CN112206191B - 一种樱花花提取物及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种樱花花提取物及其提取方法和应用，所述提取方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂包括C3～C6小分子多元醇、乙醇和水的组合物。所述提取方法工艺路线简单，易于实现大规模工业化应用，得到的樱花花提取物中含有丰富的高活性有效成分，具有良好的乌发功效，且能应用于水剂、乳剂等多种剂型的乌发化妆品中，应用范围广阔。所述樱花花提取物温和无刺激性，能够激活酪氨酸酶，修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞的生长和黑色素的生成，从黑色素形成通路上进行调控和修复，达到乌发、改善灰发和白发的目的，在使用15天时即可实现显效乌发，具有优异的功效性。

Description

一种樱花花提取物及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于植物提取物技术领域，具体涉及一种樱花花提取物及其提取方法和应用。
背景技术
樱花为蔷薇科落叶乔木，又名山樱花、福岛樱、黑野樱或青肤樱等，伞形花状，不仅具有很高的观赏价值，还可从花瓣中提取樱花色素用于食品加工中，而且具有多种药用价值。樱花树叶和樱花是传统的中药材，具有止咳、平喘、润肠和解酒等功效，近年来，樱花提取物更是被广泛应用于化妆品中作为皮肤调理剂来发挥功效。
樱花作为一种化妆品植物原料，其花、树皮和叶的提取物都具有一定的功效性。研究表明，樱花树皮的成分以黄酮化合物为主，包括樱桃苷、柚皮素、芫花素和d-儿茶素等；樱花树叶中富含芦丁，鲜叶中的芦丁含量甚至可达50％以上，含多酚类物质，尤其以儿茶素居多；樱花花瓣中含有樱花素、紫云英苷、橙黄素、异槲皮苷和槲皮素等黄酮类化合物，另外还含有多糖和有机酸，具有抗氧化、抗炎、抗癌和美白等功效。
由于樱花提取物在化妆品和生物医药中表现出巨大的应用潜力，有很多研究工作聚焦于樱花有效成分的制备和提取工艺上，目前比较常规的提取方法为溶剂提取法。
CN111087483A公开了一种樱花多糖的提取方法，所述提取方法的步骤如下：将樱花花瓣干燥粉碎后浸于蒸馏水中，于85～95℃水浴锅中提取2～4次，每次1～2h，过滤后收集上清液并进行醇沉，离心分离醇沉淀液中的絮状沉淀，再经硅胶柱色谱分离、浓缩即得。该制备方法简便易操作，可有效提取樱花多糖类成分，具有显著的抗氧化作用，可用于药品制备；但是，该方法只能获得樱花多糖，对于樱花花瓣中其他功效性成分的提取效果较差。
CN1572755A公开了一种樱树叶提取物及其制备方法，所述制备方法包括：将干燥樱叶粉置入萃取容器中，加入含量为70～99.7％的乙醇，进行连续搅拌萃取，将萃取获得的溶液进行分离、浓缩，得到所述樱树叶提取物，可用于制药、保健品、化妆品、食品和酒类中；然而，该制备方法的提取效率不高，造成植物原料的浪费，且采用含量为70～99.7％的乙醇进行提取，制得的樱树叶提取物极性较小，难以应用于水剂型产品中，应用范围较窄。
CN103393787A公开了一种超临界二氧化碳连续萃取樱花有效成分的方法，所述方法包括：将樱花干燥后粉碎，超声波处理，装入超临界二氧化碳萃取设备的萃取釜中，在超临界状态下萃取1～2h，收集非极性部分功效成分；进行第二次萃取，动态萃取1～3h，收集极性部分功效成分；浓缩合并极性和非极性提取物，得到樱花有效成分。该萃取方法对功效成分破坏小，提取效果好，但提取方法中所使用的萃取釜和超临界二氧化碳不易获得，大大提高了樱花有效成分的提取成本。
现有技术公开的樱花提取物制备工艺仍然面临提取效果欠佳、植物原料利用度低的问题，同时提取过程还会产生大量废液，进一步增加了制备成本；而超临界二氧化碳萃取法依赖于复杂的仪器设备和高成本的萃取剂，工艺路线复杂，同样不利于樱花提取物的规模化制备。更为重要的是，现有的提取工艺无法获得多品类、高活性、应用范围广的有效成分，导致樱花提取物的功效性无法满足化妆品中的应用需求。
因此，开发一种提取效率高、工艺路线简单的樱花提取物的提取方法，以获得功效优异的樱花提取物，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种樱花花提取物及其提取方法和应用，所述提取方法通过提取剂组分的筛选和优化，有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有丰富的黄酮类物质，具有优异的乌发功效；且所述樱花花提取物能够适用于水剂或乳化剂等多种剂型，应用性能更好。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种樱花花提取物的提取方法，所述提取方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂包括C3～C6(例如C3、C4、C5或C6)小分子多元醇、乙醇和水的组合物。
本发明提供的提取方法是一种溶剂提取法，所述提取剂中包括小分子多元醇、乙醇和水三类组分，通过提取剂组分的筛选和优化，更有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的有效成分的浸出，使得到的樱花花提取物含有更加丰富的有效成分，尤其是总黄酮含量显著提升；且其适用于水剂和乳化剂等多种剂型的产品，应用范围广。本发明所述提取方法的工艺路线简单，目标产物樱花花提取物中的活性成分含量高，而且具有优异的乌发功效，能够有效促进酪氨酸酶活性和黑色素生成，尤其能够修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长，使毛囊恢复黑色素生成功能，从根源上实现乌发、改善灰发和白发的功效。
本发明中，所述C3～C6小分子多元醇包括1,2-己二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甲基丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合，优选为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合。
优选地，所述C3～C6小分子多元醇包括1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合，所述1,2-己二醇和甲基丙二醇的质量比为(1～2):1，例如1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1或1.9:1等，进一步优选为1:1。
本发明中，所述提取剂中C3～C6小分子多元醇的质量百分含量为35～55％，例如36％、38％、40％、42％、44％、45％、47％、49％、50％、51％、53％或54％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂中乙醇的质量百分含量为15～40％，例如16％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、37％或39％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
作为本发明的优选技术方案，所述提取剂中含有体积百分含量为35～55％的C3～C6小分子多元醇，减少了常规提取剂水和乙醇的用量，避免提取过程中产生大量的废液，更加绿色环保。同时，所述提取剂中的C3～C6小分子多元醇可作为分散介质存在于樱花花提取物中，即本发明得到的樱花花提取物是一种“高浓度原液”，有助于保持樱花花提取物中有效成分的活性和稳定性；而且C3～C6小分子多元醇本身具有良好的锁水和保湿功能，有利于所述樱花花提取物在护发(乌发)各剂型产品中的应用。
本发明中，所述浸提的温度为50～100℃，例如52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃、95℃或98℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为70～90℃。
本发明中，所述浸提的时间为0.5～3h，例如0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h或2.8h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述樱花花瓣与提取剂的质量比为1:(40～80)，例如1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60、1:62、1:65、1:68、1:70、1:72、1:75、1:77或1:79等。
本发明中，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣。
优选地，所述樱花花瓣为樱花干花瓣粉。
优选地，所述樱花干花瓣粉的细度为40～60目，例如42目、44目、45目、47目、49目、50目、52目、54目、55目、57目或59目，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述浸提完成后还包括后处理的步骤。
优选地，所述后处理包括过滤、浓缩或纯化中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述提取方法具体包括：将樱花花瓣与提取剂以质量比1:(40～80)混合，50～100℃条件下浸提0.5～3h，得到所述樱花花提取物；
所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
另一方面，本发明提供一种樱花花提取物，所述樱花花提取物通过如上所述的提取方法提取得到。
本发明中，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷。
优选地，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5～7％，例如5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％或6.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7～1％，例如0.72％、0.74％、0.76％、0.78％、0.8％、0.82％、0.84％、0.86％、0.88％、0.9％、0.92％、0.94％、0.96％或0.98％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2～1.6％，例如1.22％、1.25％、1.28％、1.3％、1.32％、1.35％、1.38％、1.4％、1.42％、1.45％、1.48％、1.5％、1.52％、1.55％、1.57％或1.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4～0.6％，例如0.41％、0.43％、0.45％、0.47％、0.49％、0.5％、0.51％、0.53％、0.55％、0.57％或0.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明提供的樱花花提取物中含有丰富的总黄酮、多糖、多酚和皂苷，尤其含有较多的高活性黄酮类物质，赋予了所述樱花花提取物优异的乌发功效。
另一方面，本发明提供一种如上所述的樱花花提取物在化妆品中的应用，所述化妆品包括洗发化妆品、护发化妆品或养发化妆品。
优选地，所述化妆品为乌发功效化妆品。
优选地，所述化妆品的剂型包括水剂、乳剂或油剂。
优选地，所述化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的樱花花提取物的提取方法为溶剂浸提法，通过提取剂组分的筛选和复配，使其更有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有丰富的高活性有效成分，且其应用范围广，可应用水剂、乳剂等多种剂型的产品中。所述提取方法的工艺路线简单，易于实现大规模工业化应用。所述樱花花提取物温和无刺激性，能够激活酪氨酸酶，修复受损的黑色素细胞，促进黑色素细胞的生长和黑色素的生成，从黑色素形成通路上进行调控和修复，达到乌发、改善灰发和白发的目的；所述樱花花提取物能够提升毛囊数目和真皮层厚度，能够上调VEGF蛋白水平，促进β-catenin基因的表达，对酪氨酸酶的激活率可以达到8～14％，使B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量提升至6.0～6.7％，在使用15天时即可在动物实验中实现显效乌发，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1提取得到的樱花花提取物对黑花色豚鼠用药实验的光学结果图；
图2为实施例1提取得到的樱花花提取物对黑花色豚鼠用药实验的VEGF免疫组化染色图，其中，(a)为涂抹所述樱花花提取物的实验组，(b)为涂抹生理盐水的模型对照组；
图3为实施例1提取得到的樱花花提取物对黑花色豚鼠用药实验的VEGF蛋白水平测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇25％，水25％)，在80℃条件下浸提2h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例2
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为40目)2kg，向其中加入80kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇23％，甲基丙二醇12％，乙醇40％，水25％)，在85℃条件下浸提2.5h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例3
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为60目)2kg，向其中加入100kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,3-丁二醇40％，乙醇30％，水30％)，在85℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例4
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-戊二醇45％，乙醇40％，水15％)，在70℃条件下浸提2.5h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例5
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入160kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,3-丙二醇20％，异戊二醇35％，乙醇25％，水20％)，在100℃条件下浸提1h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇和水，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例6
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：甘油50％，乙醇25％，水25％)，在80℃条件下浸提2h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇和水，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例7
一种樱花花提取物的提取方法，具体包括如下步骤：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入140kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甘油25％，乙醇25％，水25％)，在55℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩、除去低沸点的乙醇，得到所述樱花花提取物；向所述樱花花提取物中加水补充至130kg，用于后续的测试和应用。
实施例8
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇20％，甲基丙二醇30％，乙醇25％，水25％。
实施例9
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇50％，乙醇25％，水25％。
实施例10
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：甲基丙二醇50％，乙醇25％，水25％。
实施例11
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇10％，甲基丙二醇10％，乙醇40％，水40％。
实施例12
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇15％，甲基丙二醇15％，乙醇45％，水25％。
实施例13
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇30％，甲基丙二醇30％，乙醇20％，水20％。
实施例14
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇30％，甲基丙二醇30％，乙醇10％，水30％。
对比例1
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，将提取剂中的1,2-己二醇用等量的正己醇替换，将甲基丙二醇用等量的正丁醇替换。
对比例2
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，将提取剂中的乙醇用等量的甲醇替换。
对比例3
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇50％。
对比例4
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：乙醇50％，水50％。
对比例5
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，水50％。
对比例6
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂为纯水。
对比例7
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂为乙醇。
对比例8
一种樱花花提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，提取剂为1,2-己二醇和甲基丙二醇以质量比1:1的混合物。
测试例1
对实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物进行组分含量测试，方法如下：
(1)总黄酮测试标准曲线的建立：
以芦丁标准品配制浓度为0.416mg/mL的芦丁标准溶液(溶剂为30％乙醇)，分别取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL，用30％乙醇定容为5mL；然后分别加入0.3mL Al(NO3)3溶液(浓度为10％)、0.3mL 5％NaNO2溶液(浓度为5％)、3mL NaOH溶液(1mol/L)和1.4mL 30％乙醇；反应15min后在510nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到芦丁标准曲线：Y＝6.0769X+0.0084，R2＝0.9998。
(2)多糖测试标准曲线的建立：
以葡萄糖标准品配制浓度为0.1001mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，用纯水定容为2mL；然后分别加入1mL苯酚溶液(浓度为5％)和5mL浓硫酸，反应15min后冷水中冷却显色30min；在490nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到葡萄糖标准曲线：Y＝54.781X-0.0028，R2＝0.9992。
(3)多酚测试标准曲线的建立：
以没食子酸标准品配制浓度为0.1001mg/mL的没食子酸标准溶液，分别取0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，分别加入5mL蒸馏水和1.5mL F-C试剂，混合静置4min；然后加入3mL碳酸钠溶液(浓度为10％)，避光静置60min，紫外检测最大吸收波长，得到没食子酸标准曲线：Y＝117.1X+0.0226，R2＝0.9994。
(4)皂苷测试标准曲线的建立：
以齐墩果酸标准品(98％)配制浓度为0.100mg/mL的齐墩果酸标准溶液(溶剂为甲醇)，0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL，70℃加热挥干甲醇，分别加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(香草醛浓度为5％)和0.3mL高氯酸溶液，70℃水浴条件下反应16min，冰水浴中停止反应5min；然后加入5mL冰醋酸，放置22min后，在540nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到齐墩果酸标准曲线：Y＝77.577X+0.0643，R2＝0.9931。
将实施例1～14、对比例1～8制备得到的樱花花提取物稀释100倍，用于总黄酮含量的检测；将樱花花提取物稀释50倍，分别用于多糖和多酚含量的检测；将樱花花提取物稀释20倍，分别用于皂苷含量的检测。
根据上述实验方法分别测试紫外吸光度值，然后将吸光度代入对应的标准曲线中，通过换算得到各组分的质量百分含量，然后以提取方法中所用的樱花干花瓣粉的质量为100％计，折算出得到的樱花花提取物中总黄酮、多酚、多糖和皂苷的质量。具体数据如表1所示。
表1
Figure BDA0002753513370000131
Figure BDA0002753513370000141
结合实施例1～14、对比例1～8的提取方法以及表1的数据可知，采用小分子多元醇、乙醇和水三者混合的提取剂有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有更多的有效成分，总黄酮、皂苷、多糖和多酚的含量较高。如果提取剂并非小分子多元醇、乙醇和水的组合(对比例1～8)，则樱花花提取物中的有效成分显著降低，尤其对于总黄酮含量的影响更加显著。
比较实施例1～10、11～14的效果数据可以得知，提取剂中小分子多元醇的体积百分含量为35～55％、乙醇的体积百分含量为15～40％时，能够获得更好的提取效果，提取剂中小分子多元醇含量过低(实施例11～12)或过高(实施例13～14)会影响樱花花瓣中有效成分的浸出，尤其会降低樱花花提取物中总黄酮的含量。此外，结合实施例1～10中的效果数据可知，当小分子多元醇为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合时，能够赋予提取剂更优异的提取效果，使总黄酮的提取量更高。
测试例2
对实施例1～14提取得到的樱花花提取物进行安全性测试，方法如下：
(1)细胞毒性实验
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，HaCaT细胞的细胞毒性测试数据可作为对皮肤安全性的参考数据。将对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，细胞浓度为5×104/mL，37℃、5％CO2条件下培养24h使细胞贴壁生长；将96孔板中的细胞分为15组，分别对应实施例1～14(实验组)和空白对照，每组设置6个复孔；吸出旧的培养基，PBS清洗后，以每孔0.1％的浓度向实验组中加入实施例1～14提取得到的樱花花提取物，37℃、5％CO2条件下培养48h后，再加入终浓度为5mg/mL的MTT 10μL继续培养4h；终止培养，吸弃上清，向每个孔中加入50μL DMSO，置于培养箱中10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪570nm处测定各孔的光密度值(OD值)，计算细胞存活率＝(OD实验–OD0)/(OD对照–OD0)，其中，OD0为培养基的OD值。
(2)3D皮肤刺激性实验
实验组：将实施例1～14提取得到的樱花花提取物局部接触约0.38cm2的皮肤模型表面15min；阴性对照组为PBS，阳性对照组为SDS(十二烷基磺酸钠)，处理方法与实验组相同。
接触15min后用PBS冲洗皮肤模型，浸入维持培养基(2mL)中，在饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育42h；然后浸入MTT溶液(2mL，0.3mg/mL，溶剂为测试培养基)中，饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育3h；MTT反应完成后的皮肤模型浸入500μL酸化异丙醇的离心管中，混匀后在室温避光条件下过夜，然后从离心管中取出200μL液体样品置于96孔板中，在酶标仪570nm处读取各孔的OD值，以酸化异丙醇溶液作为空白对照；取3次测试结果的平均值进行计算，相对细胞活力百分比＝OD实验/OD阴性对照。
(3)人体斑贴皮肤刺激性
将实施例1～14提取得到的樱花花提取物制成樱花花提取物喷雾，用于人体斑贴皮肤刺激性的测试；樱花花提取物喷雾的配方如表2所示。
表2
Figure BDA0002753513370000161
Figure BDA0002753513370000171
将上述樱花花提取物喷雾(25μL)分别滴加于斑试器所附的滤纸片上，置于斑试器内；将滴加有樱花花提取物喷雾的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂曲侧，用于手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h；去除受试斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次；封闭型斑贴试验的皮肤反应评判标准如表3所示。
表3
Figure BDA0002753513370000172
30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定为对人体有皮肤不良反应。
选420名皮肤健康的18～50岁的志愿者，随机分成14组，分别使用实施例1～14提取得到的樱花花提取物制成的樱花花提取物喷雾，记录封闭型斑贴试验的评分，得到人体斑贴皮肤刺激性实验结果。
按照上述实验方法从细胞毒性、3D皮肤刺激性和人体斑贴皮肤刺激性三个方面对实施例1～14提取得到的樱花花提取物进行安全性测试，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002753513370000181
根据表4的数据可知，本发明实施例1～14提取得到的樱花花提取物不影响HaCaT细胞的生长增殖，对3D皮肤模型温和无刺激，在人体斑贴皮肤刺激性实验中表现出良好的安全性，证明通过本发明所述的提取方法获得的樱花花提取物对于人体皮肤温和无刺激性，可安全使用。
测试例3
对实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物进行体外和细胞水平的乌发功效性测试，方法如下：
(1)酪氨酸酶激活率
配制0.5mg/mL的L-酪氨酸溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，配制35mg/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，用丙二醇为溶剂配制1mg/mL的待测样品溶液(分别测试实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物，并以市售黑芝麻提取物(购自湖南佳沐生物科技，芝麻素含量为98％)作为对比测试组)。
按照如下比例配制4组溶液：
A：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL纯丙二醇+0.6mL磷酸缓冲液；
B：0.7mL纯丙二醇+1.3mL磷酸缓冲液；
C：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
D：0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
将上述4组溶液在37℃水浴中恒温10min后，各加入0.3mL酪氨酸酶溶液，反应5min后，迅速移入比色皿中，在475nm处测吸光度值(OD值)，记录OD值，并按照公式计算酪氨酸酶激活率＝100％×((ODC-ODD)-(ODA-ODB))/(ODA-ODB)；其中，(ODA-ODB)代表没有激活剂条件下的反应液的OD值改变，(ODC-ODD)代表有激活剂(实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物、市售黑芝麻提取物)条件下的反应液的OD值改变。
(2)黑色素含量测试
将B16黑色素瘤细胞悬液的密度调成1×105个/mL，每孔1mL接种于12孔板，使细胞密度为5×104个/孔，置于培养箱(37℃、5％二氧化碳)培养24h。取出12孔板，抽除培养基，加入1mL含待测样品(实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物、市售黑芝麻提取物，浓度为1mg/mL)的培养基，空白对照组和调零组加入1mL不含待测样品的培养基，继续置于培养箱培养12h后，抽除培养基。实验组和调零组每孔加入1mL用RPMI 1640培养基配制1μM的α-MSH溶液，空白组加入1mL不含α-MSH的培养基，置于培养箱培养36h后。分别用1mL PBS洗两次，每孔加入100μL 1N含10％DMSO的NaOH溶液(用PBS配置)，在80℃的水浴锅中水浴1h后，将12孔板中各组的细胞溶出物转移到96孔板中，在酶标仪475nm处测定各孔的吸光度OD值。计算胞内黑色素含量的公式为：黑色素含量＝100％×(OD1-OD3)/(OD2-OD3)，其中，OD1为实验组的吸光度值，OD2为空白对照组的吸光度值，OD3为调零组的吸光度值。
按照上述实验方法分别测试实施例1～14、对比例1～8提取得到的樱花花提取物以及市售黑芝麻提取物对酪氨酸酶激活率和黑色素含量的影响，具体测试数据如表5所示。
表5
Figure BDA0002753513370000201
Figure BDA0002753513370000211
根据表4的数据可知，相比于常规乌发活性物质黑芝麻提取物，本发明实施例1～14提取得到的樱花花提取物对酪氨酸酶的激活率可以达到8～14％，使B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量提升至6.0～6.7％，证明其对于黑色素的生成具有显著的促进作用，即具有良好的乌发功效。
平行比较实施例1～14、对比例1～8的数据可知，采用小分子多元醇、乙醇和水三者混合的提取剂能够使樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分充分浸出，提取得到的樱花花提取物具有更高的有效成分含量、尤其是总黄酮含量，因此对于酪氨酸酶和黑色素的促进作用更加显著；提取剂的组分差异会直接导致提取效果下降，进而影响樱花花提取物的功效。此外，提取剂中小分子多元醇的含量也会影响提取效果，小分子多元醇含量过高或过低(实施例11～14)都会使樱花花瓣中的部分有效成分无法完全浸出，使樱花花提取物的促黑色素生成功效有所减弱。
测试例3
对所述樱花花提取物制备成樱花花提取物喷雾(喷雾配方与测试例2中的表2相同)，模型对照组中采用不含有樱花花提取物的喷雾(将表2中的樱花花提取物用水替换)进行动物水平表观层面的乌发功效检测，方法如下：
(1)建立动物模型
取健康黑花色豚鼠45只，用剪刀剪去背部黑毛区长毛，不可损伤皮肤；按体重随机分为3组(A组：樱花花提取物喷雾组；B组：不含樱花花提取物的喷雾模型对照组；C组：正常对照组)，每组15只，每组均用5％过氧化氢外涂豚鼠受试区40天，每天2次，每次用2mL，使其毛发变为白色。造模成功后，每组随机取一只豚鼠切取适当大小的实验区皮肤组织做病理切片，观察皮肤组织和毛囊的黑色素变化。
(2)实验方法
以上3组豚鼠造模成功后，A组涂抹本发明实施例1提取得到的樱花花提取物喷雾，B组涂抹不含樱花花提取物的喷雾，C组不做处理；每日涂抹1次，每次2mL，连续涂抹15天，在1天、5天、10天和15天分别进行观察。
对以上3组的改善效果进行观察，选取用药部位中心9cm2处为观察单位判定效果，A组在用药15天后黑毛＞75％，对白毛的改善效果十分显著；B组和C组在处理15天后效果相当，黑毛比例均明显小于A组，B组的黑毛＞25％，对白毛的改善效果不明显；A组(樱花花提取物喷雾组)和B组(不含樱花花提取物的喷雾模型对照组)的光学图片如图1所示。
测试例4
对所述樱花花提取物制备成的水剂喷雾应用豚鼠背部的皮肤进行免疫组化染色和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测组织中乌发通路靶点表达的测试，水剂喷雾的配方与测试例2中的表2相同；具体测试方法如下：
(1)免疫组化染色
按照测试例3所记载的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，用10％甲醛固定，进行常规组织脱水，石蜡包埋，进行VEGF免疫组化染色。
VEGF是血管内皮生长因子，又称血管通透性因子，是毛囊起源的一种血管生成因子，可由毛囊的毛鞘细胞、毛乳头细胞以及外毛根鞘细胞合成和分析，在生长期时毛囊中的VEGF浓度比较高，但在退化期以及休止期发现毛囊中的VEGF明显消减。VEGF促进毛发生长的可能机制为：促进毛乳头细胞的增殖和迁移、诱导毛囊周围血管的形成、刺激合成蛋白酶，促进毛囊重塑、改变和提高血管内皮细胞的通透性，从而促进营养物质的跨内皮转运，使供给毛囊的营养物质增加。
VEGF一抗工作浓度为1:100，免疫组化染色的具体实验步骤按照SABC试剂盒说明书进行，用PBS替换VEGF一抗作为阴性对照，以细胞膜或胞浆出现棕黄色产物为阳性结果，苏木素轻度复染细胞核。
在荧光显微镜下进行观察，获得VEGF免疫组化染色图如图2所示，其中，(a)为使用樱花花提取物喷雾的实验组(A组)，(b)为不含樱花花提取物的喷雾模型对照组(B组)；从图2中可知，与未用药处理的模型对照组相比，本发明实施例1提取得到的樱花花提取物具有促进VEGF表达的作用。
将图2中的图片上各点的光密度值进行累加，得到IOD值，实现对VEGF免疫组化染色的定量分析结果，实施例1所述樱花花提取物制成的喷雾处理后的A组IOD达到33000，不含樱花花提取物的喷雾模型对照组的IOD为20500，进一步证明了本发明所述提取方法获得的樱花花提取物能够促进VEGF表达。
(2)豚鼠皮肤组织Western Blot检测VEGF蛋白水平
按照性能测试3所记载的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型(A组：涂抹实施例1提取得到的樱花花提取物制成的喷雾；B组：不含樱花花提取物的喷雾模型对照组)，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，充分研磨粉碎后，加入RIPA裂解液进行裂解、提取蛋白；向获得的蛋白样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，置于沸水中加热10分钟；然后采用浓度为10％的SDS-PAGE分离蛋白，并通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上；一抗二抗免疫反应，化学发光显影与凝胶图象分析，具体操作按说明书进行，得到本发明所述樱花花提取物对VEGF蛋白水平的测试结果图，如图3所示。从图3中可知，与涂抹不含樱花花提取物的喷雾模型对照组相比，使用实施例1提供的樱花花提取物制成的喷雾能够显著增加VEGF蛋白水平。
(3)豚鼠皮肤组织RT-qPCR检测β-catenin基因表达水平
β-catenin：在毛囊形成和毛发生长过程中，离不开许多信号通路和信号分子的相互调控。在各种信号通路和相关信号分子的协助或者拮抗作用下，控制毛囊的再生、周期、发育。β-catenin通过与细胞核内淋巴细胞增强因子(Lef)/T细胞转录因子结合，激活相关靶基因的转录，促进毛囊干细胞的再生、增殖和分化；另外，研究表明，毛色形成也有β-catenin的参与。
按照测试例3所记载的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，通过RT-qPCR测试β-catenin表达水平，具体方法如下：
I、首先抽提总RNA：取匀浆管，加入1mL的Trizol Reagent试剂，置冰上预冷；取100mg组织，加入到匀浆管中，充分研磨直至无可见组织块，12000rpm离心10min取上清；然后加入250μL三氯甲烷，充分混匀，静置并离心，将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，混匀后-20℃静置15min并4℃离心，管底的白色沉淀即为RNA；将其清洗、溶解并稀释，使其终浓度为200ng/μL。
II、反转录：向PCR管中加入含2μg RNA的溶液，加入1μL oligo(dT)18，用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μL；置于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却；依次加入4μL 5×Reaction Buffer、2μL dNTP Mix(10mM)、1μL RiboLock RNAase抑制剂(20U/μL)和1μLRevertAi M-MuLV逆转录酶(200U/μL)，混匀后于PCR仪上42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。
III、定量PCR：取PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管；(12.5μL 2×qPCR Mix、2.0μL 7.5μM基因引物、2.5μL反转录产物和8.0μL双蒸水)；进行PCR扩增，预变性95℃，10min；循环(40次)95℃，15s，升温至60℃，60s；熔解曲线为60℃至95℃，每15s升温0.3℃，得到的结果采用ΔCT法进行处理，得到β-catenin的相对表达量。根据结果可知，通过本发明所述提取方法得到的樱花花提取物制备成的水剂喷雾能够使豚鼠皮肤组织中β-catenin的相对表达量达到1.51(内参GAPDH)，而使用不含樱花花提取物的喷雾模型对照组仅为0.35，证明所述樱花花提取物能够有效提供β-catenin表达水平。
通过测试例4的实验结果可以得知，通过本发明所述提取方法得到的樱花花提取物能够促进VEGF和β-catenin表达，从黑色素形成通路上进行促进黑色素细胞的修复和生长，从根源上促使黑色素细胞再生，令毛囊恢复生产黑色素的功能，从而让新生的白发重新变黑，从而逆转了因外界氧化因素导致的白发产生。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种樱花花提取物及其提取方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (20)

1.一种具有乌发功效的樱花花提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：将樱花花瓣与提取剂以质量比1:(40~80)混合，50~100℃条件下浸提0.5~3 h，得到所述樱花花提取物；
所述提取剂按照质量百分含量包括：C3~C6小分子多元醇35~55%，乙醇15~40%，余量为水；
所述C3~C6小分子多元醇包括1,2-己二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甲基丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述C3~C6小分子多元醇为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述C3~C6小分子多元醇包括1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合，所述1,2-己二醇和甲基丙二醇的质量比为(1~2):1。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述1,2-己二醇和甲基丙二醇的质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浸提的温度为70~90℃。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述樱花花瓣为樱花干花瓣粉。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述樱花干花瓣粉的细度为40~60目。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浸提完成后还包括后处理的步骤。
10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述后处理包括过滤、浓缩或纯化中的任意一种或至少两种的组合。
11.一种樱花花提取物，其特征在于，所述樱花花提取物通过如权利要求1~10任一项所述的提取方法提取得到。
12.根据权利要求11所述的樱花花提取物，其特征在于，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷。
13.根据权利要求12所述的樱花花提取物，其特征在于，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5~7%。
14.根据权利要求12所述的樱花花提取物，其特征在于，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7~1%。
15.根据权利要求12所述的樱花花提取物，其特征在于，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2~1.6%。
16.根据权利要求12所述的樱花花提取物，其特征在于，以所述提取方法中樱花花瓣的质量为100%计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4~0.6%。
17.一种如权利要求11~16任一项所述的樱花花提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品包括洗发化妆品、护发化妆品或养发化妆品。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述化妆品为乌发功效化妆品。
19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述化妆品的剂型包括水剂、乳剂或油剂。
20.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
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