CN112263520B - 一种乌发组合物、乌发精华液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乌发组合物、乌发精华液及其应用，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05～10份、甘草亭酸0.01～5份、何首乌提取物0.01～10份、女贞子提取物0.01～5份、人参提取物0.01～5份和多元醇5～20份。所述乌发组合物通过组分的筛选和复配，能够有效渗透吸收到头皮和毛囊中，更新和修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞生长、功能性黑色素细胞的成熟转变以及黑色素的生成，激活酪氨酸酶，从黑色素的形成通路上进行调控和修复，快速实现乌发、改善灰发和白发的目的。同时，所述乌发组合物能够维护头发生长环境的稳定和健康，实现持久的乌发效果。

Description

一种乌发组合物、乌发精华液及其应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种乌发组合物、乌发精华液及其应用。
背景技术
头发是人体的重要附属器，具有保护、修饰以及其他生理功能。近年来，随着社会的不断发展，城市生活节奏加快，人们的日常工作逐渐从体力劳动向脑力劳动转变，工作和竞争压力增大，饮食作息不规律，上述因素都有可能导致头发的生长出现异常，从而过早出现白发、脱发等问题，给人们的身体和情绪带来负面影响。
白发的成因包括遗传、衰老和疾病等多方面的因素，中医认为，白发的形成与肝肾不足、血气虚弱有关；现代医学认为：白发的主要成因在于黑色素减少，毛球中黑素细胞生成黑色素的功能减退，酪氨酸酶活性降低或丧失，毛干中缺乏黑色素等。白发虽然不会直接危及生命，但是会影响人的外在形象，给人带来不容忽视的心理压力和精神负担。因此，研究一种切实有效的乌发方法具有重要意义。
目前市场上的乌发产品包括染发剂、洗发水和护发素等。其中，染发剂以氧化型染发剂和模拟黑色素生成过程的染发剂居多，上述染发剂中没有直接添加染料，而是加入染料中间体、改性剂、偶合剂或生成黑色素中间体。使用上述染发剂可以使被染头发的色调具有良好的持久性，但头发以每月12mm的速度生长，新生长的头发依然是白发，因此是一种治标不治本的乌发产品。
为了实现彻底的乌发功效，通过中药组方进行内源性防治是目前的主要手段。例如CN107007745A公开了一种乌发的药物，所述药物由以下重量份的原料组成：制黄精2～4份，制何首乌2～4份，补骨脂2～4份，熟地黄2～4份，黑芝麻2～4份，女贞子1～3份，当归1～3份，松叶1～2份；所述药物的制备方法和使用方法为：将原料粉碎，用蜂蜜调匀制成约9g的丸状，口服，每日早晚各1丸。该药物主治白发、脱发等，具有较高的药用价值；但是，口服中药剂的起效慢，而且长期口服中药会给肝脏和肾脏带来代谢负担，甚至导致肝脏或肾脏损伤。
CN107412444A公开了一种生发乌发养发的中药洗发药物，由如下组分制成：茶麸、旱莲草、侧柏叶、骨碎补、洗手果、菟丝子、首乌、当归、桑白皮和人参，所述中药洗发药物为浴粉剂、水剂、粉散剂或泡腾剂，用于头发清洗后，具有生发乌发固发、毛发再生和白发变黑等功效。但是，中药洗发药物在头发和头皮处的停留时间较短，使用效果并不明显。
现有技术中，内源性防治白发的中药组分通常包含何首乌、黑芝麻、人参和当归，长期口服中药制剂会给肝脏和肾脏带来代谢负担。洗发类产品中的有效成分在头皮和头发上的停留时间较短，导致其功效性欠佳；而且，具有乌发功效的洗护产品通常由多种中药和植物提取物组合而成，存在一定的透皮吸收问题，起效慢，具有明显的黏腻感，使用体验不佳。
因此，开发一种能够从根源上促进黑色素生成、起效快、乌发效果和使用体验好的乌发产品，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乌发组合物、乌发精华液及其应用，所述乌发组合物通过六种有效组分的筛选和协同复配，具有良好的头皮吸收性和功效性，能够深入毛囊，更新和修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞生长，对黑色素的形成通路进行针对性地修复和调理，从根源上实现乌发、改善灰发和白发的功效。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种乌发组合物，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05～10份、甘草亭酸0.01～5份、何首乌提取物0.01～10份、女贞子提取物0.01～5份、人参提取物0.01～5份和多元醇5～20份。
本发明中，所述樱花花提取物从樱花花瓣中提取得到，其中包括总黄酮、多糖、多酚和皂苷等活性物质，能够促进毛发生长，尤其在修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长、改善酪氨酸酶活性和促黑色素生成方面具有显著功效。所述甘草亭酸具有舒缓抗炎、免疫调节和促进细胞再生的作用，有利于毛母细胞和黑色素细胞的生长。所述何首乌提取物中包括卵磷脂和蒽醌类化合物等，能够延缓细胞衰老，调节头皮微环境，改善白发和灰发。所述女贞子提取物中包含齐墩果酸、多糖类和脂肪油等有效成分，能够滋养头皮和头发，具有显著的乌发功效。所述人参提取物中含有丰富的皂苷和多糖类成分，能够增强头皮的细胞活性，促进头发的生长和修复。所述多元醇具有良好的渗透性和保湿性，能够促进多种活性物质的均匀分散和良好透皮吸收。
本发明提供的乌发组合物通过樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇的协同复配，能够有效渗透吸收到头皮和毛囊中，更新和修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞生长、功能性黑色素细胞的成熟转变以及黑色素的生成，激活酪氨酸酶，从黑色素的形成通路上进行调控和修复，快速实现乌发、改善灰发和白发的目的。同时，所述乌发组合物能够对头皮、毛囊和头发生长的微环境进行调控，维护头发生长循环的稳定和健康，实现持久的乌发效果。
本发明中，所有组分的含量(重量份数)、质量比或质量百分含量都是以有效成分(或活性物质)的含量进行计算，组分中的溶剂或提取剂等不计入含量中。
本发明中，所述樱花花提取物的含量为0.05～10份，例如0.08份、0.1份、0.15份、0.2份、0.4份、0.5份、0.8份、1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或9.5份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述甘草亭酸的含量为0.05～5份，例如0.08份、0.1份、0.3份、0.5份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.2份、4.5份或4.8份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述何首乌提取物的含量为0.01～10份，例如0.03份、0.05份、0.08份、0.1份、0.15份、0.2份、0.4份、0.5份、0.8份、1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或9.5份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述女贞子提取物的含量为0.01～5份，例如0.03份、0.05份、0.08份、0.1份、0.3份、0.5份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.2份、4.5份或4.8份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述人参提取物的含量为0.01～5份，例如0.03份、0.05份、0.08份、0.1份、0.3份、0.5份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.2份、4.5份或4.8份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述多元醇的含量为5～20份，例如6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份或19份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷。
优选地，所述樱花花提取物通过如下方法浸提得到，所述方法包括：使用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂为C3～C6(例如C3、C4、C5或C6)多元醇、乙醇和水的组合物。
作为本发明的优选技术方案，所述樱花花提取物从樱花花瓣中提取得到，所用提取剂包括小分子多元醇、乙醇和水的组合物，通过提取剂组分的筛选和优化，更有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的有效成分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有更加丰富的活性物质，尤其具有高的总黄酮含量，从而表现出优异的促黑色素细胞生长、促进黑色素生成和激活酪氨酸等乌发功能。而且，通过所述提取剂浸提得到的樱花花提取物能够用于水剂和乳化剂等多种剂型的洗发、护发和养发产品中，应用广泛。
优选地，所述C3～C6多元醇包括1,2-己二醇、甲基丙二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合。
优选地，所述提取剂中C3～C6多元醇的质量百分含量为35～55％，例如36％、38％、40％、42％、44％、45％、47％、49％、50％、51％、53％或54％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂中乙醇的质量百分含量为15～40％，例如16％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、37％或39％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
优选地，所述浸提的温度为60～100℃，例如62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃、95℃或98℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述浸提的时间为0.5～3h，例如0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h或2.8h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述樱花花瓣与提取剂的质量比为1:(40～80)，例如1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60、1:62、1:65、1:68、1:70、1:72、1:75、1:77或1:79等。
优选地，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5～7％，例如5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％或6.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7～1％，例如0.72％、0.74％、0.76％、0.78％、0.8％、0.82％、0.84％、0.86％、0.88％、0.9％、0.92％、0.94％、0.96％或0.98％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2～1.6％，例如1.22％、1.25％、1.28％、1.3％、1.32％、1.35％、1.38％、1.4％、1.42％、1.45％、1.48％、1.5％、1.52％、1.55％、1.57％或1.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4～0.6％，例如0.41％、0.43％、0.45％、0.47％、0.49％、0.5％、0.51％、0.53％、0.55％、0.57％或0.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述多元醇包括己二醇、戊二醇、丁二醇或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，以所述樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇的总质量为100％计，所述樱花花提取物的质量为10～30％，例如11％、13％、15％、17％、19％、20％、21％、23％、25％、27％或29％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
作为本发明的优选技术方案，以所述樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇的总质量为100％计，所述樱花花提取物的质量为10～30％，能够使所述乌发组合物不仅能够促进酪氨酸酶活性、修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长、使毛囊恢复黑色素生成功能，而且可以针对受损的头皮微环境进行舒缓和免疫调节，延缓细胞衰老，调控头皮和头发生长的微环境，形成健康稳态的头皮生态。如果樱花花提取物含量过低，则会直接影响所述乌发组合物的乌发效果，而樱花花提取物含量过高，则不利于头皮健康微环境的重建，使乌发组合物的显效慢，而且不利于乌发效果的持久性和稳定性。
优选地，所述乌发组合物还包括溶剂。
优选地，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
优选地，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物1～10份、甘草亭酸0.1～5份、何首乌提取物0.5～10份、女贞子提取物0.1～5份、人参提取物0.1～5份和多元醇5～15份；所述樱花花提取物通过如下方法浸提得到，所述方法包括：使用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂为C3～C6多元醇、乙醇和水的组合物。
本发明所述乌发组合物通过将各组分混合均匀制备得到，具体包括：将樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物、多元醇和任选的溶剂混合均匀，得到所述乌发组合物。
优选地，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1,3-丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
所述制备方法中，溶剂的添加量可以根据实际应用中对于有效成分的浓度要求进行调节；为了增加各组分在溶剂中的溶解度，可以在混合过程中适度加热(优选温度≤85℃，避免高温造成有效成分失活)。
另一方面，本发明提供一种乌发化妆品，所述乌发化妆品包括如第一方面所述的乌发组合物。
优选地，所述乌发化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
另一方面，本发明提供一种乌发精华液，所述乌发精华液包括如第一方面所述的乌发组合物。
优选地，所述乌发精华液中乌发组合物的质量百分含量0.1～60％，例如0.15％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、13％、15％、17％、19％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％、50％、52％、52％或58％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述乌发精华液中还包括溶剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、抗氧化剂、增稠剂、防腐剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述溶剂包括水和/或醇类溶剂。
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述增溶剂包括PEG-40氢化蓖麻油和/或PPG-26-丁醇聚醚-26；
优选地，所述抗氧化剂包括生育酚。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的乌发组合物包含樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇，通过组分之间的协同配合，能够有效渗透吸收到头皮和毛囊中，激活酪氨酸酶，更新和修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞生长、功能性黑色素细胞的成熟转变以及黑色素的生成，从黑色素的形成通路上进行调控和修复，快速实现乌发、改善灰发和白发的目的；同时，所述乌发组合物能够对头皮、毛囊和头发生长的微生态系统进行调控，维护头发生长循环的稳定和健康，实现持久的乌发效果。
(2)本发明所述樱花花提取物通过特定组分的提取剂浸提得到，能够使樱花花瓣中不同极性和溶解性的活性成分充分浸出，樱花花提取物中含有更丰富的总黄酮、多酚、多糖和皂苷等乌发活性物质。
(3)本发明提供的乌发组合物及包含其的乌发精华液温和无刺激性，能够上调VEGF蛋白水平，促进VEGF表达，对酪氨酸酶的激活率可以达到20～24.5％，使B16黑色素瘤细胞中的黑色素含量提升至7.6～8.13％，在动物模型实验中使用15天时表现出显效乌发，能够逆转因外界氧化因素导致的白发产生，从根源上改善白发和灰发。
附图说明
图1为实施例1提供的乌发组合物对黑花色豚鼠用药实验的结果图；
图2为实施例1提供的乌发组合物对黑花色豚鼠用药实验的VEGF免疫组化染色图，其中，(a)为乌发组合物实验组，(b)为安慰剂模型对照组。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
一种樱花花提取物，通过如下方法提取得到：向2kg樱花干花瓣粉(细度为50目)中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇25％，水25％)，在80℃条件下浸提2.5h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例2
一种樱花花提取物，通过如下方法提取得到：向2kg樱花干花瓣粉(细度为50目)中加入100kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇20％，甲基丙二醇15％，乙醇40％，水25％)，在90℃条件下浸提2h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例3
一种樱花花提取物，通过如下方法提取得到：向2kg樱花干花瓣粉(细度为50目)中加入150kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇40％，甲基丙二醇15％，乙醇15％，水30％)，在75℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例4
一种樱花花提取物，通过如下方法提取得到：向2kg樱花干花瓣粉(细度为50目)中加入130kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇20％，1,3-丁二醇15％、甘油10％、乙醇25％，水30％)，在80℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例5
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇35％，甲基丙二醇35％，乙醇15％，水15％。
制备例6
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇15％，甲基丙二醇15％，乙醇35％，水35％。
制备例7
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇50％。
制备例8
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，水50％。
制备例9
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：乙醇50％，水50％。
制备例10
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂为乙醇。
制备例11
一种樱花花提取物，与制备例1的区别仅在于，提取剂为去离子水。
实施例1
一种乌发组合物，其组分配方如表1所示，配方中各组分的单位均为重量份。
表1
Figure BDA0002753513250000121
Figure BDA0002753513250000131
表1中，何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物购自湖南佳沐生物科技有限公司，樱花花提取物的重量份以有效成分的含量计算(不含溶剂和提取剂)。
按照表1中的组分配方将各物料混合均匀，得到所述乌发组合物。
实施例6～15
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，将其中的樱花花提取物(制备例1)分别替换为制备例2～11提供的樱花花提取物。
对比例1～6
一种乌发组合物，其组分配方如表2所示，配方中各组分的单位均为重量份。
表2
对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
樱花花提取物 0 6.5 6.5 6.5 6.5 9.5
甘草亭酸 3 0 3 3 3 0
何首乌提取物 5 5 0 5 5 5
女贞子提取物 2 2 2 0 2 2
人参提取物 3.5 3.5 3.5 3.5 0 3.5
1,6-己二醇 10 10 10 10 10 10
对比例7
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，将其中的樱花花提取物用等量的黑芝麻素提取物替换。
性能测试1
对制备例1～11中的樱花花提取物进行组分含量测试，方法如下：
(1)总黄酮测试标准曲线的建立：
以芦丁标准品配制浓度为0.416mg/mL的芦丁标准溶液(溶剂为30％乙醇)，分别取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL，用30％乙醇定容为5mL；然后分别加入0.3mL Al(NO3)3溶液(浓度为10％)、0.3mL 5％NaNO2溶液(浓度为5％)、3mL NaOH溶液(1mol/L)和1.4mL 30％乙醇；反应15min后在510nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到芦丁标准曲线：Y＝6.0769X+0.0084，R2＝0.9998。
(2)多糖测试标准曲线的建立：
以葡萄糖标准品配制浓度为0.1001mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，用纯水定容为2mL；然后分别加入1mL苯酚溶液(浓度为5％)和5mL浓硫酸，反应15min后冷水中冷却显色30min；在490nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到葡萄糖标准曲线：Y＝54.781X-0.0028，R2＝0.9992。
(3)多酚测试标准曲线的建立：
以没食子酸标准品配制浓度为0.1001mg/mL的没食子酸标准溶液，分别取0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，分别加入5mL蒸馏水和1.5mL F-C试剂，混合静置4min；然后加入3mL碳酸钠溶液(浓度为10％)，避光静置60min，紫外检测最大吸收波长，得到没食子酸标准曲线：Y＝117.1X+0.0226，R2＝0.9994。
(4)皂苷测试标准曲线的建立：
以齐墩果酸标准品(98％)配制浓度为0.100mg/mL的齐墩果酸标准溶液(溶剂为甲醇)，0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL，70℃加热挥干甲醇，分别加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(香草醛浓度为5％)和0.3mL高氯酸溶液，70℃水浴条件下反应16min，冰水浴中停止反应5min；然后加入5mL冰醋酸，放置22min后，在540nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到齐墩果酸标准曲线：Y＝77.577X+0.0643，R2＝0.9931。
将制备例1～11中的樱花花提取物稀释100倍，用于总黄酮含量的检测；将樱花花提取物稀释50倍，分别用于多糖和多酚含量的检测；将樱花花提取物稀释20倍，分别用于皂苷含量的检测。
根据上述实验方法分别测试紫外吸光度值，然后将吸光度代入对应的标准曲线中，通过换算得到各组分的质量百分含量，然后以提取方法中所用的樱花干花瓣粉的质量为100％计，计算出所述樱花花提取物中总黄酮、多酚、多糖和皂苷的质量。具体数据如表3所示。
表3
Figure BDA0002753513250000151
Figure BDA0002753513250000161
根据制备例1～11中的提取方法和表3的测试数据可知，采用小分子多元醇、乙醇和水的混合提取剂能够使樱花花瓣中不同极性和溶解性的活性物质充分浸出，使得到的樱花花提取物中包含丰富的总黄酮、皂苷、多糖和多酚等活性成分。如果提取剂并非小分子多元醇、乙醇和水的组合(制备例7～11)，则得到的樱花花提取物中活性物质的含量明显较低，尤其对于总黄酮的提取量影响最大，其含量＜4％，显著低于制备例1～6所述樱花花提取物中总黄酮的含量。
性能测试2
对实施例1～15提供的乌发组合物进行安全性评价，方法如下：
(1)细胞毒性实验
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，HaCaT细胞的细胞毒性测试数据可作为对皮肤安全性的参考数据。将对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，细胞浓度为5×104/mL，37℃、5％CO2条件下培养24h使细胞贴壁生长；将96孔板中的细胞分为15组，分别对应实施例1～15(实验组)和空白对照，每组设置6个复孔；吸出旧的培养基，PBS清洗后，以每孔0.1％的浓度向实验组中加入实施例1～15提供的乌发组合物，37℃、5％CO2条件下培养48h后，再加入终浓度为5mg/mL的MTT 10μL继续培养4h；终止培养，吸弃上清，向每个孔中加入50μL DMSO，置于培养箱中10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪570nm处测定各孔的光密度值(OD值)，计算细胞存活率＝(OD实验–OD0)/(OD对照–OD0)，其中，OD0为培养基的OD值。
(2)3D皮肤刺激性实验
按照OECD 439欧盟标准测试方法进行实验，具体方法如下：
实验组：将实施例1～15提供的乌发组合物局部接触约0.38cm2的皮肤模型表面15min；阴性对照组为PBS，阳性对照组为SDS(十二烷基磺酸钠)，处理方法与实验组相同。
接触15min后用PBS冲洗皮肤模型，浸入维持培养基(2mL)中，在饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育42h；然后浸入MTT溶液(2mL，0.3mg/mL，溶剂为测试培养基)中，饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育3h；MTT反应完成后的皮肤模型浸入500μL酸化异丙醇的离心管中，混匀后在室温避光条件下过夜，然后从离心管中取出200μL液体样品置于96孔板中，在酶标仪570nm处读取各孔的OD值，以酸化异丙醇溶液作为空白对照；取3次测试结果的平均值进行计算，相对细胞活力百分比＝OD实验/OD阴性对照。
(3)人体斑贴皮肤刺激性
将实施例1～15提供的乌发组合物制成乌发精华液，用于人体斑贴皮肤刺激性的测试；乌发精华液的配方如表4所示。
表4
Figure BDA0002753513250000171
Figure BDA0002753513250000181
将上述乌发精华液(25μL)分别滴加于斑试器所附的滤纸片上，置于斑试器内；将滴加有乌发精华液的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂曲侧，用于手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h；去除受试斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次；封闭型斑贴试验的皮肤反应评判标准如表5所示。
表5
Figure BDA0002753513250000182
30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定为对人体有皮肤不良反应。
选450名皮肤健康的18～50岁的志愿者，随机分成15组，分别使用实施例1～15提供的乌发组合物制成的乌发精华液，记录封闭型斑贴试验的评分，得到人体斑贴皮肤刺激性实验结果。
按照上述实验方法从细胞毒性、3D皮肤刺激性和人体斑贴皮肤刺激性三个方面对实施例1～15提供的乌发组合物进行安全性测试，结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002753513250000191
根据表6的数据可知，本发明实施例1～15提供的乌发组合物不影响HaCaT细胞的生长和增殖，对3D皮肤模型温和无刺激性，在人体斑贴皮肤刺激性实验中表现出较高的安全性，证明本发明提供的乌发组合物对人体皮肤温和无刺激性，无不良反应，安全性好。
性能测试3
对实施例1～15、对比例1～7提供的乌发组合物进行细胞水平的乌发功效性测试，方法如下：
(1)酪氨酸酶激活率
配制0.5mg/mL的L-酪氨酸溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，配制35mg/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，用丙二醇为溶剂配制1mg/mL的待测样品溶液(分别测试实施例1～15、对比例1～7提供的乌发组合物)作为对比测试组)。
按照如下比例配制4组溶液：
A：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL纯丙二醇+0.6mL磷酸缓冲液；
B：0.7mL纯丙二醇+1.3mL磷酸缓冲液；
C：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
D：0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
将上述4组溶液在37℃水浴中恒温10min后，各加入0.3mL酪氨酸酶溶液，反应5min后，迅速移入比色皿中，在475nm处测吸光度值(OD值)，记录OD值，并按照公式“酪氨酸酶激活率＝100％×((ODC-ODD)-(ODA-ODB))/(ODA-ODB)”进行计算；其中，(ODA-ODB)代表没有激活剂条件下的反应液的OD值改变，(ODC-ODD)代表有激活剂(实施例1～15、对比例1～7提供的乌发组合物)条件下的反应液的OD值改变。
(2)黑色素含量测试
将B16黑色素瘤细胞悬液的密度调成1×105个/mL，每孔1mL接种于12孔板，使细胞密度为5×104个/孔，置于培养箱(37℃、5％二氧化碳)培养24h。取出12孔板，抽除培养基，加入1mL含待测样品(实施例1～15、对比例1～7提供的乌发组合物，浓度为1mg/mL)的培养基，空白对照组和调零组加入1mL不含待测样品的培养基，继续置于培养箱培养12h后，抽除培养基。实验组和调零组每孔加入1mL用RPMI 1640培养基配制1μM的α-MSH溶液，空白组加入1mL不含α-MSH的培养基，置于培养箱培养36h后。分别用1mL PBS洗两次，每孔加入100μL1N含10％DMSO的NaOH溶液(用PBS配制)，在80℃的水浴锅中水浴1h后，将12孔板中各组的细胞溶出物转移到96孔板中，在酶标仪475nm处测定各孔的吸光度OD值。计算胞内黑色素含量的公式为：黑色素含量＝100％×(OD1-OD3)/(OD2-OD3)，其中，OD1为实验组的吸光度值，OD2为空白对照组的吸光度值，OD3为调零组的吸光度值。
按照上述实验方法分别测试实施例1～15、对比例1～7提供的乌发组合物对酪氨酸酶激活率和黑色素含量的影响，具体测试数据如表7所示。
表7
Figure BDA0002753513250000211
Figure BDA0002753513250000221
根据表7的数据可知，本发明实施例1～9提供的乌发组合物对酪氨酸酶的激活率可以达到20～24.5％，使B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量提升至7.6～8.13％，证明其对于黑色素的生成具有显著的促进作用，具有优异的乌发功效。
对比实施例1～5的数据可知，本发明所述乌发组合物中，以樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇的总质量为100％计，核心组分樱花花提取物的质量为10～30％，能够使乌发组合物对酪氨酸酶和黑色素的促进作用可以达到最佳(实施例1～3)，酪氨酸酶的激活率高达22～24.5％；如果樱花花提取物的含量低于10％(实施例5)，则会使所述乌发组合物的促黑色素生长效果有所下降。
结合表7中实施例1、实施例11～15的数据以及制备例1、7～11的浸提取方法可知，本发明所述乌发组合物中，樱花花提取物通过小分子多元醇、乙醇和水的混合提取剂进行浸提，能够使樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分充分浸出，使得到的樱花花提取物中含有更多的活性物质，从而具有更好的激活酪氨酸酶和促黑色素生成的效果。如果混合提取剂并非小分子多元醇、乙醇和水的组合，则会影响樱花花瓣中乌发活性物质的浸出，进而导致乌发组合物的促黑色素生成功效显著降低。
本发明提供的乌发组合物中，樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇协同复配，赋予了所述乌发组合物优异的酪氨酸酶激活效果和促进黑色素生成性能，各原料组分缺一不可，任一组分的缺失都会导致组合物的功效性降低，甚至不具有激活酪氨酸酶的性能(对比例1～6)。此外，本发明所述乌发组合物中引入通过特定方法提取得到的樱花花提取物作为核心成分，该组分及其与其他组分协同作用对乌发性能具有重要贡献；如果将其用传统的乌发活性物质黑芝麻素替换(对比例7)，则会使酪氨酸酶激活率和黑色素含量降低，乌发效果不理想。
性能测试4
对所述乌发组合物进行动物水平的乌发功效检测，方法如下：
(1)建立动物模型
取健康黑花色豚鼠45只，用剪刀剪去背部黑毛区长毛，不可损伤皮肤；按体重随机分为3组(A组：乌发组合物组；B组：模型对照组；C组：正常对照组)，每组15只，每组均用5％过氧化氢外涂豚鼠受试区40天，每天2次，每次用2mL，使其毛发变为白色。造模成功后，每组随机取一只豚鼠切取适当大小的实验区皮肤组织做病理切片，观察皮肤组织和毛囊的黑色素变化。
(2)实验方法
以上3组豚鼠造模成功后，A组涂抹本发明实施例1提供的乌发组合物对应的乌发精华液(精华液配方与表4相同)，B组涂抹不含有乌发组合物的安慰剂(将表4中的乌发组合物用水替换)，C组不做处理；每日涂抹1次，每次2mL，连续涂抹15天，在1天、5天、10天和15天分别进行观察。
对以上3组的改善效果进行观察，选取用药部位中心9cm2处为观察单位判定效果，A组在用药15天后黑毛≥85％，对白毛的改善效果十分显著；B组和C组在处理15天后效果相当，黑毛比例均明显小于A组，B组的黑毛约为25～30％，对白毛的改善效果不明显；A组(实验组)和B组(模型对照组)的光学图片如图1所示。由此可见，本发明提供的乌发组合物具有显著的乌发效果，能够有效改善白发和灰发，逆转了因外界氧化因素导致的白发产生。
性能测试5
对使用所述乌发组合物的乌发精华液的豚鼠背部的皮肤进行免疫组化染色，获得乌发通路靶点的表达水平，乌发精华液的配方与表4相同；具体测试方法如下：
按照性能测试4中的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，用10％甲醛固定，进行常规组织脱水，石蜡包埋，进行VEGF免疫组化染色。
VEGF是血管内皮生长因子，又称血管通透性因子，是毛囊起源的一种血管生成因子，可由毛囊的毛鞘细胞、毛乳头细胞以及外毛根鞘细胞合成和分析，在生长期时毛囊中的VEGF浓度比较高，但在退化期以及休止期发现毛囊中的VEGF明显消减。VEGF促进毛发生长的可能机制为：促进毛乳头细胞的增殖和迁移、诱导毛囊周围血管的形成、刺激合成蛋白酶，促进毛囊重塑、改变和提高血管内皮细胞的通透性，从而促进营养物质的跨内皮转运，使供给毛囊的营养物质增加。
VEGF一抗工作浓度为1:100，免疫组化染色的具体实验步骤按照SABC试剂盒说明书进行，用PBS替换VEGF一抗作为阴性对照，以细胞膜或胞浆出现棕黄色产物为阳性结果，苏木素轻度复染细胞核。
在荧光显微镜下进行观察，获得VEGF免疫组化染色图如图2所示，其中，(a)为含有乌发组合物的实验组(A组)，(b)为不含有乌发组合物的安慰剂模型对照组(B组)；从图2中可知，与使用安慰剂的模型对照组相比，本发明实施例1提供的乌发组合物及包含其的乌发精华液具有促进VEGF表达的作用。
将图2中的各点的光密度值进行累加，得到IOD值，实现对VEGF免疫组化染色的定量分析结果，实施例1所述乌发组合物对应的乌发精华液处理后的A组IOD达到35000，不含乌发组合物的安慰剂模型对照组的IOD为21000，证明了本发明所述乌发组合物及包含其的乌发精华液能够促进细胞中VEGF的表达。
通过上述实验结果可以得知，本发明提供的乌发组合物能能够促进VEGF表达，从黑色素形成通路上进行促进黑色素细胞的修复和生长，从根源上促使黑色素细胞再生，令毛囊恢复生产黑色素的功能，从而让白发重新变黑，逆转和修复因外界氧化因素导致的白发。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种乌发组合物、乌发精华液及其应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (24)

1.一种乌发组合物，其特征在于，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05~10份、甘草亭酸0.01~5份、何首乌提取物0.01~10份、女贞子提取物0.01~5份、人参提取物0.01~5份和多元醇5~20份；
所述樱花花提取物通过如下方法浸提得到，所述方法包括：使用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂为C3~C6多元醇、乙醇和水的组合物；
所述C3~C6多元醇包括1,2-己二醇、甲基丙二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合；
所述提取剂按照质量百分含量包括：C3~C6多元醇35~55%，乙醇15~40%，余量为水；
以所述樱花花提取物、甘草亭酸、何首乌提取物、女贞子提取物、人参提取物和多元醇的总质量为100%计，所述樱花花提取物的质量为10~30%。
2.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷。
3.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述C3~C6多元醇为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合。
4.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述浸提的温度为60~100℃。
5.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述浸提的时间为0.5~3 h。
6.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花瓣与提取剂的质量比为1:(40~80)。
7.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣。
8.根据权利要求2所述的乌发组合物，其特征在于，以待提取的樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5~7%。
9.根据权利要求2所述的乌发组合物，其特征在于，以待提取的樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7~1%。
10.根据权利要求2所述的乌发组合物，其特征在于，以待提取的樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2~1.6%。
11.根据权利要求2所述的乌发组合物，其特征在于，以待提取的樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4~0.6%。
12.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述多元醇包括己二醇、戊二醇、丁二醇或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
13.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述乌发组合物还包括溶剂。
14.根据权利要求13所述的乌发组合物，其特征在于，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
15.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物1~10份、甘草亭酸0.1~5份、何首乌提取物0.5~10份、女贞子提取物0.1~5份、人参提取物0.1~5份和多元醇5~15份；所述樱花花提取物通过如下方法浸提得到，所述方法包括：使用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂为C3~C6多元醇、乙醇和水的组合物。
16.一种乌发化妆品，其特征在于，所述乌发化妆品包括如权利要求1~15任一项所述的乌发组合物。
17.根据权利要求16所述的乌发化妆品，其特征在于，所述乌发化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
18.一种乌发精华液，其特征在于，所述乌发精华液包括如权利要求1~15任一项所述的乌发组合物。
19.根据权利要求18所述的乌发精华液，其特征在于，所述乌发精华液中乌发组合物的质量百分含量0.1~60%。
20.根据权利要求18所述的乌发精华液，其特征在于，所述乌发精华液中还包括溶剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、抗氧化剂、增稠剂、防腐剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合。
21.根据权利要求20所述的乌发精华液，其特征在于，所述溶剂包括水和/或醇类溶剂。
22.根据权利要求21所述的乌发精华液，其特征在于，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的组合。
23.根据权利要求20所述的乌发精华液，其特征在于，所述增溶剂包括PEG-40氢化蓖麻油和/或PPG-26-丁醇聚醚-26。
24.根据权利要求20所述的乌发精华液，其特征在于，所述抗氧化剂包括生育酚。
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