를 dNTP 250 μM, Tris-HCL(pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM를 포함한 Hipi PCR kit 20 μl에서 시행하였다. PCR은 95℃에서 45초 간 denaturing, 55℃에서 45초 간 annealing 그리고 72℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5 % agarose gel에서 전기영동 하였고 분획된 DNA band의 intensity를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Pa-ME를 RAW 264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 시클로 옥시게나제 2 (Cox-2), 튜머 네크로시스 펙터 알파 (TNF-α), 니트릭 옥사이드 신타제 (iNOS)의 mRNA 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
Gene | Primer sequences | |
TNF-a |
F | 5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3'(서열번호 1) |
R | 5'-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3'(서열번호 2) | |
iNOS |
F | 5`-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3`(서열번호 3) |
R | 5`-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3`(서열번호 4) | |
COX-2 |
F | 5'-CACTACATCCTGACCCACTT-3'(서열번호 5) |
R | 5'-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3'(서열번호 6) | |
GAPDH |
F | 5'-CACTCACGGCAAATTCAACGGCAC-3'(서열번호 7) |
R | 5'-GACTCCACGACATACTCAGCAC-3'(서열번호 8) |
실시예 5. Pa-ME의 p50, c-Fos 및 c-Jun 억제 활성 측정
Pa-ME의 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 유전자 발현 억제 활성이 전사인자인 NF-κB의 주요 서브유닛(subunit)인 p50의 활성화(activation) 또는 AP-1 패밀리 단백질 중의 하나인 c-Fos의 전좌(translocation)를 억제하기 때문에 유도되는 것인지 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 실시하였다.
즉, RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 90%의 밀도로 100mm의 dish에서 전 배양시킨 후, Pa-ME를 30분 동안 전처리하고 LPS(Lipopolysaccharide) 1μg/mL으로 15, 30, 60 및 120분간 처리하였다. 이후 ice-cold PBS로 washing 하고 Homogenization buffer A [20 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin] 300 μl를 이용하여 세포를 수집하였다. Sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 파쇄한 후, 8000 rpm으로 15분 동안 4℃에서 원심분리 하여 상층액 (Cytosol 분획)을 분리하였다. Pellet (Nuclear 분획)은 300 μl Homogenization buffer B [1% TritonX-100 in Homogenization buffer A]로 부유시킨 후 sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 파쇄하여 얻어진 분획을 SDS-PAGE와 western blotting을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Pa-ME에 의해 p50, c-Fos 및 c-jun의 활성화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, Pa-ME에 의한 iNOS, COX-2, 및 TNF-α유전자 발현 억제가 NF-κB의 활성화 억제에 의한 것임을 알 수 있었다.
실시예 6. Pa-ME의 신호전달 단백질 인산화 억제 효능 측정
Pa-ME의 신호전달 단백질 인산화 억제능을 측정하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.
penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 RAW264.7 세포를 7×106 cell/ml 농도로 60mm의 dish에서 전 배양시킨 후, 각 분획들을 처리하고, LPS(Lipopolysaccharide) 1μg/mL으로 2분 부터 60분 동안 처리하였다. 이 후 세포들을 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 파쇄하여 western 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정하였고, 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE를 실행하고, wet blotting 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting시킨 후 membrane을 5 % non-fat dried milk (Bio-rad)를 사용해 blocking시키고, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p50, c-Fos, c-Jun, Lamin A/C, p-IκBα, p-Src, Src, p-Syk, Syk, p-p85, p85, IRAK1, IRAK4, β-actin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 washing 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 washing하였다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하였고, 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 5 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, Pa-ME는 IκBα의 인산화를 억제시킬 뿐만 아니라, p85, Src 및 Syk의 인산화 및 IRAK-1 등을 억제시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 7. Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 효능 측정
Pa-ME의 AP-1 유전자 발현 억제 효능을 측정하기 위해, 하기와 같이 실험을 실시하였다.
즉, HEK 293 세포주를 Opti-MEM을 이용하여 24 well plate에 분주한 후 37℃ 5% CO2 세포배양기에서 전배양하였고, 배양 후 세포가 50% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. PEI 법을 이용하여 MyD88, NF-kappaB-Luc 혹은 AP-1-Luc DNA와 beta-galactosidase DNA를 co-transfection 하였다. 보다 구체적으로, PEI법은 상기의 DNA들 (MyD88 + NF-kappaB-Luc + beta-galactosidase DNA 혹은 MyD88 + AP-1-Luc + beta-galactosidase DNA, 각각 1μg씩) 과 PEI 3 μg을 Opti-MEM에 각각 희석해 준 후 상온에서 20분 동안 배양 한 후 DNA 희석액과 PEI 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하는 방법으로 진행하였다. 배양 후 혼합액을 세포가 분주된 24 well plate에 넣어준 후 6시간 후 세포배양 배지[10% FBS, 1% penicillin/streptomycin in DMEM]로 교체해주고, 24시간 배양 후 시험물질을 농도별로 처리한 후 30분 동안 배양하였다. AP-1 DNA를 활성화 시키는 stimulus인 100 nM PMA를 처리한 실험에서는 AP-1-Luc과 beta-galactosidase DNA를 PEI법을 이용하여 트랜스팩션 시킨 후 6-18 시간동안 배양한 후, lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시키고 substrate와 1:1로 반응 시켰다. 반응 후 바로 Luminometer로 흡광도를 측정한다. beta-galactosidase의 경우 X-gal과 1:1로 반응시킨 후 37℃ 배양기에서 5분 배양한 후 405 nm로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다.
실시예 8. Pa-ME의 인산화 단백질 인산화력 억제 효능 측정
Pa-ME의 인산화 단백질 인산화력 억제 효능 측정하기 위해 미국 Millipore사의 kinase profiler service를 이용하였다. 최종적으로 작용하는 용액의 부피를 25μl로 하여, Syk과 Src 1-5 mU을 reaction buffer와 배양하는데 있어서 MgATP를 첨가하여 반응을 개시하였다. 40분간 상온에서 반응한 뒤 3% 인산 용액을 5ml 첨가하여 반응을 정지시켰다. 위 용액을 10μl 덜어서 P30 filtermat에 점적 한 후 75mM의 인산으로 5분씩 3회 세척하고 메탄올로 건조시킨 뒤 섬광계수기로 측정하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Pa-ME가 인산화 단백질 Src, Syk의 인산화력을 현저히 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 9. Pa-ME의 위염 억제 활성 검증
에탄올(Ethanol)과 염산(HCl)을 사용하여 급성위염을 유발시켰다. 먼저 ICR mouse를 네 군으로 분류한 뒤 두 군은 Pa-ME의 vehicle인 0.5% CMC를 주입하였고 다른 두 군은 각각 Pa-ME와 positive control인 Ranitidine을 3일간 경구투여하였다. 이로서 동물군이 급성위염에 대한 감소효과를 갖도록 한다. vehicle을 주입한 두 군 중 한 군은 위염을 유발시키지 않았고 나머지 세 군은 에탄올과 염산으로 위염을 유발한 뒤 희생(sacrifice)시켜서 위를 절개, 위벽 상태를 관찰, 위염 유발 정도를 정량화 하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타내 바와 같이, Pa-ME을 처리한 경우 출혈량이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 또한 이를 통해 위염이 감소했음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Pharmaceutical compositions preventing or treating inflammatory
diseases comprising extract of phyllanthus acidus
<130> PB14-11853
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-a forward primer
<400> 1
ttgacctcag cgctgagttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-a reverse primer
<400> 2
cctgtagccc acgtcgtagc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS forward primer
<400> 3
cccttccgaa gtttctggca gcagc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS reverse primer
<400> 4
ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 forward primer
<400> 5
cactacatcc tgacccactt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 reverse primer
<400> 6
atgctcctgc ttgagtatgt 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 7
cactcacggc aaattcaacg gcac 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 8
gactccacga catactcagc ac 22
Claims (8)
- 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB 또는 AP-1(activator protein-1) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- 위궤양 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서, 상기 조성물은 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 필란두스 액시더스(phyllanthus acidus) 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US20020054921A1 (en) * | 2000-06-20 | 2002-05-09 | Christoph Von Keudell | Use of phyllanthus components for the treatment or prophylaxis of infections triggered by flavivirdae |
-
2014
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