KR20210033604A - 기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계; 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법 및 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물{Manufacturing method of polysaccharide and cosmetic composition}

본 발명은 기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

현재까지 생산되는 다당체는 통상적으로 보리, 인삼, 쑥, 은행 등의 식물과 클로렐라 및 일부 해조류로부터 추출되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 다당체는 식용 또는 약용버섯으로부터 추출하여 제품화한 것으로, 다당체를 추출하는 방식은 자실체나 균사체를 열수 추출하여 얻어지는 것인데, 이러한 기술적인 방식은 자실체 생산의 한계로 인한 원료 수급의 문제와 균사체에서 다당체를 추출할 경우 많은 양을 얻을 수 없는 단점이 있다. 더구나 인공배양이 되지 않는 몇몇 버섯의 경우는 자실체로부터 다당체의 대량생산 자체가 거의 불가능한 실정이다.

다당체 중 하나인 글리코겐(glycogen)은 동물의 체내에 널리 존재하는 저장 다당류의 하나로, 간이나 근육에 존재하며 세포질 속에서 물에 불용상태인 과립으로 존재하며, 간에는 2~10%, 근육에는 1~2%의 중량을 차지하고 있다. 간이나 근육의 글리코겐은 혈액 중의 포도당 값(혈당치)이나 운동량 등에 따라 변한다. 혈당치가 상승하면 글리코겐의 합성이 촉진되고, 혈당치가 저하하면 글리코겐의 분해가 촉진된다. 이에 의해 혈당치가 일정하게 유지되기 때문에 생리적 의의는 높다. 간에서 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate, G-6-P)은 효소 포스파타아제의 작용으로 인산기가 분리되고 포도당은 혈중에 방출된다. 근육에는 이 포스파타제가 없다. 그 때문에 근육의 글리코겐은 혈당치 상승에 기여하지 않는다. 근육에서는 운동에 의해 글리코겐이 분해되어 G-6-P가 생성되나 그것은 근육세포에서만 이용될 뿐이다.

글리코겐의 합성 또는 분해에는 2개의 제어메커니즘이 알려졌다. 한 개는 호르몬에 의한 제어와 그 외의 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소로 작용하는 여러 가지 물질에 의한 제어이다. 호르몬으로는 인슐린이나 피질 코르티코이드는 글리코겐의 합성에, 아드레날린(adrenaline)이나 글루카곤(glucagon)은 글리코겐의 분해에 작용한다. 또 다른 물질에 의한 것으로서는 Ca2＋나 cAMP(cyclic adenosine-3' ,5'-monophosphate, cyclic AMP)가 있고, 그들이 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소의 구조를 바꿔 조절하고 있다. 이를 입체성(allosteric) 조절메커니즘이라 한다.

글리코겐의 구조는 포도당 분자가 나뭇가지 모양으로 결합되어 있다. 그와 같은 의미로 글리코겐을 식물 전분이라고도 한다. 분자량은 백만 내외이다. 구조는 포도당 분자가 α-1,4 배당체(glycoside) 결합을 하여 10여 개 연속해있는 곳에 α-1,6 배당체 결합으로 다른 포도당 분자가 결합되고 거기에서 다시 α-1,4 배당체 결합으로 포도당 분자가 결합되어 글리코겐은 나뭇가지 모양을 하게 된다. 이 구조는 아밀로펙틴(amylopectin)과 유사하나 가지의 수는 글리코겐이 더 많고 가지의 길이는 더 짧다. 요오드 반응에서는 전분이 보라색 또는 적자색을 보이는 데 대하여 글리코겐은 적색 또는 갈색을 나타낸다.

한편, 한국공개특허 제2010-0095829호에는 '글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0700910호에는 '알칼리-용해성 β-글루칸을 생산하는 효모 변이주'에 대해 개시하고 있다.

이렇듯 생산성을 증대시키기 위한 방법의 하나로 세포 배양 방법을 이용한 다당체의 생산 기술이 연구되고 있으나, 세포로부터 다당체를 얻는 데 있어서, 다당체의 순도가 낮아 활성이 떨어지며, 원치 않는 성분으로 인한 세포, 피부 독성을 야기하는 문제가 있다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여, 고농도, 고순도로 기능성 다당체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 고순도의 기능성 다당체를 유효성분으로 하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 과제를 해결하기 위한 수단으로서,

본 발명은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계; 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 다당체를 고생산하는 대장균 변이체 TBP38 균주를 배양하여 균체를 준비하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는, 상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 정제 단계는, 상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리하는 단계; 구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로 조절하고 침전물을 제거하는 단계; 디터전트(detergent)를 첨가하여 층분리를 한 후 원심분리를 통해 상등액을 회수하는 단계; 상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하고 농축하여 농축액을 얻는 단계; 상기 농축액에 1 내지 5배 부피의 주정을 첨가하여 침전물을 회수하는 단계; 및 상기 침전물을 증류수 또는 탈이온수에 재부유한 후 1 내지 5배 부피의 주정을 재첨가하고 침전물을 회수하는 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하인 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 다당체는 글리코겐이며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 갖는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 기능성 다당체로서, 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하이고, 고형분 기준으로 99% 이상이 글리코겐인 기능성 다당체를 제공한다.

또한, 항산화 활성을 갖는 기능성 다당체를 제공한다.

또한, 1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않는 기능성 다당체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 다당체를 99% 이상의 고순도로 제조할 수 있는 기능성 다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 항산화 활성, 피부 보습, 피부 탄력 개선 기능이 있으면서, 세포 독성, 피부 독성, 광독성이 없거나 현저히 낮은 기능성 다당체 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기의 효과 및 추가적 효과에 대하여 아래에서 자세히 서술한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 기능성 다당체 제조방법 수순도이다.

이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.

한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 이하, 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체의 제조방법은 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계, 상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계 및 상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계를 포함한다.

상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 다당체를 고생산하는 대장균 변이체 TBP38 균주를 배양하여 균체를 준비한다. 또한, 상기 균주 이외에 사용 가능한 균주로서, 기탁번호가 KCTC18748P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) CEY1 변이 균주, 기탁번호가 KCTC18749P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주 등을 들 수 있다.

배양 방법 및 사용 배양액은 제한되지 않는다. 일례로, 다단 배양 방식일 수 있다. 1차 배양시에는 1차 탄소원으로 글루코오스를 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 1~3g/L (NH₄)₂·HPO₄, 6~9g/L KH₂PO₄, 0.5~1.5g/L 시트르산, 0.5~1g/L MgSO₄·7H₂O, 15~25g/L 글루코오스 및 미량 금속 용액을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 2차 배양은 1차 배양후 2차 탄소원을 첨가한 후 20~30시간 동안 배양하고 배양된 균체를 획득할 수 있다. 2차 탄소원으로는 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 말토트리오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose), 말토펜파오스(maltopentaose) 및 말토헥사오스(maltohexaose)로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 2차 탄소원은 옥수수전분 당화액 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다음, 상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는, 상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 것일 수 있다. 바람직한 pH 범위는 3.9 내지 4.1일 수 있다. 한편, 고압처리 대신에 초음파 처리로 세포를 파쇄할 수도 있으며 제한되지 않는다. 고압처리는 homogenizer를 이용하여 1200 psi에서 연속적으로 2차례 고압처리를 하여 세포를 파쇄하는 것일 수 있다.

다음, 상기 정제 단계는, 기능성 다당체를 고순도로 얻는 과정이다.

먼저, 상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리할 수 있다. 그 후 구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로, 바람직하게는 pH 범위는 3.9 내지 4.1로 조절한다. 이를 통해 단백질, 세포 파괴물 등이 침전되게 되며, 이를 반연속식의 tubular type의 원심분리기 등을 이용하여 상등액을 회수하여 1차 불순물을 제거할 수 있다.

다음 엔도톡신(endotoxin) 제거를 위해, 회수한 상등액에 디터전트(detergent)를 사용할 수 있다. 일례로 Triton X-114 등을 들 수 있으며, 제한되지 않는다. 디터전트를 0.1% 내지 5%(v/v) 농도로 첨가하고 혼합한 후 30 내지 40°C에서 충분히 방치시켜 층분리가 일어나도록 한 후, 원심분리(12000 rpm, 30 °C, 15 min)를 이용하여 상등액을 회수한다. 이후 필요에 따라 디터전트를 다수, 바람직하게는 2회 재처리하여 상등액을 회수함으로써 불순물을 더욱 제거할 수 있다.

그 후 상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하여 미세 크기의 단백질 및 DNA 등의 핵산을 제거할 수 있다. 초미세 필터로는 제한되지 않으나 300 kDa size membrane 이상의 초미세 필터를 사용할 수 있다. 여과가 완료된 후 농축할 수 있다.

그 후 농축액에 1 내지 5배 부피(v/v)의 주정을 첨가한 후 원심분리(12000 rpm, 4°C, 15 min)하여 침전물(기능성 다당체 함유)을 회수할 수 있다. 보다 고순도를 얻기 위해, 침전물을 증류수에 재부유한 후, 1 내지 5배 부피(v/v)의 주정을 재첨가하고 원심분리하여 침전물을 회수할 수 있다. 침전물은 동결건조를 진행하여 최종적으로 고순도의 기능성 다당체를 획득할 수 있다.

상기 과정으로 얻어진 기능성 다당체는 조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 중량 기준 0.5% 이하이며, 더욱 구체적으로는 조단백질이 0.50% 이하, 조지방이 0.1% 이하, 조회분이 0.45% 이하로 매우 고순도로 기능성 다당체를 얻을 수 있으며, 기능성 다당체는 주로 글리코겐일 수 있으며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 가질 수 있다.

한편, 후술하는 실시예에서 보듯이, 본 발명에 따른 고순도 기능성 다당체는 항산화 활성을 가지며, 1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않으며, 기타 피부 독성, 세포 독성이 현저히 낮다.

또한, 본 발명의 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부 보습, 피부 탄력 개선 성능이 매우 우수하다.

화장료 조성물의 제형은 제한되지 않으며, 공지의 제형을 사용할 수 있다.

상기 화장료 조성물을 포함하는 스킨 및 바디 케어 화장품으로서 에센스, 앰플, 비누, 토닉 및 바디 에센스, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 분말 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 전체 화장품에 대하여 0.05 내지 100 wt%로 포함되고, 앰플 제형의 경우 상기 기능성 조성물 100%로 이루어진 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 기능성 다당체 이외에 피부 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로서는 알콜, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등이 예시될 수 있다.

상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등으로 사용될 수 있는 구체적인 화합물 또는 조성물은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 화합물 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

여기서 몇 가지를 예시하여 보면, 알콜로서는 고급 알콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 다가 알콜 등을 들 수 있고, 오일로서는 아보가드유, 팜유, 우지, 호호바유 등을 들 수 있고, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤 등을 들 수 있으며, 보습제로서는 히알론산, 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 피롤리돈카복실산염 등을 들 수 있으며, 희석제로서는 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다.

더욱 구체적으로 기능성 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

또한 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다

또한 본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체를 포함하는 비누의 경우, 비누 기재에 기능성 다당체를 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수 연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 일실시예에 따른 기능성 다당체의 제조방법 및 화장료 조성물을 실시예를 통해 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 기능성 다당체의 제조

기능성 다당체 추출

기능성 다당체를 고생산하는 대장균(Escherichia coli) 변이체 TBP38 균주를 1차 탄소원으로 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양한 배양액에 2차 탄소원을 첨가한 후 20~30시간 동안 배양하고 배양된 균체를 획득하였다.

고농도로 세포 배양을 통해 획득한 상기 균체로부터 다당체를 추출하기 위해 먼저, 원심분리를 통해 획득한 균체를 pH 4.0 구연산 완충용액으로 재부유시켰다. 이후 homogenizer를 이용하여 1200 psi에서 연속적으로 2차례 고압처리를 하여 세포를 파쇄 후 기능성 다당체를 세포 외로 추출하여 추출액을 얻었다.

기능성 다당체 정제

기능성 다당체 추출액에 함유되어 있는 조단백질, 조지방, 조회분 등을 제거하여 정제하기 위해, 먼저 90°C에서 20분간 열처리한 후 구연산을 첨가하여 추출액의 pH를 4.0으로 맞추었다. 이후 침전된 단백질, 세포 파괴물(cell debris) 등을 제거하기 위해 반연속식의 tubular type의 원심분리기를 이용하여 상등액을 회수하였다. 엔도톡신(endotoxin) 제거를 위해, 회수한 상등액에 디터전트(detergent)로서 Triton X-114를 1%(v/v)농도로 첨가 후 37°C에 충분히 방치시켜 층분리가 충분히 일어나도록 방치시킨 후 원심분리(12000 rpm, 30 °C, 15 min)를 진행하였고, 회수한 상등액에 Triton X-114를 1%(v/v)농도로 2회 재처리하여 총 3회 처리 후 원심분리를 통하여 상등액을 회수하였다. Ultra filtration(300 kDa size membrane)을 이용하여 회수한 상등액에 잔여하고 있는 작은 크기의 단백질 및 DNA 등의 핵산을 여과하여 제거하고 농축시켰다. 상기 농축액에 2배 부피(v/v)의 주정을 첨가한 후 원심분리(12000 rpm, 4°C, 15 min)하여 침전물(기능성 다당체 함유)을 회수하였다. 그 후 침전물을 증류수에 재부유한 후, 2배 부피(v/v)의 주정을 재첨가하고 원심분리하여 침전물을 회수한 다음 동결건조를 진행하여 기능성 다당체를 획득하였다.

<실시예 2>

상기 실시예 1에서, 대장균(Escherchia coli) 변이체 TBP38 균주 대신에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) CEY1 변이 균주를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 기능성 다당체를 획득하였다.

<비교실시예 1>

상기 실시예 1에서, 상기 기능성 다당체 정제 방법 대신에, 획득한 배양된 균체에 110~130℃ 및 10~30psi의 조건으로 20~60분 동안 고온고압 처리한 후 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전시킨 다음, 침전물로부터 다당체를 여과하여 기능성 다당체를 획득하였다.

<실시예 3> 순도 측정

<실시예 3-1> 수분 함량 측정(가열 감량법)

사용 기구로서, 건조기(drying oven), 데시케이터(desiccator), 알루미늄 칭량병(crucible), 저울 (balance)을 사용하였다.

미리 건조하여 항량을 구한 알루미늄제 칭량병에 시료 2~5g을 정확히 칭량하여 항온건조기로 135±2℃로 정확히 2시간 또는 105~110℃에서 항량이 될 때까지 건조시켜 데시케이터내에서 30분간 방냉한 다음 무게를 달아 감량을 수분함량으로 하였으며, 수분 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.

<실시예 3-2> 조단백질 함량 측정(자동 분석법, kjeltec method)

사용기구 및 시약으로서, 분해장치, 시료주입 및 증류장치, 화학천평, 자석교반기, 메스플라스크, 메스실린더, 분해병, 분해병스탠드, 시약 분주기, 황산(시약 1급)을 사용하였다.

시약의 조제로서, 1 N 염산 : 농염산(비중 1.18) 87 ㎖를 증류수로 희석 10 ℓ로 하고 다음의 식과 같이 factor를 구하였다.

factor 구하는 방법으로, 표준탄산나트륨(Sodium carbonate)을 260~270℃에서 약 1시간 동안 가열한 다음 데시케이터 내에서 30분간 방냉하여 이 중에서 1.5 g을 정확히 칭량하고 증류수로 용해 후 250 ㎖ 메스 플라스크의 표선을 ??추고 혼합한 후 이 중 25 ㎖를 취하여 메틸 오렌지(Methyl orange) 두 방울을 가하고 0.1N 염산을 서서히 떨어뜨려 황색에서 담홍색이 될 때 일단 2~3분간 끓이고 냉각 후 다시 담홍색이 될 때까지 적정함. 이 때 소비된 0.1 N 염산용액의 소비 ㎖로부터 0.1 N 염산용액의 factor를 구하였다.

- 분해촉진제 : 황산칼륨(Potassium sulfate : K2SO4) 10 g에 황산동(Copper sulfate : CuSO45H2SO) 1 g의 비율로 유발에서 완전히 혼합하여 제조하였다.

- 40% 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨(Sodium hydroxide : NaOH) 4 ㎏을 증류수에 녹여 10 ℓ로 제조하였다.

- 1% 붕산용액 : 붕산(Boric acid : H3BO3) 100 g을 증류수에 용해하여 10 ℓ로 하고 여기에 브로모크레졸 그린과 메틸레드 용액(Bromocresol green 100 ㎎과 Methyl red 100 ㎎을 각각 Methanol 100 ㎖에 용해) 각각 100 ㎖와 70 ㎖를 가하여 제조하였다.

- 시료액의 조제(분해)

실시예 1, 실시예 2 및 비교실시예 1의 시료 0.7~1 g을 분해병에 취하고 분해촉진제 7~8 g을 가하여 잘 혼합한 다음, 황산(Sulfuric acid, H2SO4) 10 ㎖를 서서히 가해서 혼합하였다. 이를 처음에는 거품이 넘치지 않도록 서서히 가열하다가 거품이 나지 않으면 투명하게 될 때까지 강하게 가열하여 분해시켜주었다. 이후 자동분석기의 작동방법에 따라 조단백질을 측정하였다.

<실시예 3-3> 조지방 함량 측정(에터 추출법)

사용기구로서, 지방 추출장치(FOSS, Soxtec 1043), 건조기, 데시케이터, No. 2 여과지, 에칠 에터 등을 사용하였다.

지방 정량법을 95~100°C에서 2시간 정도 건조하고 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 칭량하고 시료 1~2 g을 원통여지에 넣고 탈지면으로 막은 다음 95~100°C에서 2시간 정도 건조시켰다. 그 후 지방 추출장치에 넣고 에칠 에터를 부어 110°C로 가열하여 1시간 지방을 추출한 다음 에칠 에터를 회수하고 지방 정량컵을 95~100°C에서 3시간 건조 후 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 칭량하여 지방 정량병의 중량을 감한 것을 시료량에 대한 백분율을 구하여 조지방 함량으로 계산하였다.

조지방 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.

<실시예 3-4> 조회분 함량 측정

사용기구로서, Electric muffle furnace(600°C로 유지), Porcelain crucible, desiccator with silica gel desiccant, metal tong, balance 등을 사용하였다.

깨끗이 씻은 crucible을 600°C의 muffle furnace에서 1~2 시간 동안 방치한 후 desiccator에 옮겨 실온까지(40분간) 방냉하고 중량을 측정하였다. 시료 1~2 g을 정확히 취해 crucible에 담고, 전기곤로 또는 가스버너로 열을 가하여 예비회화 시킨 후 600°C의 muffle furnace에서 2시간 동안 회화시켰다. 이때 회분의 색이 white, light grey 또는 reddish색을 띄도록 하였다. 그 후 desiccator에서 40분간 방냉 후 중량을 측정하였다.

조회분 함량은 다음의 식과 같이 계산하여 나타내었다.

_

검사 항목	실시예 1	실시예 2	비교실시예 1
수분	5.39%	5.54%	5.00%
조단백질	0.50%	0.50%	16.58%
조지방	0.02%	0.07%	0.19%
조회분	0.24%	0.41%	5.81%

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2는 비교실시예 1에 비하여 조단백질, 조지방, 조회분 함량은 모두 0.50% 이하로 나타나 우수하게 정제된 것으로 나타났으며, 수분을 제외시킨 후 정제된 다당체의 순도는 99% 이상으로 확인되었다.

<실시예 4> 항산화 효과

기능성 다당체의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH assay와 ABTS assay를 진행해 라디칼 소거능을 측정하였다.

<실시예 4-1> DPPH assay

- 96 well plate에 시료와 DPPH solution을 1:1 비율로 각각 0.1 ml씩 주입한 후, 35°C 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

라디칼 소거능(%)의 계산은 다음의 식과 같이 계산하였다.

- 본 실험에 사용된 시료는 5%농도로 1000 g/20 L 제조 후 사용하였음.

- DPPH solution : DPPH 0.078 g에 94% 에탄올을 이용해 1 L 용액으로 만들어서 0.2 mM 농도로 용액을 만들어 이용함.

- 시료 이용 : 94% 에탄올을 이용하여 10배로 희석 수 이용함.

- Negative control : 100 mM DPPH solution in 94% 에탄올(94% 에탄올 + 200 mM DPPH solution)을 이용함.

- 그 결과를 표 2에 나타내었다.

구분	실시예 1	실시예 2	비교실시예 1
1	29.84	28.55	18.54
2	28.99	28.15	19.47
3	29.88	28.52	20.14
Ave	29.12	28.41	19.38
SD	0.217	0.223	0.80

라디칼 소거능 측정 결과(단위 : %)

DPPH assay 결과, 실시예 1 및 실시예 2는 5% 농도에서 negative control 대비 통계적으로 유의하게 평균 28.41, 29.12%의 라디칼 소거능을 보여주었다.

<실시예 4-2> ABTS assay

- 96 well plate에 시료 및 trolox standard를 각각 10 μl씩 넣은 후, Myoglobin Working Solution 20 μl, ABTS Substrate Working Solution 150 μl를 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Stop Solution 100 μl 주입하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

라디칼 소거능(%)의 계산은 상기 DPPH assay 와 동일하게 하였다.

- Myoglobin Stock Solution : Myoglobin from horse heart에 초순수 280 μl를 첨가함.

- Myoglobin Working Solution : Myoglobin Stock Solution을 1x Assay buffer를 이용해 100배 희석함.

- Trolox Working Solution : Trolox((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid)에 2.67 ml의 1x Assay buffer를 첨가함.

- ABTS Working Solution : ABTS substrate solution 10 ml에 3% hydrogen peroxide solution 25 μl를 넣어서 제조함.

- 시료이용 : 1x ABTS assay buffer를 이용해 10배로 희석 후 이용함.

- Negative control : ABTS mixture solution(1x ABTS assay buffer + Myoglobin working solution + ABTS substrate working solution)를 이용함.

** Trolox standard

- 그 결과를 표 3에 나타내었다.

구분	실시예 1	실시예 2	비교실시예 1
1	10.99	10.76	7.74
2	10.42	10.38	8.01
3	10.98	10.69	7.81
Ave	10.87	10.61	7.85
SD	0.190	0.200	0.14

라디칼 소거능 측정 결과(단위 : %)

ABTS assay 결과, 실시예 1 및 실시예 2는 5% 농도에서 negative control 대비 통계적으로 유의하게 평균 10.61, 10.87%의 라디칼 소거능을 보여주었다.

<실시예 5> 광독성 시험

- 본 시험은 in vitro 3T3 NRU 광독성 시험에서 시료를 BALB/3T3 clone A31의 세포에 처리한 후 광독성을 평가하기 위해 세포 생존율, 광조사 유무에 따른 IC50, 농도 반응에 따른 광독성(PIF ; Photo irritation factor 및 MPE ; Mean photo effect)을 평가한 결과는 다음과 같음.

- 본 시험의 시험물질 농도는 용량설정 시험을 통해 UV 조사 및 비조사 시 모두 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81 μg/ml 농도로 설정하였음. 또한 음성대조군은 DMEM에 희석한 PBS를 사용하였음.

- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV 조사 및 비조사 시에 IC50값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV비조사 시, 28.043 μg/ml, UV조사 시 1.650 μg/ml으로 산출되었음.

- 시험물질군에서 농도 반응에 따른 광독성을 평가한 결과, PIF가 2 미만, MPE가 0.1 미만으로 산출(PIF ; Not applicable, MPE ; -0.094)되었고, 양성대조물질군에서는 PIF가 6초과, MPE가 0.15이상으로 산출(PIF ; 17.1444, MPE ; 0.459)되었음.

- 양성대조물질군에서 UV조사 시 IC50이 0.1 ~2.0 μg/ml, UV 비조사 시 IC50이 7.0 ~90.0 μg/ml범위로 나타났으며, PIF는 6 이상으로 나타나 광독성 물질임을 확인할 수 있었음.

- 또한 모든 군에서 UV 비조사 시에 대한 UV 조사 시의 음성대조물질 세포생존율은 80%이상으로 나타났고, 음성대조물질의 평균 흡광도 값은 0.4 이상으로 나타났음. 본 시험에서는 시험의 성립조건을 만족하였으므로 시험이 적절하게 실시되었다고 판단됨.

- 이상의 결과로부터 BALB/3T3 clone A31 세포주를 이용한 다당체의 광독성 평가 시 “광독성 없음(No phototoxicity)”으로 판단됨.

<실시예 5-1> 시험방법

(1) 시험물질의 조제 및 분석

(1-1) 시험물질의 조제

PBS로 시험물질을 용해하여 공비 2로 단계희석한 후, 시험물질 처리직전 DMEM으로 각 농도를 10배 희석하여 시험물질의 최종농도로 조제하였음. 시험물질은 실시예 1의 기능성 다당체를 사용하였음

(1-2) 양성대조물질의 조제

양성대조물질인 CPZ는 ethanol로 용해하여 공비 2로 단계희석한 후, 시험물질 처리직전 DMEM으로 각 농도를 100배 희석하여 양성대조물질의 최종농도로 조제하였음.

(1-3) 시험물질의 분석

시험의뢰자와 협의하여 시험물질 및 시험물질 조제물의 농도, 안정성 및 균질성에 대한 분석은 별도로 시행하지 않았음.

(2) 세포주 준비

(2-1) 세포주

세포주 : BALB/3T3 clone A31

공급원 : American Type Culture Collection

Lot No. : 62485414

(2-2) 세포주 선택 이유

본 시험에 사용되는 BALB/3T3 clone A31세포는 광독성을 평가하기 위해 많이 사용되는 세포로서 비교할 시험기초자료가 많이 축적되어 있으므로 시험결과의 해석이 용이하여 선택하였음.

(2-3) 보존

최종 10%(v/v)의 비율로 DMSO를 첨가한 배지에 세포를 부유시켜, 약 1 ml씩 분주하고, 2015-10-19에 동결한 후에 액체질소 보존용기로 옮겨 보존하였음. 시험에 있어서는 이것을 사전 또는 시험 기간 중에 해동 및 배양하고 다른 시험과 공통으로 사용하였음.

(2-4) 배양조건

온도 : (37 ± 1)°C

CO2 농도 : 5%

습도 : 가습 조건

배양기 : CO2 세포배양기(NUAIRE, NU-4850E)

(2-5) 세포주 형태와 오염도 확인

- 사용 세포에 대해서, 세포 형태 육안 관찰 및 Hoechst Stain Kit(MPBIOMEDICALS, Japan)로 mycoplasma의 오염여부를 2019-03-29에 확인하였음. (형태 관찰 ; 적합, 오염도 확인 ; 음성)

(2-6) 세포의 UV 민감도 검사

- 사용 세포에 대해서, 자외선 조사기를 이용하여 각 광량에 따른 세포의 UV 민감도를 2019-05-15에 확인하였음.

(3) 세포배양액

- DMEM 배지는 사전 혹은 시험 개시 후에 구입, 조제한 것을 다른 시험과 공통으로 사용하였음.

- Complete medium

DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) : NBCS(Newborn Calf Serum) : Penicillin Streptomycin = 89 : 10 : 1

- Serum free medium

DMEM : Penicillin Streptomycin = 99 : 1

(4) 시약

- 아래와 같은 조성으로 시약을 사용하였음.

- Neutral red 배지

Serum free medium : Neutral red solution(0.33%) = 65 : 1

- Neutral red 추출액

멸균증류수 : Ethanol(99.9%) Absolute : Acetic acid = 49 : 50 : 1

(5) 자외선 조사

(5-1) 자외선 조사장치

모델명 : BIO-SUN

제조번호 : 15-101159

광원과 시험계간의 거리 : 최저 23 cm, 최고 26 cm

(5-2) 광원 및 광량

- 세포에 대한 독성이 없으면서 화학물질을 활성화시켜 광독성 반응을 일으키는 UVA(315-400 nm)를 조사하며, 광량은 5 J/cm2으로 하였음.

(5-3) 노출시간

- 광량(5 J/cm2)에 대하여, 자외선 조사를 시작한 뒤 1분 후 측정한 광세기를 적용하여 노출시간을 산출하였음. 단, 광세기는 1.7 ± 0.5 Mw/cm2으로 유지하도록 하였음.

_

(6) 용량설정시험

- 시험물질은 UV 조사 및 비조사 시 모두 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81 μg/ml농도로 설정하였음. 세포생존율을 산출하여 세포독성을 확인하며, PIF(Photo irritation factor) 및 MPE(Mean photo effect)값은 산출하지 않았음.

<용량 설정시험 기준>

(7) 본시험

(7-1) 시험군의 구성

_

* G1과 G2 음성대조군은 DMEM에 10배 희석한 PBS를 사용하였음. G1의 농도는 용량설정시험에서 IC50이 산출되지 않았으며, 시험물질의 침전/석출이 확인되지 않아 용량설정시험과 동일한 농도로 본시험을 진행하였음.

(7-2) 시험수행

- 세포 분주 : 1일

군당 96 well plate 2개에 세포부유액(1x104 cells/well) 및 배지를 100 μl 분주한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 24 시간 배양하였음.

- 시험물질 처리 : 2일

배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. 조제물(시험물질 및 양성대조물질), 음성대조물질을 100 μl 처리한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에 1시간 배양하였음.

- UV 조사 : 2일

UV 조사 plate는 5 J/cm2의 광량으로 UVA를 조사하고, UV가 조사되는 동안 비조사 plate는 알루미늄 호일로 차광하여 실온 방치하였음. 용액을 제거한 다음, 가온한 PBS 150 μl로 2회 세척하였음. 배지를 100 μl 분주하여 37°C, 5% CO2 세포배양기에 20±2시간 배양하였음.

- Neutral red 추출 : 3일

현미경을 사용하여 세포의 성장 및 형태를 관찰하고, 배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. Neutral red 배지를 100 μl 분주한 후, 37°C, 5% CO2 세포배양기에 3시간 배양하였음. Neutral red 배지를 제거한 후, 가온한 PBS 150 μl로 1회 세척하였음. Neutral red 추출액 150 μl을 분주하여 차광상태로 10분 동안 플레이트를 교반하였음.

- 흡광도 측정 : 3일

다채널 마이크로플레이트리더기를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였음.

(8) 시험 성립 조건

- UV 조사 시 음성대조군의 세포생존율은 UV 비조사 시의 80% 이상이었음.

- 음성대조군의 평균 흡광도 값은 0.4 이상 이였음.

- 양성대조물질(CPZ)의 IC50은 UV 조사 시 0.1 ~ 2.0 μg/ml, UV 비조사 시 7.0 ~ 90.0 μg/ml이었고, PIF 값은 6 이상이었음.

(9) 결과의 평가 및 판정

(9-1) 평가

- 광조사 유무에 따른 IC50을 평가하였음.

- 광독성은 각 물질의 농도 반응에 따른 PIF 및 MPE로 평가하였음.

(9-2) 판정

- 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여, PIF 및 MPE 값을 산출하여 광독성을 판정하였음.

(10) 통계

- 측정된 흡광도로 소프트웨어(Phototox 2.6, ZEBET at the BFR, Berlin Germany)를 이용하여 PIF값 및 MPE값을 계산하고 통계학적 방법은 실시하지 않았음.

<실시예 5-2> 결과

(1) 광조사 유무에 따른 IC50 비교

- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV 비조사 및 조사 시에 IC50 값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV 비조사 시 28.043 μg/ml, UV 조사 시 1.650 μg/ml로 산출되었음.

<세포생존율 결과>

(2) 농도 반응에 따른 광독성(PIF 및 MPE)평가

- 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여 PIF 값 및 MPE 값을 산출한 결과, 시험물질군에서는 PIF 값이 산출되지 않았고, MPE 값이 -0.094으로 산출되었고, 양성대조물질군에서는 PIF 값이 17.144, MPE 값이 0.459으로 산출되었음.

<세포독성 측정결과>

(3) 종합 평가

- BALB/3T3 clone A31의 세포에 대한 기능성 다당체의 광독성을 평가하기 위해 세포 생존율, 광조사 유무에 따른 IC50, 농도 반응에 따른 광독성(PIF; photo irritation factor, MPE ; Mean photo effect)을 아래와 같이 산출하였음.

- 광조사 유무에 따른 세포생존율이 50%로 감소되는 농도 값인 IC50을 산출한 결과, 시험물질군에서는 UV비조사 및 조사 시에 IC50값이 산출되지 않았고, 양성대조물질군에서는 UV 비조사 시 28.043 μg/ml, UV 조사 시 1.650 μg/ml로 산출되었음. 광조사 유무에 따른 IC50을 이용하여 PIF값 및 MPE 값을 산출한 결과, 시험물질군에서는 PIF 값이 산출되지 않았고, MPE 값은 -0.094으로 산출되었고, 양성대조물질군에서는 PIF 값이 17.144, MPE 값이 0.459으로 산출되었음.

- 양성대조물질군에서 UV조사 시 IC50이 0.1 ~ 2.0 μg/ml, UV 비조사 시 IC50이 7.0 ~ 90.0 μg/ml범위로 나타났으며, PIF는 6 이상으로 나타나 광독성 물질임을 확인할 수 있었음. 또한 모든 군에서 UV 비조사 시에 대한 UV 조사 시의 음성대조물질 세포생존율은 80%이상으로 나타났고, 음성대조물질의 평균 흡광도 값은 0.4 이상으로 나타났음. 본 시험에서는 시험의 성립 조건을 만족하였으므로 시험이 적정하게 실시되었다고 판단됨.

- 이상의 결과로부터 BALB/3T3 clone A31 세포주를 이용한 다당체의 광독성 평가 시 “광독성 없음(No phototoxicity)”으로 판단됨

<실시예 6> 인체피부자극시험

(1) 시험 개요

- 본 연구에서는 서원대학교 산학협력단에서 제공한 원료 2종의 인체피부 일차자극시험을 위하여 한국 성인남녀를 대상으로 실험을 실시하였음.

- 패치 제거 후 2번에 거쳐 판정을 실시하였으며, 1차 판정과 2차 판정 결과를 종합하여 평균 피부반응도를 산정하고 이를 이용하여 최종 판정을 진행하였음.

(2) 시험 물질

- 시험물질

물질명 : CT16-SA25(실시예 1), CT16-SA24(실시예 2)

제조일자 : 2018-05-15

제품 유형 (외관 및 성상) : 액상 형태

보관조건 : 고온과 직사광선을 피하여 5~25℃사이에서 보관

(3) 피험자

- 본 인체적용시험에 참가한 피험자에 대한 정보는 다음 표 6과 같음.

표 6. 피험자 정보

(4) 시험 방법

(4-1) 시험 방법

- 피험자의 등(척추 부위 제외)부위에 패치를 이용해 24시간 동안 원료를 폐쇄첩포 한 후, 패치를 제거하였음.

- 피험자 등(척추 부위 제외)부위에 패치를 제거하고, 해당 부위를 표시 한 다음, 실험용 티슈(킴테크)를 이용해 등(척추 부위 제외)부위의 불순물을 제거하였음. 1차 판정평가는 패치 제거 30분 후에 진행하고, 2차 판정평가는 24시간 후에 진행하였음. 제품에 대한 두 차례의 판정평가를 종합하여 평균 피부반응도를 산정하였으며, 이를 기준으로 하여 최종 판정평가를 진행하였음

- 모든 판정평가는 공기의 이동과 직사광선이 없는 항온항습 조건에서 피험자가 최소 30분 이상 피부 안정을 취한 다음 실시하였음.

(4-2) 시험 부위 선정 및 패치 부착

- 패치 부착 부위는 등(척추 부위 제외)으로 선정하였음.

- 제품을 8 x 8 mm 크기로 잘라 패치에 배치한 후 등 부위에 부착하였음. 음성대조군으로는 증류수를 점적하였으며, 패치 내의 아무것도 점적하지 않은 공란을 blank로 설정하였음.

- 피부자극을 평가하기 위하여 패치로 IQ Ultra Chamber(Chemotechnique Diagnostics, Sweden)를 사용하였음. IQ Ultra Chamber는 폭 5 mm 길이 118 mm의 직사각형모양의 무자극성 접착테이프 위에 inert polyethylene chamber가 10개가 배열되어 있고 각 chamber volume은 최대 32 μl, 면적은 8 x 8 mm로 구성되어 있음. 각 chamber 간 간격은 열간 12 mm 행간 15 mm로 지정되어 있음.

(4-3) 피부 자극 판정

- 패치는 24시간 동안 부착 후 제거하였음. 제거에 의한 일과성 홍반의 소실을 기다려 패치 제거 후 30분 후 1차 판정평가를 진행하였음.

- 자극 판정 기준은 다음 표 7과 같이 국제 접촉 피부염 연구 그룹(ICDRG)의 판독 기준을 응용하여 Frosch & Kligman이 고안한 측정 평가법으로 사용하였음.

자극 판정 기준

(4-4) 데이터 분석

- 평균 피부반응도(mean score)는 다음 식의 계산공식에 따라 산정하였음.

_

- 제품에 대한 피부반응도의 판정기준은 mean score 값에 따라 다음 표 8과 같은 기준으로 최종 판정을 진행하였음.

최종 판정 기준

(5) 시험 결과

(5-1) 피부 자극 평가 결과 분석

- 판정 결과는 다음과 같음.

*평균 피부 반응도 : 위의 공식 참고

(6) 결론

- 본 시험은 인체 피부자극 일차자극시험으로, 식품의약품안전처 고시 제 017-4호, 기능성화장품 심사에 관한 규정에 따라 수행되었음.

- 총 33명의 피험자를 모집하였고, 시험의 제한조건이나 의무사항을 따르지 않는 경우로 1명, 피험자가 시험을 지속할 수 없다고 시험책임자가 판단하는 경우로 1명, 총 2명의 중도 탈락자가 발생하여 최종적으로 31명이 시험을 완료하였음.

- 시험결과 CT16-SA24, CT16-SA25의 평균 피부반응도는 0으로 산정되어, 최종 판정 기준에 의해 모두 무자극으로 판정되었음.

<실시예 7> 세포독성시험

(1) 요약

- 본 시험은 기능성 다당체의 세포독성을 평가하기 위해서 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용하여 세포독성시험(MTT assay)을 실시하였음. 시험물질은 실시예 1의 기능성 다당체를 희석하여 사용함.

- 기능성 다당체를 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 %의 농도로 처리 결과, 2.0 % 이하 농도에서 70 % 이상의 세포생존율이 관찰됨.

- 이상의 결과로부터 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용한 세포독성시험(MTT assay)결과, 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 세포독성이 없는 것으로 사료됨.

(2) 시험 방법

- 세포주 : CCD-986SK 공급원 : ATCC CRL-6323TM Lot No. : 60016875

- 세포주 보존 Freezing medium에 세포를 부유시켜 약 1 mL씩 분주하고 2015-09-16 에 동결한 후에 액체 질소 보존용기로 옮겨 보존함. 시험에 있어서 이것을 사전 또는 시험 기간 중에 해동 및 배 양하여 사용함.

※ 배양 조건

온도 : (37±1)℃, CO2 농도 : 5%, 습도 : 가습 조건, 배양기 : CO2 세포배양기

- 세포배양액

완전 배지

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) : 445 ml

Fetal Bovine Serum (FBS) : 50 ml

Penicillin-Streptomycin : 5 ml

Total volume : 500 ml

무혈청 배지

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) : 99 ml

Penicillin-Streptomycin : 1 ml

Total volume : 100 ml

- 세포독성시험

군 구성 시험물질 농도는 4개 농도(0.1, 0.5, 1.0, 2.0%)로 희석하여 다음과 같이 실시하였음.

G1 : 음성대조군

G2 : 기능성 다당체 0.1%

G3 : 기능성 다당체 0.5%

G4 : 기능성 다당체 1.0%

G5 : 기능성 다당체 2.0%

- 세포 분주 96 well plate에 세포를 3Х104 (100 uL/well)로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시 간 배양함.

- 시험물질처리 시험물질이 농도별로 희석된 무혈청 배지로 교체하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양함.

- MTT assay PBS로 2 회 세척하고 MTT용액(0.5 mg/mL, 무혈청 배지)을 200 μL/well 분주하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 4 시간 배양함.

- 흡광도 측정 배양이 끝나면 배지를 제거해주고 DMSO용액을 200 μL/well 넣고 plate shaker에서 20-30 분 추출 후, 570 nm 파장에서 ELISA 이용하여 흡광도를 측정함.

- 결과처리 세포 생존율이 시료 무첨가군의 70 % 미만으로 감소되는 경우에 잠재적으로 세포독성이 있는 것으로 판정하며 세포 생존율은 다음의 식에 따라 산출함.

- 통계처리 실험 결과는 SPSS(Ver. 19)통계 프로그램을 이용하여 t-test(paired t-test, 양측검증)를 실시하여 유의성을 확인함.

(3) 결과

- 세포독성 평가 (Table 1, Figure 1, Appendix 1) 기능성 다당체를 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 %로 처리한 결과, 각각의 농도에서 105.96 ± 29.69 %, 86.66 ± 14.42 %, 126.61 ± 16.46 %, 102.54 ± 21.75 %의 세포 생존율이 관찰되었음.

(4) 고찰 및 결론

- 본 시험은 기능성 다당체의 세포독성을 평가하기 위해서 CCD-986SK(Fibroblast)세포와 기능성 다당체 희석액을 이용하여 세포독성시험(MTT assay) 수행하였음.

- 하기에 나타낸 것과 같이, 세포독성시험결과 기능성 다당체의 경우 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 % 농도에서 105.96 ± 29.69 %, 86.66 ± 14.42 %, 126.61 ± 16.46 %, 102.54 ± 21.75 %의 세포 생존율이 관찰되었음.

- 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 70 % 이상의 세포 생존율이 관찰되었음.

- 세포 생존율이 시료 무첨가군의 70 %미만으로 감소되는 경우에 잠재적으로 세포독성이 있는 것으로 판정하므로, 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서는 세포독성이 없는 것으로 사료됨으로써 이상의 결과로부터 CCD-986SK(Fibroblast)세포를 이용한 세포독성시험(MTT assay)에 사용된 기능성 다당체는 2.0 % 이하 농도에서 세포독성이 없는 것으로 사료됨.

** 희석 농도 별 세포독성 확인 결과

** 희석 농도 별 세포독성 확인 결과

<실시예 8> 피부보습 탄력증진 효과 평가(화장품)

(1) 요약

- 본 시험을 종료한 시험대상자 12명은 모두 여성으로 평균연령은 만45.4세였다. 선정된 시험대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용력은 없었음.

- 피부보습 개선효과를 확인한 결과, 제품 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 수분함유량이 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였음.

- 피부탄력을 확인한 결과, R7 (biological elasticity) 값은 제품 사용 전과 비교하여 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였음.

- 시험대상자에 의한 주관적 설문평가 : 시험물질 사용 후 유효성 평가의 모든 항목에서‘보통’이상으로 평가하였음.

- 피부과 전문의에 의한 이상반응 평가 : 시험제품을 사용하는 기간 동안 시험대상자에게서 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에서도 이상소견은 관찰되지 않았음.

(2) 시험 물질

시험물질

물질명 : 비교실시예 1의 다당체가 함유된 화장용 크림 A

실시예 1의 다당체가 함유된 화장용 크림 B

제품 유형 (외관 및 성상) : 백색의 크림상

보관조건 : 실온 [(1 ~ 30℃)]

화장용 크림 성분 : 아래와 같음

(3) 시험 대상자

- 시험에 모집된 12명 모두 최종 시험대상자로 선정되었음. 이는 식품의약품안전처‘화장품 표시 광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인(민원인 안내서)’에서 제시한 시험대상자 수에 근거하여 22명으로 설정하려 하였으나, 의뢰자의 요청에 의해 12명의 시험대상자를 목표로 하였음. 시험책임자 또는 시험책임자의 위임을 받은 시험담당자는 시험의 모든 정보를 시험대상자에게 충분히 알렸으며, 시험대상자는 자의에 따라 동의서를 작성하고 시험에 참가하였음.

** 시험대상자 연령대 분포

(4) 결론

- 최종 12명의 시험대상자를 대상으로 실시예 1 및 비교실시예 1의 다당체가 함유된 크림의 피부보습, 피부탄력 개선효과에 대한 인체적용시험을 시행하였음.

- 본 시험은 만 30 ~ 60세의 건강한 성인 여성 12명을 대상으로 진행하였으며, 시험제품을 4주간 사용하게 하였음. 시험제품 사용 전과 시험제품 사용 2주 및 4주 후 결과는 다음과 같음.

- 본 시험을 종료한 시험대상자 12명은 모두 여성으로 평균연령은 만 45.4세였다. 선정된 시험대상자들은 특별한 피부 증상은 없었으며 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용력은 없었음.

- Corneometer를 이용한 피부보습을 확인한 결과, 크림 B (실시예 1의 다당체 함유)은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 20.28 %, 31.66 %의 개선율을 보였으며, 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였다. 크림 A (비교제조예 1의 다당체 함유)는 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 18.01 %, 22.75 %의 개선율을 보였으며, 통계학적으로 유의하게 증가(P＜0.05)하였다. 시험제품은 대조제품과 비교하여 사용 4주 후에 유의한 차이(P ＜0.05)를 나타냈음.

<피부 보습효과 결과>

-Cutometer를 이용한 피부탄력을 확인한 결과, 크림 B (시험제품)의 R2 (grosselasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 1.20 % 및 12.49 %의 개선율을 보였다. R5 (net elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -8.1%, -3.33 %로 개선을 보이지 않았다. R7 (biological elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -2.370 %, 7.82 %의 개선율을 보였으며, 사용 4주 후에 통계학적으로 유의하게 증가(P ＜0.05)하였다. 크림 A (대조제품)의 R2 (gross elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -1.64 % 및 6.91 %의 개선율을 보였다. R5(net elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -14.47 %, -11.6 %로 개선을 보이지 않았다. R7 (biological elasticity) 값은 사용 전과 비교하여 사용 2주 및 4주 후에 각각 -5.53 %, -0.38 %로 개선을 보이지 않았음.

** 탄력개선 효과 결과

- 시험대상자에 의한 주관적 설문평가 : 시험물질 사용 후 유효성 평가의 모든 항목에서 ‘보통’이상으로 평가되었음.

** 시험물질 사용 후 피부상태

- 피부과 전문의에 의한 이상반응 평가 : 시험제품을 사용하는 동안 시험대상자에게서 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에서도 이상소견은 관찰되지 않았음.

** 피부이상반응 평가 결과

따라서 크림 B (실시예 1의 다당체 함유)는 피부보습, 피부탄력 개선에 도움을 주는 제품으로 판단된다.

Claims (10)

1. 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계;
   상기 균체를 파쇄하여 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계; 및
   상기 추출액에서 조단백질, 조지방, 및 조회분 중 적어도 하나 이상을 제거하는 정제 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 다당체를 함유하는 균체를 준비하는 단계는, 대장균 변이체 TBP38 균주 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces Cerevisiae) CEY1을 배양하여 균체로 준비하는 기능성 다당체의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 균체를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출한 추출액을 얻는 단계는,
   상기 균체를 pH 3.5 내지 4.5 범위의 구연산 완충용액으로 부유시킨 후 고압처리를 이용하여 세포를 파쇄하여 기능성 다당체를 세포 외로 추출하는 기능성 다당체의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 정제 단계는,
   상기 추출액을 80 내지 100°C에서 5분 내지 60분간 열처리하는 단계;
   구연산을 첨가하여 pH를 3.5 내지 4.5 범위로 조절하고 침전물을 제거하는 단계;
   디터전트(detergent)를 첨가하여 층분리를 한 후 원심분리를 통해 상등액을 회수하는 단계;
   상기 회수한 상등액을 초미세 필터로 여과하고 농축하여 농축액을 얻는 단계;
   상기 농축액에 1 내지 5배 부피의 주정을 첨가하여 침전물을 회수하는 단계; 및
   상기 침전물을 증류수 또는 탈이온수에 재부유한 후 1 내지 5배 부피의 주정을 재첨가하고 침전물을 회수하는 단계;를 포함하는 기능성 다당체의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하인 기능성 다당체의 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 다당체는 글리코겐이며, 고형분 기준으로 99% 이상의 순도를 갖는 기능성 다당체의 제조방법.
   
7. 제1항의 제조방법으로 제조된 기능성 다당체로서,
   조단백질, 조지방, 및 조회분 각각의 함량이 0.5% 이하이고, 고형분 기준으로 99% 이상이 글리코겐인 기능성 다당체.
   
8. 제7항에 있어서,
   항산화 활성을 갖는 기능성 다당체.
   
9. 제7항에 있어서,
   1000 μg/ml 이하의 농도에서, BALB/3T3 clone A31 세포주에 광독성을 갖지 않는 기능성 다당체.
   
10. 제7항의 기능성 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.

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