TW201904599A - 火龍果花萃取物、其製備方法、其用途及其改善皮膚狀態之組合物 - Google Patents

火龍果花萃取物、其製備方法、其用途及其改善皮膚狀態之組合物

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Abstract

本發明提供一火龍果花萃取物，其係由下列步驟製得：提供一火龍果花、乾燥火龍果花並將火龍果花裁切以得到一火龍果花碎片。進行一萃取製程，萃取製程包含混合步驟、加熱步驟、冷卻步驟、再加熱步驟以及萃取步驟，其中混合步驟為將火龍果花碎片與醇類溶液混合成一混合物以進行後續步驟，並在完成萃取製程後將混合物之固體成分與液體成分分離，所得之液體成分即包含火龍果花萃取物，此萃取物具有抗氧化活性及修復傷口的能力，而以火龍果花萃取物所製得之組合物則具有改善皮膚狀態的能力。

Description

火龍果花萃取物、其製備方法、其用途及其改善皮膚狀態之組合物
本發明係關於一種植物萃取物及其製備方法，特別是關於一種火龍果花萃取物以及火龍果花萃取物之製備方法。
火龍果(dragon fruit、pitaya)為多年生仙人掌科(Cactaceae)三角柱屬(Hylocereus)或蛇鞭柱屬(Selenicereus)植物的果實，其含有多種營養成分，並具有豐富的花青素以及水溶性膳食纖維，對人體的健康有絕佳的功效。在台灣地區，火龍果的盛產期約為每年的6月至10月，且果實生長期病蟲害甚少，為少數可以不施農藥並進行有機栽植的水果。
火龍果花與曇花同為仙人掌科的植物，在外形以及開花的生理週期上非常相似，火龍果花除了有宜人的香味，亦含有豐富的多醣體及具有抗氧化功能的類黃酮成分，兼具觀賞與食用價值。火龍果約於每年的4至5月開始開 花，在產季中會出現7至10批的火龍果花的花芽，而在一批花芽開花時，另一批花芽即會開始生成並依序開花。為了使火龍果果實在成長期間獲得足夠的營養，以維持火龍果的大小與品質，在產期間必須進行多次的疏花作業，留下少數的花苞進行後續的生長，以免結果過多造成植株負擔過大，進而影響火龍果的品質。然而，在火龍果疏花作業中被摘除的火龍果花苞數量甚多，除少數被進一步利用於食品或其他用途之外，其餘的火龍果花苞只能以農業廢棄物的方式進行處理，不僅浪費珍貴的生物資源，亦增加農業廢棄物的處理工序。
因此，如何進一步解決火龍果疏花作業時所產生的農業廢棄物問題以及增加火龍果產業的附加經濟效益，遂成為目前相關產業的發展方向。
為了解決上述問題，本發明之一態樣為提供一種火龍果花萃取物之製備方法，包含下列步驟：提供一火龍果花。乾燥前述之火龍果花，並將乾燥後的火龍果花裁切成細塊，以獲得一火龍果花碎片。進行一萃取製程，萃取製程包含一混合步驟、一加熱步驟、一冷卻步驟、一再加熱步驟以及一萃取步驟。混合步驟係利用一醇類溶液與火龍果花碎片混合成一混合物後，以進行加熱步驟。加熱步驟係將混合物加熱至一加熱溫度後並反應一加熱時間。冷卻步驟係將混合物冷卻至一室內溫度並靜置一冷卻時間。再加熱步驟係將 混合物加熱至一再加熱溫度並反應一段再加熱時間。接著進行萃取步驟，萃取步驟係將混合物冷卻至前述之室內溫度後並攪拌反應一萃取時間。最後，去除混合物中的固體成分以獲得萃取液，萃取液包含火龍果花萃取物。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中醇類溶液可為丙三醇溶液。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中丙三醇溶液之體積百分濃度可為10%至50%，較佳地，所述之丙三醇溶液之體積百分濃度為15%至40%。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中混合步驟中火龍果花碎片與醇類溶液可以重量比1：1至1：10之比例混合，較佳地，所述之火龍果花碎片與醇類溶液以重量比1：2至1：6之比例混合。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中加熱溫度可為40℃至70℃，較佳地，所述之加熱溫度為50℃至60℃。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中加熱時間可為6小時至10小時，較佳地，所述之加熱時間為8小時。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中冷卻時間可為20小時至28小時，較佳地，所述之冷卻時間為24小時。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中再加熱溫度可為40℃至70℃，較佳地，所述之再加熱溫度為50℃至60℃。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中再加熱時間可為6小時至10小時，較佳地，所述之再加熱時間為8小時。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中萃取時間可為5天至9天，較佳地，所述之萃取時間為7天。
依據前述之火龍果花萃取物之製備方法，其中固體成分可利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。
藉此，本發明之火龍果花萃取物之製備方法可萃取火龍果花中的生物活性成分，以供後續的應用，並可解決火龍果在產季時因進行疏花作業所帶來的生物資源浪費以及農業廢棄物問題，以增加火龍果產業的附加價值。
本發明之另一態樣為提供一種火龍果花萃取物之用途，其可應用於製備一抗氧化之藥物，其中火龍果花萃取物係利用前述之火龍果花萃取物之製備方法製得。
依據前述之火龍果花萃取物之用途，其中抗氧化之藥物可用於螯合亞鐵離子。
依據前述之火龍果花萃取物之用途，其中抗氧化之藥物可用於清除DPPH自由基。
藉此，本發明之火龍果花萃取物具有抗氧化活性，能螯合亞鐵離子以及清除DPPH自由基，是以本發明之 火龍果花萃取物可應用於需以抗氧化功能來達成其功效之醫藥、保健、美容等藥物製備之用途之上，具有其相關市場的發展潛力。
本發明之又一態樣為提供一種火龍果花萃取物之用途，其可應用於製備一促進傷口癒合的藥物，其中火龍果花萃取物係利用前述之火龍果花萃取物之製備方法製得。
依據前述之火龍果花萃取物之用途，其中傷口癒合的藥物可用以促進纖維母細胞增生及/或遷移。
藉此，本發明之火龍果花萃取物可促進纖維母細胞增生或促使其進行遷移，是以本發明之火龍果花萃取物可進一步應用於製備促進傷口癒合的藥物，使具有其相關市場的發展潛力。
本發明之再一態樣為提供一種改善皮膚狀態之組合物，組合物中包含一有效劑量之一火龍果花萃取物，其中火龍果花萃取物可利用前述之火龍果花萃取物之製備方法製得。
依據前述之改善皮膚狀態之組合物，其中改善皮膚狀態之組合物可用以提高皮膚之保濕能力。
依據前述之改善皮膚狀態之組合物，其中改善皮膚狀態之組合物可用以降低皮膚之黑色素指數。
依據前述之改善皮膚狀態之組合物，其中改善皮膚狀態之組合物可用以提高皮膚之明亮度指數。
藉此，本發明之改善皮膚狀態之組合物因具有提高皮膚的保濕能力、降低皮膚的黑色素指數的能力以及提 高皮膚明亮度指數的能力，使本發明之火龍果花萃取物可應用於保養品、化妝品、醫藥品等其他的皮膚相關產品之上，以降低人工添加物的使用，進而達成高效、安全且環保的目標。
上述發明內容旨在提供本發明所揭示之內容的簡化摘要，以使閱讀者對本發明所揭示的內容具備基本的理解。上述發明內容並非本發明所揭示之內容之完整概述，且其用意並非指出本發明之重要或關鍵元件，亦非用於限制或界定本發明的範圍。
100‧‧‧火龍果花萃取物之製備方法
110‧‧‧提供一火龍果花
120‧‧‧乾燥火龍果花
130‧‧‧進行萃取製程
131‧‧‧混合步驟
132‧‧‧加熱步驟
133‧‧‧冷卻步驟
134‧‧‧再加熱步驟
135‧‧‧萃取步驟
140‧‧‧去除混合物之固體成分
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係繪示本發明一實施方式之火龍果花萃取物之製備方法之步驟流程圖；第2圖係繪示本發明另一實施方式之一實施例的火龍果花丙三醇萃取液之螯合亞鐵離子能力之分析折線圖；第3圖係繪示本發明另一實施方式之另一實施例的火龍果花丙三醇萃取液之DPPH自由基清除能力之分析折線圖；第4A圖係繪示本發明又一實施方式之一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞24小時後細胞增生率之分析柱狀圖；第4B圖係繪示本發明又一實施方式之一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞48小時後 細胞增生率之分析柱狀圖；第5圖係繪示本發明又一實施方式之另一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞0小時、12小時與24小時後之體外傷口癒合實驗的傷口寬度的分析柱狀圖；第6A圖係繪示本發明再一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液四週後皮膚角質含水量提升率之分析柱狀圖；第6B圖係繪示本發明再一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液四週後皮膚角質含水量改善狀況之人數分析柱狀圖；第6C圖係繪示本發明再一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液1.5小時後皮膚角質含水量提升率之分析柱狀圖；第7圖係繪示本發明再另一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液4週後皮膚黑色素指數降低率之分析柱狀圖；以及第8圖係繪示本發明再更一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液4週後皮膚明亮度提升率之分析柱狀圖。
<火龍果花萃取物之製備方法>
請參照第1圖，第1圖係繪示本發明一實施方式之火龍果花萃取物之製備方法100之步驟流程圖，其中火龍 果花萃取物之製備方法100中包含步驟110、步驟120、步驟130以及步驟140。
步驟110為提供一火龍果花，其中火龍果為多年生仙人掌科(Cactaceae)三角柱屬(Hylocereus)或蛇鞭柱屬(Selenicereus)的植物，其花朵含有豐富的多醣體及具有抗氧化功能的類黃酮成分。
步驟120為乾燥火龍果花，並將乾燥後的火龍果花裁切成細塊後以獲得一火龍果花碎片。乾燥火龍果花可以去除火龍果花的水分，避免多餘的水分在後續的製備過程中影響火龍果花萃取物之純度以及降低火龍果花萃取液的有效成分濃度。
步驟130為進行萃取製程，萃取製程包含混合步驟131、加熱步驟132、冷卻步驟133、再加熱步驟134以及萃取步驟135。混合步驟131為將火龍果花碎片與一醇類溶液和以重量比1：1至1：10的比例混合；較佳地，火龍果花碎片與醇類溶液可以重量比1：2至1：6之比例充分混合，以得到一醇類溶液與火龍果花碎片的混合物，其中醇類溶液可為體積百分濃度10%至50%的丙三醇溶液，較佳地為體積百分濃度為15%至40%之丙三醇溶液。加熱步驟132為將混合物加熱至一加熱溫度後並反應一段加熱時間，其中加熱溫度可為40℃至70℃，較佳為50℃至60℃，而加熱時間可為6小時至10小時，較佳為8小時。冷卻步驟133為將混合物冷卻至一室內溫度並靜置一冷卻時間，其中冷卻時間可為20小時至28小時；較佳地，所述之 冷卻時間為24小時。再加熱步驟134為將混合物加熱至一再加熱溫度並反應一段再加熱時間，其中再加熱溫度可為40℃至70℃，較佳為50℃至60℃，而再加熱時間可為6小時至10小時，較佳為8小時。萃取步驟135為將經過加熱步驟134處理之混合物冷卻至一室內溫度後並攪拌反應一萃取時間，此萃取時間可為5天至9天，較佳為7天。
步驟140為去除混合物之固體成分以獲得一萃取液，此萃取液包含火龍果花萃取物。經過步驟110、步驟120以及步驟130的處理後，火龍果花中的有效成分以及生物活性成分已進入醇類溶液之中。將混合物中的固體成分去除後，餘下之液體成分即包含火龍果花萃取物。而固體成分則可利用離心方式、過濾方式或上述方式之組合而將其去除。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，以利於本發明所屬領域之通常知識者，可在不需過度解讀與實驗的情形下完整利用並實踐本發明。然而，閱讀者應瞭解到，這些實務上的細節不應用以限制本發明，也就是說，在本發明部分試驗例中，這些實務上的細節是非必要的，而是用以說明如何實施本發明之材料與方法。
<試驗例> 一、製備火龍果花萃取物
在進行火龍果花萃取物之製備時，先將火龍果花以清水沖洗數次後，再以蒸餾水做最後沖洗並瀝乾，接著 將瀝乾之火龍果花置於烘箱中，以低於50℃之溫度烘乾6小時，待火龍果花完全乾燥後將其裁切成細塊或用果汁機打碎，以製成火龍果花碎片。
以上述方式取得火龍果花碎片後即開始進行萃取製程，首先將火龍果花碎片浸潤於一醇類溶液中，並將火龍果花碎片與醇類溶液以重量比1：2至1：6之比例混合，其中醇類溶液可為乙醇、丁二醇或丙三醇，較佳地，醇類溶液為體積百分濃度15%至40%之丙三醇溶液，並將火龍果花碎片與醇類溶液充分混合後以得到一混合物。接著將此混合物以50℃至60℃的溫度加熱8小時後，於室溫下進行冷卻，並於24小時後將混合物以50℃至60℃的溫度再加熱8小時並再次進行冷卻，以增加萃取的效率。接著將混合物於室溫下浸泡、攪拌反應7天，以萃取火龍果花之有效成分與生物活性成分。
完成上述萃取製程後，將混合物利用紗布過濾去除混合物中的固體成分，以獲得包含火龍果花萃取物的一火龍果花醇類萃取液。
為了分析火龍果花醇類萃取液之生物活性與功效，本試驗進一步對火龍果花醇類萃取液以及包含火龍果花醇類萃取液之改善皮膚狀態之組合物進行功效性評估，以說明本發明之火龍果花醇類萃取液之功效。
二、火龍果花萃取物之抗氧化能力評估
身體組織必須仰賴氧化作用來進行新陳代謝以維持生物體的功能與活力，但在氧化作用的過程中約有2-3%的氧氣會轉變成活性氧物質(Reactive oxygen species，ROS)並產生許多自由基(Free Radicals)，這些活性氧物質因存有未成對電子(non-paired electron)使其化學特性相當活潑，容易造成細胞的老化與死亡，進而對生物體帶來重大的危害。
因此，本試驗針對本發明之火龍果花丙三醇萃取液進行抗氧化能力之評估分析，其係進行螯合亞鐵離子能力測定以及DPPH清除能力的測定。
1.火龍果花萃取物螯合亞鐵離子之能力測定
在多種金屬離子中，亞鐵離子(Fe2+)係一具有高度的還原性的促氧化劑，在甲醇溶液中，Fe2+可與Ferrozine螯合而形成鮮紅色的Ferrozine-Fe2+錯合物，Ferrozine-Fe2+錯合物於波長562nm處有強烈的吸光值，當試驗樣品中的成分與Fe2+結合時，將減少錯合物的形成，造成562nm之吸光值降低，因此可藉由562nm之吸光值降低程度來判斷試驗樣品螯合亞鐵離子的能力。故本試驗例利用火龍果花丙三醇萃取液對於亞鐵離子的螯合能力來進一步測定與評估本發明之火龍果花丙三醇萃取液之抗氧化能力，當所螯合的亞鐵離子越多，代表其抗氧化的能力越強。
實驗上先將火龍果花丙三醇萃取液製成一甲醇溶液，並取4.7mL之火龍果花丙三醇萃取液之甲醇溶液與 0.1mL濃度2mM之FeCl2．4H2O溶液混合反應30秒後，接著加入0.2mL濃度5mM之Ferrozine溶液，於室溫下避光靜置反應30分鐘，再以分光光度計測定樣品於波長562nm下之吸光值。為了進一步評估火龍果花丙三醇萃取液之螯合亞鐵離子的能力，本試驗例以強效陽離子螯合劑EDTA為控制組，以比較本發明之火龍果花丙三醇萃取液之螯合亞鐵離子能力。上述實驗組進行三重複，並將三次實驗所得之亞鐵離子螯合能力值作圖，以進行後續分析，螯合亞鐵離子能力之計算公式I如下： 其中Sample 562nm為樣品於波長562nm之吸光值，而control 562nm則為控制組於波長562nm之吸光值。
請參照第2圖，第2圖係繪示本試驗例的火龍果花萃取液之螯合亞鐵離子能力之分析折線圖，由實驗結果可得知，當火龍果花丙三醇萃取液之甲醇溶液濃度為100mg/mL時，相較於濃度為100mg/mL之EDTA之94%，火龍果花丙三醇萃取液之亞鐵離子螯合能力可達76±6%，顯示本發明之火龍果花丙三醇萃取液具有良好之抗氧化能力，使其在製備抗氧化之藥物之用途上具有相當的潛力。
2.火龍果花萃取物清除DPPH自由基之能力測定
DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一種相當穩定的自由基，其乙醇溶液為一藍紫色之溶液，在波長517nm處有強烈之吸光值，當DPPH自由基被抗氧化 物還原清除時，於波長517nm處的吸光值會下降，因此，當波長517nm之吸光值降低程度越大，即代表樣品的抗氧化能力越強，故本試驗利用火龍果花丙三醇萃取液對於DPPH自由基的清除能力來進一步測定與評估本發明之火龍果花丙三醇萃取液之抗氧化能力。
實驗上將新鮮配製之250μL不同濃度之火龍果花丙三醇萃取液之乙醇溶液加入微量離心管中，再加入750μL濃度0.1mM之DPPH乙醇溶液，均勻混合後於室溫避光靜置反應30分鐘，再以分光光度計測定樣品於波長517nm下之吸光值。本試驗中另以抗氧化劑BHT(Di-Butyl Hydroxy Toluene)做為標準品，以分析本發明火龍果花丙三醇萃取液之DPPH自由基清除能力。上述實驗組進行三重複，並將三次實驗所得之DPPH自由基清除能力作圖，以進行後續分析，DPPH自由基清除能力之計算公式II如下： 其中Sample 517nm為樣品於波長517nm之吸光值，而control 517nm則為控制組於波長517nm之吸光值。
請參照第3圖，第3圖係繪示本試驗例的火龍果花丙三醇萃取液之DPPH自由基清除能力之分析折線圖，由實驗結果可得知，火龍果花丙三醇萃取液在濃度10μg/mL時具有30%的DPPH自由基清除率，而在濃度到達100μg/mL時，相較於相同濃度之BHT之DPPH自由基清除率為70%，火龍果花丙三醇萃取液可達60%以上之DPPH自由基清除率，而當火龍果花丙三醇萃取液在濃度500μg/mL 時更可達到81%的DPPH自由基清除率，顯示本發明之火龍果花萃取物具有良好之清除DPPH自由基之抗氧化能力，使其在製備抗氧化之藥物之用途上具有相當的潛力。
在此需注意的是，前述之本發明之火龍果花丙三醇萃取液製備的抗氧化之藥物除可以外用的方式進行施用之外，亦可為一口服藥物，而口服藥物則可為一口服用膠囊、懸浮液、粉末或藥錠，且本發明並不以此為限。
三、火龍果花萃取液之促進傷口癒合的有效性評估 1.火龍果花萃取物促進纖維母細胞增生之能力測定
在測試本發明之火龍果花萃取液促進纖維母細胞增生之能力方面係以細胞存活率分析(Method of transcriptional and translational assay；MTT assay)來對纖維母細胞的增生率進行分析。本實驗以CCD-966SK人類纖維母細胞株進行實驗，CCD-966SK纖維母細胞株(購自BCRC生物資源保存及研究中心，編號為60153)為一取自患有導管癌之成人患者乳房皮膚的纖維母細胞株，以說本發明之火龍果花萃取液對於不同種類之纖維母細胞的促進增生效果。
在實驗上先於96孔盤中分別植入每孔6x103個CCD-966SK纖維母細胞，於37℃、5% CO2的培養箱中培養24小時後更換新的培養基，並分別以不同濃度的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞，在本試驗中分別以四種不同濃度之火龍果花丙三醇萃取液進行實 驗，其中實施例1為使用5mg/ml之火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞，實施例2為使用2.5mg/ml之火龍果花丙三醇萃取液，實施例3為使用1.25mg/ml之火龍果花丙三醇萃取液，而實施例4則為使用0.5mg/ml之火龍果花丙三醇萃取液。此外，在本試驗中同時利用未包含本發明之火龍果花萃取物之丙三醇溶液做為比較例，以觀察CCD-966SK纖維母細胞在未受火龍果花萃取物處理下之細胞增生情形，其中比較例1為使用5mg/ml之丙三醇溶液處理CCD-966SK纖維母細胞，比較例2為使用2.5mg/ml之丙三醇溶液，比較例3為使用1.25mg/ml之丙三醇溶液，而比較例4則為使用0.5mg/ml之丙三醇溶液。在完成處理24小時與48小時後分別於每孔加入10μL之MTT試劑，於37℃的條件下孵育4小時，接著以分光光度計測試波長570nm之吸光值，並將實施例1至實施例4與比較例1至比較例3之吸光值數值與比較例4之吸光值數值進行標準化後，依照下列公式III以實施例1至實施例4處理後之纖維母細胞的吸光值與其所對應濃度之比較例1至比較例4的吸光值分別進行細胞相對增生率的計算，每個濃度進行二重複測試： 其中，X=12、24，Y=1、2、3、4(公式III)。
此外，在本試驗中亦分別將經過實施例1至實施例4之本發明之火龍果花丙三醇萃取液處理後之纖維母細胞的細胞相對增生率數據、以及比較例1至比較例3處理後 之纖維母細胞的細胞相對增生率數據與比較例4所得之纖維母細胞的相對增生率數據進行統計分析，若兩者具有統計上的顯著性(p<0.05)，則在圖式中以「*」符號進行標記，以比較與說明本發明之火龍果花丙三醇萃取液具有較佳之促進纖維母細胞增生的能力。
請參照第4A圖與第4B圖，第4A圖係係繪示本發明又一實施方式之一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞24小時後細胞增生率之分析柱狀圖，而第4B圖則係繪示本發明又一實施方式之一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞48小時後細胞增生率之分析柱狀圖，其中第4A圖與第4B圖係將前述之公式III所計算而得之細胞相對增生率數值加上100%以作為纖維母細胞增生之基準，藉以說明本發明之火龍果花丙三醇萃取液對於CCD-966SK纖維母細胞在正常生長狀態下之額外的促進增生效果，特此先敘明。如第4A圖與第4B圖所示，在使用未包含本發明之火龍果花萃取物之丙三醇溶液之比較例1至比較例3處理CCD-966SK纖維母細胞株24小時與48小時後，相較於比較例4的細胞增生率並無顯著差異，顯示未包含本發明之火龍果花萃取物之丙三醇溶液對於CCD-966SK纖維母細胞株之細胞增生率並無顯著影響。在以實施例1至實施例4之不同濃度的本發明之火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞株24小時與48小時後，可見實施例1至實施例4相較於對應濃度之比較例1至比較例4均表現較佳的細胞增生率，其中又以 實施例3處理後的CCD-966SK纖維母細胞的細胞增生率為最佳，其細胞增生率相較於未加樣本之比較例4於24小時和48小時分別增加14%以及32%。
由上述的結果可知，本發明之火龍果花丙三醇萃取液對於纖維母細胞具有優良之促進細胞增生的效果，對於促進傷口癒合而言具有優良的潛力。
2.火龍果花萃取物促進纖維母細胞遷移之能力測定
已有許多研究指出，纖維母細胞可在短時間內增生並遷移至傷口處，進而促進傷口的修復與癒合，是以本試驗利用體外傷口癒合實驗來測定本發明之火龍果花丙三醇萃取液對於CCD-966SK纖維母細胞的爬行能力促進效果，並以細胞在模擬傷口處的爬行距離作為判定CCD-966SK纖維母細胞株的遷移能力指標。
在實驗上首先將5x104個CCD-966SK纖維母細胞分別植入已預先置放於24孔細胞培養盤之細胞分隔器的兩個腔室中，於37℃、5% CO2的培養箱中培養24小時後移除細胞分隔器，使分別植入二腔室之CCD-966SK纖維母細胞之間形成寬度為500μm之間隙，以模擬生物體上的傷口，於此同時以包含前述之實施例1至實施例4的本發明之火龍果花丙三醇萃取液的培養基處理CCD-966SK纖維母細胞，並將此時之細胞分布情形做為0小時的傷口寬度(亦即，傷口發生之時間點)，並拍攝於光學顯微鏡下之細胞分布狀態，而在完成藥物處理12小時與24小時後則進一步拍 攝與量測以不同濃度的本發明之火龍果花丙三醇萃取液處理後之傷口的寬度，並依照下列公式IV計算傷口的修復率： 其中，X=12、24。此外，在本試驗中亦包含前述之比較例1至比較例4以及一未使用火龍果花丙三醇萃取液或丙三醇溶液進行處理之對照組，藉以評估本發明之火龍果花丙三醇萃取液之促進纖維母細胞遷移之能力。
請參照第5圖其係繪示本發明又一實施方式之另一實施例的火龍果花丙三醇萃取液處理CCD-966SK纖維母細胞0小時、12小時與24小時後之體外傷口癒合實驗的傷口寬度的分析柱狀圖。如第5圖所示，對照組經過12小時與24小時的生長後其傷口寬度分別為400μm與320μm，顯示CCD-966SK纖維母細胞的自然傷口修復率在傷口發生後12小時約為20%，在傷口發生後24小時約為36%。而在不包含本發明之火龍果花丙三醇萃取液之各濃度的比較例1至比較例4的傷口修復率結果方面，於傷口發生後12小時後，比較例1至比較例4的傷口修復率同樣約為20%，而於傷口發生後24小時後，比較例1至比較例4的傷口修復率同樣約為36%。而在經過實施例1至實施例4的本發明之火龍果花丙三醇萃取液處理後之CCD-966SK纖維母細胞方面，在傷口發生後24小時其傷口修復率分別為實施例1的36%、實施例2的36%、實施例3的48%及實施例4的68%，相較於比較例1至比較例4及對照組均具有較佳的傷口修復率，顯示本發明之火龍果花丙三醇萃取液之促進纖維母細胞 株的遷移能力甚佳，使其在製備促進傷口癒合的藥物之用途上具有相當的潛力。
在此需注意的是，前述之本發明之火龍果花丙三醇萃取液製備之促進傷口癒合的藥物除可以外用的方式進行施用之外，亦可為一口服藥物，而口服藥物則可為一口服用膠囊、熟浮液、粉末或藥錠，且本發明並不以此為限。
四、含有火龍果花萃取液之改善皮膚狀態之組合物的有效性評估
本發明提供一種改善皮膚狀態之組合物，包含一有效劑量之火龍果花萃取物，其中火龍果花萃取物係利用前述之火龍果花萃取物之製備方法製得。本試驗例提供一種火龍果花萃取液乳液，其係由下表一之成分所組成：
火龍果花萃取液乳液之調製步驟首先秤取B相中所有的原料並將其放入容器中並充分混合，再將B相原料加熱至70℃至75℃，並攪拌至完全溶解，同時亦秤取A相中所有的原料並將其放入另一個容器中並充分混合，再將A相原料加熱至70℃至75℃，並攪拌至完全溶解。接著將溫度保持在70℃至75℃之A相原料倒入溫度保持在70℃至75℃之B相原料中並快速攪拌5分鐘，再以均質機處理A、B相原料之混合物3分鐘後，以攪拌機攪拌直至混合物之溫度降至室溫，以獲得本試驗例之火龍果花萃取液乳液。
為了評估火龍果花萃取液乳液對於改善皮膚狀態之效能，本試驗例係分別針對火龍果花乙醇萃取液乳液、火龍果花丁二醇萃取液乳液、火龍果花丙三醇萃取液乳液、以及丙三醇乳液(未加火龍果花萃取液)對於受試者皮膚之長效性以及短效性之保濕能力測定、皮膚黑色素指數降低率之測定，以及皮膚明亮度提升率之測定。
1.火龍果花萃取液乳液的長效性保濕能力評估
皮膚角質含水量的程度可夠透過皮膚所反應之電容大小來測試，故本試驗例以非侵入性之皮膚電容測試儀Corneometer® CM 825(Courage-Khazaka Electronic,Cologne,Germany)來偵測淺層上皮至0.1mm的含水量。在實驗方面，本試驗例分成下列不同實驗組來進行，分別是火龍果花乙醇萃取液乳液、火龍果花丁二醇萃取液乳液、火 龍果花丙三醇萃取液乳液、丙三醇乳液以及安慰劑等5組，各組的受試者在未使用火龍果花萃取液乳液前先於化粧品有效性評估室進行使用前測試，其中化粧品有效性評估室之環境溫度為22±1℃且相對溼度為60±5%，待受試者完成臉部清潔並等待30分鐘後，以Corneometer® CM 825測定受試者使用火龍果花乳液前之右臉皮膚角質含水量，再請受試者於每日早晚清潔臉部之後使用火龍果花乳液4週後再回化妝品有效性評估室進行使用後測試，測試部位同樣為右臉。上述實驗組各進行三重複，並將三次實驗所得之皮膚角質含水量之提升率作圖，以進行後續分析。皮膚角質含水量之提升率之計算公式V如下：
請參照第6A圖與第6B圖，第6A圖係繪示本發明再一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液四週後皮膚角質含水量提升率之分析柱狀圖，而第6B圖則係繪示本發明再一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液四週後皮膚角質含水量改善狀況之人數統計分析圖，由實驗結果可知，受試者使用本發明之火龍果花萃取液乳液四週後在皮膚角質的含水量方面，火龍果花乙醇萃取液乳液提升21.6%、火龍果花丁二醇萃取液乳液提升20.9%、火龍果花丙三醇萃取液乳液提升25.1%、丙三醇乳液提升16.5%，而安慰劑則提升13.0%，其中以火龍果花丙三醇萃取液乳液的角質含水量提升率效果最好。
上述各實驗組的角質含水量提升率數值亦利用統計方法T-test進一步分析，如第6A圖所示，以火龍果花丙三醇萃取液乳液為比較組時，若其角質含水量提升率與其他實驗組之角質含水量提升率相比具有統計上的顯著性(p<0.05)，則以「*」符號標記來表示，而由統計分析的結果可見，火龍果花丙三醇萃取液乳液的角質含水量提升率相較於火龍果花乙醇萃取液乳液、火龍果花丁二醇萃取液乳液、丙三醇乳液以及安慰劑之角質含水量提升率均具有顯著的提升，顯示火龍果花丙三醇萃取液乳液提升角質含水量的效果甚佳。各組間詳細的角質含水量提升率比較之統計分析結果如下表二所示：
從受試者皮膚角質含水量改善狀況之人數統計結果來看，受試者使用火龍果花丙三醇萃取液乳液四週後皮膚角質含水量改善程度大於11%之人數與程度均比使用單純之丙三醇乳液好，顯示火龍果花丙三醇萃取液乳液可有效提升皮膚的長效保濕能力。
2.火龍果花萃取液乳液的短效性保濕能力評估
玻尿酸(Hyaluronan、hyaluronic acid)又稱醣醛酸、透明質酸或琉璃醣碳基酸，因其具有高度的生物相容性以及保濕能力，在醫學美容上常用以做為緩解皮膚乾燥之用途。故本試驗例以不同比例之玻尿酸、火龍果花丙三醇萃取液以及不同比例之玻尿酸與火龍果花丙三醇萃取液所製成之乳液來進行皮膚角質含水量之短效性測試。本試驗例同樣以非侵入性之皮膚電容測試儀Corneometer® CM 825來偵測淺層上皮至0.1mm的含水量。
在實驗方面，本試驗例分成9組不同實驗組來進行，第1組為含有5%火龍果花丙三醇萃取液+1%玻尿酸之乳液、第2組為含有3%火龍果花丙三醇萃取液+1%玻尿酸之乳液、第3組為含有1%火龍果花丙三醇萃取液+1%玻尿酸之乳液、第4組為含有5%玻尿酸之乳液、第5組為含有3%玻尿酸之乳液、第6組為含有1%玻尿酸之乳液、第7組為含有5%火龍果花丙三醇萃取液之乳液、第8組含有3%火龍果花丙三醇萃取液之乳液，以及第9組為含有1%火龍果花丙三醇萃取液之乳液。各組的受試者在未使用上述乳液前先於化粧品有效性評估室進行使用前測試，待受試者完成臉部清潔並等待30分鐘後，以Corneometer® CM 825測定受試者使用上述乳液前右臉之皮膚角質含水量，待各組受試者使用上述乳液1.5小時後，再次測定使用後之右臉皮膚角質含水量。上述實驗組各進行三重複，並將三次實驗所得之皮膚角質含水量之提升率作圖，以進行後續分析。皮膚角質含水量之提升率之計算公式VI如下：
請參照第6C圖，第6C圖係繪示本發明再一實施方式之受試者使用上述乳液1.5小時後皮膚角質含水量提升率之分析柱狀圖，由實驗結果可得知，在使用含有不同濃度之火龍果花丙三醇萃取液之乳液或玻尿酸乳液的短效性測試中，第1組受試者的皮膚角質含水量提升率為19.9%、第2組為14.7%、第3組為13.1%、第4組為12.0%、第5組為10.6%、第6組為9.6%、第7組為13.2%、第8組為11.9%，以及第9組為12.4%，由此可知，火龍果花萃取液乳液之短效性保濕能力相當優異，在角質含水量提升率上與添加玻尿酸之乳液相當。
上述各實驗組的角質含水量提升率數值亦利用統計方法T-test進一步分析，如第6C圖所示，以第1組之含有5%火龍果花丙三醇萃取液+1%玻尿酸之乳液為比較組時，若其角質含水量提升率與其他實驗組之提升率具有統計上的顯著性(p<0.05)，則以「*」符號標記來表示。而經由統計分析的結果可見，第1組之受試者的皮膚角質含水量提升率相較於他組之皮膚角質含水量提升率具有顯著的提升，顯示5%火龍果花丙三醇萃取液+1%玻尿酸之乳液在提升皮膚角質含水量的效果上甚佳。各組間詳細的角質含水量提升率比較之統計分析結果如下表三所示：
3.火龍果花萃取液乳液之皮膚黑色素指數降低率之功效評估
本試驗例中皮膚之黑色素指數(E；Melanin Index)係由DSM II Skin ColorMeter(Cortex Technology,Hadsun,Denmark)來做測定。在實驗方面，本試驗例分成下列實驗組來進行，分別是使用火龍果花乙醇萃取液乳液、使用火龍果花丁二醇萃取液乳液、使用火龍果花丙三醇萃取液乳液以及使用安慰劑等4組，各組的受試者在未使用火龍果花萃取液乳液前先於化粧品有效性評估室進行使用前測試，待受試者完成臉部清潔並等待30分鐘後，以DSM II Skin ColorMeter測定受試者使用火龍果萃取液花乳液前之右臉之皮膚黑色素指數，再請受試者於每日早晚清潔臉部之後使用火龍果花萃取液乳液4週後，再回化妝品有效性評估室進行使用後測試，測試部位同樣為右臉。上述實驗組各進行三重複，並將三次實驗所得之皮膚黑色素指數降低率作圖，以進行後續分析。皮膚黑色素指數降低率之計算公式VII如下：
請參照第7圖，第7圖係繪示本發明再另一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液4週後皮膚黑色素指數降低率之分析柱狀圖，由實驗結果可得知，受試者使用火龍果花萃取液乳液4週後皮膚之黑色素指數明顯降低，相較於火龍果花乙醇萃取液乳液之3.9%、火龍果花丁二醇萃取液乳液之2.1%以及安慰劑之1.4%，使用火龍果花丙三醇萃取液乳液4週後之皮膚黑色素指數降低率可達5.8%。
上述各實驗組的黑色素指數降低率數值同樣利用統計方法T-test進一步分析，如第7圖所示，以火龍果花丙三醇萃取液乳液為比較組時，若其黑色素指數降低率與其他實驗組之黑色素指數降低率具有統計上的顯著性(p<0.05)，則以「*」符號標記來表示。而由統計分析的結果顯示，使用火龍果花丙三醇萃取液乳液4週後之皮膚黑色素指數降低率相較於其他組別之黑色素指數降低率均具有顯著的降低，顯示火龍果花丙三醇萃取液乳液降低皮膚黑色素的效果甚佳。各組間詳細的皮膚黑色素指數降低率比較之統計分析結果如下表四所示：
4.火龍果花乳液之皮膚明亮度提升率之功效評估
本試驗例中皮膚之明亮度指數(L*)係由DSM II Skin ColorMeter來做測定。在實驗方面，本試驗例分成4組不同實驗組來進行，分別是使用火龍果花乙醇萃取液乳液、使用火龍果花丁二醇萃取液乳液、使用火龍果花丙三醇萃取液乳液組以及使用安慰劑等組別，各組的受試者在未使用火龍果花萃取液乳液前先於化粧品有效性評估室進行使用前測試，待受試者完成臉部清潔並等待30分鐘後，以DSM II Skin ColorMeter測定受試者使用火龍果花萃取液乳液前之右臉之皮膚明亮度指數，再請受試者於每日早晚清潔臉部之後使用火龍果花萃取液乳液4週後，再回化妝品有效性評估室進行使用後測試，測試部位同樣為右臉。上述實驗組各進行三重複，並將三次實驗所得之明亮度指數提升率作圖，以進行後續分析。皮膚明亮度指數提升率之計算公式VIII如下：
請參照第8圖，第8圖係繪示本發明再更一實施方式之受試者使用火龍果花萃取液乳液4週後皮膚明亮度指數提升率之分析柱狀圖，由實驗結果可得知，受試者使用含火龍果花萃取液乳液4週後皮膚之皮膚明亮度指數明顯提升，相較於火龍果花乙醇萃取液乳液之5.4%、火龍果花丁二醇萃取液乳液之6.2%以及安慰劑之3.8%，使用火龍果花丙三醇萃取液乳液4週後皮膚明亮度指數提升率可達6.9%。
上述各實驗組的黑色素指數降低率數值同樣利用統計方法T-test進一步分析，如第8圖所示，以火龍果花丙三醇萃取液乳液為比較組時，若其皮膚明亮度指數提升率與其他實驗組之皮膚明亮度指數提升率具有統計上的顯著性(p<0.05)，則以「*」符號標記來表示，而由統計分析的結果顯示，使用火龍果花丙三醇萃取液乳液4週後相較於他組之皮膚明亮度指數提升率均具有顯著的提升，顯示火龍果花丙三醇萃取液乳液提升皮膚明亮度的效果甚佳。各組間的皮膚明亮度指數提升率比較之統計分析結果如下表五所示：
綜上所述，本發明所揭露之火龍果花萃取物之製備方法所製得的火龍果花萃取物具有螯合亞鐵離子、清除DPPH自由基等抗氧化能力，並可促進纖維母細胞增生或促使其進行遷移，使其可進一步應用於製備促進傷口癒合的藥物。而利用包含本發明之火龍果花萃取物之火龍果花萃取液所製得之火龍果花萃取液乳液能達成受試者皮膚長效性與短效性之保濕效果，並可降低皮膚之黑色素指數以及提升皮膚的明亮度，具有醫學與美容上的發展潛力。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神 和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (28)

  1. 一種火龍果花萃取物之製備方法，包含：提供一火龍果花；乾燥該火龍果花，並將乾燥後之該火龍果花裁切成細塊，以獲得一火龍果花碎片；進行一萃取製程，該萃取製程包含：一混合步驟，係利用一醇類溶液與該火龍果花碎片混合成一混合物；一加熱步驟，係將該混合物加熱至一加熱溫度後並反應一加熱時間；一冷卻步驟，係將該混合物冷卻至一室內溫度並靜置一冷卻時間；一再加熱步驟，係將該混合物加熱至一再加熱溫度並反應一段再加熱時間；及一萃取步驟，將該混合物冷卻至該室內溫度後並攪拌反應一萃取時間；以及去除該混合物之一固體成分以獲得一萃取液，該萃取液包含該火龍果花萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該醇類溶液為一丙三醇溶液。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該丙三醇溶液之體積百分濃度為10%至50%。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該丙三醇溶液之體積百分濃度為15%至40%。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該混合步驟中該火龍果花碎片與該醇類溶液以重量比1：1至1：10之比例混合。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該火龍果花碎片與該醇類溶液以重量比1：2至1：6之比例混合。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該加熱溫度為40℃至70℃。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該加熱溫度為50℃至60℃。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該加熱時間為6小時至10小時。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該加熱時間為8小時。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該冷卻時間為20小時至28小時。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該冷卻時間為24小時。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該再加熱溫度為40℃至70℃。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該再加熱溫度為50℃至60℃。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該再加熱時間為6小時至10小時。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該再加熱時間為8小時。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該萃取時間為5天至9天。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該萃取時間為7天。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之火龍果花萃取物之製備方法，其中該固體成分係利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。
  20. 一種火龍果花萃取物之用途，其係應用於製備一抗氧化之藥物，其中該火龍果花萃取物係利用如申請專利範圍第1項至第19項任一項之製備方法製得。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之火龍果花萃取物之用途，其中該抗氧化之藥物係用以螯合亞鐵離子。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之火龍果花萃取物之用途，其中該抗氧化之藥物係用以清除DPPH自由基。
  23. 一種火龍果花萃取物之用途，其係應用於製備一促進傷口癒合的藥物，其中該火龍果花萃取物係利用如申請專利範圍第1項至第19項任一項之製備方法製得。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之火龍果花萃取物之用途，其中該傷口癒合的藥物係用以促進纖維母細胞增生及/或遷移。
  25. 一種改善皮膚狀態之組合物，其中該改善皮膚狀態之組合物包含一有效劑量之一火龍果花萃取物，該火龍果花萃取物係利用如申請專利範圍第1項至第19項任一項之製備方法製得。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之改善皮膚狀態之組合物，其中該改善皮膚狀態之組合物係用以提高皮膚之一保濕能力。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之改善皮膚狀態之組合物，其中該改善皮膚狀態之組合物係用以降低皮膚之一黑色素指數。
  28. 如申請專利範圍第25項所述之改善皮膚狀態之組合物，其中該改善皮膚狀態之組合物係用以提高皮膚之一明亮度指數。
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