CN102125585A - 活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种以安全性高的天然提取物为有效成分的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂。在本发明所说明的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂中，获取猕猴桃采摘果实的提取物。

Description

活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂
技术领域
本发明涉及一种活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂。
背景技术
近年来，活性氧，尤其作为使生物体氧化的因素而为人们所知，但是，对生物体的不良影响正成为一个问题。活性氧在生物体细胞内能量代谢过程中产生，可以分为：过氧化物(即：氧分子的电子还原中产生的过氧化物阴离子：·O2-)、双氧水(H2O2)、乙烯基自由基(·OH)以及纯态氧(1O2)等。这些活性氧是吞噬细胞的杀菌机构所必须的，在驱除细菌、癌细胞过程中发挥重要作用。
但是，活性氧的过量生成攻击构成生物体内膜和组织的生物体内分子，诱发各种疾病。由于细胞内所含过氧化物歧化酶(SOD)的催化作用，通常，在生物体内产生并成为其他活性氧促发物质的过氧化物逐渐被清除。当过氧化物的产生过剩或者SOD的作用降低时，则过氧化物的清除不充分，过氧化物的浓度增高，将引起类风湿性关节炎等组织障碍、心肌梗塞、脑中风、白内障、皱纹、糖尿病、动脉硬化、肩膀酸痛、冷敏感等。
尤其是因皮肤直接接受紫外线等环境因素的刺激，过氧化物容易影响器官，所以，通过过氧化物浓度的上升，例如：分解胶原蛋白等生物体组织、变形、架桥，生成能氧化各种油脂、障碍细胞的过氧脂质，由活性氧引起的障碍成为皮肤皱纹、皮肤弹性降低等老化的原因；所以，通过抑制活性氧、生物体内自由基的生成，可以预防、治疗或改善皱纹形成、弹性降低等皮肤老化、类风湿性关节炎、贝切特氏病等组织伤害、心肌梗塞、脑中风、白内障、糖尿病、动脉硬化、肩膀酸痛、冷敏感等由活性氧参与的各种障碍。
活性氧能引起炎症、过氧脂质的生成、各种酶失去活性、DNA受损等。这些氧化的细胞障碍被认为是皮肤粗糙、皱纹形成、皮肤弹性降低等皮肤老化的一个原因。
所以，基于安全考虑，试图将活性氧清除物质、自由基清除物质等从合适的天然物中获取，具有该作用的物质有：十字花科芸苔属植物的提取物(参照专利文献1)等。另外，作为抑制因活性氧而产生的氧化的细胞障碍，西洋黑种草、胡黄连、水牛膝草的提取物(参照专利文献2)正为人们所知。
发明内容
本发明的目的：以来自安全性高的天然提取物并具有活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用的物质为中心，提供以该物质为有效成分的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂。
为达成以上目的，关于本发明的活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化的细胞障碍抑制剂，其特征为以猕猴桃采摘果实的提取物为有效成分。
在本发明中，“猕猴桃采摘果实”是指：在猕猴桃栽培过程中，为了将猕猴桃采摘果实的含糖量和大小提高到希望的范围而隔开距离(修剪)的果实，果实的具体情况是：含糖量为3.0-7.0％，最佳为4.0-5.5％；大小(长半径)为1-4cm，最佳为2-3cm。
在本发明中，“氧化的细胞障碍”是指：因活性氧而产生的细胞障碍，尤其是炎症、过氧脂质的生成、各种酶失去活性、DNA损伤等氧化障碍，也包括皮肤组织障碍等组织障碍。另外，作为因活性氧而产生障碍的细胞仅限于因活性氧而产生障碍的生物体细胞，但不属于被特别限定的物质。
【发明的效果】
根据本发明，以天然物“猕猴桃采摘果实”的提取物为有效成分，可以提供安全性很高的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂。
具体实施方式
以下对本发明的一个实施过程进行说明。
关于本实施过程的活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化的细胞障碍抑制剂，以猕猴桃(学名：Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))采摘果实的提取物为有效成分。
这里，在本实施过程中，“提取物”中含有：以猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))采摘果实为提取原料而得到的提取液、该提取液的稀释液或浓缩液、将该提取液干燥以后得到的干燥物、或者以上物质的某一种粗/精加工物或精加工物。
猕猴桃(学名：Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))是属于猕猴桃科猕猴桃属的落叶攀缘灌木，在日本各地都有栽培，其果实很容易从栽培地区获得。作为提取原料而被利用的猕猴桃的部位是采摘果实。另外，在本发明中，作为提取原料而被利用的猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae))的栽培品种没有特别的限定，但是，憬红色、苹果猕猴桃、红心、金王、小林39、Viewer Country、始皇帝、泪珠、红鲜、葡萄猕猴桃、赞岐黄金、丰蜜等是使用的最佳品种。
对于作为提取原料而被使用的猕猴桃的采摘果实，其含糖量为3.0-7.0％，大小(长半径)为1-4cm，最佳糖量为4.0-5.5％，大小(长半径)为2-3cm。
关于猕猴桃采摘果实的提取物，将提取原料用粉碎机器，通过提取的溶剂进行提取，最后得到提取物。
作为提取的溶剂，使用极性溶剂比较好，例如水、亲水性有机溶剂等，单独或混合两种以上，在常温或溶剂沸点以下使用比较好。
作为提取的溶剂而使用的水除了纯净水、自来水、井水、矿泉水、温泉水、淡水、酸性或碱性离子水、海洋深层水等以外，也包括对它们处理后的水。对水的处理包括：精制、加热、杀菌、过滤、离子交换、渗透压调整、缓冲化等。因此，在本发明中，作为提取的溶剂而使用的水，也包括精制水、热水、离子交换水、生理食盐水、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理食盐水等。
作为提取的溶剂而使用的亲水性有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等碳原子数在1-5的低级脂肪族乙醇；丙酮、丁酮等低级脂肪族酮；1，3-丁二醇、丙二醇、丙三醇等碳原子数在2-5的多价乙醇等。
将两种以上极性溶剂的混合液作为提取溶剂进行使用时，其混合比例可以适当地进行调整。例如：在使用水和低级脂肪族乙醇的混合液时，对于1体积的水，最好混合1-100体积的低级脂肪族乙醇；在使用水和低级脂肪族酮的混合液时，对于1体积的水，最好混合1-100体积的低级脂肪族酮；在使用水和多价乙醇的混合液时，对于1体积的水，最好混合1-100体积的多价乙醇。
在提取处理中，将提取的原料中所含的可溶性成分在提取溶剂中溶解，无特殊限定，可以采用常用的方法。例如：在相当于提取原料5-15倍(比重)的提取溶剂中，浸入提取原料，在常温或回流加热下，提取可溶性成分；然后，通过过滤并清除残渣而获得提取液。对于获得的提取液，为了得到该提取液的稀释液或浓缩液、该提取液的干燥物、粗/精制物或精制物，根据常用方法，进行稀释、浓缩、干燥、精制等处理。
在精制中，可以通过活性炭处理、吸附树脂处理、离子交换树脂处理等进行实施。获得的提取液可以直接作为活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂的有效成分进行使用，但是，如果作为浓缩液或干燥物，则比较容易使用。
猕猴桃采摘果实的提取物具有特有的气味，所以，在不降低其生理活性的情况下，可以实施以退色、除臭等为目的的精制，但在用于皮肤化妆品等方面时，不能大量使用。因此，即使未精制也可以使用。
如上所述，从猕猴桃采摘果实获得的提取物具有活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用，所以，可以利用其各个作用，将其作为活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂的有效成分进行使用。
另外，从下述的实施事例可以看出，猕猴桃采摘果实从获得的提取物具有表皮角化细胞增殖促进作用、丝聚蛋白原mRNA发现促进作用、紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用，因此，利用其各自的作用，可以将该提取物作为抗老化剂、表皮角化细胞增殖促进剂、丝聚蛋白原mRNA发现促进剂、紫外线照射引起的细胞障碍抑制剂的有效成分。
关于上述各种药剂的成分，可以只是猕猴桃采摘果实的提取物，也可以是猕猴桃采摘果实的提取物的制剂。
在猕猴桃采摘果实的提取物中，使用糊精、环糊精等药物学上允许的物质及其他任何助剂，根据通常的方法，可以制成粉末状、颗粒状、药丸状、液状等任意形式。此时，可以使用助剂，例如：赋形剂、结合剂、崩溃剂、润滑剂、稳定剂、除臭剂等。另外，猕猴桃采摘果实的提取物可以与其他成分(皮肤化妆品等)一起使用。
另外，对于本实施过程的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂，如果需要，可以与具有活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用的其他天然提取物等一起作为有效成分进行使用。
关于本实施过程的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂的使用方法，通常，有经皮实施等，但是，最好灵活采取符合预防、治疗等的方法(经皮实施、经黏膜实施)。
关于本实施过程的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂的使用量，也要根据疾病种类、重症程度、患者的个人差别、使用方法、使用期间等，进行合理增减。
关于本实施过程的活性氧清除剂，通过猕猴桃采摘果实的提取物所拥有的活性氧清除作用，可以预防、治疗或改善皱纹形成、弹性降低等皮肤老化、类风湿性关节炎、贝切特氏病等组织伤害、心肌梗塞、脑中风、白内障、糖尿病、动脉硬化、肩膀酸痛、冷敏感等由活性氧参与的各种障碍。然而，关于本实施过程的活性氧清除剂，也可以用于以上用途以外能发挥活性氧清除作用的所有用途。
关于本实施过程的自由基清除剂，通过猕猴桃采摘果实的提取物所拥有的自由基清除作用，可以预防或改善皱纹形成、弹性降低等皮肤老化、类风湿性关节炎、贝切特氏病等组织伤害、心肌梗塞、脑中风、白内障、糖尿病、动脉硬化、肩膀酸痛、冷敏感等由活性氧(自由基)参与的各种障碍。然而，关于本实施过程的自由基清除剂，也可以用于以上用途以外能发挥自由基清除作用的所有用途。
关于本实施过程的氧化的细胞障碍抑制剂，通过猕猴桃采摘果实的提取物所拥有的氧化的细胞障碍抑制作用，可以抑制因活性氧引起的细胞障碍，结果是可以预防或改善皮肤粗糙、皱纹形成、皮肤弹性降低等皮肤老化等。然而，关于本实施过程的细胞障碍抑制剂，也可以用于以上用途以外能发挥细胞障碍抑制作用的所有用途。
猕猴桃采摘果实的提取物具有活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用，在用于皮肤时，使用效果和安全性俱佳，所以，若配合皮肤化妆品使用，则效果更佳。
此时，对于皮肤化妆品，可以直接与猕猴桃采摘果实的提取物一起使用，也可以与猕猴桃采摘果实的提取物制成的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂一起使用。
通过同时使用猕猴桃采摘果实的提取物或者由该提取物制成的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂，能对皮肤化妆品提供活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用。
对于与猕猴桃采摘果实的提取物一起使用的皮肤化妆品，其种类不固定，例如：软膏、霜、乳液、洗剂、面膜、底妆等。
将猕猴桃采摘果实的提取物等与皮肤化妆品一起使用时，根据皮肤化妆品的种类，可以适当调整提取物的用量。但是，合适的比例为0.0005-0.45％重量(固体时)，最佳比例为0.005-0.05％重量(固体时)。另外，由下文的实施事例可以看出，与猕猴桃熟透果实的提取物相比，在更低浓度下，猕猴桃采摘果实的提取物具有活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用、紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用、表皮角化细胞增殖促进作用、丝聚蛋白原mRNA发现促进作用。所以，即使猕猴桃采摘果实的提取物与皮肤化妆品的比例很低-0.0005-0.001％重量(固体时)，也能使皮肤化妆品产生理想的作用。
上述皮肤化妆品不影响猕猴桃采摘果实的提取物所具有的活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用、紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用、表皮角化细胞增殖促进作用、丝聚蛋白原mRNA发现促进作用，可以与普通皮肤化妆品生产中使用的主要药剂、助剂或其他成分(例如：收敛剂、杀菌/抗菌剂、紫外线吸收剂、保湿剂、细胞刺激剂、消炎/抗过敏剂、抗氧化/活性氧清除剂、油脂类、油性物质、碳氢类、脂肪酸类、乙醇类、酯类、表面活性剂、香料等)同时使用。这样，通过同时使用，使其成为大众商品，以与上述成分发生增效作用，并产生极佳的使用效果。
上述皮肤化妆品具有很高的安全性，而且，在由活性氧清除作用、自由基清除作用、氧化的细胞障碍抑制作用、紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用、表皮角化细胞增殖促进作用、丝聚蛋白原mRNA发现促进作用组成的群里选择1种或2种以上的作用，可以预防、治疗或改善皱纹形成、弹性降低等皮肤老化、类风湿性关节炎、贝切特氏病等组织伤害、心肌梗塞、脑中风、白内障、糖尿病、动脉硬化、肩膀酸痛、冷敏感等由活性氧参与的各种障碍。
另外，本实施过程的活性氧清除剂、自由基清除剂、氧化的细胞障碍抑制剂可完全用于人，但是，各作用效果明显，也可以用于人以外的动物。
〔实施例〕
以下表示实施事例和比较事例，对本发明进行详细说明，本发明不受以下各例的限制。
〔实施例1〕猕猴桃采摘果实提取物的制造
在猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae)，憬红色种)采摘果实(含糖量：4.3％，长半径：2cm)的粉碎物200g中，加入提取溶剂(精制水)400mL，在30℃条件下加温、提取1小时，热过滤。关于残渣，则进行同样的提取处理。将获得的提取液混合，在减压条件下浓缩，干燥以后，得到猕猴桃采摘果实的提取物5.5g。
〔比较例〕猕猴桃果实提取物的制造
除了猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.(Actinidiaceae)，憬红色种)熟透果实(含糖量：13.4％，长半径：5cm)的粉碎物200g以外，其他内容与实施事例1相同，得到猕猴桃果实的提取物18.5g。
〔试验例1〕过氧化物清除作用试验(NBT法)
关于实施事例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较事例1的猕猴桃果实提取物，按照以下方法，对过氧化物清除作用进行试验。
在试验管内加入0.05M的NaHCO3缓冲液(pH10.2)2.4mL，再加入3mM的黄嘌呤、3nM的EDTA、50ug/mL的牛血清清蛋白溶液、0.75mM的NBT(nitroblue tetrazolium)，每次0.1mL，然后加入样品溶液(实施事例1和比较事例1，样品的浓度请参照下表1)0.1mL，在25℃条件下放置10分钟。然后，加入酶溶液“黄嘌呤氧化酶”0.1mL，立即搅拌，在25℃条件下使其反应20分钟。之后，加入6mM的氯化铜0.1mL，使反应停止，测试波长560nm时的吸光度。
在不加入酶溶液的情况下，实施同样的操作、吸光度的测试；然后，在不加入样品溶液而加入蒸馏水的情况下，实施同样的测试。根据得到的结果，由以下公式算出过氧化物清除率(％)。
过氧化物清除率(％)＝{1-(A-B)/(C-D)}×100
这里，A表示“酶溶液添加、样品溶液添加时的吸光度”，B表示“酶溶液不添加、样品溶液添加时的吸光度”，C表示“酶溶液添加、样品溶液不添加时的吸光度”，D表示“酶溶液不添加、样品溶液不添加时的吸光度”。
结果如表1所示。
【表1】
Figure BSA00000366295600081
在表1中，尤其在高浓度(100ug/mL)条件下，猕猴桃采摘果实提取物(实施事例1)具有极佳的过氧化物清除作用(活性氧清除作用)。另外，猕猴桃果实提取物(比较事例1)几乎不具有过氧化物清除作用。猕猴桃采摘果实提取物的过氧化物清除作用的强弱依赖于提取物(样品)浓度，依赖的程度正在提高，所以，过氧化物清除作用的程度可以通过猕猴桃采摘果实提取物的浓度进行调节。
〔试验例2〕自由基清除作用试验
对于实施事例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较事例1的猕猴桃果实提取物，按以下方法对自由基清除作用进行试验。
向1.5×10-4M的DPPH(diphenyl-p-picrylhydrazyl)乙醇溶液3mL内加入样品溶液(实施例1和比较例1，样品的浓度请参照下表2)3mL，密封以后摇晃，放置30分钟。之后，测试波长520nm时的吸光度。作为控制，不使用样品溶液，而只使用溶解了样品的溶剂，实施同样的操作，测试波长520nm时的吸光度。作为空白，在乙醇中加入样品溶液3mL以后，直接测试波长520nm时的吸光度。根据得到的结果，由以下公式算出自由基清除率(％)。
自由基清除率(％)＝{1-(B-C)/A}×100
这里，A表示“控制的吸光度”，B表示“样品溶液添加时的吸光度”，C表示“空白的吸光度”。
结果如表2所示。
【表2】
Figure BSA00000366295600091
在表2中，尤其在高浓度(200ug/mL)条件下，猕猴桃采摘果实提取物(实施例1)具有极佳的自由基清除作用(活性氧清除作用)。另外，猕猴桃果实提取物(比较例1)不具有自由基清除作用。猕猴桃采摘果实提取物的自由基清除作用的强弱依赖于提取物(样品)浓度，依赖程度正在提高，所以，自由基清除作用的程度可以通过猕猴桃采摘果实提取物的浓度进行调节。
〔试验例3〕氧化的细胞障碍抑制作用试验
对于实施事例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较事例1的猕猴桃果实提取物，按以下方法对氧化的细胞障碍抑制作用进行试验。
DMEM(Dulbecco’s modified minimum essential medium，Gibco公司制造)含有来自40岁健全男性皮肤的纤维芽细胞(NBKN，获得研究同意而树立的物质，传代数：13以下)10％FBS(Fetal Bovine Serum，JRH生物科学公司制造)，使用DMEM，在37℃、5％CO2-95％air的条件下进行培养。
使用无菌水，将质粒pGL2稀释成31ug/mL，将其移至60mm的盘内以后，添加玫瑰红(关东化学公司制造，100ug/mL)，用可视光线(氙气灯，ushio电机公司制造，370-760nm，30cm)照射10分钟。
在24孔板内播种细胞(2×104cells/孔)，培养18个小时。在添加了玫瑰红或未添加了玫瑰红的质粒(0.2ug DNA/孔)内添加基因导入剂(Qiagen公司制造)，在37℃条件下导入24小时。培养基交换以后，添加样品溶液(实施例1和比较例1，样品浓度请参照下表3)，再培养24小时。
用PBS(-)(磷酸缓冲食盐水)将细胞洗净以后，添加由无菌水稀释5倍后的细胞溶解剂(东洋b-net公司制造，产品名称：Picagene，25mM Tris(7.5)，2mM DTT，10％glycerol，1％Triton X-100)50uL/孔。然后，在-80℃条件下保存30分钟，通过在常温下放置15分钟对细胞进行溶解。
盘搅拌(常温，15分钟)以后，用刮刀将细胞溶解液回收到1.5mL的离心用试管内，实施离心(15000rpm，2分钟)。添加上清液20uL、发光底层(东洋b-net公司制造，产品名称：Picagene，20mM Tricine/1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O/2.67mM MgSO4/0.1mM EDTA/33.3mM DTT/270um Coenzyme A/470um luciferin/530uM ATP)100uL，在常温下混合以后，与光度计(GENELIGHT55，微技术nition公司制造)一致，在560nm条件下测试。
氧化的细胞障碍抑制率(％)的计算方法：针对不添加玫瑰红，通过修复添加玫瑰红以后的DNA，计算荧火虫荧光素酶的活性量。
结果如表3所示。
【表3】
Figure BSA00000366295600111
如表3所示，与猕猴桃果实的提取物(比较例1)相比，猕猴桃采摘果实的提取物(实施例1)具有极佳的氧化的细胞障碍抑制作用。
〔试验例4〕紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用试验
对于实施例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较例1的猕猴桃果实提取物，按以下方法对紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用进行试验。
DMEM(Dulbecco’s modified minimum essential medium，Gibco公司制造)含有来自40岁健全男性皮肤的纤维芽细胞(NBKN，获得研究同意而得到的物质，传代数：13以下)10％FBS(Fetal Bovine Serum，JRH生物科学公司制造)，使用DMEM，在37℃、5％CO2-95％air的条件下进行培养。
使用无菌水，将质粒pGL2稀释成31ug/mL，将其移至60mm的盘内以后，在冰上照射紫外线1500J/m2。
在24孔板内播种细胞(2×104cells/孔)，培养18个小时。在紫外线照射或未照射的质粒(0.2ug DNA/孔)内添加基因导入剂(Qiagen公司制造)，在37℃条件下导入24小时。培养基交换以后，添加样品溶液(实施例1和比较例1，样品浓度请参照下表4)，再培养24小时。
用PBS(-)(磷酸缓冲食盐水)将细胞洗净以后，添加由无菌水稀释5倍后的细胞溶解剂(东洋b-net公司制造，产品名称：Picagene，25mM Tris(7.5)，2mM DTT，10％glycerol，1％Triton X-100)50uL/孔。然后，在-80℃条件下保存30分钟，通过在常温下放置15分钟对细胞进行溶解。
盘搅拌(常温，15分钟)以后，用刮刀将细胞溶解液回收到1.5mL的离心用试管内，实施离心(15000rpm，2分钟)。添加上清液20uL、发光底层(东洋b-net公司制造，产品名称：Picagene，20mM Tricine/1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O/2.67mM MgSO4/0.1mM EDTA/33.3mM DTT/270um Coenzyme A/470um luciferin/530uM ATP)100uL，在常温下混合以后，与光度计(GENELIGHT55，微技术nition公司制造)一致，在560nm条件下测试。
紫外线照射引起的细胞障碍抑制率(％)的计算方法：针对紫外线未照射，通过修复紫外线照射后的DNA，计算荧火虫荧光素酶的活性量。
结果如表4所示。
【表4】
Figure BSA00000366295600121
如表4所示，与猕猴桃果实的提取物(比较例1)相比，猕猴桃采摘果实的提取物(实施例1)具有极佳的紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用。
〔试验例5〕表皮角化细胞增殖促进作用试验
对于实施例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较例1的猕猴桃果实提取物，按以下方法对表皮角化细胞增殖促进作用进行试验。
使用正常人表皮角化细胞长期培养用增殖培养基(EpiLife-KG2)，对正常新生儿包皮表皮角化细胞(normal human epidermal keratinocyte，NHEK)进行培养以后，通过胰岛素处理，实施细胞回收。使回收的细胞呈1.5×104cells/mL的细胞密度，用EpiLife-KG2稀释以后，在胶原蛋白包裹的96个孔盘内，每个孔每次播种100uL，培养一夜。培养结束以后，将溶解于EpiLife-KG2的样品溶液(实施例1和比较例1，样品的浓度请参照下表5)添加到各个孔中，每孔100uL，逐次添加，培养3天。
表皮角化细胞增殖促进作用根据MTT化验法进行试验。培养结束以后，取出培养基，通过最终浓度0.4mg/mL，将溶解于PBS(-)的MTT添加到各个孔内，每次100uL。培养2小时以后，通过2-丙醇，对细胞内生成的蓝色甲臜进行提取。提取以后，测试波长570nm时的吸光度。同时，对于浑浊度，测试波长650nm时的吸光度，将两者的差作为蓝色甲臜的生成量。根据测试到的各个吸光度，由以下公司算出表皮角化细胞增殖促进率(％)。
表皮角化细胞增殖促进率(％)＝St/Ct×100
这里，St表示“样品溶液添加时的吸光度”，Ct表示“样品溶液不添加时的吸光度”。
结果如表5所示。
【表5】
Figure BSA00000366295600131
如表5所示，与猕猴桃果实的提取物(比较例1)相比，猕猴桃采摘果实的提取物(实施例1)具有极佳的表皮角化细胞增殖促进作用。
〔试验例6〕丝聚蛋白原mRNA发现促进作用试验
对于实施例1的猕猴桃采摘果实提取物、比较例1的猕猴桃果实提取物，按以下方法对丝聚蛋白原mRNA发现促进作用进行试验。
使用80cm2烧瓶，在正常人表皮角化细胞长期培养用增殖培养基(EpiLife-KG2)中，在37℃、5％CO2-95％air条件下，对正常新生儿包皮表皮角化细胞(normal human epidermal keratinocyte，NHEK)进行预培养，通过胰岛素处理，实施细胞收集。
使用EpiLife-KG2，在35mm玻璃容器(FALCON公司制造)内播种40×104cells/2mL玻璃容器，逐次进行，在37℃、5％CO2-95％air条件下培养一夜。24小时以后仍掉培养液，用EpiLife-KG2将样品溶液溶解至需要的浓度(实施例1和比较例1，样品的浓度请参照下表6)，将溶解后的该样品溶液加入各个玻璃容器内，每次2mL，在37℃、5％CO2-95％air条件下培养24小时。之后，扔掉培养液，根据SOGEN(NIPPN GENE公司制造，Cat.no.311-02501)提取总RNA，用分光光度仪测量各个RNA量。调整总RNA，以达到200ng/ul。
以上述总RNA为模板，测量丝聚蛋白原、内部标准“GAPDH(glycerol dehyde 3-phosphate dehydrogenase)的mRNA发现量。检测时使用实时PCR装置Smart Cycer(Cepheid公司制造)，根据由TakaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time，code No.RR063A)产生的实时2Step RT-PCR反应进行实施。丝聚蛋白原的mRNA发现量基于：由不添加或添加样品时分别培养的细胞所制成的总RNA样品，根据GAPDH的值求修正值，然后计算的是：不添加样品的修正值为100时添加样品的修正值。根据所得结果，又以下公式算出丝聚蛋白原mRNA发现促进率(％)。
丝聚蛋白原mRNA发现促进率(％)＝A/B×100
这里，A表示“样品添加时的修正值”，B表示“样品不添加时的修正值”。
结果如表6所示。
【表6】
Figure BSA00000366295600141
如表6所示，与猕猴桃果实的提取物(比较例1)相比，在低浓度(12.5ug/mL)下，猕猴桃采摘果实的提取物(实施例1)具有极佳的丝聚蛋白原mRNA发现促进作用。即：在低浓度(12.5ug/mL)下，猕猴桃果实的提取物能促进：提高皮肤保湿性能的丝聚蛋白的先驱“丝聚蛋白原”的基因发现。
从上述试验例1-6可以看出，在猕猴桃采摘果实的提取物中，具有猕猴桃熟透果实的提取物所没有的作用(过氧化物清除作用(活性氧清除作用)、自由基清除作用)，即使是后者具有的作用(氧化的细胞障碍抑制作用、紫外线照射引起的细胞障碍抑制作用、表皮角化细胞增殖促进作用、丝聚蛋白原mRNA发现促进作用)方面，前者的优势也更明显。
工业上利用的可能性
关于本发明中的活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化的细胞障碍抑制剂，包括由活性氧引起的细胞障碍等在内，对各种障碍的预防、改善都具有巨大的贡献。

Claims (3)

1.一种活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂，其特征在于，包括：活性氧清除剂，所述活性氧清除剂以猕猴桃采摘果实的提取物为有效成分。
2.一种活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂，其特征在于，包括：自由基清除剂，所述自由基清除剂以猕猴桃采摘果实的提取物为有效成分。
3.一种活性氧清除剂、自由基清除剂以及氧化性细胞障碍抑制剂，其特征在于，包括：自由基清除剂，所述自由基清除剂以猕猴桃采摘果实的提取物为有效成分；氧化性细胞障碍抑制剂，所述氧化性细胞障碍抑制剂以猕猴桃采摘果实的提取物为有效成分。
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