TWI701038B - 可活化能量、抗皺、抗發炎及美白的蘭花芽胚組織萃取物 - Google Patents
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Abstract
一種蘭花芽胚組織萃取物之萃取方法，步驟有：超音波萃取；以及過濾及去除溶劑。藉由整體於非高溫下進行，可避免低沸點與有效物質揮發及保持芽胚組織之生長活性，所得的萃取物之總多酚及總黃酮含量高，添加於化妝保養品中，具美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效。
Description
本發明有關植物萃取方法，特別是指應用於蘭花芽胚組織萃取物之萃取方法，所製成的萃取物可作為醫藥品、化妝品、保養品、香氛或人體清潔用品等產品的原料者。
臺灣素有「蘭花王國」美譽，擁有成熟的種植與組織培養技術，其中包括品種繁多豐富、純熟的組織培養技巧、病毒檢驗能力及量產工程技術等。此外，台灣農業目前擁有推動蘭花產業的優勢條件，包括得天獨厚的天然地理條件、傲視全球的多元化品種、技術頂尖的育種專家群、超水準的農業科技基礎、遍佈全國的農業試驗改良及學研等各類農業技術輔助機構、聞名世界的資訊產業與現代化的物流通路等。
在臺灣，全年蝴蝶蘭產量約1億3,294萬株，外銷總量約4千萬株，佔全球供應量的20%，銷售地區遍及歐洲、日本與美國，因此需要應用精進的生物科技技術，進行大量繁殖以因應供貨需求。而蘭花的培育繁殖方法，最常見的有「播種繁殖法」、「花梗催芽繁殖法」、「斷心催芽繁殖法」、「切莖繁殖法」及「組織培養法」等五種，可按照培殖品種的特性及需求選用適當繁殖方法進行培育。其中「組織培養法」大多擷取具有分生能力的「頂芽」部位來進行培養；而「莖頂生長點」部位之生產多採用芽體增殖(芽長芽)或誘導擬原球體(PLBs)分生苗方式，其中芽體增殖
亦即減低或去除頂芽優勢，使側芽容易長出來，以此方式增殖芽體。
蘭花除了可供觀賞用外，近年來亦廣泛用於化妝品及保養品等產品中作為原料，使得蘭花的經濟價值提升，蘭花的需求量更大；而蘭花需經過萃取作業成為萃取物後，再作為化妝品及保養品之填加物。而因萃取蘭花的部位不同，則要配合適當的萃取技術，萃取流程如有變化，所製成的萃取物成份也會不同，萃取物可達到之美白功能、抗氧化及抗老化效果也會受到影響。
由於人類皮膚經常受到紫外線、空氣與溫度等環境因素的影響，而有加速皮膚老化現象及罹患皮膚癌的風險，以皮膚老化來說，外因性因素占據60%，而其中紫外線又占了老化原因高達60%。於影響皮膚老化的研究中發現，紫外線不只會造成黑色素細胞的活躍性，導致皮膚斑點的出現，也會使真皮組織產生退化現象，並且加速皮膚的氧化，產生游離自由基，這些自由基會造成纖維母細胞破壞、膠原蛋白變性和含量減少以及彈性纖維組織退化而產生老化皺紋，更會加速細胞內DNA傷害，使得皮膚細胞更新能力變差，新細胞取代舊細胞的速度變慢。
因此市售的化妝品及保養品大多針對前述皮膚問題，開發出不同的化妝品原料，再配合填加其他具特殊效果之填加物或萃取物，其中填加植物萃取物的活性成份如花青素、類黃酮、多酚類等，對於皮膚之美白、抗氧化、抗老化或防皺等功效相當顯著，因此市面上許多化妝或保養商品常見有各類植物活性成份添加其中。然而，因不同的植物、不同部位、或所製成萃取物成份要求與功效不同，則需應用的萃取技術皆不同，以蘭花而言，雖同樣作為化妝品及保養品之填加原料，但其萃取技術應用有許
多方式，且萃取作業之步驟、流程與環境參數亦有差異。
按，習知應用於化妝品的蘭花之萃取技術，如中國發明專利申請號第CN201510295194.7號所揭露之「蘭花萃取物及其製備方法和應用」，其特徵在於，所述蘭花為蝴蝶蘭屬，所述蘭花萃取物由下列步驟所製備而得：(1)萃取：將所述蘭花與溶劑以重量比例為0.5：1至10：1，進行混合粉碎或者破壁得到蘭花漿，所述溶劑為水、醇類或醇類水溶液，其中所述醇類為乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分離：將步驟(1)萃取的蘭花漿進行固液分離，留下液態為蘭花濾液；(3)活性劃分：將步驟(2)所分離的蘭花濾液以分子篩薄膜處理純化，得到蘭花萃取篩分液；(4)濃縮：將步驟(3)純化的蘭花萃取篩分液以分子篩薄膜處理濃縮，或者真空或蒸煮方式進行部分濃縮，得到活性沉澱物與具活性的液態活性萃取液。
另一種應用於化妝品的蘭花之萃取技術，如中國發明專利公開號第CN105878122A號所揭露之「一種具有怯斑美白效果的天然提取物化妝品」，其包括功效成分澤蘭提取物和石吊蘭提取物，其中，所述澤蘭提取物和石吊蘭提取物的重量比為2至4：1。澤蘭提取物和石吊蘭提取物的製備方法為：將乾燥的澤蘭或石吊蘭用乙醇熱回流提取，合併濾液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液；再用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取；正丁醇萃取物用水溶解，過濾，濾液用大孔樹脂富集活性成分，噴霧乾燥即得。本發明提供的祛斑美白化妝品以植物提取物為功效成分，且通過控制澤蘭提取物和石吊蘭提取物的含量比值，可最大化去斑美白。
更有一種應用於化妝品的蘭花之萃取技術，如台灣發明專利
申請號第102140137號所揭露之「白花蝴蝶蘭花瓣的萃取物及其製備方法與用途」，其藉由下列步驟的方法而製得：以超臨界CO2來萃取白花蝴蝶蘭花瓣，藉此而得到一白花蝴蝶蘭花瓣的脂溶性萃取物以及一殘餘物；以及以水來萃取殘餘物，俾以得到一白花蝴蝶蘭花瓣的水溶性萃取物，可用於促進皮膚美白、提升皮膚的保濕能力以及預防或延緩皮膚老化。
上述之萃取技術均為取得蘭花的萃取物，其中第一案係以整株蘭花施以萃取、固液分離、活性劃分及濃縮等流程；第二案則以整株澤蘭或石吊蘭施以乾燥、熱回流提取、濃縮、稀釋、溶解及過濾等步驟；第三案即利用白花蝴蝶蘭的花瓣進行超臨界CO2萃取後，再以水來萃取殘餘物的作業流程者。前述習知利用蘭花進行萃取的部位皆不同，第一、二案以整株進行，第三案則僅使用花瓣部位，且又因萃取方法、流程、使用設備及環境相關參數均不同，所取得的萃取物成份與含量也會不一樣。
無論以整株蘭花或花瓣部位進行萃取，所製成的萃取物活性成份含量及效果仍會受到限制；此外，前述第二、三案習知萃取過程中有透過高溫進行的步驟，恐造成萃取物的活性減低或有效物質揮發的情形，以致化妝及保養產品美白功能、抗氧化及抗老化的效果不佳；再者，習知以整株蘭花進行萃取作業，使得蘭花所有部位無論活性存量好壞，於同時萃取的情形下，製成的萃取物的活性平均下來品質將會受到限制，無法提升；又，習知以醇類或醇類水溶液為溶劑之萃取方式，除了使用設備成本高外，過程中有揮發性氣體產生而有安全上的疑慮。
另一方面，由於蘭花的莖節部位具有優異的生長機能，通常
此部位會成為一生長點，此一生長點的細胞擁有快速地分裂和分化以產生新芽的特性，並可使芽軸不斷伸長，猶如動物的幹細胞再生功能，如能擷取蘭花莖節生長點細胞進行萃取，所得的萃取物活性成份含量與活性效益高，然而前述習知蘭花相關的萃取技術尚未見有針對蘭花開花株的莖節部位進行萃取或提煉等技術；故本案發明人提供一種蘭花生長點切割及萃取技術，以解決前述習知問題，並獲得活性成份含量高且效果佳之蘭花芽胚萃取物。
於是，本發明之一目的即在提供一種蘭花芽胚之萃取方法及其萃取物，主要提供蘭花芽胚的培育、切割及萃取的完整流程，且僅擷取並收集蘭花最具有活性成份的莖節生長點之再生植物細胞來進行萃取作業，所製成的芽胚萃取物之總多酚、總黃酮及植物激素含量高，添加於化妝保養品產品中，具有美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效。
本發明之另一目的即在提供一種蘭花芽胚之萃取方法及其萃取物，以開花株其莖節生長點部位進行誘導培育，使長出再生新側芽後，且切割取得新側芽之新生植物組織，此一莖節生長點誘導培育方式可獲得大量的新生植物組織，而可符合大量生產的需求。
本發明之再一目的即在提供一種蘭花芽胚之萃取方法及其萃取物，萃取方法於非高溫下操作，以減少溫度所造成的熱損失，亦可避免低沸點與有效物質揮發及保持生長點組織之生長活性。
本發明之更一目的即在提供一種蘭花芽胚之萃取方法及其萃取物，經超音波萃取所製成的半成品萃取液，再進行過濾及去除溶劑作
業，可獲得活性及穩定性高的芽胚萃取物。
有鑑於此，本發明所揭露蘭花芽胚之萃取方法，其步驟為：(a)誘導再生新側芽：將蘭花其開花株的莖節部位之梗芽切出若干段梗芽，並進行培育作業使之長出新側芽；(b)切除梗芽並擷取新側芽：將梗芽切除並擷取新側芽後，取出生長點組織；(c)去除壁膜：將各小片段之生長點組織去除壁膜，成為一新生植物組織；(d)收集新生植物組織：收集預設數量生長點新側芽之新生植物芽胚組織；(a)超音波萃取：將芽胚組織秤取100公克，放入超音波萃取設備，於低溫下，以芽胚組織重量5倍量的純水為溶劑將芽胚組織覆蓋浸泡，以製成半成品萃取液；及(b)過濾及去除溶劑作業：將半成品萃取液經由抽真空之過濾作業後，再利用減壓濃縮機將半成品萃取液進行去除溶劑作業，以製成萃取物。
藉由上述步驟，整個流程於非高溫下進行，可避免低沸點與有效物質揮發及保持芽胚組織之生長活性，且所製成的萃取物之總多酚及總黃酮含量高，添加於化妝保養品產品中，具有美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效。
此外，本發明所揭露上述製成萃取物的用途為用於製備具有美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺功效的組合物，而此組合物可為醫藥品、化妝品、保養品、香氛或人體清潔用品。
另外，本發明所揭露上述製成萃取物的用途為用於製備具促進皮膚細胞粒線體再生的組合物，而此組合物可為醫藥品、化妝品、保養品、香氛或人體清潔用品。
圖1為一流程示意圖，說明本發明所揭露蘭花開花株莖節生長點之萃取方法。
圖2為一顯微鏡照片圖，說明本發明所揭露之萃取物對人類皮膚角質株化細胞型態的影響。
圖3為一流式細胞分析結果圖，說明本發明所揭露之萃取物對人類皮膚角質株化細胞的細胞週期影響。
圖4為一DNA膠體電泳結果圖，說明本發明所揭露之萃取物對質體DNA型態的影響。
圖5為一DNA膠體電泳結果圖，說明本發明所揭露之萃取物對DNA marker型態的影響。
圖6為一細胞存活分析結果圖，說明本發明所揭露之萃取物對細胞存活的影響。
圖7為一螢光偵測結果圖，說明本發明所揭露之萃取物對光產物CPD生成的影響。
請參照圖1，本發明所提供之一種蘭花芽胚之萃取方法，以最佳實施之大白蘭花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品種作說明，其步驟依序為：(a)誘導再生新側芽；(b)切除梗芽並擷取新側芽；(c)去除壁膜；(d)收集新生植物組織；(e)超音波萃取；(f)過濾及去除溶劑作業；及(g)製成芽胚萃取物；其中：
步驟(a)：將蘭花其開花株的莖節部位之梗芽，於梗芽側邊
進行切割，以莖節為單位切出若干段梗芽，各梗芽於預定時間內所切割的部位將自行癒合，消毒後種入進行培育作業，使之長出新側芽；培育作業以蘋果、馬鈴薯、香蕉、胡蘿蔔為培養基；培養溫度為15至20℃；培養時間約為4至4.5週。
步驟(b)：將梗芽切除並擷取新側芽後，於兩片新側芽交接的位置往下0.1cm之部位的生長點組織，切成小片段。
步驟(c)：將各小片段之生長點組織去除壁膜，成為一新生植物組織，其再生的途徑為經由芽等器官形成新生植物胚胎；新生植物組織呈形狀一致的圓形。
步驟(d)：收集預設數量生長點新側芽之新生植物芽胚組織。
步驟(e)：將收集之新生植物芽胚組織秤取100公克，放入超音波萃取設備，於低溫下，以芽胚組織重量5倍量的逆滲透純水或滅菌之去離子水為溶劑將芽胚組織覆蓋浸泡，置入超音波設備內，水溫設定於50至60℃，功率設定為300瓦，時間設定為40分鐘，以超音波震盪對生長點之芽胚組織進行萃取作業，以製成半成品芽胚萃取液。
步驟(f)：先將半成品芽胚萃取液經由抽真空之過濾作業；再利用減壓濃縮機以45℃加熱，以旋轉速度80轉，將半成品芽胚萃取液減壓濃縮，進行去除溶劑作業；且重覆此一去除溶劑作業1至4次，以完整萃取。
步驟(g)：製成之芽胚萃取物具有總多酚及總黃酮等成份；所製成之萃取物，約1.51公克，萃取率約1.51%；所製成之芽胚萃取物內含總多酚，每克萃取物中所含沒食子酸(gallic acid)毫克數約為4.5至5.28；
所製成之萃取物，以芸香苷(rutin)的標準曲線來計算，每克芽胚萃取物中含類黃酮化合物的量約為4.2至4.75mg；所製成之萃取物，可於冷凍乾燥後於溫度-20℃下保存冷藏；且所製成之芽胚萃取物可應用於醫藥品、化妝品、保養品、香精、香水或人體清潔用品等產品的原料。
藉由上述步驟，可提供針對蘭花芽胚的培育、切割及萃取的完整流程，使整個流程於非高溫下進行，可避免低沸點與有效物質揮發及保持生長點組織之生長活性，且所製成的萃取物之總多酚、總黃酮及植物激素含量高，添加於化妝保養產品中，具有美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效，同時此一莖節生長點誘導培育方式可獲得大量的新生植物芽胚組織，而可因應大量生產的需求，並且具有高經濟價值與高實用性者。
為進一步瞭解本發明技術特徵、運用技術手段及所預期達成之功效，茲將本發明使用方式加以說明敘述如下：
本發明之蘭花芽胚萃取技術，主要針對蘭花的莖節部位具有優異生長機能之生長點部位，利用此一生長點的細胞擁有快速分裂和分化以產生新芽並可使芽軸不斷伸長的特性，擁有高生命力及活性的特質，且蘭花芽胚其再生的方式為經由芽等器官形成新生植物胚胎，猶如動物幹細胞的再生功能；藉此建立從生長點的培育、切割到萃取的一整套流程。再者，本發明除可應用於大白蘭花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品種的生長點萃取外，其他品種的蘭花亦都可適用此一萃取技術，以獲得活性成份高的芽胚萃取物。
本發明之蘭花莖結生長點培育方法，請參照步驟(a)之誘導再生新側芽，本發明之誘導方式依開花株的莖節部位，先切出若干段梗芽，再進行培育繁殖作業，約4至4.5週後，即能製成新側芽。
本發明之蘭花芽胚切割擷取方法，請參照步驟(b)之切除梗芽並擷取新側芽及(c)之去除壁膜，將新側芽切除梗芽後，再除去壁膜，則可得圓形之新生植物組織，本發明只使用此一新生植物芽胚組織進行萃取。
本發明之蘭花芽胚萃取方法，請參照步驟(e)超音波萃取，將前述所取的之新生植物組織，利用超音波高頻恆速震盪、疏密有秩的特性，將超音波振動對液體瞬間造成「增壓」及「減壓」，推動介質，產生空穴效應(cavitation)。當萃取液中無數細小的真空氣泡爆裂時，產生瞬間高溫及強大衝擊力，可將待萃取物之成份分離，而達到萃取效果。
經前述流程所獲得之萃取物，其總黃酮含量測定方法如下：取1μL蘭花芽胚萃取物並加入49μL二次去離子水及3μL的5%NaNO2溶液反應6分鐘後，再加入3μL的10%AlCl3溶液並反應6分鐘後再加入40μL的4%NaOH溶液及4μL二次去離子水震盪混合均勻後，靜置15分鐘後，在波長510nm下測吸光值。以芸香苷的標準曲線來計算，每克萃取物中含類黃酮化合物的量約為4.2至4.75mg。
經前述流程所獲得之萃取物，其總多酚含量測定方法如下：(1)1μL蘭花芽胚萃取物混合25μL的10倍稀釋Folin-Ciocalteu’s phenol reagent反應5分鐘後，再加入20μL的7.5%Na2CO3溶液，最後加入ddH2O使總體積為100μL，混合均勻後反應15分鐘後，於波長510nm下測定吸光值
(BioTek，SynergyTM2，USA)；(2)利用沒食子酸標準品製作之校正曲線y=0.0225x+0.097(R2=0.993)，再對照萃取物之吸光值；(3)換算每克萃取物中所含沒食子酸毫克數，得到萃取物之總酚含量，其中1g萃取物相當於含有5.5±1.6mg沒食子酸。
經前述流程所獲得之萃取物，其總黃酮含量測定方法如下：(1)1μL蘭花生長點萃取物，依序混合3μL的5%NaNO2溶液、3μL的AlCl3溶液和40μL的NaOH溶液，再加入ddH2O使總體積為100μL，混合均勻後反應15分鐘後，於波長510nm下測定吸光值(BioTek，SynergyTM2，USA)；(2)利用芸香苷標準品製作之標準曲線y=0.0032x+0.032(R2=0.999)後，再對照萃取物之吸光值；(3)換算每克萃取物中所含芸香苷毫克數，得到萃取物之總黃酮含量，其中1g萃取物相當於含5.0±0.3mg芸香苷。
經前述流程所獲得之萃取物，含有吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)，此為植物生長素，為重要的植物激素之一，其廣泛存在於植物的葉芽和嫩葉等分生組織中，可使細胞生長和細胞分化，進而促進植物的生長與發育。本發明所製成之萃取物利用高效能液相層析法分析蘭花生長點萃取物之成分，可進行吲哚-3-乙酸的成分分析，以建立蘭花芽胚萃取物之指標成分分析，並以一化合物進行定量分析，藉此做為蘭花芽胚萃取物之指標依據。
本發明所製成芽胚萃取物之指標成分分析方法，主要於移動相使用不同比例的純水和乙晴，流速為1mL/1min，總試驗時間30分鐘，測得標準品吲哚-3-乙酸滯留時間為23.194min；蘭花芽胚萃取物測試體積為20μL，於相同滯留時間(23.194min)測得最大面積，積分面積參數為92.75
%。藉由此一指標成分分析，可得知蘭花芽胚萃取物中含有92.75%的吲哚-3-乙酸，往後可以吲哚-3-乙酸作為蘭花芽胚萃取物效能成分之指標依據。
本發明之蘭花開芽胚萃取方法，具有下列功效：
一、本發明主要提供針對蘭花芽胚的培育、切割及萃取的完整流程，且僅擷取並收集蘭花最具有活性成份的莖節生長點之再生植物組織，來進行萃取作業，所製成的萃取物活性成分之總多酚、總黃酮及植物激素含量高，品質優，故相較於習知將整株蘭花或花瓣進行萃取的方法，本發明所製成之萃取物之總多酚、總黃酮及植物激素含量較高，品質較好。
二、因本發明之萃取物具有優於習知技術萃取物的活性成份含量及品質，因此將本發明之萃取物添加於化妝保養品產品中，具有美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效。
三、本發明以開花株其莖節生長點部位進行誘導培育，使長出再生新側芽後，且切割取得新側芽之植物新生組織，此一莖節生長點誘導培育方式可獲得大量的新生植物芽胚組織，而可因應大量生產的需求。
四、本發明於開花株其莖節生長點部位先進行培育以大量繁殖新側芽後，再切割出新生植物組織，此一莖節生長點切割作業可去除其他莖梗葉部位，只使用具有較高生長活性含量的新生植物組織進行萃取，故具有去蕪存菁的效果，進而可提升萃取物品質，解決習知蘭花萃取技術活性含量及品質無法提升的問題。
五、本發明之芽胚之萃取方法，為於非高溫下操作，其萃取過程中溫度約50至60℃，以減少溫度所造成的熱損失，亦可避免低沸點與有效物質揮發及保持生長點組織之生長活性，故可維持新生植物組織的活
性含量，解決習知以煮沸、蒸氣或熱回流提取等加工流程中所造成萃取物的活性減低或有效物質揮發的問題。
六、本發明以超音波水萃取方法，且只使用逆滲透純水，未有其他溶劑，故能改良傳統溶劑萃取方法成本高且萃取過程危險的缺點，又可減少處理時間和溶劑使用量並得到高產率。
七、本發明經超音波萃取所製成的半成品萃取液，再進行過濾及去除溶劑作業，因本發明所使用的溶劑為無毒無菌的純水，因此不會有習知使用醇類或醇類水溶液為溶劑之萃取方式的安全性問題，且本發明經此過濾及去除溶劑作業，可獲得活性高及穩定性佳的萃取物。
八、本發明於獲得萃取物後，配合建立「蘭花芽胚萃取物之指標成分分析方法」可進行成份分析，以得知萃取物中所含植物激素「吲哚-3-乙酸」含量是否達到標準，而具有建立植物激素「吲哚-3-乙酸」成分之分析方法及指標依據的效果。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行與「人體皮膚細胞安全性相關試驗」，其試驗方式包括有「細胞存活度試驗」、「細胞型態變化觀察」及「細胞週期試驗」三種，各別試驗方法詳述如下：
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「細胞存活度試驗」，其試驗方式如下：(1)從液態氮桶中將人類皮膚角質株化細胞株HaCaT迅速移至37℃水浴箱內使其在40至60秒內急速解凍，隨即將細胞冷凍保存液(含10%DMSO的細胞培養液)加入細胞培養液，將細胞打散並移置25cm2細胞培養瓶，於37℃、5%CO2細胞培養箱中生長，平均每隔2天更
換一次培養液；(2)將培養瓶的細胞培養液吸去，以PBS清洗一次，再加入適量的1xTrypsin。待細胞剝落後，離心去除上層液，接著加入培養液，把細胞均勻打散。取100μl細胞液到微量離心管，加入同體積的trypan blue均勻混合。最後將混合液吸至血球計數器(hemacytometer)於顯微鏡下計算細胞數目；(3)將人類皮膚角質株化細胞以1x104個細胞/孔密度培養在96孔盤，並在37℃及5%CO2培養箱中培養至少24小時；(4)加入不同濃度的萃取物以及於指定的時間作用，達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反應，於37℃、5%CO2反應4小時後移除培養液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570nm下測定吸光值(BioTek，SynergyTM2，USA)。其中，將人類皮膚角質株化細胞HaCaT分別作用0、0.05、0.1和0.5mg/mL蘭花芽胚萃取物作用24小時後，細胞存活度分別為100±2.2%、108.5±1.2%、105.0±2.9%、127.0±3.2%。此結果顯示蘭花芽胚萃取物濃度小於0.5mg/mL時，細胞存活度大於100%以上。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「細胞型態變化觀察」，其試驗方式如下：(1)將人類皮膚角質株化細胞HaCaT以1x104個細胞/孔密度培養在96孔盤，並在37℃及5%CO2培養箱中培養至少24小時；(2)加入1μL蘭花芽胚萃取物作用人類皮膚角質株化細胞HaCaT24小時，達反應時間後，於顯微鏡(Nikon，TE2000-U，Japan)下觀察細胞型態，並拍照記錄。如圖2所示，人類皮膚角質株化細胞經蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用24小時後，細胞型態與控制組的細胞型態無
明顯差異。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「細胞週期試驗」，其試驗方式如下：(1)將1x104個細胞/孔密度培養在24孔盤中至少24小時，之後加入10μL蘭花芽胚萃取物，於培養箱中反應。之後收集上清液至15mL離心管，再以trypsin-EDTA溶液將細胞取下至離心管中，與上清液一併離心1200rpm、5分鐘。移除上清液，加入300μL的PBS，緩慢震盪，並逐滴加入700μL絕對酒精固定細胞，再移至微量離心管，置於4℃冰箱中儲存；(2)流式細胞儀上機前，細胞在4℃下以1200rpm離心5分鐘，移除上清液，依序加入445μL的PBS、5μL的RNase(10mg/mL)、50μL的10%Triton X-100，將細胞的RNA破壞分解後，於37℃反應30分鐘，以1200rpm離心5分鐘，移除上清液，加入400μL的PBS混合均勻，再加入5μL的PI(5mg/mL)，於4℃避光反應5分鐘，以過濾膜過濾；(3)利用流式細胞分析儀(flow cytometer，FACScan)，配合Winmdi電腦軟體來分析細胞週期分佈比例。如圖3所示，蘭花芽胚萃取物(0.1和0.5mg/mL)作用於皮膚角質株化細胞24小時後，細胞週期無顯著變化；具體地說，經蘭花芽胚萃取物(0.1和0.5mg/mL)作用後sub-G1(M1區域)比例為5.8和6.2%，皆小於10%。
針對蘭花芽胚之活性評估，本發明亦建立相關測試方法，包括「保護因紫外線及氧化傷害而造成的DNA損傷試驗」、「保護片段化DNA效應試驗」、「修護皮膚細胞經紫外線作用之細胞存活度試驗」、「偵測DNA損傷之環丁嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers，CPD)生成量試驗」、「DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基清除試驗」、「抑制酪胺酸酶
活性試驗」、「粒線體再生試驗」、「皮膚膠原蛋白生成試驗」、「抑制發炎因子一氧化氮活性試驗」，茲分別詳細說明如下：
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「保護因紫外線及氧化傷害而造成的DNA損傷試驗」，其試驗方式如下：(1)將DNA質體pUC119(25μg，0.5μg/μl，Takara，Japan)以1：8比例用PBS稀釋，進行各別處理：①控制組、②UVB(20mJ/cm2)與H2O2(1mM)+FeSO4(0.5mM)作用組、③UVB(20mJ/cm2)與H2O2(1mM)+FeSO4(0.5mM)+蘭花芽胚萃取物作用組；(2)各取2μL的pUC119於微量離心管後，以①、②和③組別分別處理，並分別於37℃作用1小時；(3)加入loading dye混合後，於0.8%agarose膠體進行電泳30分鐘後以電泳膠片影像擷取系統分析；(5)分析S-form DNA和L-form DNA之比例。質體本為一環狀結構(supercoil form，S-form)，其受到氧化傷害及紫外線傷害時，會形成開放性(open form，O-form)或是直線型(linear form，L-form)的結構。質體pUC119為一段S-form結構之DNA質體，其經過氧化及UVB傷害後，質體會形成L-form、O-form，受到劇烈傷害時甚至會片段化。如圖4所示，質體DNA經UVB和氧化傷害(H2O2+FeSO4)作用後(第二條帶)，DNA形成片段化，超螺旋結構比例僅為1.6%，而經過蘭花芽胚萃取物(0.1mg/mL)作用後(第四條帶)，超螺旋結構比例為22.5%。此結果顯示蘭花芽胚點萃取物具有保護DNA質體不受UVB及氧化傷害的效能。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「保護片段化DNA效應試驗」，其試驗方式如下：(1)將稀釋之2μL的DNA Mw Standard Marker加入0.5mL微量管，進行各別處理：①控制組、②UV與H2O2
作用組、③UV與H2O2+萃取物作用組；(2)於37℃下作用1小時後，加入loading dye混合，以瓊脂膠凝膠核酸電泳分析。如圖5所示，DNA marker為一片段DNA條狀帶(未經傷害之DNA，第一條狀帶)，DNA會依照不同分子量排列。一旦受到氧化及UVB傷害後，條狀DNA會變成碎片(第二條狀帶)，而經過蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用後，DNA仍保持明顯的條狀帶，亦即蘭花芽胚萃取物於0.05mg/mL具有保護DNA效能。此結果再次證實蘭花芽胚萃取物具有保護DNA不受氧化及UVB傷害的效果。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「修護皮膚細胞經紫外線作用之細胞存活度試驗」，其試驗方式如下：(1)將人類皮膚角質細胞以1x104個細胞/孔密度培養在96孔盤，並在37℃及5%CO2培養箱中培養至少24小時，進行各別處理：①控制組-移除細胞上清液，更換無血清之新鮮培養液，培養4小時後，以PBS清洗置入無血清之新鮮培養液，繼續培養4小時，進行存活度分析；②UV照射組-移除細胞上清液，更換無血清之新鮮培養液，放置細胞培養箱中培養4小時後，移除上清液以PBS清洗並抽乾，進行UV照射後，立即加入無血清之新鮮培養液，繼續培養4小時，進行存活度分析；③UV照射+萃取物組：移除細胞之上清液，將萃取物各別混合於無血清之新鮮培養液，加入培養4小時後，移除上清液以PBS清洗並抽乾，各別進行UV照射後，立即加入含萃取物之無血清新鮮培養液，繼續培養4小時，進行存活度分析；(2)達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，加入10μL的MTT溶液反應，於37℃、5%CO2反應4小時後移除培養液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570nm下測定吸光值(BioTek，SynergyTM2，USA)。
由於化妝保養產品使用時最先接觸皮膚角質層，故本試驗選用人類皮膚角質株化細胞進行的理由於此。如圖6所示，經UVB(20mJ/cm2)照射後，細胞存活度約80%，而經過蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用後，細胞存活度為92.1%、100.6%和132.9%；亦即，蘭花芽胚萃取物於0.05mg/mL便具有保護細胞免於UVB傷害之效能。此結果顯示蘭花芽胚萃取物具有保護細胞免於UVB傷害之效能。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「偵測DNA損傷之環丁嘧啶二聚體生成量試驗」，其試驗方式如下：(1)將1x105個細胞/mL培養於24孔盤至少24小時，進行各別處理：①控制組、②UV照射組；③UV照射+萃取物組-萃取物作用4小時後進行UV照射，更換不含血清培養液培養4小時；(2)移除培養液以PBS清洗，以冰甲醇固定細胞，再以Triton X-100作用，加入2M的HCl溶液作用1小時，再以1%BSA填補細胞間隙，再以CPD一級抗體於37℃搖晃反應1小時，去除一級抗體後，再加入二級抗體避光反應30分鐘，以PBS清洗並於激發光504nm，發射光524nm下偵測螢光表現；(3)再加入Hoechst 33342(10mg/mL)進行細胞核染色，以PBS清洗後再以激發光355nm，發射光460nm下偵測螢光表現，並於螢光顯微鏡下觀察拍照。
過量的紫外線照射引起DNA損傷的原因在於其能誘發DNA同條鏈內相鄰的嘧啶鹼基產生CPD光產物，使DNA空間結構發生變化，從而阻礙DNA複製、轉錄進而影響蛋白質的生物功能。換言之，經過UVB照射後細胞受到傷害而碎裂並產生光產物堆積，CPD為一種光產物，可利用螢光偵測之特性進行試驗。如圖7所示，皮膚細胞經蘭花芽胚萃取物(0.1
和0.5mg/mL)作用再經UVB照射後，僅有些許光產物產生。亦即，蘭花芽胚萃取物於0.1mg/mL便具有保護細胞免於UVB傷害之效能。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基清除試驗」，其試驗方式如下：將蘭花芽胚萃取物配置成不同濃度，分別加入90μL新鮮配置的100μM的DPPH自由基乙醇溶液後一起添加至96孔盤中反應，以酵素免疫分析儀檢測517nm吸光值。試驗標準品為AA，DPPH自由基清除率公式如下：
依此結果，蘭花芽胚(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)清除DPPH自由基能力分別為19.6±1.2%、30.5±0.3%、50.0±0.2%和82.6±2.1%。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「抑制酪胺酸酶活性試驗」，其試驗方式如下：將不同濃度蘭花芽胚萃取物取2μL至96孔盤中，加入18μL的DMSO混合，再加入25μL的100unit香菇酪胺酸酶並於室溫下反應10分鐘。之後加入155μL的2.5mM L-DOPA，於492nm之波長以酵素免疫分析儀測定吸光值。
依此結果，蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)抑制酪胺酸酶活性分別為12.8±1.5%、28.5±2.2%、46.2±2.5%和75.2±1.8%。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「粒線體再生試驗」，其試驗方式如下：(1)人類皮膚角質株化細胞HaCaT以1×104個細胞/孔的密度培養於24孔盤，在37℃及5%CO2培養箱中培養至少24小時，加入不同濃度蘭花生長點萃取物處理，置入培養箱作用24小時；(2)
達反應時間後，移除培養液，加入PBS清洗，加入paraforaldehyde固定細胞，使用1%TritonX100作用5分鐘，接著使用PBS清洗細胞，加入mitoview染劑及用Hoechst 33342 staining solution染細胞核(作為定量細胞數)，使用螢光免疫分析儀(BioTek，SynergyTM2，USA)測定粒線體(綠色，激發光：490nm，發射光：523nm)及細胞核螢光(藍色，激發光：346nm，發射光：460nm)表現；(3)粒線體表現計算公式如下：
人類粒線體在體內有許多功能，最重要的功能為產生能量；然而，粒線體會隨著年齡增加逐漸減少，因此粒線體質量與健康和老化有極大關係。依此結果，人類皮膚角質株化細胞HaCaT經蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)作用24小時後，粒線體質量分別為102.2±1.2%、105.7±0.2%、110.5±2.1%和124.9±1.7%。此結果顯示蘭花芽胚萃取物可促進人類皮膚角質株化細胞之粒線體再生。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「皮膚膠原蛋白生成試驗」，其試驗方式如下：(1)將3T3L-1細胞以2×105個細胞/mL密度培養在3公分盤中24小時後，移除上清液再加入含有不同濃度蘭花芽胚萃取物之無血清培養液培養48小時，PBS清洗後，刮除細胞，離心1200rpm、5分鐘，再去除上清液；(2)利用Sircol soluble collagne assay kit進行膠原蛋白測定，為先將100μL細胞液混合1mL的sircol dye reagent，再於室溫下均勻搖晃30分鐘，再離心12000rpm、10分鐘，直接倒掉上清液，再加入750μL ice-cold acid-salt wash reagent，再離心12000rpm、10分鐘，將dye reagent完
全去除乾淨。之後加入250μL的alkali reagent混合均勻，取100μL至96孔盤，在555nm下以酵素免疫分析儀測吸光值。
膠原蛋白為保持肌膚彈性及抗皺的重要因子，其合成量受到年齡的影響，因此若能適時促進膠原蛋白之合成量，可避免肌膚生成皺紋、失去彈力光澤的情形。依此結果，經過蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用後，可促進纖維母細胞中膠原蛋白的生成量約4.7±0.4%、21.1±2.1%及35.0±0.1%。此結果顯示蘭花芽胚萃取物對於促進膠原蛋白生成量具有優異的效果。
本發明之蘭花芽胚萃取技術所製成之萃取物，進行「抑制發炎因子一氧化氮活性試驗」，其試驗方式如下：取2μL蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)各別加入98μL的25mM硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)SNP反應120分鐘，之後加入100μL的Griess reagent反應10分鐘，以酵素免疫分析儀檢測546nm吸光值。
SNP本身是一氧化氮捐獻體的一種，與氧反應會形成亞硝酸(nitrite)，亞硝酸再與Griess reagent反應會變成粉紅色溶液，於波長546nm具有特定吸光值。若樣品能抑制一氧化氮生成的速率而減少亞硝酸產生，其吸光值會降低；吸光值愈低，表示樣品清除一氧化氮自由基的能力越強。依上述分析結果，蘭花芽胚萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)清除一氧化氮自由基能力分別為22.0±1.4%、25.0±1.3%、34.7±1.1%和63.4±1.9%。
綜合上述，本發明係提供一種針對蘭花芽胚切割及萃取技術，從培育、切割及萃取的完整流程，其利用蘭花莖節生長點細胞會不斷分裂和分化的再生特性，擁有高生命力及活性的特質，於非高溫下進行，
可避免低沸點與有效物質揮發及保持生長點組織之生長活性，且所製成的芽胚萃取物之總多酚、總黃酮及植物激素含量高、品質佳，使用於化妝保養產品中，可美白、抗氧化、抗發炎、抗老化、活化能量、保護、修復及防皺等功效，且莖節生長點誘導培育方式可因應大量生產的需求，又配合過濾及去除溶劑作業可獲得活性及穩定性高的萃取物，據以獲致一實用性高與經濟價值高之蘭花活性萃取物，俾使整體確具產業實用性及成本效益，且其構成又未曾見於諸書刊或公開使用，誠符合發明專利申請要件，懇請 鈞局明鑑，早日准予專利，至為感禱。
需陳明者，以上所述乃是本發明之具體實施例及所運用之技術原理，若依本發明之構想所作之改變，其所產生之功能作用仍未超出說明書及圖式所涵蓋之精神時，均應在本發明之範圍內，合予陳明。
Claims (4)
- 一種蘭花芽胚組織萃取物的用途，係用於製備皮膚抗皺、皮膚美白、及保護修復皮膚受UVB造成之光傷害的組合物，其中該蘭花芽胚組織為生長點新側芽的新生植物組織，且該蘭花芽胚組織萃取物的製備方法包括：(a)超音波萃取：將該蘭花芽胚組織放入超音波萃取設備，並於低溫下以該蘭花芽胚組織重量5倍量的純水為溶劑將該蘭花芽胚組織覆蓋浸泡，以製成半成品萃取液；以及(b)過濾及去除溶劑作業：將該半成品萃取液經由抽真空的過濾作業後，再利用減壓濃縮機將該半成品萃取液進行去除溶劑作業，以製成該萃取物。
- 如請求項第1項所述之用途，其中該蘭花為大白蘭花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品種。
- 如請求項第1項所述之用途，其中該生長點新側芽之新生植物組織的取得方法包含：(i)誘導再生新側芽：將該蘭花其開花株的莖節部位之梗芽切出複數段梗芽，並進行培育作業使之長出新側芽；(ii)切除梗芽並擷取新側芽：將該梗芽切除並擷取該新側芽後，取出生長點組織；(iii)去除壁膜：將各小片段之該生長點組織去除壁膜，成為該新生植物組織；以及(iv)收集新生植物芽胚組織：收集預設數量的該生長點新側芽之新生植物芽胚組織。
- 如請求項第1項所述之用途，其中每克該萃取物中沒食子酸(gallic acid)的含量為4.5至5.28mg，且以芸香苷(rutin)的標準曲線來計算，每克該萃取物中類黃酮化合物的含量為4.2至4.75mg。
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