KR20110083480A

KR20110083480A - 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제

Info

Publication number: KR20110083480A
Application number: KR1020100120553A
Authority: KR
Inventors: 하야미 타베; 아키히토 후지타; 마유미 코타니
Original assignee: 가부시키가이샤 블룸 클래식
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2011-07-20
Also published as: CN102125585A; JP2011144113A; JP5025030B2

Abstract

안전성이 높은 천연 추출물을 유효 성분으로 하는 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제를 제공한다.
본 발명의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제에, 키위의 적과 과실로부터의 추출물을 함유시킨다.

Description

활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제{Superoxide dismutase, radical scavenger, and cell disorder inhibitor by oxidation}

본 발명은, 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제에 관한 것이다.

근년, 특히 생체 성분을 산화시키는 요인으로서 활성 산소가 주목받고 있고, 그 생체에 대한 악영향이 문제가 되고 있다. 활성 산소는 생체 세포 내의 에너지 대사 과정에서 생기는 것으로, 활성 산소로서는, 슈퍼옥사이드(즉, 산소 분자의 일 전자 환원으로 생기는 슈퍼옥시드 애니온: ·O₂ ^-), 과산화수소(H₂O₂), 하이드록시 라디칼(·OH) 및 일중항 산소(¹O₂) 등을 들 수 있다. 이들 활성 산소는, 식세포의 살균 기구에 있어 필수적이며, 바이러스나 암 세포의 제거에 중요한 기능을 하고 있다.

그러나, 활성 산소의 과잉 생성은 생체 내의 막이나 조직을 구성하는 생체 내 분자를 공격하여 각종 질환을 유발한다. 통상, 생체 내에서 생산되어 다른 활성 산소의 출발 물질이 되는 슈퍼옥사이드는, 세포 내에 포함되어 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 촉매 작용에 의해 순차 소거되지만, 슈퍼옥사이드의 산생(産生)이 과잉인 경우, 또는 SOD의 작용이 저하되는 경우에는, 슈퍼옥사이드의 소거가 불충분하게 되어, 슈퍼옥사이드 농도가 높아지고, 이것이 관절 류머티즘이나 베이체트병 등의 조직 장애, 심근경색, 뇌졸중, 백내장, 주름, 당뇨병, 동맥경화, 어깨 결림, 냉증 등을 일으킨다.

특히, 피부는 자외선 등의 환경 인자의 자극을 직접 받으므로, 슈퍼옥사이드가 생성되기 쉬운 기관이기 때문에, 슈퍼옥사이드 농도의 상승에 의해, 예를 들면, 콜라겐 등의 생체 조직을 분해하여, 변성 또는 가교(架橋)하거나 유지류를 산화하여 세포에 장애를 주는 과산화지질을 생성한다고 생각되고, 활성 산소에 의해 발생되는 장애가 피부의 주름 형성이나 피부의 탄력 저하 등의 노화의 원인이 되는 것이라고 생각된다. 따라서, 활성 산소나 생체 내 라디칼의 생성을 저해·억제함에 따라, 주름 형성이나 탄력 저하 등의 피부의 노화나, 관절 류머티즘이나 베이체트병 등의 조직 장애, 심근경색, 뇌졸중, 백내장, 당뇨병, 동맥경화, 어깨 결림, 냉증 등의 활성 산소가 관여하는 각종 장애를 예방, 치료 또는 개선할 수 있다고 생각된다.

또한, 활성 산소는, 염증, 과산화지질의 생성, 여러 가지 효소의 실활(失活) 및 DNA의 손상 등을 일으키는 것이 알려져 있고, 이들 산화적 세포 장애는, 피부의 거칠어짐, 주름 형성, 피부의 탄력성 저하 등의 피부 노화의 원인의 하나로 생각된다.

따라서, 활성 산소 소거 물질, 라디칼 소거 물질 등을 안전성의 점에서 유리한 천연물로부터 얻는 시도가 이루어지고 있고, 이와 같은 작용을 가지는 것으로서 유채과 브라시카(Brassica)속 식물로부터의 추출물(특허문헌 1 참조) 등이 알려져 있다. 또한, 활성 산소에 기인하여 생기는 산화적 세포 장애를 억제할 수 있는 것으로서, 니겔라 사티바, 호황련, 워터 히솝으로부터의 추출물(특허문헌 2 참조) 등이 알려져 있다.

일본국 특개 2003-81848호 공보 일본국 특개 2009-227598호 공보

본 발명은, 안전성이 높은 천연 추출물로부터 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용 및 산화적 세포 장애 억제 작용을 가지는 것을 찾아내고, 그것을 유효 성분으로 하는 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 「키위의 적과 과실」이란, 키위 과실의 재배 과정에서, 재배되는 키위 과실의 당도 및 크기를 소망의 범위로 증대시키는 것을 목적으로 하여 솎아내어지는(가지치기되는) 과실을 의미하고, 구체적으로는, 당도가 3.0∼7.0%, 바람직하게는 4.0∼5.5%이며, 또한 크기(긴 직경)가 1∼4 cm, 바람직하게는 2∼3 cm인 키위의 과실을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서 「산화적 세포 장애」란, 활성 산소에 기인하여 생기는 세포 장애, 특히 염증, 과산화지질의 생성, 여러 가지의 효소의 실활, DNA 손상 등의 산화 장애를 의미하고, 피부 조직 장애 등의 조직 장애도 포함된다. 또한, 활성 산소에 의해 장애가 생기는 세포로서는, 활성 산소에 의해 장애가 생기는 생체 세포라면 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 천연물인 키위의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유하고, 안전성이 높은 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제를 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 및 산화적 세포 장애 억제제는, 활성 산소종에 기인하는 세포 장애 등을 포함하는 각종 장애의 예방·개선에 크게 공헌할 수 있다.

이하, 본 발명의 일 실시형태에 대하여 설명한다.

본 실시형태의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제는, 키위(학명 : Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유한다.

여기서, 본 실시형태에 있어서 「추출물」에는, 키위(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))의 적과 과실을 추출 원료로 하여 얻어지는 추출액, 이 추출액의 희석액 혹은 농축액, 이 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물 혹은 정제물의 모두가 포함된다.

키위(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))는, 다래과 다래속에 속하는 낙엽덩굴성 저목으로서, 그 과실은 일본 각지에서 재배되고 있으며, 이들 지역으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 추출 원료로서 사용하는 키위의 구성 부위는 적과 과실이다. 또한, 본 발명에서 추출 원료로서 사용할 수 있는 키위(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))의 재배 품종으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 레인보우 레드, 애플 키위, 홍심(紅心), 골든킹, 제스프리 골드, 고바야시 39, 뷰어 컨트리, 퍼스트 엠페러, 티어드롭, 홍선(紅鮮), 그레이프 키위, 사누키 골드, 풍밀(豊密) 등을 적합하게 이용할 수 있다.

추출 원료로서 사용하는 키위의 적과 과실은 그 당도가 3.0∼7.0%이고, 또한 크기(긴 직경)가 1∼4 cm의 것으로, 바람직하게는 당도가 4.0∼5.5%이고, 또한 크기(긴 직경)가 2∼3 cm의 것이다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물은 조쇄기(粗碎機)를 이용하여 추출 원료를 분쇄하고, 추출 용매에 의한 추출에 제공함으로써 얻을 수 있다.

추출 용매로서는, 극성 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 물, 친수성 유기용매 등을 들 수 있고, 이것들을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여, 실온 또는 용매의 끓는 점 이하의 온도에서 사용하는 것이 바람직하다.

추출 용매로서 사용할 수 있는 물로서는, 순수(純水), 수돗물, 우물물, 광천수, 광수, 온천수, 용수, 담수, 산성·알칼리성 이온수, 해양 심층수 등 외에, 이것들에 각종 처리를 실시한 것이 포함된다. 물에 실시하는 처리로서는, 예를 들면, 정제, 가열, 살균, 여과, 이온 교환, 침투압 조정, 완충화 등이 포함된다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출 용매로서 사용할 수 있는 물에는, 정제수, 열수, 이온 교환수, 생리 식염수, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수 등도 포함된다.

추출 용매로서 사용할 수 있는 친수성 유기용매로서는, 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등의 탄소수 1∼5의 저급 지방족 알코올 ; 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 저급 지방족케톤 ; 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 탄소수 2∼5의 다가 알코올 등을 들 수 있다.

2종 이상의 극성 용매의 혼합액을 추출 용매로서 사용하는 경우, 그 혼합비는 적절히 조정할 수 있다. 예를 들면, 물과 저급 지방족 알코올과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 1 용량부에 대하여 저급 지방족 알코올 1∼100 용량부를 혼합하는 것이 바람직하고, 물과 저급 지방족 케톤과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 1 용량부에 대하여 저급 지방족 케톤 1∼100 용량부를 혼합하는 것이 바람직하고, 물과 다가 알코올과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 1 용량부에 대하여 다가 알코올 1∼100 용량부를 혼합하는 것이 바람직하다.

추출 처리는, 추출 원료에 포함되는 가용성 성분을 추출 용매에 용출시킬 수 있다면 특별히 한정되지 않고, 상법(常法)에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 추출 원료의 5∼15 배량(질량비)의 추출 용매에, 추출 원료를 침지하여, 상온 또는 환류 가열하에서 가용성 성분을 추출시킨 후, 여과하여 추출 잔사를 제거함으로써 추출액을 얻을 수 있다. 얻어진 추출액은 이 추출액의 희석액 혹은 농축액, 이 추출액의 건조물, 또는 이들의 조정제물 혹은 정제물을 얻기 위해, 상법에 따라 희석, 농축, 건조, 정제 등의 처리를 실시해도 좋다.

정제는, 예를 들면, 활성탄 처리, 흡착 수지 처리, 이온 교환 수지 처리 등에 의해 행할 수 있다. 얻어진 추출액은 그대로도 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제의 유효 성분으로서 사용할 수 있지만, 농축액 또는 건조물로 한 것이 사용하기 쉽다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물은, 특유의 냄새를 가지고 있기 때문에, 그 생리 활성의 저하를 초래하지 않는 범위에서 탈색, 탈취 등을 목적으로 하는 정제를 행하는 것도 가능하지만, 피부 화장 안료 등에 배합하는 경우에는 대량으로 사용하는 것은 아니기 때문에, 미정제인 채로도 실용상 지장은 없다.

상기와 같이 하여 얻어지는 키위의 적과 과실로부터의 추출물은, 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용 또는 산화적 세포 장애 억제 작용을 가지고 있기 때문에, 각각의 작용을 이용하여 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제의 유효 성분으로서 이용할 수 있다.

또한, 후술하는 실시예로부터 확실히 알 수 있는 바와 같이, 키위의 적과 과실로부터의 추출물은 표피 각화 세포 증식 촉진 작용, 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용 또는 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용을 가지고 있기 때문에, 각각의 작용을 이용하여 항노화제, 표피 각화 세포 증식 촉진제, 프로피라그린 mRNA 발현 촉진제 또는 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제제의 유효 성분으로서 이용할 수도 있다.

상기 각 약제는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 키위의 적과 과실로부터의 추출물을 제제화한 것이어도 좋다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물은, 덱스트린, 시클로 덱스트린 등의 약학적으로 허용할 수 있는 캐리어, 기타 임의의 조제를 이용하여, 상법에 따라, 분말상, 과립상, 정제상, 액상 등의 임의의 제형으로 제제화할 수 있다. 이 때, 조제로서는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 교취제 등을 이용할 수 있다. 또, 키위의 적과 과실로부터의 추출물은 다른 조성물(예를 들면, 피부 화장 안료 등)에 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 실시형태의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제는, 필요에 따라, 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용 또는 산화적 세포 장애 억제 작용을 가지는 다른 천연 추출물 등을 배합하여 유효 성분으로서 이용할 수 있다.

본 실시형태의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제의 투여 방법으로서는, 일반적으로 경피 투여 등을 들 수 있지만, 질환의 종류에 따라, 그 예방·치료 등에 적합한 방법(예를 들면, 경구 투여, 경점막 투여 등)을 적절히 선택하면 좋다.

또한, 본 실시형태의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제의 투여량도, 질환의 종류, 중증도, 환자의 개인차, 투여 방법, 투여 기간 등에 따라 적절히 증감하면 좋다.

본 실시형태의 활성 산소 소거제는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물이 가지는 활성 산소 소거 작용을 통하여, 주름 형성이나 탄력 저하 등의 피부의 노화나, 관절 류머티즘이나 베이체트병 등의 조직 장애, 심근경색, 뇌졸중, 백내장, 당뇨병, 동맥경화, 어깨 결림, 냉증 등의 활성 산소가 관여하는 각종 장애를 예방·개선할 수 있다. 단, 본 실시형태의 활성 산소 소거제는 이러한 용도 이외에도 활성 산소 소거 작용을 발휘하는 것에 의의가 있는 모든 용도에 이용할 수 있다.

본 실시형태의 라디칼 소거제는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물이 가지는 라디칼 소거 작용을 통하여, 주름 형성이나 탄력 저하 등의 피부의 노화나, 관절 류머티즘이나 베이체트병 등의 조직 장애, 심근경색, 뇌졸중, 백내장, 당뇨병, 동맥경화, 어깨 결림, 냉증 등의 활성 산소(라디칼)가 관여하는 각종 장애를 예방·개선할 수 있다. 단, 본 실시형태의 라디칼 소거제는, 이러한 용도 이외에도 라디칼 소거 작용을 발휘하는 것에 의의가 있는 모든 용도에 이용할 수 있다.

본 실시형태의 산화적 세포 장애 억제제는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물이 가지는 산화적 세포 장애 억제 작용을 통하여, 활성 산소에 기인하여 발생하는 세포 장애를 억제할 수 있고, 이 결과, 피부의 거칠어짐, 주름 형성, 피부의 탄력성 저하 등의 피부의 노화 증상 등을 예방·개선할 수 있다. 단, 본 실시형태의 산화적 세포 장애 억제제는 이러한 용도 이외에도 산화적 세포 장애 억제 작용을 발휘하는 것에 의의가 있는 모든 용도에 이용할 수 있다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물은, 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용 또는 산화적 세포 장애 억제 작용을 가지고 있고, 피부에 적용한 경우의 사용감 또는 안전성이 뛰어나기 때문에, 피부 화장 안료에 배합하기에 적합하다.

이 경우에, 피부 화장 안료에는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물을 그대로 배합해도 좋고, 키위의 적과 과실로부터의 추출물로부터 제제화한 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제를 배합해도 좋다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물, 또는 이 키위의 적과 과실로부터의 추출물로부터 제제화한 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 혹은 산화적 세포 장애 억제제를 배합함으로써, 피부 화장 안료에 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용 또는 산화적 세포 장애 억제 작용을 부여할 수 있다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물 등을 배합할 수 있는 피부 화장 안료의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 연고, 크림, 유액, 로션, 팩, 파운데이션 등을 들 수 있다.

키위의 적과 과실로부터의 추출물 등을 피부 화장 안료에 배합하는 경우, 그 배합량은, 피부 화장 안료의 종류에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 적합한 배합율은, 0.0005∼0.45 질량%(고형분 환산)이며, 더욱 적합한 배합율은, 0.005∼0.05 질량%(고형분 환산)이다. 또한, 후술하는 실시예에서 확실히 알 수 있는 바와 같이, 키위의 적과 과실로부터의 추출물은, 키위의 완숙 과실로부터의 추출물과 비교하여, 보다 저농도에서 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용, 산화적 세포 장애 억제 작용, 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용, 표피 각화 세포 증식 촉진 작용, 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용을 얻을 수 있으므로, 키위의 적과 과실로부터의 추출물의 피부 화장 안료에 있어서의 배합율을 0.0005∼0.001 질량%(고형분 환산)로 저농도로 했다고 하더라도, 피부 화장 안료에 소망하는 작용을 부여할 수 있다.

상기 피부 화장 안료는, 키위의 적과 과실로부터의 추출물이 가지는 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용, 산화적 세포 장애 억제 작용, 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용, 표피 각화 세포 증식 촉진 작용 또는 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용을 방해하지 않는 한, 통상의 피부 화장 안료의 제조에 이용되는 주제, 조제 또는 그 외의 성분, 예를 들면, 수렴제, 살균·항균제, 자외선 흡수제, 보습제, 세포 활력제, 소염·항알레르기제, 항산화·활성 산소 제거제, 유지류, 왁스류(蠟類), 탄화수소류, 지방산류, 알코올류, 에스테르류, 계면활성제, 향료 등을 병용할 수 있다. 이와 같이 병용함으로써, 보다 일반성이 있는 제품이 되고, 또한, 병용된 상기 성분들 사이의 상승 작용이 통상 기대되는 이상의 뛰어난 사용 효과를 가져오는 경우가 있다.

상기 피부 화장 안료는, 높은 안전성을 가지고 있고, 또한, 활성 산소 소거 작용, 라디칼 소거 작용, 산화적 세포 장애 억제 작용, 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용, 표피 각화 세포 증식 촉진 작용 및 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 작용을 통하여, 주름 형성이나 탄력 저하 등의 피부의 노화나, 관절 류머티즘이나 베이체트병 등의 조직 장애, 심근경색, 뇌졸중, 백내장, 당뇨병, 동맥경화, 어깨 결림, 냉증 등의 활성 산소가 관여하는 각종 장애, 건조 피부, 피부의 거칠어짐 등을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

또한, 본 실시형태의 활성 산소 소거제, 라디칼 소거제 또는 산화적 세포 장애 억제제는, 사람에 대하여 적합하게 적용되는 것이지만, 각각의 작용 효과가 얻어진다면, 사람 이외의 동물에 대해 적용할 수도 있다.

[실시예]

이하, 실시예 및 비교예를 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기의 각 예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 키위 적과 과실 추출물의 제조

키위(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae), 레인보우 레드종)의 적과 과실(당도: 4.3%, 긴 직경: 2 cm)의 분쇄물 200 g에 추출 용매(정제수) 400 mL를 첨가하고, 30℃에서 1시간 가온 추출하여, 열시 여과했다. 잔사에 대하여 또한 마찬가지의 추출 처리를 했다. 얻어진 추출액을 합하여 감압하에서 농축하고, 더 건조하여 키위 적과 과실 추출물 5.5 g을 얻었다.

[비교예 1] 키위 과실 추출물의 제조

키위(Actinidia chinensis Planch.(Actinidlaceae), 레인보우 레드종)의 완숙 과실(당도: 13.4%, 장경: 5 ㎝)의 분쇄물 200 g을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여, 키위 과실 추출물 18.5 g을 얻었다.

[시험예 1] 슈퍼옥사이드 소거 작용 시험(NBT법)

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 슈퍼옥사이드 소거 작용을 시험했다.

시험관에, 0.05 M의 NaHCO₃ 완충액(pH 10.2)을 2.4 mL, 및 3 mM의 크산틴, 3 mM의 EDTA, 50 μg/mL의 소 혈청 알부민 용액 및 0.75 mM의 NBT(nitroblue tetrazolium)를 0.1 mL씩 더하고, 이것에 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 1을 참조) 0.1 mL를 첨가하고, 25℃에서 10분간 방치했다. 방치 후, 효소 용액으로서의 크산틴 옥시다제 0.1 mL를 더하여 재빨리 교반하고, 25℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 6 mM의 염화구리 0.1 mL를 더하여 반응을 정지시키고, 파장 560 nm에서의 흡광도를 측정했다.

효소 용액을 첨가하지 않는 경우에 대해서도, 마찬가지의 조작과 흡광도의 측정을 행하고, 또한 시료 용액을 첨가하지 않고 증류수를 첨가한 경우에 대해서도 같은 측정을 행하였다. 얻어진 결과로부터, 하기식에 의해 슈퍼옥사이드 소거율(%)을 산출했다.

슈퍼옥사이드 소거율(%) = {1-(A-B)/(C-D)}×100

식중, A는 「효소 용액 첨가·시료 용액 첨가시의 흡광도」를 나타내고, B는 「효소 용액 무첨가·시료 용액 첨가시의 흡광도」를 나타내고, C는 「효소 용액 첨가·시료 용액 무첨가시의 흡광도」를 나타내고, D는 「효소 용액 무첨가·시료 용액 무첨가시의 흡광도」를 나타낸다.

결과를 표 1에 나타낸다.

	시료 농도(μg/mL)	슈퍼옥사이드 소거율(%)
실시예 1	6.25	12.5
	25	34.7
	100	75.6
비교예1	6.25	3.3
	25	4.6
	100	11.3

표 1에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 특히 고농도(100 μg/mL)에서 매우 뛰어난 슈퍼옥사이드 소거 작용(활성 산소 소거 작용)을 가지는 것이 확인되었다. 한편, 키위 과실 추출물(비교예 1)은, 슈퍼옥사이드 소거 작용을 거의 나타내지 않았다. 또한, 키위 적과 과실 추출물의 슈퍼옥사이드 소거 작용의 강점은, 추출물(시료) 농도에 의존하여 향상되기 때문에, 슈퍼옥사이드 소거 작용의 정도는 키위 적과 과실 추출물의 농도에 따라 조절할 수 있다는 것이 확인되었다.

[시험예 2] 라디칼 소거 작용 시험

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 라디칼 소거 작용을 시험했다.

1.5×10^-4 M의 DPPH(diphenyl-p-picrylhydrazyl) 에탄올 용액 3 mL에 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 2를 참조) 3 mL를 첨가하여 마개를 닫은 후, 흔들어 섞어 30분간 방치했다. 방치 후, 파장 520 nm에서의 흡광도를 측정했다. 컨트롤로서 시료 용액 대신에 시료를 용해한 용매만을 이용하여 마찬가지 조작을 하여, 파장 520 nm의 흡광도를 측정했다. 또한, 블랭크로서 에탄올에 시료 용액 3 mL를 첨가한 후, 바로 파장 520 nm의 흡광도를 측정했다. 얻어진 결과로부터, 하기식에 의해 라디칼 소거율(%)을 산출했다.

라디칼 소거율(%) = {1-(B-C)/A}×100

식중, A는 「컨트롤의 흡광도」를 나타내고, B는 「시료 용액 첨가시의 흡광도」를 나타내고, C는 「블랭크의 흡광도」를 나타낸다.

결과를 표 2에 나타낸다.

	시료 농도(μg/mL)	라디칼 소거율(%)
실시예 1	12.5	6.8
	50	22.1
	200	66.4
비교예1	12.5	0.2
	50	1.2
	200	3.8

표 2에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 특히 고농도(200 μg/mL)에서 뛰어난 라디칼 소거 작용을 가지는 것이 확인되었다. 한편, 키위 과실 추출물(비교예 1)은 라디칼 소거 작용을 나타내지 않았다. 또한, 키위 적과 과실 추출물의 라디칼 소거 작용의 강점은, 추출물(시료) 농도에 의존하여 향상되기 때문에, 라디칼 소거 작용의 정도는 키위 적과 과실 추출물의 농도에 따라 조절할 수 있다고 생각된다.

[시험예 3] 산화적 세포 장애 억제 작용 시험

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 산화적 세포 장애 억제 작용을 시험했다.

40세의 건강한 정상인 남성 피부 유래 섬유아세포(NBKN, 연구 동의를 얻어 수립한 것, 계대수 : 13 이하)를, 10% FBS(Fetal Bovine Serum, JRH bioscience사제)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified minimum essential medium, Gibco사제)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ -95% air의 조건하에서 배양했다.

플라스미드 pGL2를 멸균수(滅菌水)에서 31 μg/mL로 희석하여, 60 mm 디쉬로 옮긴 후, 로즈벤갈(칸토화학사제, 100 μg/mL)을 첨가하여, 가시광선(크세논 램프, 우시오 전기사제, 370∼760 nm, 30 cm)을 10분간 조사했다.

24 월 플레이트에 세포(2×10⁴ cells/월)를 파종하여, 18시간 배양했다. 로즈벤갈 첨가 또는 비첨가의 플라스미드(0.2 μg DNA/월)에 유전자 도입제(Qiagen사제)를 첨가하여, 37℃에서 24시간 도입시켰다. 배지 교환 후, 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 3을 참조)을 첨가하고, 24시간 더 배양했다.

세포를 PBS(-)(인산 완충 식염수)로 세정한 후, 멸균수로 5배 희석한 세포 용해제(동양비넷사제, 픽커진, 25 mM Tris(7.5), 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100)를 50 μL/월 첨가했다. 그 후, -80℃에서 30분 보존하고, 실온에서 15분간 방치하여 세포를 융해시켰다.

플레이트 교반(실온, 15분)한 후, 스크레버로 세포 용해액을 1.5 mL 원심용 튜브에 회수하여, 원심(15,000 rpm, 2분)했다. 상청 20 μL 및 발광 기질(동양비넷사제, 픽커진, 20 mM Tricine/1.07 mM(MgCO₃) 4Mg(OH)₂·5H₂O/2.67 mM MgSO₄/0.1 mM EDTA/33.3 mM DTT/270 μM Coenzyme A/470 μM luciferin/530 μM ATP) 100 μL를 첨가하여, 실온에서 혼합한 후, 루미노미터(GENELIGHT55, 마이크로테크·니치온사제)에 세트하여, 560 nm에서 측정했다.

산화적 세포 장애 억제율(%)은, 로즈벤갈 비첨가에 대한 로즈벤갈 첨가 후의 DNA 수복에 의한 루시페라제 활성량을 산출하여 구했다.

결과를 표 3에 나타낸다.

	시료 농도(질량%)	산화적 세포 장애 회복율(%)
실시예 1	0.1	80.0
실시예 1	0.2	130.0
비교예1	0.1	65.0
비교예1	0.2	75.0

표 3에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 키위 과실 추출물(비교예 1)에 비해, 뛰어난 산화적 세포 장애 억제 작용을 가지는 것이 확인되었다.

[시험예 4] 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용 시험

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용을 시험했다.

40세의 건강한 정상인 남성 피부 유래 섬유아세포(NBKN, 연구 동의를 얻어 수립한 것, 계대수 : 13 이하)를, 10% FBS(Fetal Bovine Serum, JRH bioscience사제)를 포함하는 DMEM(Dulbacco's modified minimum essential medium, Gibco사제)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ -95% air의 조건하에서 배양했다.

플라스미드 pGL2를 멸균수로 31 μg/mL로 희석하여, 60 mm 디쉬로 옮긴 후, 빙상에서 자외선을 1500 J/m² 조사했다.

24 월 플레이트에 세포(2×10⁴ cells/월)를 파종하고, 18시간 배양했다. 자외선 조사 또는 미조사의 플라스미드(0.2 μgDNA/월)에 유전자 도입제(Qiagen사제)를 첨가하여, 37℃에서 24시간 도입시켰다. 배지 교환 후, 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 4를 참조)을 첨가하고, 24시간 더 배양했다.

플레이트 교반(실온, 15분)한 후, 스크레버로 세포 용해액을 1.5 mL 원심용 튜브에 회수하여, 원심(15,000 rpm, 2분)했다. 상청 20 μL 및 발광 기질(동양비넷사제, 픽커진, 20 mM Tricine/1.07 mM(MgCO₃) 4Mg(OH)₂·5H₂O/2.67 mM MgSO₄/0.1 mM EDTA/33.3 mM DTT/270 μM Coenzyme A/470 μM luciferin/530 μM ATP) 100 μL를 첨가하고, 실온에서 혼합한 후, 루미노미터(GENBLIGHT55, 마이크로테크·니치온사제)에 세트하여, 560 nm에서 측정했다.

자외선 조사에 의한 세포 장애 억제율(%)은, 자외선 미조사에 대한 자외선 조사 후의 DNA 수복에 의한 루시페라제 활성량을 산출하여 구했다.

결과를 표 4에 나타낸다.

	시료 농도(질량%)	자외선 조사에 의한 세포 장애 회복율(%)
실시예 1	0.2	205.0
실시예 1	1	114.0
비교예1	0.2	47.0
비교예1	1	45.0

표 4에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 키위 과실 추출물(비교예 1)에 비해, 뛰어난 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용을 가지는 것이 확인되었다.

[시험예 5] 표피 각화 세포 증식 촉진 작용 시험

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 표피 각화 세포 증식 촉진 작용을 시험했다.

정상인 신생아 포피 표피 각화 세포(normal human epidermal keratinocyte, NHEK)를, 정상인 표피 각화 세포 장기 배양용 증식 배지(EPiLife-KG2)를 이용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.5×10⁴ cells/mL의 세포 밀도가 되도록 EPiLife-KG2로 희석한 후, 콜라겐 코트한 96 월 플레이트에 1 월당 100 μL씩 파종하여, 하룻밤 배양했다. 배양 종료후, EPiLife-KG2에 용해한 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 5를 참조)을 각 월에 100 μL씩 첨가하여, 3일간 배양했다.

표피 각화 세포 증식 촉진 작용은, MTT assay법을 이용하여 측정했다. 배양 종료 후, 배지를 빼고, 종농도 0.4 mg/mL로 PBS(-)에 용해한 MTT를 각 월에 100 μL씩 첨가했다. 2시간 배양한 후, 세포 내에 생성한 블루 포르마잔을 2-프로판올 100 μL로 추출했다. 추출 후, 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정했다. 동시에 탁도로서 파장 650 nm에서의 흡광도를 측정하여, 양자의 차이를 가지고 블루 포르마잔 생성량으로 했다. 측정된 각 흡광도로부터, 하기식에 의해 표피 각화 세포 증식 촉진율(%)을 산출했다.

표피 각화 세포 증식 촉진율(%) = St/Ct×100

식중, St는 「시료 용액 첨가시의 흡광도」를 나타내고, Ct는 「시료 용액 무첨가시의 흡광도」를 나타낸다.

결과를 표 5에 나타낸다.

	시료 농도(질량%)	표피 각화 세포 증식 촉진율(%)
실시예 1	3.125	119.9
실시예 1	12.5	129.8
비교예1	3.125	103.3
비교예1	12.5	118.7

표 5에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 키위 과실 추출물(비교예 1)에 비해, 뛰어난 표피 각화 세포 증식 촉진 작용을 가지는 것이 확인되었다.

[시험예 6] 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용 시험

실시예 1의 키위 적과 과실 추출물 및 비교예 1의 키위 과실 추출물에 대하여, 이하와 같이 하여 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용을 시험했다.

정상인 신생아 포피 표피 각화 세포(normal human epidermal keratinocyte, NHEK)를 80 cm² 플라스크에서 정상인 표피 각화 세포 장기 배양용 증식 배지(EPiLife-KG2)에서, 37℃, 5% CO₂-95% air의 조건하에서 전(前)배양하고, 트립신 처리에 의해 세포를 모았다.

EPiLife-KG2를 이용하여 35 mm 샬레(FALCON)에 40×10⁴ cells/2 mL/샬레씩 뿌리고, 37℃, 5% CO₂-95% air의 조건하에서 하룻밤 배양했다. 24시간 후에 배양액을 버리고, EPiLife-KG2로 필요 농도로 용해한 시료 용액(실시예 1 및 비교예 1, 시료 농도는 하기 표 6을 참조)을 각 샬레에 2 mL씩 첨가하여, 37℃, 5% CO₂-95% air의 조건하에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 버리고 ISOGEN(NIPPON GENE사제, Cat. no. 311-02501)으로 총RNA를 추출하고, 각각의 RNA량을 분광 광도계로 측정하여, 200 ng/μL가 되도록 총RNA를 조제했다.

이 총RNA를 주형으로 하여, 프로피라그린 및 내부 표준인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA의 발현량을 측정했다. 검출은 리얼타임 PCR 장치 Smart Cycler(Cepheid사)를 이용하여, TakaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time, code No. RRO63A)에 의한 리얼타임 2 Step RT-PCR 반응에 의해 행하였다. 프로피라그린의 mRNA의 발현량은 시료 무첨가 및 시료 첨가의 각각에서 배양한 세포로부터 조제한 총RNA 표품을 기초로 하여, GAPDH의 값으로 보정값을 구하고, 또한 시료 무첨가의 보정값을 100으로 했을 때의 시료 첨가의 보정값을 산출했다. 얻어진 결과로부터, 하기식에 의해 프로피라그린 mRNA 발현 상승 촉진율(%)을 산출했다.

프로피라그린 mRNA 발현 상승 촉진율(%)=A/B×100

식 중 A는 「시료 첨가시의 보정값」을 나타내고, B는 「시료 무첨가시의 보정값」을 나타낸다.

결과를 표 6에 나타낸다.

	시료 농도(질량%)	프로피라그린 mRNA 발현 촉진율(%)
실시예 1	12.5	341.3
실시예 1	50	196.0
비교예1	12.5	179.3
비교예1	50	209.9

표 6에 나타낸 바와 같이, 키위 적과 과실 추출물(실시예 1)은, 키위 과실 추출물(비교예 1)에 비하여, 저농도(12.5 μg/mL)에서 매우 뛰어난 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용을 가지는 것이 확인되었다. 즉, 키위 적과 과실 추출물은 저농도(12.5 μg/mL)에서 피부의 보습 기능의 향상에 관여하는 피라그린의 전구체인 프로피라그린의 유전자 발현을 촉진시키는 것이 판명되었다.

상술한 시험예 1∼6으로부터 확실히 알 수 있는 바와 같이, 키위의 적과 과실로부터의 추출물에는, 키위의 완숙 과실로부터의 추출물이 가지지 않는 작용(슈퍼옥사이드 소거 작용(활성 산소 소거 작용), 라디칼 소거 작용)을 가지고, 또는 그것이 가지는 작용(산화적 세포 장애 억제 작용, 자외선 조사에 의한 세포 장애 억제 작용, 표피 각화 세포 증식 촉진 작용, 프로피라그린 mRNA 발현 촉진 작용)에 있어서도, 현저하게 뛰어난 작용을 가지는 것이 판명되었다.

Claims

키위의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 활성 산소 소거제.
키위의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 라디칼 소거제
키위의 적과 과실로부터의 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 산화적 세포 장애 억제제.