CN117545761A - 新型异黄酮化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种源于长角豆的新型活性成分及其用途。本发明是下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。

Description

新型异黄酮化合物
技术领域
本发明涉及一种从豆科植物的长角豆(Ceratonia siliqua L.)分离、提纯从而获得的新型异黄酮化合物及其用途，进而，涉及该化合物的制造方法。
背景技术
长角豆(Ceratonia siliqua L.)是主要原产于地中海地区的豆科植物。长角豆的荚果、即长角豆的荚和果肉被称为角豆荚(carob)，自古以来被用于食用或用作食品原料。成熟的荚果的长度为10～25cm左右，呈现甜味。长角豆的荚果中包含大量多糖类、纤维素及矿物质类，且包含少量蛋白质、非碳水化合物系的小分子化合物等。近年来，正不断推进与长角豆的新型功能相关的研究，报告有：长角豆的荚果(pod)的水萃取物在消化道中具有止泻、抗氧化、抗菌、抗溃疡以及抗炎症作用等数种药理作用，具有对溃疡性结肠炎或胃溃疡等消化系统疾病的预防和治疗效果(非专利文献1、2)。另外，专利文献1记载有：长角豆的种子萃取物中存在α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有抑制体重增加的效果，专利文献2记载有：从长角豆的种子萃取的肽活化水通道蛋白的表达。
炎症是非常常见且重要的病理学进程，与神经退化性疾病、癌、心血管疾病、类风湿性关节炎、呼吸系统疾病、糖尿病、肌肉和软组织的损伤等大多数疾病密切相关，被视为大量急性和慢性疾病的重要的致病因子之一。IL-6(白细胞介素-6)是分子量为21～28kDa的糖蛋白，是与急性炎症、组织损伤或免疫应答等生物学进程有关的炎症性细胞因子之一。IL-6主要在TNF-α与IL-1诱发单核细胞时产生，不仅活化炎症细胞，也诱发急性期蛋白质的表达，催化、放大炎症反应和毒性作用，对组织细胞造成损伤。因此，IL-6产生抑制分析被用作筛选抗炎剂的方法。由于大多数炎症性疾病的临床治疗药存在各种副作用和耐药性，因此在临床应用上存在限制。因此，依然期待一种治疗效果较高、副作用较少、也具备较高安全性的新型抗炎剂。
另一方面，水通道蛋白3(Aquaporin3：AQP3)是在人类皮肤表达最多的水通道蛋白的异构体之一。水通道蛋白3是存在于细胞膜上通过膜来传输水等小分子的转运体，通过在细胞膜上形成“细孔(pore)”，而具有调解生物体内的水、甘油、脲等小分子的膜输送来调节水的平衡的作用。水通道蛋白3与肌肤的保湿、肌肤的屏障功能、创伤治愈有关，具有维持皮肤的形态和功能正常的功能，与角质细胞的增生和迁移、进而初始分化、特异性皮炎、白癜风、皮肤癌、牛皮癣等大量皮肤疾病相关。另外，已知水通道蛋白3的表达量降低(下调)会引起非曝光部皮肤的自然老化。
另外，丝聚蛋白2(Filaggrin-2：FLG2)是S100融合型(fused-type)蛋白质家族的成员，存在于表皮分化复合体(EDC)。丝聚蛋白2蛋白质和丝聚蛋白2的mRNA主要存在于角质化的上皮、特别是皮肤。丝聚蛋白2的表达模式限定于颗粒层的上侧和角质层，与丝聚蛋白的表达模式类似，结构上也与丝聚蛋白密切相关。丝聚蛋白2与上皮的恒常性有关，除此以外，是皮肤角化所必需，也具有保护肌肤屏障的功能。另外，丝聚蛋白2基因的缺陷也与皮肤疾病的发病相关。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2005-119999号公报
专利文献2：日本专利特表2013-515704号公报
非专利文献
非专利文献1：Rtibi K，Jabri M A，Selmi S，etal.，“Preventive effect ofcarob(Ceratonia siliqua L.)in dextran sulfate sodium-induced ulcerativecolitis in rat”，RSC Advances，2016年，Vol.6，p.19992-20000.
非专利文献2：Rtibi K，Selmi S，Grami D，etal.，“Chemical constituents andpharmaco logical actions of carob pods and leaves(Ceratonia siliqua L.)on thegastrointestinal tract：A review”，Biomedicine&Pharmacotherapy，2017年，Vo1.93，p.522-528.
发明内容
发明要解决的课题
然而，上述非专利文献1、2报告有：长角豆的荚果萃取物在消化道中具有止泻、抗氧化、抗菌、抗溃疡和抗炎症作用等药理作用，具有对消化系统疾病的治疗效果，并且专利文献1、2报告有：长角豆的种子萃取物具有抑制体重增加的效果，以及包含活化水通道蛋白的表达的肽，但尚未限定具体的活性成分。
另外，至今未研究过将长角豆的荚果而非长角豆的种子(豆)用于经由水通道蛋白3基因或丝聚蛋白2基因的表达亢进来改善皮肤屏障功能，其有效性完全不明确。
因此，本发明鉴于上述方面而成，其目的在于提供一种源于长角豆的新型活性成分及其用途。
另外，本发明的另一目的在于提供一种源于长角豆的新型抗炎剂，其可以抑制IL-6产生。进而，其目的在于提供一种包含该抗炎剂的皮肤外用剂、化妆品和抗炎症用饮食品组合物。
另外，本发明的另一目的在于提供一种源于长角豆的新型的皮肤屏障功能改善剂，其可以使水通道蛋白3基因和/或丝聚蛋白2基因的表达亢进。进而，其目的在于提供一种包含该皮肤屏障功能改善剂的皮肤外用剂、化妆品和皮肤屏障功能改善用饮食品组合物。
用于解决课题的手段
本发明人等发现，从长角豆的荚果萃取物分离出新型异黄酮化合物，该新型化合物具有抗炎症作用、以及水通道蛋白3基因和丝聚蛋白2基因的表达促进作用。基于该见解，完成了本发明。
为了解决上述课题，本发明是下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。
[化学式1]
式(I)所表示的化合物是从长角豆(Ceratonia siliqua)的荚果萃取物分离、提纯而得的新型异黄酮化合物，具备水通道蛋白3产生促进作用和丝聚蛋白2产生促进作用，具有皮肤屏障功能改善效果且具有抗炎症作用。
另外，本发明的皮肤屏障功能改善剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。通过施用式(I)所表示的化合物，可促进水通道蛋白3基因和丝聚蛋白2基因的表达，可促进承担将皮肤屏障功能保持在适当的状态的功能的水通道蛋白3和丝聚蛋白2的产生，因此可发挥皮肤屏障功能的改善效果。
另外，本发明的水通道蛋白3产生促进剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。通过施用式(I)所表示的化合物，可促进水通道蛋白3基因的表达，可促进水通道蛋白3的产生。
另外，本发明的丝聚蛋白2产生促进剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。通过施用式(I)所表示的化合物，可促进丝聚蛋白2基因的表达，可促进丝聚蛋白2的产生。
另外，本发明的抗炎剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。通过施用式(I)所表示的化合物，可抑制作为炎症因子的IL-6的产生，可降低炎症反应。
另外，本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂以及抗炎剂中，上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物的浓度也优选为0.001mM～1mM。由此，可选择效果优异的活性成分的浓度。
另外，本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂也优选为皮肤外用剂或化妆品。由此，可获得具有皮肤屏障功能的改善效果、水通道蛋白3产生促进作用、丝聚蛋白2产生促进作用以及抗炎症作用的皮肤外用剂或化妆品。
另外，本发明的皮肤屏障功能改善用饮食品组合物含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。水通道蛋白3基因和丝聚蛋白2基因的表达亢进，水通道蛋白3和丝聚蛋白2的产生得以促进，由此可获得皮肤屏障功能的改善效果得以发挥的饮食品组合物。
另外，本发明的抗炎症用饮食品组合物含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物。通过抑制作为炎症因子的IL-6产生，可获得抗炎症作用得以发挥的饮食品组合物。
另外，本发明的上述式(I)所表示的化合物的制造方法具有以下工序：获得长角豆(Ceratonia siliqua)的荚果的含水醇萃取物的工序；依次用石油醚、乙酸乙酯对该含水醇萃取物进行液液萃取，并回收乙酸乙酯级分的工序；以及从所回收的乙酸乙酯级分分离式(I)所表示的化合物的工序。由此，可获得具备水通道蛋白3产生促进作用和丝聚蛋白2产生促进作用、具有皮肤屏障功能改善效果且具有抗炎症作用的新型异黄酮化合物。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种具有如以下这样的优异效果的新型异黄酮化合物以及含有其的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂、抗炎剂、皮肤外用剂、化妆品和饮食品组合物。
(1)可以使水通道蛋白3基因的表达亢进，促进水通道蛋白3的产生。
(2)可以使丝聚蛋白2基因的表达亢进，促进丝聚蛋白2的产生。
(3)具备水通道蛋白3产生促进作用和丝聚蛋白2产生促进作用，具有协同的皮肤屏障功能改善效果。
(4)抑制IL-6产生，具有抗炎症作用。
(5)将源于自古以来被食用的长角豆的荚果的化合物作为有效成分，因此对人体的安全性高。
附图说明
图1是表示本发明的化合物的高分辨率ESI质谱的图。
图2是表示本发明的化合物的紫外吸收光谱的图。
图3是表示本发明的化合物的红外吸收光谱的图。
图4是表示本发明的化合物的1H-NMR谱(CD3OD、600MHz)的图。
图5是表示本发明的化合物的13C-NMR谱(CD3OD、150MHz)的图。
图6是表示本发明的化合物的HSQC谱的图。
图7是表示本发明的化合物的HMBC谱的图。
图8是表示本发明的化合物的NOESY谱的图。
图9是将本发明的化合物的1H-NMR信号和13C-NMR信号汇总一览而得的图。
图10是表示本发明的化合物的HMBC相关和NOESY相关的图。
图11是表示实施例4中的LPS诱发IL-6的产生量的图表。
图12是表示实施例5中的水通道蛋白3基因(AQP3)的mRNA表达量的图表。
图13是表示实施例5中的丝聚蛋白2基因(FLG2)的mRNA表达量的图表。
具体实施方式
以下，对本发明的新型异黄酮化合物及包含其的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂、抗炎剂、皮肤外用剂、化妆品、皮肤屏障功能改善用饮食品组合物、抗炎症用饮食品组合物以及该化合物的制造方法进行说明。
本发明的下述式(I)所表示的新型异黄酮化合物是异黄酮化合物与葡萄糖进行酯键合而成的异黄酮配糖体。
[化学式2]
本发明的新型异黄酮化合物可以是盐，优选为药理学上所容许的盐。作为该新型异黄酮化合物的药理学上所容许的盐，只要是与酸或碱形成的盐即可，并没有特别限定。另外，该新型异黄酮化合物或其盐可以是溶剂化物，并没有特别限定，可列举例如：水合物、乙醇等有机溶剂化物。
本发明的新型异黄酮化合物兼具优异的水通道蛋白3产生促进作用和丝聚蛋白2产生促进作用，因此可以用作可获得基于数种机理的皮肤屏障的正常化、屏障功能的保持效果的皮肤屏障功能改善剂。进而，本发明的化合物具有IL-6产生抑制活性，可以用作抗炎剂。
在本发明中，水通道蛋白3产生促进是指水通道蛋白3基因的表达促进或水通道蛋白3(蛋白质)的表达促进，是指与未添加或施用本发明的新型异黄酮化合物的状态的对照组相比，水通道蛋白3基因或水通道蛋白3的表达亢进。更具体而言，水通道蛋白3基因的表达水平优选为对照组的1.5倍以上，更优选为1.7倍以上，特别优选为2倍以上。另外，丝聚蛋白2产生促进是指丝聚蛋白2基因的表达促进或丝聚蛋白2(蛋白质)的表达促进，是指与未添加或施用本发明的新型异黄酮化合物的状态的对照组相比，丝聚蛋白2基因或丝聚蛋白2的表达亢进。更具体而言，丝聚蛋白2基因的表达水平优选为对照组的1.1倍以上，更优选为1.2倍以上，特别优选为1.3倍以上。这些基因的表达水平可以通过例如实时PCR(QPCR)或微阵列等公知方法进行测定，蛋白质的表达水平可以通过例如免疫染色、蛋白质印迹法等公知方法进行测定。
另外，在本发明中，抗炎症作用是指以下作用：与未添加或施用本发明的新型异黄酮化合物的状态的对照组相比，例如减少由LPS所诱发的IL-6产生量。
本发明的新型异黄酮化合物可以通过从长角豆的荚果进行分离、提纯而获得。本发明中所使用的长角豆的学名为Ceratonia siliqua，是豆科云实亚科长角豆属的植物。其是原产于地中海沿岸地区的植物，但在本发明中，产地或栽培环境并没有特别限定，可以使用所有产地和栽培环境的长角豆。
对本发明的新型异黄酮化合物的从长角豆分离的方法进行说明。首先，从长角豆的荚果获得含水醇萃取物。本发明中的长角豆荚果的含水醇萃取物是指通过以下方式所获得的萃取物，即，在长角豆的荚果中加入含水醇作为萃取溶剂，实施萃取处理。长角豆的荚果是指长角豆的带荚果实的荚和果肉，也可以使用荚或果肉的任一者作为萃取材料，更优选使用荚和果肉。对采集后的状态即生的状态的长角豆荚果、或干燥状态的长角豆荚果进行萃取处理，但为了提高萃取效率或使操作变容易，也可以对实施过各种预处理的长角豆荚果实施萃取处理。作为预处理，并没有特别限定，可列举：干燥处理、破碎处理或粉碎处理等，可以对实施过这些预处理的长角豆的荚果实施萃取处理从而获得萃取物。
作为构成用作萃取溶剂的含水醇的醇，只要能够萃取本发明的异黄酮化合物，则并没有特别限定，可列举例如：乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇等。其中，就对人体的安全性和萃取效率等观点而言，作为萃取溶剂，优选选择含水乙醇。另外，作为含水醇的醇浓度，优选为50～99％，更优选为60～97％，特别优选为70～95％。另外，萃取溶剂中也可以在不妨碍本发明的化合物的萃取的范围内含有其他成分。
作为基于含水醇的萃取方法，在长角豆的荚果中加入作为萃取溶剂的含水醇使之浸渍并进行萃取。例如，在将长角豆荚果制成含水率小于10％的干燥破碎物的情况下，优选相对于植物体1重量份使用5～10重量份的萃取溶剂。另外，作为萃取方法，可以通过室温下的萃取、加热萃取、加压加热萃取或亚临界萃取等任一方法进行，但就萃取效率的观点而言，优选为利用回流操作的加热萃取。另外，为了提高萃取效率，优选为进行数次萃取操作，进一步优选改变萃取溶剂中的醇浓度进行数次萃取操作。虽并没有特别限定，但具体而言，可列举：进行利用95％乙醇的回流萃取1～5次，继而，进行利用70％乙醇的回流萃取1～5次之类的萃取方法。萃取时间可根据萃取方法、萃取材料的方式、萃取溶剂的种类或萃取温度等进行各种设定，例如，在使用70～95％的乙醇进行回流萃取的情况下，作为1次萃取时间，优选为1～3小时左右，特别优选为1.5小时左右。上述萃取处理后，通过倾析、离心分离或过滤等去除残渣，由此可获得长角豆的荚果的含水醇萃取物。对所获得的萃取物而言，也包括通过实施减压蒸馏等处理而制成的浓缩液、固形物。
对于如上所述获得的长角豆的荚果的含水醇萃取物，由于考虑到存在长角豆的荚果中所大量包含的糖类等，因此为了去除这些不需要的成分，也可以进行基于离子交换树脂的分离操作。具体而言，相对于长角豆的荚果的含水醇萃取物1重量份，加入1～10重量份的水使之分散，通过装有大孔吸附树脂等离子交换树脂的柱，吸附本发明的异黄酮化合物，使糖类等不需要的成分流出而去除。其后，通过95％乙醇等使之溶出，由此回收包含本发明的异黄酮化合物的级分。
继而，对长角豆的荚果的含水醇萃取物或通过上述离子交换树脂分离出的回收级分的进一步分离操作进行说明。使含水醇萃取物或回收级分分散于水系溶剂中，依次用石油醚、乙酸乙酯进行溶剂萃取。作为水系溶剂，只要能够使本发明的异黄酮化合物分散，则并没有特别限定，优选使用50％含水甲醇。进行数次利用石油醚/水系溶剂的液液萃取后，进行数次利用乙酸乙酯/水系溶剂的液液萃取。通过该溶剂萃取操作回收的乙酸乙酯级分中包含本发明的新型异黄酮化合物。利用各溶剂系的液液萃取的次数优选为2～10次左右，特别优选为5次左右。
由如上所述获得的乙酸甲酯级分基于常规方法进行提纯，由此可单独分离出本发明的新型异黄酮化合物。作为提纯方法，可以列举：正相色谱法、逆相色谱法、薄层色谱法、凝胶过滤色谱法和高效液相色谱法等，可以组合这些之中的1种或数种进行提纯。各种色谱法中使用的载体和溶出溶剂等可以对应于各种色谱法进行适当选择。
需要说明的是，如上所述从长角豆的荚果分离、提纯的本发明的异黄酮化合物可以不单独分离为完全的纯物质，也可以包含一部分源于长角豆原料的其他成分。
进而，本发明的新型异黄酮化合物可以是通过公知方法合成获得的合成品。
本发明的新型异黄酮化合物兼具优异的水通道蛋白3产生促进作用和丝聚蛋白2产生促进作用，因此可以用作基于数种机理的皮肤屏障功能改善剂。另外，本发明的新型异黄酮化合物可以用作水通道蛋白3产生促进剂或丝聚蛋白2产生促进剂。进而，本发明的新型异黄酮化合物具有IL-6产生抑制活性，因此可以用作抗炎剂。另外，本发明的新型异黄酮化合物可以用作IL-6产生抑制剂。
含有本发明的新型异黄酮化合物的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂和丝聚蛋白2产生促进剂可增加皮肤细胞中所含的水通道蛋白3和丝聚蛋白2，可以用作改善皮肤屏障功能、改善皮肤老化、保持皮肤处于稳定的状态的皮肤外用剂。另外，本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂和丝聚蛋白2产生促进剂可以增加皮肤细胞中所含的水通道蛋白3和丝聚蛋白2，可以用作具有保持皮肤湿润、保持皮肤健康的作用的化妆品。进而，含有本发明的新型异黄酮化合物的抗炎剂可以用作用于抑制炎症因子的产生、预防或改善皮肤中的炎症、保持皮肤处于稳定的状态的皮肤外用剂。另外，本发明的抗炎剂可以用作抑制炎症因子的产生、具有保持皮肤健康的作用的化妆品。
本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂的施用量会根据目标效果、预防或治疗效果、施用方法或年龄等而发生变化，因此无法无差别地进行规定，但用作外用剂的情况下的通常一天的非经口的施用量，作为本发明的异黄酮化合物，优选为0.2μg～30mg，更优选为1μg～3mg，进一步优选为5μg～500μg。另外，用作内用剂的情况下的经口的施用量，作为本发明的异黄酮化合物，通常一天优选为1μg～1000mg，更优选为5μg～500mg。
本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂以及皮肤外用剂和化妆品的剂型并没有特别限定，可列举例如：低粘度液体、洗液等液剂、乳液、凝胶、浆料、乳霜、泡沫、面膜、软膏、粉剂、雾剂或贴附剂等、以及锭剂、颗粒剂、胶囊剂或内服用液剂等。需要说明的是，本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂也可以应用于化妆品、准医药品或医药品的任一种。作为具体的产品，并没有特别限定，可列举：化妆水、化妆乳霜、化妆乳液、美容液、化妆面膜、化妆清洗剂、肥皂、毛发护理剂、沐浴剂或妆用化妆品、抗痘护肤化妆品等。
在本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂以及皮肤外用剂和化妆品中，本发明的新型异黄酮化合物的配合浓度优选为0.001mM～1mM，更优选为5μM～100μM，进一步优选为10μM～30μM。通过将新型异黄酮化合物的配合量设为该范围内，可以稳定地配合本化合物，对皮肤的安全性也较高，可以发挥较高的皮肤屏障功能改善效果、水通道蛋白3产生促进效果、丝聚蛋白2产生促进效果和抗炎症效果。
本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂可以通过以往惯用的方法制成各种形态。在该情况下，可以使用通常制剂用的载体和赋形剂等容许作为医药品的添加剂的添加剂进行制剂化。另外，为了提高本化合物的生物体利用率和稳定性，也可以使用包括微胶囊、微粉末化、使用环糊精等的包接化等制剂技术的给药系统。
另外，可以在本发明的皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂和抗炎剂以及皮肤外用剂和化妆品中适当配合作为皮肤外用剂和化妆品中通常使用的成分的水、油脂类、蜡类、烃类、脂肪酸类、高级醇类、酯类、植物萃取物类、维生素类、水溶性高分子、表面活性剂、金属肥皂、醇、多元醇、pH调节剂、防腐剂、香料、粉体、增粘剂、色素或螯合剂等成分。进而，可以在不损害本发明的作用效果的范围内，并用通常使用的各种功能性成分，例如选自保湿剂、美白剂、抗氧化剂、细胞活化剂、紫外线防御剂、血液循环促进剂和其他抗炎剂等的功能性成分的一种或两种以上。
进而，本发明的皮肤屏障功能改善用饮食品组合物和抗炎症用饮食品组合物含有本发明的新型异黄酮化合物作为活性成分。本发明的饮食品组合物可以制成锭剂或胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂等补充剂形态；清凉饮料、果汁饮料、酒精饮料等饮料；糖或口香糖、曲奇、饼干、巧克力等点心；面包、粥、谷类、面类、果冻、汤、乳产品、调味料等所有形态。在如此用作饮食品时，也可以在不会对本发明的有效成分的功效造成影响的范围内，组合各种其他有效成分、或者维生素、矿物质或氨基酸等营养素等。本发明的饮食品包括补充品、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等。另外，本发明的饮食品的每天的摄取量，以本发明的异黄酮化合物计，通常一天优选设为1μg～1000mg，更优选设为5μg～200mg。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例任何限定。
实施例
[实施例1]
1.长角豆荚果的含水醇萃取物的制备
从采集后经干燥处理的长角豆(Ceratonia siliqua)的带荚果实中去除种子。用粉碎机粉碎该长角豆的荚果，获得粒径2mm以下的粉碎物。相对于20kg的粉碎物，加入140kg(7倍量)的含水的95％乙醇，回流萃取1.5小时，将上述操作进行2次后，进而通过140kg(7倍量)的含水的70％乙醇对残渣进行1.5小时回流萃取。合并所获得的回流萃取液后，减压蒸馏去除溶剂，获得长角豆荚果的含水乙醇萃取物12.4kg。
[实施例2]
2.长角豆荚果的含水醇萃取物的分离和提纯
使实施例1中所获得的长角豆荚果的含水乙醇萃取物分散于1～10倍量的水中，使之吸附于离子交换树脂(大孔吸附树脂D101，Cangzhou Bon Adsorber Technology Co.，Ltd.)。用柱容量的3倍量的蒸馏水使之溶出，去除糖类等杂质，然后用柱容量的3倍量的含水的95％乙醇使之溶出，减压蒸馏去除溶剂，获得462.7g的乙醇溶出级分（非碳水化合物系小分子化合物级分)。其次，使所获得的乙醇溶出级分分散于1.0L的含水的50％甲醇中，依次用石油醚、乙酸乙酯分别进行5次液液萃取。减压蒸馏去除各溶剂，分别获得石油醚级分28.4g、乙酸乙酯级分139.4g和水系级分290.2g。
其次，对于135.0g的乙酸乙酯级分，供于正相硅胶柱色谱(柱填充材料：200～300目，青岛海洋化工厂产品)，使用石油醚(P)/乙酸乙酯(E)和二氯甲烷(C)/甲醇(M)的2种展开溶剂使之溶出，进行分级。其结果，获得108个溶出级分。对于所获得的108个溶出级分，利用薄层色谱法(硅胶GF254板，青岛海洋化工厂产品)进行鉴定，合并类似的级分，获得10个溶出级分A～J。
其次，对于溶出级分I(20.0g)，供于逆相ODS柱色谱(柱填充材料：40～63μm，Merck公司产品)，通过在甲醇∶水＝15∶85→100∶0的梯度溶出进行分级。对于所获得的溶出级分，利用薄层色谱法(硅胶GF254板，青岛海洋化工厂产品)进行鉴定，合并类似的级分，获得5个溶出级分I1～I5。
其次，对于溶出级分I5(2.7g)，供于凝胶过滤色谱(柱填充材料：Sephadex LH-20)，用二氯甲烷∶甲醇＝1∶1使之溶出，获得5个溶出级分I5a～I5e。
其次，将溶出级分I5c(0.3g)供于半制备HPLC(柱I：YMC-PackODS-A，250×20mm，5μm)，在甲醇∶水＝55∶45、检测波长267nm下进行分离，获得级分I5c1。将该级分I5c1供于半制备HPLC(柱II：YMC-PackODS-A，250×10mm，5μm)，在甲醇：水＝49：51、检测波长267nm下进行分离，获得本发明的化合物(以下，称为“Ceratonia siliqua C”)3.3mg(保留时间tR＝56.42分钟)。
[实施例3]
3.化合物(Ceratonia siliqua C)的结构解析
进行实施例2中所获得的化合物、“Ceratonia siliqua C”的结构解析。结构解析时，进行高分辨率质谱分析(HR-ESI-MS；正离子模式)、紫外吸收光谱分析、红外吸收光谱分析、1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC和NOESY分析。这些分析中使用的装置如下所示。
·高解析度质谱分析：电喷雾电离四极杆飞行时间质谱分析装置(BrukerDaltonics公司产品)
·紫外吸收光谱分析：紫外线可见分光亮度计(UV-2401PC，株式会社岛津制作所产品)
·红外吸收光谱分析：FT-IR(NEXUS470，Thermonicolet公司产品)
·NMR分析：600MHz核磁共振装置(AVANCE III 600，Bruker公司产品)
Ceratonia siliqua C的物理性质如以下所示。分别将高分辨率质谱分析(HR-ESI-MS)的谱图示于图1，将紫外吸收光谱分析的结果示于图2，将红外吸收光谱分析的结果示于图3。
·性状：黄色粉末
·HR-ESI-MS(positive)m/z：499.1266[M+Na]+
·紫外吸收光谱：λmax(MeOH)nm(logε)：204.6(4.07)，264.2(4.02)
·红外吸收光谱(KBr、cm-1)：vmax：3422.30，1651.40，1613.95，1587.91，1516.46，1494.55，1441.21，1366.52，1323.41，1279.56，1265.05，1253.99，1219.53，1182.66，1112.36，1071.83，1055.90，1029.91，1012.41，830.57
高分辨率质谱分析(图1)的结果，由于准分子离子峰为m/z 499.1266[M+Na]+，因此推定组成式为C23H24O11，不饱和度为12。另外，根据紫外吸收光谱(图2)，由于在204nm和264nm具有最大吸收，因此暗示Ceratonia siliqua C可能为类黄酮系化合物。另外，根据红外吸收光谱(图3)，示出了分子结构中包含羟基(3422.30cm-1)、苯环(1613.95cm-1、1494.55cm-1)和酮羰基(1651.40cm-1)等官能团。
进而，根据由1H-NMR分析(溶剂：CD3OD，观察频率：600MHz)所获得的谱图(图4)，确认到：2个芳香族单峰信号[δH：8.24(1H，s，H-2)，6.69(1H，s，H-5)]、1组AABB系质子信号[δH：7.50(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，H-6′)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz，H-3′，H-5′)]、2个甲氧基信号[δH：3.91(3H，s，OCH3-8)、3.83(3H，s，OCH3-4′)]、1组葡萄糖残基的质子信号[δH：5.09(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″)、3.91(1H，dd，J＝12.0Hz，J＝2.4Hz，H-6α″)、3.73(1H，dd，J＝12.0Hz，J＝5.4Hz，H-6β″)、3.55(1H，m，H-2″)、3.50(2H，m，H-3″，H-5″)、3.43(1H，m，H-4″)](图9)。另外，根据由13C-NMR分析(溶剂：CD3OD，观察频率：150MHz)所获得的谱图(图5)，观察到：包含1个酮羰基的碳信号(δC：182.5)、14个芳香族或烯烃的碳信号(δC：161.4，158.7，157.7，155.5，151.4，131.4×2，130.7，124.7，124.2，114.9×2，107.7，100.2)、2个甲氧基信号(δC：62.4、55.8)、1组葡萄糖残基的碳信号(δC：102.0，78.4，78.0，74.8，71.1，62.3)的23个碳信号(图9)。根据这些解析结果，推定本化合物为类黄酮配糖体。
此外，由于在1H-NMR谱的低磁场区域观察到异黄酮所特有的芳香族质子信号[δH：8.24(1H，s，H-2)]，因此推定本化合物为异黄酮化合物。
并且，根据由HMBC分析所得的谱图(图7)，观察到：H-2与C-4/C-9/C-1′和H-2′/H-6′与C-3的远程相关信号。根据该结果，表示本化合物为异黄酮化合物。H-2′/H-6′与C-4′、OCH3-4′的远程相关信号表示OCH3-4′键合于C-4’位，其也可通过NOESY谱图(图8)所观察到的H-3′/H-5′与OCH3-4′的相关信号进行确认。另外，根据HMBC谱图，可观察到H-5与C-4/C-6/C-7/C-8/C-9的远程相关信号，可知H-5位未被取代基取代。另一方面，H-1″与C-6的远程相关信号表示葡萄糖残基键合于C-6位，其也可以通过NOESY谱图的H-1″与H-5的相关信号进行确认。另外，根据HMBC谱图，在OCH3-8和化学位移值δC：130.7的碳观察到远程相关信号，在H-5与C-7/C-8也观察到远程相关信号。因此，在HMBC谱图中，无法确认OCH3-8的键合位置。因此，参照与类黄酮化合物相关的文献(Yang G Y，Miao MM，Wang Y，etal.，“Flavonoids from the leaves of Sun Cured Tobacco and their anti-tobaccomosaic virus activity”，Cheminform.，2015年，Vol.46，N0.6，p.1198-1203)，研究本化合物的结构和NMR数据，结果可知，在类黄酮化合物的C-8位被甲氧基取代的情况下，化学位移值δC约为130.0，在C-7位被甲氧基取代的情况下，化学位移值δC大于150.0。因此，鉴定出OCH3-8键合于C-8位而不是C-7位。已知葡萄糖末端的质子的键合常数为7.8Hz，葡萄糖的末端的相对配置为β型。根据这些解析结果，将本化合物、Ceratonia siliqua C的结构确定为如下式(I)所示。图9表示基于HSQC谱图和HMBC谱图分析的汇总有1H-NMR的δH及13C-NMR的δC的归属表。另外，图10表示Ceratonia siliqua C的NOESY和HMBC的解析结果。
[实施例4]
4.Ceratonia siliqua C的抗炎症作用
使用实施例2中所获得的Ceratonia siliqua C，调查Ceratonia siliqua C对作为炎症性细胞因子的IL-6的产生造成的影响。
在本试验中，使用源于小鼠巨噬细胞的细胞株的RAW264.7细胞。RAW264.7细胞用DMEM培养基(包含10％FBS、100U/mL的青霉素和100μM/mL链霉素)在37℃、5％CO2存在下、于饱和湿度条件下进行培养。
在96孔板的各孔中分别播种8×103个RAW264.7细胞，通过CO2培养箱培养24小时。将其分成空白对照组、阳性对照组和试验组，在空白对照组中添加100μL的DMEM培养基，在阳性对照组中添加100μL使地塞米松(DXM)溶解于DMEM培养基中所得的溶液(地塞米松的最终浓度：20μM)，在试验组中以100μL逐次添加用DMEM培养基适当稀释Ceratonia siliqua C而得的溶液，以成为不同浓度(最终浓度：1μM、5μM、10μM、50μM和100μM)。3小时后，添加LPS(1μg/mL)诱发炎症。24小时后，回收上清液，使用IL-6定量酶联免疫吸附分析(ELISA，Enzyme Linked Immuno sorbent Assay)套组测定上清液中的IL-6含量。对于空白对照组、阳性对照组和试验组中的各浓度的样品液，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。
将结果示于图11。LPS表示空白对照，DXM表示阳性对照(地塞米松：20μM)。可知，作为本发明的化合物的Ceratonia siliqua C浓度依赖性地抑制IL-6的产生。因此，表示本发明的新型异黄酮化合物具有抗炎症作用。
[实施例5]
5.Ceratonia siliqua C的皮肤屏障功能相关基因的表达促进作用
使用实施例2中所获得的Ceratonia siliqua C，调查作为源于人类表皮的角化细胞株的HaCaT细胞中的Ceratonia siliqua C对水通道蛋白3(AQP3)和丝聚蛋白2(FLG2)的基因表达造成的影响。
首先，使用DMEM培养基(包含10％FBS和100U/mL青霉素、100μm/mL链霉素)，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养HaCaT细胞。其次，在6孔细胞培养板的各孔中播种细胞浓度调整为5×105cells/mL的HaCaT细胞，通过CO2培养箱(5％CO2，37℃)培养24小时。其后，将实施例2中所单独分离的Ceratonia siliqua C添加至各孔中，使之成为不同的最终浓度。具体而言，使HaCaT细胞培养液中的Ceratonia siliq ua C的最终浓度分别为1μM、5μM、10μM、50μM和100μM。另外，将未添加有Ceratoni a siliqua C的孔设为对照(0μM)。添加后，进行24小时培养。
培养结束后，从各孔回收HaCaT细胞，使用RNA萃取试剂(RNAzol(注册商标)，Molecular Research Center公司产品)，萃取总RNA。使用超微量分光亮度计(Nano Drop，Thermo Fisher Scientific公司产品)，确认萃取所获得的总RNA的浓度。在该总RNA中添加寡聚胸腺嘧啶引物(Oligod T Primer)、dNTP Mix、5×1st链缓冲液、RNase抑制剂、DTT和M-MLV反转录酶，从总RNA合成cDNA。使用该cDNA，通过实时PCR(QPCR)测定水通道蛋白3基因和丝聚蛋白2基因的mRNA表达量。
QPCR使用市售的QPCR试剂套组和QPCR测定装置(Light Cycler(注册商标)480，Roche Diagnostics株式会社产品)来进行，检测时使用作为双链DNA键合荧光色素的SYBR(注册商标)Green。水通道蛋白3的QPCR用引物使用下述表1所示的序列编号1、2的引物。丝聚蛋白2的QPCR用引物使用下述表2所示的序列编号3、4的引物。
[表1]
正向引物 5′-AGACAGCCCCTTCAGGATTT-3′ 序列编号1
反向引物 5′-TCCCTTGCCCTGAATATCTG-3′ 序列编号2
[表2]
正向引物 5′-CTGTGGTCATTCATGGAGTGG-3′ 序列编号3
反向引物 5′-CCCTAGAAGGGCTAATGTGTGA-3′ 序列编号4
将水通道蛋白3的结果示于图12，将丝聚蛋白2的结果示于图13。水通道蛋白3的mRNA表达量以将对照(control)的表达量设为100时的相对值的形式表示。另外，丝聚蛋白2的mRNA表达量以相对于对照(control)的表达量的增加率(％)的形式表示。如图12和图13所示，可知通过添加本发明的化合物、Ceratonia siliqua C，与未添加的对照相比，水通道蛋白3和丝聚蛋白2的mRNA表达量大幅增加。当Ceratonia siliqua C的浓度为10μM时，确认到最高的表达促进效果，水通道蛋白3的mRNA表达量增加至2.5倍，丝聚蛋白2的mRNA表达量也增加至1.35倍。
本发明并不限定于上述实施方式或实施例，在不脱离申请专利范围中所记载的发明的主旨的范围内进行各种设计变更而成的形态也包括在技术范围中。
产业上之可利用性
本发明的新型异黄酮化合物可用作皮肤屏障功能改善剂、水通道蛋白3产生促进剂、丝聚蛋白2产生促进剂、抗炎剂、皮肤外用剂和化妆品，可广泛地利用于医疗和美容的领域。
序列表自由文本
序列编号1：目标基因：水通道蛋白3的QPCR用正向引物
序列编号2：目标基因：水通道蛋白3的QPCR用反向引物
序列编号3：目标基因：丝聚蛋白2的QPCR用正向引物
序列编号4：目标基因：丝聚蛋白2的QPCR用反向引物
SEQUENCE LISTING
<110> 拿波佳尔股份有限公司
<120> 新型异黄酮化合物
<130> PCT22-003
<150> JP 2021-093328
<151> 2021-06-03
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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ccctagaagg gctaatgtgt ga 22

Claims (11)

1.一种由下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
2.一种皮肤屏障功能改善剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
3.一种水通道蛋白3产生促进剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
4.一种丝聚蛋白2产生促进剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
5.一种抗炎剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
6.根据权利要求2至5中任一项所述的剂，其中，所述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物的浓度为0.001mM～1mM。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的剂，其为皮肤外用剂。
8.根据权利要求2至5中任一项所述的剂，其为化妆品。
9.一种皮肤屏障功能改善用饮食品组合物，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
10.一种抗炎症用饮食品组合物，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂化物：
11.一种化合物的制造方法，其特征在于具有以下工序：
获得长角豆的荚果的含水醇萃取物的工序；
依次用石油醚、乙酸乙酯对所述含水醇萃取物进行液液萃取，并回收乙酸乙酯级分的工序；以及
从所述乙酸乙酯级分分离式(I)所表示的化合物的工序，
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