CN109419851A

CN109419851A - 大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用

Info

Publication number: CN109419851A
Application number: CN201710741398.8A
Authority: CN
Inventors: 于朝晖; 张可; 谭昕; 吴亚南; 李萌
Original assignee: Han Yi Biotechnology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Han Yi Biotechnology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2019-03-05

Abstract

本发明公开了大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用，本发明还公开了大麻提取物或大麻二酚在制备祛除皮肤瘢痕的药品或化妆品中的应用，以及大麻提取物或大麻二酚在制备抑制酪氨酸酶活性、促进纤维细胞增殖的药品或化妆品中的用途。

Description

大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用

技术领域

本发明涉及药品及化妆品领域，具体涉及大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用。

背景技术

大麻(学名：Cannabis sativa L.)为大麻科、大麻属植物，又名麻、汉麻、火麻、山丝苗、黄麻，具有重要的农用及医用价值。大麻植株，不同部位均有良好的应用价值，常见使用部位有大麻根、大麻籽、大麻杆、大麻花及大麻叶等。

大麻秆具有和硬木类似的物理机械性能，大麻秆芯是大麻秆去除韧皮纤维后剩余的部分，形态为中空结构，中腔呈线形或椭圆形，常与外形不一，纤维横截面有许多微细孔隙，这种结构使得大麻秆芯富含氧气较多，使厌氧菌无法生存。大麻秆及秆芯产量较高，有利于工业化应用。大麻花，又称“麻勃”，雄株花絮疏松，为复总状花序，有花柄，风媒传粉，开阔地能传播约12km；雌株花序紧密，为穗状花序，雌花很小，无花柄、花瓣，每朵花只有一个雌蕊，由一片绿色苞叶包着。大麻叶有单叶和复叶，且多为掌状复叶，叶序为对生和互生，叶片绿色，上有短茸毛，容易脱落。叶子由叶柄支撑，叶柄长度一般在3-15cm 之间，生长旺盛时，叶子的质量占整个植株质量的24％-25％；在生长后期，由于叶子的脱落等因素，叶子质量仅占整个植株质量的8％-14％。

大麻素是大麻中特有的萜类次生代谢产物，具有复杂的生物活性，目前已分离得到70 多种大麻素，其中主要活性成分为四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。THC与CBD 均具有神经保护作用。THC因具有强致幻性使其应用受限，CBD无成瘾性且具有抗痉挛、抗风湿关节炎及抗焦虑作用，越发成为研究热点。

痤疮是一种常见的皮肤炎症性疾病，与皮脂腺分泌过多、细菌过度生长、毛孔堵塞、内分泌、情绪、遗传、饮食生活习惯、环境、使用不恰当的化妆品等因素相关。大量皮脂的分泌和排出障碍易继发细菌感染，毛囊中存在多种微生物如痤疮丙酸杆菌、白色葡萄球菌和糠秕马拉色菌，其中以痤疮丙酸杆菌感染为最重要。

痤疮的一般症状较为轻微，但是处理不当常常遗留有不同程度的凹陷或增生性瘢痕。中医辨瘢痕为血瘀之证，故治疗药物多取活血化瘀之品；现代医学则认为瘢痕形成的具体机制尚不明确，一般认为瘢痕形成过程中存在成纤维细胞过度增殖及凋亡抑制。

瘢痕形成的效应细胞是成纤维细胞，对于瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕，成纤维细胞存在着广泛的异质性。成纤维细胞胶原合成增加、降解减少导致病理性瘢痕中胶原过度积聚。成纤维细胞的增殖异常是病理性瘢痕过度增生和持续存在的主要原因。成纤维细胞对细胞因子等因素反应性有明显异常。肥厚性瘢痕的收缩和成纤维细胞的异质性有直接关系。

影响瘢痕形成与消退的重要因素是胶原的更新，更新过程主要依赖于胶原酶的作用，而胶原酶主要是由成纤维细胞产生的。结缔组织形成时，新的胶原不断合成，此时胶原酶不仅继续分解残存的胶原，也分解新合成的胶原，胶原纤维的沉积和分解形成动态平衡，使胶原稳固。

然而修复细胞(主要是成纤维细胞)的大量增殖与凋亡抑制、细胞外基质中胶原合成与分解失衡、部分生长因子的大量产生及三者密切的关系构成了病理性瘢痕形成的生物学基础。

在痤疮的治疗方面，市售中成药以口服为主，外用较少，多以清热解毒、活血祛瘀为主要功效，西药方面外用产品居多，如他莫替芬、维A酸类药物、肉毒碱、博来霉素、 TNF-α等大多从抑制成纤维细胞角度在瘢痕治疗上发挥作用，但由于作用不明确、疗效差、复发率较高、难根治等问题，影响推广应用。

专利US20160214920A1主要公开了从工业大麻中提取大麻素的方法，充分利用工业废料提取高纯度的CBD，同时提及了CBD可以用来治疗痤疮。Attila Oláh等(J ClinInvest， 2014Sep 2，124(9)：3713–3724)研究表明CBD可以抑制脂肪生成和抑制血细胞增殖通道，同时还发挥抗炎作用，从而指出CBD具有潜力作为治疗寻常型痤疮的有希望的治疗剂。专利CN106232130A公开了使用芦荟提取大麻植物材料的方法，以及使用该提取物治疗痤疮等皮肤病症。然而上述现有技术中均没有提到大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕，尤其是痤疮留下的痘印中的用途，也没有将大麻提取物或大麻二酚应用到药品或化妆品以祛除皮肤瘢痕或痘印。

发明内容

本申请发明人通过工艺探索将大麻提取物或大麻二酚用于药品和化妆品治疗瘢痕，更令人惊奇的是，发明人发现大麻提取物中的活性物，例如是CBD，对细菌尤其是痤疮丙酸杆菌有杀灭和抑制的作用，可预防痤疮的形成；同时发明人通过实验证明大麻提取物或大麻二酚可以促进表皮细胞增殖以及抑制酪氨酸酶活性，推动痘印加速脱落，消除瘢痕处的色素沉积现状，从而达到淡化痘印的效果。

为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用。

大麻提取物或大麻二酚对新生的痘坑有很好的修复效果，各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。大麻提取物刺激成纤维细胞增殖与生长，在前期可以帮助痘坑处的肌肤快速修复；在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建，而增加胶原蛋白合成，有加速皮肤创面的均一愈合及增加局部抗张力强度等生物学作用。

同时大麻提取物或大麻二酚对于结痂部分的修复机理为：首先，结痂处由于成纤维细胞增殖异常产生过度积聚，需要适当的剥脱剂(如有机酸类物质)帮助祛除多余的表层细胞；其次，大麻提取物可以促进成纤维细胞增生，并且释放胶原酶，此时胶原酶不仅继续分解残存的胶原，也分解新合成的胶原，胶原纤维的沉积和分解形成动态平衡——使得该处肌肤与其他正常肌肤趋向一致。此外，成纤维细胞增殖可以加速细胞剥落，加速祛除黑色素。

优选的，本发明所述的大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用是指非治疗目的的祛除皮肤瘢痕。

本发明所述的大麻二酚(CBD)可以是化学合成产物、生物合成产物、植物提取物或采用其他方式制备得到。优选的，本发明所述的大麻二酚是植物提取物，所述的植物提取部位可以为大麻Cannabis sativa L.的秆芯、花、叶、根和/或籽的外壳，优选为大麻叶提取物。

在本发明的一个实施例中，所述的大麻提取物中按质量百分比含有活性物为50％-99％；优选的，所述的大麻提取物中按质量百分比含有活性物为60％-99％；优选的，所述的大麻提取物中按质量百分比含有活性物为95％-99％。本发明中所述的活性物为去除四氢大麻酚的大麻酚类物质，所述的活性物选自大麻二酚、大麻酚、大麻酚萜、大麻环萜酚、次大麻二酚、四氢次大麻酚、大麻萜酚酯中的一种或两种以上；优选的，所述的活性物为大麻二酚。

在本发明的另一个实施例中，所述大麻提取物中按质量百分比含有1％-99％的大麻二酚。优选的，本发明所述的大麻提取物中按质量百分比含有50％-99％的大麻二酚。更优选的，所述的大麻提取物中按质量百分比含有60％-99％的大麻二酚。特别优选的，本发明所述的大麻提取物中按质量百分比含有95％-99％的大麻二酚。

在本发明的一个实施例中，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.01％-6％；优选的，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.01％-3％；进一步优选的，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.1％-1％；进一步更优选的，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.4-0.6％；特别优选的，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.6％。

本发明所述的瘢痕选自增生性瘢痕、表浅性瘢痕、萎缩性瘢痕、瘢痕疙瘩、挛缩性瘢痕或凹陷性瘢痕；优选的，本发明所述的瘢痕为痘印。

本发明还提供了大麻提取物或大麻二酚在制备祛除皮肤瘢痕的药品或化妆品中的应用；优选的，所述的瘢痕为痘印。

本发明还提供了大麻提取物或大麻二酚在制备抑制酪氨酸酶活性、促进成纤维细胞增殖的药品或化妆品中的应用；优选的，所述的瘢痕为痘印。

优选的，本发明所述的药品或化妆品可以是药学或化妆品领域可接受的任何剂型，包括固体、液体或半固体；所述的化妆品包括气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、洗面奶、分散体、泡沫、凝胶、柔肤水、爽肤水、化妆水、摩丝、软膏、粉末、贴剂、发蜡、溶液、手按泵型喷雾剂、配合棒状物组成的产品形式、配合湿纸巾组成的产品形式；所述的药品优选为膏剂、乳剂、喷雾剂、凝胶剂、贴剂；本发明所述的药品或化妆品还可包含多种任选组分，例如，磨料、缓冲剂、成膜剂、湿润剂、遮光剂、芳香剂、颜料、精油、润肤剂、皮肤抚慰剂、pH调节剂、增塑剂、防腐剂、附加的皮肤调理剂、皮肤渗透增强剂、皮肤保护剂、悬浮剂、乳化剂、增稠剂、增溶剂、防晒剂、紫外线吸收剂或散射剂、免晒美黑剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂，维生素及其衍生物、以及其它天然提取物等。

本发明所述的大麻提取物是由大麻植株提取得到，所述的大麻植株的提取部位，包括秆芯、花、叶、根和/或籽的外壳；所述大麻提取物，可以是将大麻植株不同的植物部位分别提取形成的提取物或提取物的组合，也可以是将大麻植株不同的植物部位或其组合同时提取，得到的提取物或提取物的组合。优选的，本发明所述的大麻提取物为大麻叶提取物。

本发明所述的大麻提取物是通过药学或化妆品领域常规提取方法提取得到，优选通过溶剂提取得到。所述的提取溶剂选自水、低分子醇或其水溶液、乙酸酯、酮、醚或低沸点的烃；所述的低分子醇包括甲醇、乙醇、丁醇或丙醇；所述的乙酸酯包括乙酸甲酯或乙酸乙酯；所述的酮包括丙酮；所述的醚包括甲醚或乙醚；所述的低沸点的烃包括脂肪烃、芳香烃或氯化烃。优选的，所述的提取溶剂选自水或乙醇溶液。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的大麻提取物可以通过以下方法得到：

1)使用提取溶剂或其混合物对原材料加热回流；

2)过滤除去残余物；

3)萃取；

4)调节pH值为2-4；

5)用提取溶剂提取，随后除去溶剂；

6)进行色谱分离，获得大麻提取物。

优选的，所述步骤1)中使用3-10倍量的提取溶剂或其混合物对大麻提取部位加热回流至少1小时；所述的大麻提取物提取方法中步骤3)中所述的萃取溶剂为含有20wt％的乙醇的氢氧化钠水溶液；所述步骤4)中pH调节剂为萃取液与5％硫酸溶液的混合液；所述的大麻提取物提取方法中步骤6)中所述的色谱分离应用的流动相混合物由甲醇/水和乙酸或乙醇/水和乙酸组成。

需要说明的是，本申请中的“3-10倍量”等描述，是指采用的提取溶剂的体积是提取部位质量的3-10倍，比如，大麻提取部位为1g，提取溶剂的用量为3mL-10mL。

1)将原材料粉碎至10-40目，得到粉末；

2)将所得粉末用提取溶剂冷浸提取，得到提取液；

3)将所得的提取液脱色；

4)减压浓缩，即得大麻提取物浸膏。

优选的，所述步骤2)中，用4-8倍量、30％-60％的乙醇冷浸提取1-3次，每次0.5-2小时；所述步骤3)中脱色应用0.1-1wt％活性炭吸附脱色；所述减压浓缩在70℃条件下. 浓缩到相对密度为1.01-1.03。

本发明所述的大麻提取物或大麻二酚能够促进表皮细胞增殖，并且大麻提取物或大麻二酚极低的毒性有助于帮助保护使用产品之后的新生细胞，使产品效果更加持久；大麻提取物或大麻二酚还加速成纤维细胞增殖可以帮助加速角质形成细胞向角质层转移，加速细胞新生并由此推动含痘印的部分加速脱落达到淡化痘印的效果；体外抑制酪氨酸酶活性实验表明，大麻提取物或大麻二酚具有一定的美白功效，可以帮助消除瘢痕处的色素沉积现状，有助于帮助瘢痕处的肤色与其余位置恢复均一；而且大麻提取物或大麻二酚对细菌具有抑制和杀灭作用，适宜应用于痤疮的治疗及预防。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)对酪氨酸酶抑制率的影响，随着浓度的上升，抑制率提高；

图2：大麻叶提取物(50％活性成分，49.8％CBD)对酪氨酸酶抑制率的影响，随着浓度的上升，抑制率提高；

图3：不同浓度的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)对B16细胞相对存活率的影响；

图4：不同浓度的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)作用B16细胞后，细胞内酪氨酸酶活性变化，其中熊果苷为阳性对照，细胞空白为阴性对照；

图5：不同浓度的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)作用B16细胞后，细胞产生黑色素变化量，其中，熊果苷为阳性对照，细胞空白为阴性对照；

图6：不同浓度的大麻叶提取物(A：50％活性物含量，49.8％CBD；B：99％活性物含量，95％CBD)对成纤维细胞的增殖作用的影响，其中空白对照为不含待测药品的培养液。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 大麻提取物的制备

(1)将原材料(大麻叶、大麻秆芯、大麻花)洗净风干；

(2)将上述风干后的原材料粉碎，后过40目筛；

(3)将所得粉末，用6倍量、45％的乙醇冷浸提取2次，每次1.5小时；

(4)合并提取液，经0.5wt％活性炭吸附脱色；

(5)70℃温度条件下，减压浓缩至相对密度1.02，即得大麻提取物浸膏。

按照上述制备方法，

当原材料为大麻叶时，得到大麻提取物1A；

当原材料为大麻花时，得到大麻提取物1B；

当原材料为大麻秆芯时，得到大麻提取物1C；

当原材料为大麻叶和大麻花时，得到大麻提取物1D；

其中大麻提取物1A中含有活性物质量含量为50％，在活性物中大麻二酚的质量含量为90％。

实施例2 大麻提取物的制备

(1)使用9倍量的乙醇对原材料(大麻叶、大麻秆芯、大麻花)加热回流1小时；

(2)过滤除去残余物，真空条件下除去溶剂；

(3)将获得的浸膏在温度约125℃加热约40分钟；

(4)随后进行色谱分离，其中流动相混合物由乙醇/水和乙酸组成，即得大麻提取物。

按照上述制备方法，

当原材料为大麻叶时，得到大麻提取物2A；

当原材料为大麻花时，得到大麻提取物2B；

当原材料为大麻秆芯时，得到大麻提取物2C；

当原材料为大麻叶和大麻花时，得到大麻提取物2D；

其中大麻提取物2A中含有活性物质量含量为80％，在活性物中大麻二酚的质量含量为92％。

实施例3 大麻提取物的制备

(1)使用7倍量的乙醇对原材料(大麻叶、大麻秆芯、大麻花)加热回流1.5小时；

(2)过滤除去残余物；

(3)用5％的氢氧化钠水溶液至少萃取两次，其中氢氧化钠水溶液中含有20wt％的乙醇；

(4)将萃取液与5％的硫酸溶液混合以使pH值约3；

(5)然后使用脂肪烃提取两次，低温真空下除去溶剂；

(6)随后进行色谱分离，其中流动相混合物由乙醇/水和乙酸组成，即得大麻提取物。

按照上述制备方法，

当原材料为大麻叶时，得到大麻提取物3A；

当原材料为大麻花时，得到大麻提取物3B；

当原材料为大麻秆芯时，得到大麻提取物3C；

当原材料为大麻叶和大麻花时，得到大麻提取物3D；

其中大麻提取物3A中含有活性物质量含量为99％，在活性物中大麻二酚的质量含量为95％。

实施例4 用于祛除皮肤瘢痕的洗面奶的制备

配方(质量百分比)：

A相：椰油酰胺MEA 2％，椰油两性醋酸钠7％，乙二醇二硬脂酸酯1.5％，维生素E醋酸酯0.1％，大麻叶提取物(实施例1制备得到的1A)6％，椰油两性醋酸1.4％，去离子水81.74％；

B相：香精0.05％，甲基异噻唑啉酮0.01％；

C相：柠檬酸0.2％。

将A相加热至78℃，搅拌至充分溶解后，降温至40℃，然后加入B相搅拌混合均匀，最后加入C相调节pH至5.5，降温至30℃，过滤出料即得洗面奶。

实施例5 用于祛除皮肤瘢痕的粉底液的制备

配方(质量百分比)：

A相：山梨坦橄榄油酸酯0.5％，月桂基PEG/PPG-18/18聚甲基硅氧烷3％，鲸蜡基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷3％，聚二甲基硅氧烷4％，矿油8％，肉豆蔻酸异丙酯5％, 硬脂酸镁1％，硬脂酸铝1％，尼泊金丙酯0.15％，二氧化钛8％，颜料1.5％；

B相：甘油6％，尼泊金甲酯0.15％，氯化钠1.5％，大麻叶提取物(实施例2制备得到的2A)0.01％，去离子水57.19％。

将A、B相分别在良好搅拌下加热至80℃，充分溶解后，将B相缓慢加入到A相中，均质搅拌并使两相充分均匀混合，冷却至30℃，即得粉底液。

实施例6 用于祛除皮肤瘢痕的喷雾剂的制备

配方(质量百分比)：

A相：1,2-丙二醇6％，乙基己基甘油0.1％，去离子水90.4％；

B相：大麻叶提取物(实施例3制备得到的3A)3％；

C相：DMDM乙内酰脲0.5％。

将A相搅拌加热至85℃，充分溶解后，搅拌冷却到40℃，加入B相、C相各料，搅拌均匀后，继续降温至30℃，过滤即得喷雾剂。

实施例7 酪氨酸酶活性抑制实验

一、实验原理

在瘢痕位置常会出现色素沉着，而为了将瘢痕位置的皮肤与正常皮肤颜色恢复均一，则要进行对黑色素合成的研究，黑色素是在黑素细胞内合成的一种高分子生物色素。在细胞内合成，在从黑素细胞中输送到角朊细胞，并随着角朊细胞的成熟而分散到表皮各层，最后随表皮脱落而消失。针对其形成途径，本实验通过细胞生物学法和分子生物学的方法对工业大麻叶提取物美白功效进行研究。

细胞水平主要测定工业大麻叶提取物对黑色素细胞中的酪氨酸酶活性以及黑色素含量变化的影响；分子生物学水平，主要研究其对黑色素合成过程中相关重要的基因表达量的影响。本实验选用B16细胞，是因为B16细胞株的基本结构，尤其是黑色素合成过程与人正常的黑色素细胞合成黑色素过程基本一致，而人的原代黑色素细胞很不容易培养，因此在评价美白功效的过程中，选取B16细胞作为合适的模型。

二、实验方法

1、酪氨酸酶抑制率测定

1.1实验方法：

收集对数生长期状态良好的细胞，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将细胞悬浮液调整为10×10⁴cells/mL，接种于96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬浮液，边缘孔用无菌的PBS填充，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，吸取培养基，每孔加入样品100μL，作用72h，加入50μL1％TritionX-100溶液裂解细胞，迅速放入-80℃超低温冰箱冻存1h，随后室温融化，使细胞内的酪氨酸酶释放出细胞外，37℃预温后加入50μL1％左旋多巴溶液，37℃反应2h，于490nm波长下测定每孔吸光度值，每一个浓度设置3个以上副孔，取平均值。

1.2实验样品：

浓度为0.1％、0.5％、1％、2％的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)；

浓度为0.50％、1％、2％、3％的大麻叶提取物(50％活性物含量，49.8％CBD)。

1.3酪氨酸酶抑制率计算公式：

酪氨酸酶抑制率＝1-(各浓度平均吸光度值-对照组平均吸光值)×100％

2、B16-MTT实验

2.1实验方法：

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL(96孔板)，铺板使待测细胞调密度至500个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO₂，37℃孵育，至细胞生长至一定密度，换液加入大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)，使得大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)的浓度分别为5.00％、1.67％、0.56％、0.19％和0.06％，以无大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)的培养液为对照。5％CO₂，37℃孵育24小时，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h，先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD值490nm处测量各孔的吸光值。

2.2培养基：

B16细胞培养使用培养基为：DMEM培养基+10％胎牛血清。

2.3细胞相对存活率计算公式：

细胞相对存活率＝(测定OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)×100％。

3、酪氨酸酶活力测定

3.1实验方法：

收集对数生长期状态良好的细胞，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将细胞悬浮液调整为10×10⁴cells/mL，接种于96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬浮液，边缘孔用无菌的PBS填充，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，吸取培养基，每孔加入样品100μL，作用48h，加入50μL1％TritionX-100溶液裂解细胞，迅速放入-80℃超低温冰箱冻存1h，随后室温融化，使细胞内的酪氨酸酶释放出细胞外，37℃预温后加入50μL1％左旋多巴溶液，37℃反应2h，于490nm波长下测定每孔吸光度值，每一个浓度设置3个以上副孔，取平均值。

3.2实验样品：

浓度为0.2％、1％、5％的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)。

对照品：33mM熊果苷和细胞空白。

3.3酪氨酸酶活力计算公式：

酪氨酸酶活力＝(各浓度平均吸光度值-对照组平均吸光值)×100％

4、黑色素含量测定

收集对数生长期状态良好的B16细胞，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将配置的细胞悬浮液调整为5×10⁴cells/mL加入6孔培养板，每孔加入2mL细胞悬浮液，置于培养箱37℃，5％CO₂环境中培养过夜；吸取培养基，每孔加入不同浓度大麻提取物2mL，作用48h，吸弃培养基，经胰蛋白酶消化，收集至离心管中，离心得到细胞沉淀， PBS洗涤1次，加入1MNaOH(10％DMSO)溶液裂解，放入80℃水浴锅中，水浴30min；振荡混匀，吸取至96孔板；于475nm波长下测定吸光度值。

三、实验结果

1、大麻提取物对酪氨酸酶抑制作用

由图1、2可以看出，大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)和大麻叶提取物(50％活性物含量，49.8％CBD)对酪氨酸酶抑制作用，随着大麻提取物的浓度上升，酪氨酸酶抑制率提高。

2、B16-MTT实验结果

从图3可以看出，在一定的范围内，B16细胞的存活率随大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)浓度的增大而降低，具有一定的浓度依赖性。当大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)浓度5％作用48h细胞相对存活率最低为90.88％，其他浓度下细胞相对存活率均在90.88％之上，不同浓度下对比没有显著性差异，表现为无细胞毒性。

3、酪氨酸酶活力变化结果

考察不同浓度(0.2％、1％、5％)大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)含量作用于B16细胞后细胞内酪氨酸酶活性变化结果，如图4。本次实验以33mM熊果苷为阳性对照，以细胞空白为阴性对照，对实验数据进行显著性分析(p<0.05)。

结果表明浓度为0.2％、1％、5％的大麻叶提取物可以显著降低细胞内酪氨酸酶活力，随着大麻叶提取物浓度的增大，酪氨酸酶活力降低，且浓度为0.2％、1％、5％的大麻叶提取物对酪氨酸酶活力的抑制作用均与阳性对照熊果苷的效果相近，同时浓度为5％的大麻叶提取物对酪氨酸酶的抑制效果最佳，可使酪氨酸酶活力降至73.13％。

4、黑色素含量变化结果

考察不同浓度大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)作用B16细胞后，细胞产生黑色素变化量，结果如图5。本次实验以33mM熊果苷为阳性对照，以细胞空白为阴性对照，对实验数据进行显著性分析，结果表明：不同含量的大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)可以显著减少细胞黑色素的合成量，可使B16细胞内黑色素含量降到之前的73.79％，阳性对照为79.24％，并随着大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)浓度的增大，黑色素含量变低。且不同含量大麻叶提取物对黑色素合成的影响和熊果苷相对比没有显著性差异。

实施例8 成纤维细胞增殖实验(MTT)

一、实验方法

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL(96孔板)，铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO₂，37℃孵育，至细胞生长至一定密度，换液加入不同浓度梯度的待测药品，以不含待测药品的培养液为对照。5％CO₂， 37℃孵育24小时，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。使药物与MTT充分反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT 的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD值490nm处测量各孔的吸光值。

细胞活率＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100％。

二、实验结果

如图6所示，1％浓度及以下的含大麻叶提取物(99％活性物含量，95％CBD)和大麻叶提取物(50％活性物含量，49.8％CBD)的化妆品对成纤维细胞无毒性，且有促进增殖的效果。而加速细胞增殖可以帮助加速角质形成细胞向角质层转移，加速细胞新生并由此推动含痘印的部分加速脱落达到淡化痘印的效果。

实施例9 人体安全试验

本试验符合《化妆品安全技术规范》中人体安全性检验方法的相关规定。

本试验前已完成必要的毒理学检验，检验结果为合格。

人体皮肤斑贴试验-皮肤封闭型斑贴试验

1.试验目的

检测受试物引起人体皮肤不良反应的潜在可能性。

2.试验材料

2.1试验产品

实施例4-6中涉及的3种药品/化妆品，分别选用每种产品的配方进行试验人体安全性试验)，共3个产品。

2.2斑试材料

面积不超过50mm²、深度约1mm的合格斑试器材。

3.受试者的选择

符合要求的社会志愿者90名，年龄20-45岁，男30名，女60名，按产品分为3组，每组30名，按组分别试用实施例4-6中所列3类产品中的配方，其中每组10名男性，20 名女性。

4.试验方法

4.1分别取受试产品0.020g-0.025g(固体或半固体)或0.020mL-0.025mL(液体)，放入斑试器小室内。

4.2对照孔不做任何处理。

4.3将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。

4.4分别于去除受试物斑器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表1标准观察皮肤反应。

表1皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

5.试验结果

所有产品的试验结果均呈现阴性反应，证明本发明提供的化妆品安全性有保证，不会产生皮肤刺激性、致敏性(易过敏人群或对本品过敏的人群除外)等不良反应；

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用。

2.根据权利要求1所述的大麻提取物或大麻二酚在祛除皮肤瘢痕中的应用，其特征在于，所述的瘢痕为增生性瘢痕、表浅性瘢痕、萎缩性瘢痕、瘢痕疙瘩、挛缩性瘢痕或凹陷性瘢痕；优选的，所述的瘢痕为痘印。

3.大麻提取物或大麻二酚在制备祛除皮肤瘢痕的药品或化妆品中的应用。

4.大麻提取物或大麻二酚在制备抑制酪氨酸酶活性、促进成纤维细胞增殖的药品或化妆品中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的大麻提取物中按质量百分比含有活性物为50％-99％，所述的活性物为去除四氢大麻酚的大麻酚类物质，优选的，所述的活性物选自大麻二酚、大麻酚、大麻酚萜、大麻环萜酚、次大麻二酚、四氢次大麻酚、大麻萜酚酯中的一种或两种以上。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的大麻提取物中按质量百分比含有大麻二酚为1％-99％；优选的，所述的大麻提取物中按质量百分比含有大麻二酚为50％-99％。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的药品或化妆品中按质量百分比含有大麻提取物或大麻二酚为0.01％-6％。

8.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的药品或化妆品可以是药学或化妆品领域可接受的任何剂型，所述的药品优选为膏剂、乳剂、喷雾剂、凝胶剂、贴剂；所述化妆品选自气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、洗面奶、分散体、泡沫、凝胶、柔肤水、爽肤水、化妆水、摩丝、软膏、粉末、贴剂、发蜡、溶液、手按泵型喷雾剂、配合棒状物组成的产品形式、配合湿纸巾组成的产品形式。

9.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的大麻提取物是由大麻植株提取得到，所述的大麻植株的提取部位包括秆芯、花、叶、根和/或籽的外壳。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的大麻植株的提取部位为大麻叶。

11.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的大麻提取物通过溶剂提取得到，所述的溶剂选自水、低分子醇或其水溶液、乙酸酯、酮、醚或低沸点的烃。

12.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的大麻提取物可以通过以下方法得到：

1)使用提取溶剂或其混合物对大麻植株的提取部位加热回流；

2)过滤除去残余物；

3)萃取；

4)调节pH值为2-4；

5)用提取溶剂提取，随后除去溶剂；

6)进行色谱分离，获得大麻提取物；或者，

1)将大麻植株的提取部位粉碎至10-40目，得到粉末；

2)将所得粉末用提取溶剂冷浸提取，得到提取液；

3)将所得的提取液脱色；

4)减压浓缩，即得大麻提取物浸膏。