KR101542774B1

KR101542774B1 - 리그난 유도체를 함유하는 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101542774B1
Application number: KR1020080117688A
Authority: KR
Inventors: 김정기; 서대방; 김완기; 이상준; 오원근
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2015-08-10
Also published as: KR20100059050A

Abstract

본 발명은 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료 용도의 조성물에 관한 것이다. 좀더 상세하게는 리그난 유도체를 유효성분으로서 함유함으로써 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

세라마이드, 자초, 리그난, 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(serine-palmitoyl trasnferase)

Description

리그난 유도체를 함유하는 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating ceramide metabolism-related enzyme mediated disease comprising lignan derivatives as an active ingredient}

본 발명은 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료 용도의 조성물에 관한 것이다. 좀더 상세하게는 자초 리그난 유도체를 유효성분으로서 함유함으로써 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부의 가장 외층인 표피는 외부 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 보호장벽의 역할을 하고 있다. 표피의 각질층에 존재하는 피부장벽은 수분과 전해질의 소실을 억제하고 외부의 물질적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하며, 세균 및 바이러스 등이 피부로 침투하는 것을 방지하는 역할을 한다(Feingold KR. Cosmet. Toilet. 112:49-59, 1997). 각질세포간 지질은 세라마이드(ceramides), 콜레스테 롤(cholesterol), 유리 지방산(free fatty acids) 등의 지질혼합체로 세포간 층상(intercellular lamellae) 구조를 이루고 있다. 특히 표피 피지막의 40-50%를 차지하는 세라마이드는 스핀고신(sphingosine), 아미드가 결합된 논하이드록시 애시드(amide-linked nonhydroxy acid), 알파 하이드록시 애시드(α-hydroxy acid) 또는 오메가 하이드록시 애시드(ω-hydroxy acid), 에스터가 결합된 지방산(ester-linked fatty acid) 등을 포함하는 복잡한 구조를 이루고 있고, 이들 구조적 인자에 의해 형성되는 극성은 피지막의 층상(lamellae) 구조를 유지하는데 중요하다(Choi MJ et al. Am. J. Clin. Dermatol. 6:215-223, 2005). 세라마이드 대사와 관련하여 세라마이드 합성과 세라마이드 분해를 담당하는 두 종류의 효소가 알려져 있는데 각각 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(serine-palmitoyl trasnferase)와 세라미다아제(ceramidase)이다. 따라서, 세라마이드의 총량을 증가시키기 위해서는 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(serine-palmitoyl trasnferase, SPT)를 통한 세라마이드의 합성이 증가되거나, 세라미다아제(ceramidase)에 의한 세라마이드 분해가 감소되는 것이 필요하다.

국내 식물자원인 자근(생약명: Radix lithospermi)은 지치의 뿌리로서, 시코닌(shikonin), 아세틸시코닌(acetylshikonin) 등과 함께 다당류인 리소스퍼먼(lithosperman) 등의 성분을 함유하며, 혈액순환 촉진작용, 해독작용, 항균 및 항염작용 등이 있어 각종 창양, 종기나 화상, 습진 등을 치료하는데 상용되는 한약재로 알려져 있다. 대한민국 공개특허 제2000-0038904호에는 자초가 창상 및 화상면의 세포의 신생을 촉진하고 항염증 작용과 창상 치유 촉진 효과 등이 있다고 개 시되어 있으며, 제2004-0011984호에는 피부 표피 장벽의 지방 층상 구조가 손상되어 있는 아토피 피부염 또는 건조증을 치료하는 용도로서의 자초 추출물이 보고되었다. 하지만, 자초 식물내에서 생리활성을 나타내는 유효물질의 구조를 보고한 예가 없으며 또한 화합물에 의한 아토피 피부염 또는 건조증을 치료하는 세부 기전에 대해서는 알려진 바가 없다.

일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법 중, 기존 약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학에서 사용되고 있는 천연물 약재를 이용하는 것이 새로운 활성성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성염려가 적은 장점이 있다. 그러므로 본 발명자들은 각종 자생식물 및 한약재를 대상으로 조사하였고 이 중 자초 추출물을 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하여 얻은 자초 리그난 유도체가 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제의 발현량을 증대시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 자초로부터 순수하게 분리 정제하여 얻은 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제의 발현량을 증가시키는 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개 질환의 예방 또는 치료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자초로부터 분리한 로즈마리산(Rosmarinic acid), 리소스퍼믹 애시드(Lithospermic acid), 9”-메틸 리소스퍼메이트(9”-Methyl lithospermate) 및 9’-메틸 리소스퍼메이트(9’-Methyl lithospermate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 피부의 표피 상태를 개선하고, 표피 장벽의 지방 층상 구조가 손상되어 있는 아토피 피부염 또는 건조증을 치료하여 궁극적으로는 세라마이드 대사관련 효소에 의해 매개되는 질환의 피해를 경감시켜 줄 수 있다.

본 발명의 조성물은 자초로부터 분리한 하기 화학식 1~2로 표시되는 로즈마리산(Rosmarinic acid, 화합물 1), 리소스퍼믹 애시드(Lithospermic acid, 화합물 2), 9”-메틸 리소스퍼메이트(9”-Methyl lithospermate, 화합물 3) 및 9’-메틸 리소스퍼메이트(9’-Methyl lithospermate, 화합물 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리그난 유도체를 유효성분으로 함유한다.

리그난은 페닐프로파노이드 단위로 이루어지는 페놀 화합물이며, 이들은 소량이면서도 식물의 뿌리, 잎, 줄기, 종자, 과실이라고 하는 모든 부분에 분포되어 있다. 리그난은 에스트로겐과 마찬가지로 장간순환하고, 뇨중에 글루쿠로니드 포합체 또는 황산염 포합체로서 방출되는 물질이다.

본 발명의 자초 추출물은 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 먼저 건조시킨 자초를 분쇄하여 4배 내지 5배의 추출 용매와 함께 추출장치에 넣고 이틀 동안 방치하여 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 추출물을 얻는다. 본 발명에 있어 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C₁~C₆의 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에 테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 70% 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기와 같은 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50중량%의 양으로 함유한다. 0.01중량% 미만에서는 유효한 효능을 구현하기 어려우며, 50중량% 초과에서는 제형화에 어려움이 있다.

본 발명에 따른 리그난 유도체는 다양한 식물로부터 분리할 수 있을 뿐만 아니라 안정도도 높으므로 의약품 및 의약품의 첨가제로 이용할 수 있다. 의약품에 적용할 경우에는 피부의 표피 상태를 개선하고, 피부 표피 세라마이드 감소에 기인하여 피부 표피 장벽의 지방 층상 구조가 손상되어 있는 아토피 피부염, 피부건조증, 건선 등을 치료할 목적으로 본 발명에 따른 리그난 유도체 화합물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

경구투여을 위한 제제로서는 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 연질/경질 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제(乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑) 등을 들 수가 있다.

본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완 충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 섭취할 경우 상기 화학식 1 내지 2로 표현되는 리그난 유도체를 유효 성분으로서 일일 1~12000mg 섭취할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 2로 표현되는 리그난 유도체를 유효 성분으로 함유하는 식품을 제공한다.

상기 성분을 식품에 함유할 경우, 상기 자초 추출물 또는 화학식 1 내지 2로 표현되는 리그난 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 단계별로 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 시험예에만 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1] 리그난 유도체의 분리 및 구조확인

자초 리그난 분획물의 제조 및 세라마이드 대사관련 효소 매개 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 활성화합물의 구조확인을 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

단계 1 : 자초로부터 리그난 유도체의 분리 및 정제

자초의 건조된 뿌리 5kg을 잘게 부순 후 70% 에탄올에 2일간 침지하여 실온에서 추출하였다. 상기 에탄올 추출물을 감압농축한 후 클로로포름을 사용하여 추 출한 다음 남은 수용액층을 사용하여 디아이온 에이치피-20 칼럼크로마토그래피(diaion HP-20 column chromatography)를 수행하여 5개의 분획으로 나누었다. 가장 강한 활성을 나타내는 60% 메탄올 용매에 용출되는 분획(17.3g)을 모아 30% 메탄올을 사용하여 알피-18 칼럼크로마토그래피(RP-18 column chromatography)하여 활성있는 분획(LE-A, 3.2g)을 얻었다. 최종적으로 일부의 LE-A 분획을 사용하여 고압 액체크로마토그래피(HPLC; Gilson system, YMC column (20 × 150 mm, 입자 크기 4 ㎛), 280 및 320nm에서 UV 검출)를 실시하여 SPT의 발현을 증가시키는 화합물 1(16.0 mg), 화합물 2(10.2 mg), 화합물 3(15.0 mg), 화합물 4(21.0 mg)를 분리하였다.

단계 2 : 화합물 4종의 물리화학적 특성 및 화학구조 분석

상기 자초로부터 분리한 화합물들의 구조분석을 위하여 우선 화합물 2의 화학적 구조를 추정하였다. 화합물 2는 진한 갈색을 띤 분말로 획득되었으며 메탄올 용매로 UV 스펙트럼을 측정한 결과 251, 289 및 306nm에서 최대흡수 피크(peak)를 나타내었다. 또한 FAB 질량 분석을 통하여 [M + Na]+ 피크를 561에서 관찰하였다. ¹H NMR 분석결과 6.82ppm과 7.20ppm에서 이중항(doublet)의 방향족 프로톤(proton), 6.61ppm, 6.68ppm과 6.80ppm에서 삼치환된 벤젠 고리(trisubstituted benzene ring)와 다른 한 쌍의 시그널을 6.72ppm, 6.77ppm과 6.80ppm의 피크를 확인할 수 있었다. 또한, 6.32ppm과 7.84ppm에서 trans 관계인 프로톤 피크(proton peaks)(J= 16.2 Hz)를 확인하였다. ¹³C NMR을 통하여 170 근처에서 3개의 카르복실기의 탄소와, 145ppm 근처에서 6개의 수산기 피크(hydroxy peak) 등이 관찰되었다. 특히, ¹H 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 데이터(spectral data)에서 4.36ppm(δ_C89.3ppm) 근처에서 나타나는 산화된 메틴 피크(oxygenated methine peak)를 관찰하였으며 이러한 분자의 부분적 구조 정보들을 토대로 문헌 조사를 실시하여 이 화합물은 리소스퍼믹 애시드(lithospermic acid)임을 확인하였으며 각각의 화합물은 위와 유사한 구조해석을 통하여 화합물 1은 로즈마리산(rosmarinic acid), 화합물 3은 9”-메틸 리소스퍼메이트(9”-methyl lithospermate), 화합물 4는 9’-메틸 리소스퍼메이트(9’-methyl lithospermate)임을 확인하였고 각각 화합물의 ¹H, ¹³C의 핵자기 공명스펙트럼의 결과를 정리하여 하기 표 1에 나타내었다.

CD₃OD에서 화합물 1~4의 ¹H- 및 ¹³C-NMR 데이터

위치	1		2		3		4
위치	δ_H(mult., J in Hz)	δ_c	δ_H(mult., J in Hz)	δ_c	δ_H(mult., J in Hz)	δ_c	δ_H(mult., J in Hz)	δ_c
1		127.7		124.8		124.7		124.7
2	7.17 (s)	115.2		128.4		127.1		127.9
3		146.8		149.0		149.0		149.0
4		149.7		145.2		145.4		145.4
5	6.78 (d, 8.4)	116.3	6.82 (d, 8.4)	118.2	6.81 (d, 8.4)	118.5	6.82 (d, 8.7)	118.4
6	6.92 (d, 8.4)	123.2	7.20 (d, 8.4)	121.7	7.19 (d, 8.4)	122.1	7.22 (d, 8.4)	122.1
7	7.85 (d, 16.2)	147.7	7.84 (d, 16.2)	144.0	7.72 (d, 15.9)	144.0	7.83 (d, 15.6)	144.4
8	6.32 (d, 16.2)	114.5	6.32 (d, 16.2)	116.4	6.30 (, 15.9)	116.8	6.34 (d, 15.9)	116.2
9		168.5		168.4		168.3		168.2
1'		129.4		129.8		129.4		128.9
2'	6.78 (br s)	117.6	6.8 (br s)	113.6	6.74 (br s)	113.6	6.74	113.6
3'		146.2		145.3		145.4		145.4
4'		145.3		146.2		146.3		146.3
5'	6.72 (d, 8.4)	116.5	6.68 (d, 8.1)	116.5	6.68 (d, 8.1)	116.5	6.68 (d, 8.1)	116.5
6'	6.65 (d, 8.4)	121.9	6.61 (dd, 8.1, 1.8)	118.5	6.68 (dd, 8.1, 2.1)	118.5		118.4
7'	3.06 (dd, 14.1, 8.4) 3.01 (dd, 14.1, 3.6)	38.0	3.05 (dd, 14.1, 8.4) 2.99 (dd, 14.1, 3.6)	38.3	3.09 dd (14.4, 3.9) 2.99 dd (14.4, 8.7)	38.0	3.03 (br s) 3.07 (br s)	38.0
8'	5.13 (dd, 8.4, 3.6)	74.8	5.12 (dd, 8.0, 3.6)	75.1	5.19 dd (8.7, 3.9)	75.0	5.12 (dd, 7.2, 6.0)	74.9
9'		173.6		174.2		173.8		172.3
1”				134.2		133.5		133.9
2”			6.80 (s)	118.0	6.78 (d, 1.8)	117.6		117.7
3”				146.7		146.8		146.8
4”				146.8		147.0		146.9
5”			6.77 (d, 8.1)	116.4	6.77 (d, 8.1)	116.5	6.77 (d, 8.1)	116.5
6”			6.72 (d, 8.1)	121.9	6.61 (dd, 8.1, 1.8)	121.9	6.58 (dd, 8.1, 1.8)	121.8
7”			5.90 (d, 4.8)	58.5	5.89 (d, 4.8)	57.4	5.91 (d, 4.9)	57.8
8”			4.36 (d, 4.5)	89.3	4.43 (d, 4.8)	88.6	4.36 (d, 4.5)	89.0
9”				176.2		173.6		175.5
OCH₃					3.70 s	53.4	3.68	52.8

(NMR 스펙트럼은 Varian Inova 300 스펙트로미터에서 기록됨)

상기 시험예 1의 자초 리그난 분획물의 세라마이드 대사관련 효소 매개 질환의 예방 또는 치료 효과를 측정하기 위해 하기와 같은 방법으로 시험예 2~5의 실험을 수행하였다.

[시험예 2] 리그난 유도체의 세라마이드 대사관련 효소 발현에 미치는 영향(SPT mRNA 발현량 관찰)

리그난 유도체의 세라마이드 대사관련 효소 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 방법으로 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(Serine-palmitoyl transferase, SPT) mRNA 발현량을 관찰하였다. 실시예 1은 자초 70% 에탄올 추출물을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 2는 시험예 1에서 얻은 LE-A 분획인 자초 리그난 전체 분획물을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 3은 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 1(화합물 1)을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 4는 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 2(화합물 2)를 100ppm의 양으로 처리, 실시예 5는 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 3(화합물 3)을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 6은 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 4(화합물 4)를 100ppm의 양으로 처리하였다. 또한, 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 비교예 1(음성대조군) 및 니코틴아미드(nicotinamide) 30μM을 처리한 비교예 2(양성대조군)을 준비하였다.

상기 실시예 1~6의 자초 리그난 분획 시료들은 모두 DMSO에 1000X 의 농도로 녹여 배지로 희석한 후 각 실험군별로 시험용접시(dish)에 첨가해 주었다. 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제 (Serine-palmitoyl transferase, SPT) mRNA 발현을 관찰하기 위하여, 시험물질을 처리한 다음 12시간 후에 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 시험용 접시에 트리졸(Gibco Laboratories, USA)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 다음, Fermentas사의 First Strand cDNA Synthesis Kit(#K1612)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 이후 Qiagen사의 Quantitect SYBR green PCR kit(cat# 204343)를 이용하여 PCR을 수행하였다. SPT에 대한 프라이머(primer)와 mRNA 발현 비교를 위한 GAPDH에 대한 프라이머는 Applied Biosystems사의 TaqMan gene expression assay를 구입하여 사용하였으며, 실시간 PCR(realtime PCR)은 Corbett(Applied Biosystems사)기종을 이용하였다.

상기 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(SPT) mRNA 발현을 관찰하기 위한 실험은 독립적으로 2회 실시하였으며, 평균값은 하기 표 2에 나타내었다.

세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(SPT LC2) mRNA 발현량

	구분	평균 (%)	표준편차 (%)
비교예1	음성대조군 (무처리)	100	9.1
비교예2	양성대조군 (니코틴아미드, 30μM)	128	17.0
실시예1	자초70% EtOH추출물 (100ppm)	145.7	21.1
실시예2	자초 리그난 전체 분획 (100ppm)	165	4.2
실시예3	자초리그난 유도체1 (100ppm)	146.3	5.5
실시예4	자초리그난 유도체2 (100ppm)	150.5	10.8
실시예5	자초리그난 유도체3 (100ppm)	151.0	7.1
실시예6	자초리그난 유도체4 (100ppm)	159.0	2.8

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 자초 추출물 혹은 리그난 유도체의 처리에 의해 SPT mRNA의 발현이 각각 145~165% 정도 증가됨을 확인할 수 있으며(실시예 1~6), 자초 리그난 유도체 중에서 특히 화합물 4(실시예 6)인 9’-메틸 리소스퍼메이트(9’-Methyl lithospermate)의 SPT mRNA 발현 증가 효능이 가장 뛰어남을 확인하였다.

[시험예 3] 리그난 유도체의 세라마이드 대사관련 효소 발현에 미치는 영향(SPT 단백질 발현량 관찰)

리그난 유도체의 세라마이드 대사관련 효소 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 방법으로 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(Serine-palmitoyl transferase, SPT) 단백질(protein) 발현량을 관찰하였다. 실시예 7은 자초 70% 에탄올 추출물을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 8은 시험예 1에서 얻은 LE-A 분획인 자초 리그난 전체 분획물을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 9는 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 1을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 10은 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 2를 100ppm의 양으로 처리, 실시예 11은 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 3을 100ppm의 양으로 처리, 실시예 12는 상기 시험예 1에서 추출한 자초 리그난 유도체 4를 100ppm의 양으로 처리하였다. 또한, 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 비교예 3(음성대조군) 및 니코틴아미드(nicotinamide) 30μM을 처리한 비교예 4(양성대조군)를 준비하였다.

세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(Serine-palmitoyl transferase, SPT) 단백질(protein) 발현을 관찰하기 위하여 시험물질을 처리한 다음 24시간 후에 시험용접시를 차가운 PBS로 세척한 다음, 분석에 사용될 때까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관하였다. 이후 세포파쇄액으로 4℃에서 파쇄한 후 BCA용액으로 단백질량을 정량하였다. 동량으로 맞춘 단백질과 LDS 샘플 버퍼(LDS sample buffer)를 섞어서 샘플을 만든 후 소디움 도데실 설페이트(sodium dodesyl sulfate, SDS) 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동으로 분리하였다. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 분리된 단백질을 함유한 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 일렉트로블로팅(electroblotting)에 의해 전이시킨 후 Ponceus S solution으로 염색하여 동량 전이되었음을 확인하였다. 단백질이 전이된 막(membrane)을 5% 무지방 우유(non-fat milk)를 함유한 TBS-T(0.1% Tween 20 in TBS)로 상온에서 1시간 배양하여 비특이적인 단백질들에 대한 블로킹(blocking)을 실시하고 TBS-T로 2번 세척하였다. 세척 후 abcam사의 SPT 1차 항체(Cat. # ab23696)를 1:500의 농도로 처리하여 4℃에서 오버나이트(overnight)시킨 후 1차 항체에 맞는 2차 항체 (1:2000)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T로 세척 후 ECL(enhanced chemiluminoesence) 용액을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray 필름에 감광시켜 SREBP-1 단백질의 발현양상을 비교 분석하였다.

상기 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(SPT) 단백질 발현을 관찰하기 위한 실험은 독립적으로 2회 실시하였으며, 결과의 분석은 NIH에서 제공하는 ImageJ 1.34s을 이용하였다. 그 평균값을 하기 표 3에 나타내었고, 웨스턴 블롯 분석 실험 결과는 도 1에 나타내었다.

세린-팔미토일 트랜스퍼라아제(SPT) 단백질 발현량

	구분	평균 (%)	표준편차 (%)
비교예3	음성대조군 (무처리)	100.0	19.0
비교예4	양성대조군 (니코틴아미드, 30μM)	149.3	17.2
실시예7	자초70% EtOH추출물 (100ppm)	120.1	18.5
실시예8	자초 리그난 전체 분획 (100ppm)	127.3	14.7
실시예9	자초리그난 유도체1 (100ppm)	142.3	10.1
실시예10	자초리그난 유도체2 (100ppm)	151.1	26.6
실시예11	자초리그난 유도체3 (100ppm)	132.4	23.0
실시예12	자초리그난 유도체4 (100ppm)	167.0	10.9

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 자초 추출물 혹은 리그난 유도체의 처리에 의해 SPT 단백질의 발현이 각각 125~170% 정도 증가됨을 확인할 수 있으며 (실시예 7~12), 자초 리그난 유도체 중에서 특히 유도체 4(실시예 12)인 9’-메틸 리소스퍼메이트(9’- Methyl lithospermate)의 SPT 단백질 발현 증가 효능이 가장 뛰어났으며, 이는 mRNA 발현 양상과 비슷함을 확인하였다.

이를 통해 본 발명에 의한 조성물은 SPT의 발현을 증가시켜 세라마이드의 생성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 4] 기능성 식이 소재의 식이 공급이 표피의 세라마이드 총 함량 변화에 미치는 영향

실험동물 준비

4주령의 NC/Nga 마우스와 정상 대조군 마우스인 BALB/c 마우스 수컷을 구입하여(중앙 실험동물) 염증 및 건조화의 자연적인 유발을 위해 공기 여과 시설이 없는 일반 사육실에서 유지하였다. 대조군 및 각 실험군을 난괴법으로 나눈 후 각 실험군은 우리당 10마리씩으로 하여 2개의 우리에서 사육하였고, 사료와 물을 마음껏 섭취하도록 하였으며 온도 22±1℃, 습도 60±5%를 유지하고 12시간 간격으로 명암을 바꿔주었다.

식이구성

상기 마우스를 실험 식이로 사육하기 전 1주 동안 고형배합 사료로 적응시켰다. 체중에 따라 난괴법으로 실험군을 5군(n=20)으로 나눈 후 실험 식이를 5주 또는 10주간 공급하였다. 각 실험군의 식이 조성은 하기 표 4와 같으며 식이 지방은 식이 무게의 10%로 고정시키고 옥수수 기름(corn oil)을 공급하였다. 식이 소재 급여군은 전체 식이 무게의 1%를 상한선으로 제공받은 분말을 식이에 혼합하여 공급하였다. 자초 식이 소재 사용에서 생기는 건분 식이 무게 차이는 옥수수 전분을 감하여 조정하였다. 자초 식이 소재가 함유되어 있지 않는 식이를 10주간 공급받는 BALB/c 마우스군(대조군 A)을 양성대조군으로, NC/Nga Tnd 마우스군(대조군 B)을 음성대조군으로 두었다. 실험군 1~5은 자초 추출물과 자초리그난 분획 식이소재를 단독 혼합하여 제공하였다.

표피 세라마이드의 총 함량 측정

표피를 폴리트론(polytron)으로 분쇄하고 클로로포름/메탄올(Chloroform/Methanol)(2:1, v/v)을 이용하여 지질을 추출하여 N₂ 기체(gas)로 건조한 후 100μl의 클로로포름에 녹였다. 표피에서 추출된 지질을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, Waters 1525 Binary HPLC pump, Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector, Waters Co., U.S.A)를 이용하여 세라마이드를 분리하였다. HPLC 분석에서 칼럼(column)은 Shiseido Co.의 UG 120(250x4.60mm; 5μm)을 사용하였다. 이동상(Mobile phase)은 헥산(hexane)과 3% 이소프로판올(Isopropanol, IPA)의 혼합액을 사용하고, 유량(flow rate)은 1㎖/min으로 하였다. 흡광도 254㎚에서 분리된 세라마이드 분획을 표피 세라마이드 기준(external ceramides standard)을 이용하여 정량하고 사용한 표피의 단백질 함량 측정과 함께 세라마이드(Ceramides) μg/μg protein으로 표시하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2를 통해 알 수 있듯이, 5주간의 자초유래 식이 소재의 공급 후 각군의 표피에서 측정된 총 세라마이드 함량은 3.14 ± 0.4(대조군 A), 0.84 ± 0.2(대조군 B), 1.73 ± 0.2(실험군 1), 1.45 ± 0.3(실험군 2), 0.90 ± 0.2(실험군 3), 1.22 ± 0.3(실험군 4), 1.20 ± 0.3(실험군 5) (μg/μg protein)로 나타났다. 측정된 세라마이드 함량을 보면 피부장벽 손상군(실험군 1~5 및 대조군 B)이 정상대조군(대조군 A)에 비해 표피 세라마이드 함량은 낮지만, 실험군 1~5의 경우는 대조군 B의 경우보다는 표피 세라마이드의 함량이 높음을 알 수 있다. 특히 여러 기능성 소재 중 자초 70% 에탄올 추출물을 식이 공급하였을 때 세라마이드 함량이 아토피 군인 대조군 B에 비해 유의적으로 증가하였으며, 리그난 각 분획을 식이 공급하였을때도 세라마이드 함량이 다소 증가함을 확인하였다.

10주간의 각 기능성 식이 소재의 식이 공급 후 각 군의 표피에서 측정된 총 세라마이드 함량은 0.07± 0.01(대조군 A), 0.02 ± 0.003(대조군 B), 0.06 ± 0.01(실험군 1), 0.04 ± 0.015(실험군 2), 0.05 ± 0.02(실험군 3), 0.05 ± 0.02(실험군 4), 0.05 ± 0.02(실험군 5) (μg/μg protein)로 5주차에 측정된 세라마이드 함량보다 절대적으로 낮았다. 이는 각 동물의 노화에 따른 피부의 세라마이드 함유량의 절대적인 감소에 기인한 것으로 여겨진다. 그러나 10주간의 각 기능성 식이 소재의 식이 공급에 의한 변화 양상은 더욱 뚜렷이 나타났다. 자초 70% 에탄올 추출물을 함유한 실험군 1의 세라마이드 증가 양상은 더욱 현저하여 정상대조군인 대조군 A과 유사한 수준의 세라마이드 함량을 보였다. 또한 그룹 3~5에서도 유의적인 세라마이드 증가 효과가 나타났는데, 이는 자초 리그난 분획물인 각각의 리그난 유도체 화합물의 첨가에 의해서도 세라마이드 증가 효과가 커짐을 의미한다.

[시험예 5] 기능성 식이 소재의 식이 공급이 표피 증식에 미치는 영향

DNA 증가는 세포 증식의 지표이므로 DNA 구조물인 [³H]티미딘의 병합을 이용해 표피 증식을 측정하였다(Thymidine Incorporation Assay). 상기 시험예 4에서의 대조군 A, B 및 실험군 1~5에서 4mm²의 표피조직을 채취하여 [³H]티미딘과 37℃에서 항온 배양 후, 0.5M NaOH와 95℃에서 가열하여 DNA를 유리하였다. DNA에 EtBr을 반응시켜 방출되는 형광을 β-counter(Beckmann Instruments)를 이용하여 DNA의 양을 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다.

표피의 세라마이드 함량 및 수분 보유량 감소에 의해 피부가 건조해지면 2차적으로 표피 세포의 증식이 증가되는 것으로 보고되어 있다. 도 3을 보면, 5주간의 식이 공급 후 티미딘 병합(Thymidine incorporation)으로 측정한 피부장벽 손상군(대조군 B)의 표피 증식 정도는 정상대조군(실험군 A)에 비해 현저히 높아 표피 과증식은 세라마이드 함량과 역의 상관 관계가 있음을 알 수 있다.

여러 기능성 식이 소재의 5주간의 식이 공급 후 실험군 1~5 모두에서 표피의 과증식이 정상대조군 수준으로 현저히 억제되었는데, 이는 기능성 소재 모두 표피의 세라마이드 함량 변화와 무관하게 표피의 과증식 억제 효과가 있음을 제시한다.

도 1은 SPT 단백질의 발현량 증가를 비교하는 웨스턴 블롯 분석 실험 결과이다.

도 2는 표피 세라마이드 총량을 비교하는 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 표피 과증식 정도를 비교하는 실험 결과를 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 리소스퍼믹 애시드(Lithospermic acid), 하기 화학식 2로 표시되는 9"-메틸 리소스퍼메이트(9"-Methyl lithospermate), 및 하기 화학식 2로 표시되는 9'-메틸 리소스퍼메이트(9'-Methyl lithospermate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 예방 또는 치료제용 약학 조성물.

[화학식 2]

(단, 상기 화학식 2에 있어서, 리소스퍼믹 애시드는 R₁이 H, R₂가 H이고, 9"-메틸 리소스퍼메이트는 R₁이 H, R₂가 CH₃이며, 9'-메틸 리소스퍼메이트는 R₁이 CH₃, R₂가 H임)
제1항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~50중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 예방 또는 치료제용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세라마이드 합성 효소인 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제의 발현을 촉진하고, 표피의 세라마이드 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 예방 또는 치료제용 약학 조성물.
하기 화학식 2로 표시되는 리소스퍼믹 애시드(Lithospermic acid), 하기 화학식 2로 표시되는 9"-메틸 리소스퍼메이트(9"-Methyl lithospermate), 및 하기 화학식 2로 표시되는 9'-메틸 리소스퍼메이트(9'-Methyl lithospermate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 개선용 건강기능식품 조성물.

[화학식 2]

(단, 상기 화학식 2에 있어서, 리소스퍼믹 애시드는 R₁이 H, R₂가 H이고, 9"-메틸 리소스퍼메이트는 R₁이 H, R₂가 CH₃이며, 9'-메틸 리소스퍼메이트는 R₁이 CH₃, R₂가 H임)
제4항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~50중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 세라마이드 합성 효소인 세린-팔미토일 트랜스퍼라아제의 발현을 촉진하고, 표피의 세라마이드 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 또는 표피 건조증의 개선용 건강기능식품 조성물.