KR102453167B1

KR102453167B1 - 식물성 세라마이드 성분을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102453167B1
Application number: KR1020220053620A
Authority: KR
Inventors: 엄태명; 이해민; 서유리; 박지수; 김다애; 이대우
Original assignee: 씨앤텍(주); (주)더마랩
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-10-11

Abstract

본 발명은 식물성 세라마이드 성분을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부주름 개선, 보습, 피부장벽강화, 피부재생효과 및 여드름 개선 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

식물성 세라마이드 성분을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving skin containing phyto-ceramide}

본 발명은 식물성 세라마이드 성분을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부주름 개선, 보습, 피부장벽강화, 피부재생효과 및 여드름 개선효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 하며 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 한다.

피부 노화의 원인에는 내적 원인과 외적 원인이 있다. 피부는 외부 환경에 노출되어 있어서 외적인 인자의 영향으로 노화가 진행되는 경우가 많으며, 이 들 중에는 자외선에 의한 손상, 외부 유해 환경 성분, 각종 스트레스로 인한 내부 요인이 포함된다. 이러한 인자들에 의하여 피부 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠어지면서 갈라지게 된다. 수분 손실이 되면 각질이 탈락되면서 외부에 노출되기 용이하게 되면서 자극에 대한 염증 및 피부질환이 유발된다. 건조한 피부는 면역기능이 약화되어 가려움증 및 아토피 피부염 등의 알러지가 유발되기 쉬워진다. 그러므로 피부의 수분 손실을 방지하는 것은 중요하다. 인체의 60~70%가 수분으로 이루어져 있으나, 외부 자극으로 인해 수분을 공기 중으로 빼앗기게 되어 피부는 수분을 잃게 되며, 이로 인해 수분 부족과 피부 탄력 저하 등 피부 노화가 시작 된다. 염증 반응은 조직에 해롭거나 해로울 가능성이 있는 요인들로부터 생체를 보호하는 생리적 반응이다. 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 피부탄력을 감소시켜 주름의 원인이 되며 이로 인해 빠른 피부 노화를 초래한다. 따라서 과다 염증에 의해 생성되는 단백질 및 지질 분해 효소들을 억제하여 손상되는 세포들을 보호함으로서 피부 노화를 억제할 수 있다.

산화스트레스는 단백질 분해효소의 활성화, 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴 절단, 히아루론산 절단 등의 생체 구성 성분들의 손상을 야기하며, 피부 염증 유발 및 피부 면역기능을 억제시켜 세균 감염증 또는 발암율의 증가를 가져온다. 따라서 활성산소 생성을 억제하고 활성산소로 인한 염증 반응 억제 및 피부 보습력을 증가시켜 피부세포를 보호하여야 한다. 페놀계 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 BHA(butylated hydroxy anisol)와 BHT(butylated hydroxytolunene)는 그 효과와 경제성 때문에 많이 사용해 왔지만 안전성에 의심을 받고 있다. 따라서 인체에 안전한 천연 항산화제에 대한 개발이 요구되고 있다.

최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

여드름이란 모낭에 붙어있는 피지선에 염증이 발생하는 피부 질환을 말하며 주로 얼굴, 목, 가슴, 등, 어깨 부위에 발생한다. 여드름의 발생원인은 크게 남성호르몬의 증가, 피지 분비의 증가, 모낭의 협착, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 증식 등이 있다. 여드름의 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나 여러 원인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

여드름은 남성호르몬에 의해 활성화되며, 특히 남성호르몬인 테스토스테론이 피지선을 커지게 하여 피지 분비를 과도하게 증가시킨다. 피지는 모공을 통해 피부 밖으로 배출되는데, 피지 분비가 많아지면 모낭의 내벽을 자극하여 내벽세포의 과각화(過角化)를 유도한다. 탈락한 세포들은 엉겨서 모공을 폐쇄하고 모낭 내 피지가 배출되지 못하고 면포를 형성하여 염증으로 이어진다.

또한 여드름은 모낭 내에 상주하는 세균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의해 악화된다. 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)는 과잉 분비된 피지에 의해 생장이 촉진되고 지방분해 효소를 분비하여 피지를 구성하는 트리글리세라이드(Triglyceride)를 분해한다. 이에 따라 자유 지방산(free fatty acid)이 형성되고 모낭을 자극하여 여드름 생성을 촉진시키고 염증반응까지 수반하게 된다.

여드름을 완화시키기 위해서는 비정상적인 남성호르몬의 분비를 제어하거나 과잉 피지 분비 감소, 분비된 피지 제거를 통해 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 증식을 억제, 피부 각질 제거를 통한 모낭 협착을 예방하는 방법이 있다.

종래 여드름을 치료하기 위해 호르몬제 및 화합물 제재를 사용하고 있는데 초기 치료에는 효과적이지만 내성이 생기고 당뇨, 고혈압, 소화성궤양, 면역기능 저하 등 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해 천연물 유래의 새로운 화장료를 개발하고자 하였으며, 특정한 방법에 의하여 제조되는 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물이 식물성 세라마이드를 다량 함유하고 있어 이를 글루코실세라마이드, 플루란과 함께 사용하는 경우 우수한 피부개선활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001)대한민국 공개특허 제10-2017-0078947호(2017.07.10.) (0002)대한민국 공개특허 제10-1998-0053302호(1998.09.25) (0003)대한민국 공개특허 제10-2010-0013849호(2010.02.10.) (0004)대한민국 공개특허 제10-2009-0055243호(2009.06.02) (0005)대한민국 공개특허 제10-2014-0069470호(2014.06.10)

본 발명은 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 주름 개선, 보습, 피부장벽강화, 피부재생 및 여드름 개선 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

바람직하게는, 상기 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물은 곤약감자 및 파인애플의 혼합물을 추출한 후 흑효모로 발효하고, β-글루코시다제로 처리하여 제조되는 것이다.

이때, 상기 곤약감자 및 파인애플의 혼합물은 곤약감자 및 파인애플이 각각 1~2:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란은 각각 5~10:1~2:1~2의 중량비율로 함유되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용, 피부 보습용, 피부장벽 강화용, 피부 재생용 및 여드름 개선용인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 주름 개선, 보습, 피부장벽강화, 피부재생효과 및 여드름 개선효과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 따르면 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

곤약감자(Amorphophallus konjac)는 형태학적으로는 토란과에, 생태학적으로는 천남생과에 속하는 다년생 초본으로서, 근경(뿌리 부분)을 식용으로 사용하고 있다. 곤약감자에는 피부 보습에 큰 영향을 미치는 뮤코 다당류인 글루코만난(Glucomannan)이 다량 함유되어 있다. 뮤코 다당류는 점액질 등으로 얻어지는 침상 결정으로 천연의 아미노산인 글루코사민을 함유한 다당체로 생체 내에서 결합 조직이나 점막의 구성물질로 이용된다. 주로 진피의 망상체에 존재하며 망상체의 3가지 결합인 콜라겐, 엘라스틴, 뮤코 다당류 중 하나이다. 곤약감자의 근경부분을 건조 후 분쇄하여 얻은 곤약감자 분말은 글루코만난을 주성분으로 하고 있으며, 글루코만난은 포도당 분자와 만노스(mannose) 분자가 1:2의 비로 구성된 화학적 구조를 가진다.

파인애플(Ananas comosus)은 쌍떡잎식물 분질배유목 파앤애플과의 상록 여러해살이풀의 열매이다. 길이 15~20cm, 지름 1~12cm 이며 큰 품종에서는 길이 약 30cm, 지름 약17cm에 이르는 것도 있다. 열매 모양은 원통 모양, 원뿔 모양, 달걀 모양 등이 있으며 익으면 주황색에서 노란색으로 되며 향기가 있다. 파인애플의 산지는 미국, 필리핀, 말레이시아, 브라질, 오스트레일리아 등이 주된 산지이나. 본 발명에 이용되는 추출물을 얻음에 있어서는 그 종류나 산지는 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유효성분으로서의 상기 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물은 다음과 같이 제조된다.

먼저, 건조 후 분쇄된 곤약감자와 파인애플을 혼합하여 추출물을 제조한다. 각각의 추출물을 제조한 후 혼합하는 것도 가능하다.

추출용매로는 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판다이올 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매가 사용된다. 이때, 바람직하게는 곤약감자와 파인애플은 각각 1~2:1~3의 중량비율로 혼합되어 추출된다.

상기 혼합추출물을 유효성분으로서 사용하는 것도 가능하지만, 상기 혼합추출물을 흑효모(Aureobasidium pullulans)로 발효한 후, 가수분해효소 바람직하게는 β-글루코시다제로 효소처리하여 사용하는 경우에 더욱 우수한 피부개선활성을 나타내므로 더욱 바람직하다. 상기 흑효모 발효 및 가수분해효소 처리에 의하여 식물성 세라마이드 성분이 크게 강화되는 것을 확인하였다.

상기 곤약감자 및 파인애플 혼합추출물과 함께, 글루코실세라마이드 및 플루란을 유효성분으로서 함유한다.

글루코실세라마이드(Glucosylceramide)는 동물과 식물의 조직 내에 존재하며 글루코오스, 락토오스, 갈락토오스 등의 당이 세라마이드와 결합한 구조이다. 글루코실세라마이드는 당이 결합되어 있기 때문에, 단순 세라마이드에 비해 물이나 에탄올에 대해 우수한 용해성을 가지고 있다. 또한 당이 결합된 세라마이드는 세라마이드에 비해 매우 뛰어난 사용감과 우수한 보습 효능을 갖고 있으며 항염증, 아토피 개선, 미백 효능, 주름 개선 등 다양한 효능이 보고되고 있다. 세라마이드는 용해도 문제로 화장품에 적용하는데 많은 어려움을 가지고 있으므로, 아직까지 제형 관련 제품이 많이 나오지 못하고 있으며, 설령 제품화되더라도 제형 안정성이 불안정한 실정이다. 이에 반해, 당세라마이드의 경우 물과 에탄올 등에 대한 용해성이 높아 상대적으로 화장품 적용이 매우 용이하다.

플루란(Pullulan)은 불완전 곰팡이에 속하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasodium pullulans)가 세포 밖으로 분비하는 분비물인 다당류의 일종으로, 급성 독성, 만성 독성, 돌연변이성 등이 전혀 없는 가식성 천연 다당류의 고분자 중합체이다. 이와 같은 특성을 지닌 플루란은 식품 산업을 비롯한 필름류 등과 같은 여러 가지 무공해 재료의 용도로써 사용되고, 교질화제, 유화제, 안정제 및 젤이 이에 속하며, 식품 산업 및 화공산업 등과 같이 광범위한 분야에 그 이용 가능성이 모색되고 있다.

유효성분으로서의 상기 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물과 글루코실세라마이드 및 플루란은 각각 5~10:1~2:1~2의 중량비율로, 더욱 바람직하게는 10:1~2:1~2, 가장 바람직하게는 10:2:1의 중량비율로 함유된다. 상기 비율로 함유되는 경우에 더욱 우수한 피부 개선활성을 나타내었다.

본 발명의 상기 곤약감자 및 파인애플 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란은 그 상승작용에 의하여 우수한 피부 주름개선효과(시험예 2, 3), 보습과 관련된 인자의 발현증가효과(시험예 4, 5), 피부 장벽개선효과(시험예 6), 피부 재생효과(시험예 7), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 효과(시험예 8)가 우수한 것을 확인하였다.

그러므로 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용, 피부 보습용, 피부장벽 개선용, 피부 재생용 및 여드름 개선용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1: 곤약감자추출물의 제조

건조 후 분쇄된 곤약감자에 추출용매로서 정제수 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 2: 파인애플 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 파인애플에 추출용매로서 정제수 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조예 3~5: 곤약감자 및 파인애플 혼합추출물의 제조

건조 후 분쇄된 곤약감자와 파인애플을 하기 표 1의 조성에 따라 혼합하고 추출용매로서 정제수 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출물을 제조하였다.

중량비	곤약감자	파인애플
제조예 3	1	1
제조예 4	2	1
제조예 5	1	3

제조예 6: 흑효모 배양액의 제조

1000ml 플라스크에 하기 표 2의 조성으로 제조된 액체배지 500ml를 넣고 계대 중인 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균주 OD600 = 0.2의 양으로 접종하여 회전 진탕 배양기(Daihan Labtech Co.Korea, 25±1℃, 150rpm)에서 3일간 배양하였다.

성분	함량(g/L)
효모추출물	2
글루코오스	10
펩톤	10
수크로오즈	10
포도즙	10
귀리추출물	10
정제수	1000

제조예 7~9: 곤약감자 및 파인애플 혼합추출물의 제조

상기 제조예 3~5에서 제조한 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물을 121℃에서 고압 멸균처리 하였다. 멸균 후 상기 제조예 6의 흑효모 OD600 = 0.2의 양으로 배양액을 접종하여 회전진탕배양기(Daihan Labtech Co.Korea, 25±1℃, 150rpm)에서 3~5일간 발효를 실시하였다.

위의 방법으로 발효한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출물을 제조하였다.

제조예 10~12: 곤약감자 및 파인애플 혼합추출물의 제조

상기 제조예 7~9에서 제조한 혼합추출물에 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와, β-글루코시다아제 효소 25ml을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로 95℃로 30분간 가온하여 효소 반응을 완료한 후 반응물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter): 30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출물을 제조하였다.

실시예 1~3: 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란 혼합물의 제조

상기 제조예 10~12에서 제조한 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물에 글루코실세라마이드((주)대덕약업, 일본)과 플루란((주)더부움,일본)을 아래 표 3의 배합비로 혼합하였다.

중량비	곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물			글루코실세라마이드	플루란
중량비	제조예 10	제조예 11	제조예 12	글루코실세라마이드	플루란
실시예 1	10	-	-	1	1
실시예 2	-	10	-	1	2
실시예 3	-	-	10	2	1

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO_2,37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음, 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의흡광도×100

구분	세포 생존율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	100	101	100
제조예 2	100	101	100
제조예 3	100	100	100
제조예 4	101	100	100
제조예 5	100	100	101
제조예 7	101	100	100
제조예 8	100	100	101
제조예 9	100	101	100
제조예 10	100	100	100
제조예 11	100	101	100
제조예 12	101	100	100
실시예 1	101	100	100
실시예 2	100	100	101
실시예 3	100	101	100

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 제조예 및 실시예의 추출물들을 적용한 시료 모두 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 엘라스타제 활성 억제 확인

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

엘라스틴을 포함하는 한천배지에 엘라스타제만을 적가하는 한편, 실시예 1 내지 3 및 제조예의 농도가 0.5, 1.5 및 2.0 %가 되는 용액을 시료로 하여 엘라스타제와 함께 적가하여 배지 상에 나타나는 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 시료의 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 Retinol crystal을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다. 상기 시험결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구분	Halo diameter(cm)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	1.8	1.7	1.8
제조예 2	1.6	1.5	1.5
제조예 3	1.4	1.2	1.7
제조예 4	1.4	1.1	1.5
제조예 5	1.3	1.2	1.1
제조예 7	1.6	1.3	1.2
제조예 8	1.5	1.3	1.1
제조예 9	1.4	1.3	1.1
제조예 10	1.4	1.2	1.1
제조예 11	1.3	1.2	1.1
제조예 12	1.2	1.1	1.0
실시예 1	1.4	1.3	1.2
실시예 2	1.2	1.1	1.1
실시예 3	1.1	1.0	0.9
Elastase	1.8
Retinol crystal	0.9

헤일로 직경(Halo diameter)이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 3 및 제조예를 처리했을 때 헤일로 직경(halo diameter)이 감소하는 것으로 엘라스타제 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그 중에서도 실시예 3에서 가장 우수한 엘라스타제 억제 효과를 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진 효과 확인

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 농도가 0.5, 1.5 및 2.0%가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 하기 식에 따라 계산하였으며, 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 양

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 양

구분	procollagen 발현율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	25.48	31.04	34.35
제조예 2	31.04	34.35	37.68
제조예 3	25.48	31.04	34.30
제조예 4	38.65	39.56	45.63
제조예 5	39.65	43.26	50.35
제조예 7	39.5	46.8	52.3
제조예 8	42.3	47.2	56.1
제조예 9	43.2	48.2	58.2
제조예 10	45.2	49.6	53.2
제조예 11	46.8	51.6	57.6
제조예 12	51.2	55.6	65.2
실시예 1	78.57	78.57	85.61
실시예 2	80.30	83.50	90.30
실시예 3	151.47	160.03	182.53

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 곤약감자 및 파인애플의 용매추출물인 제조예 3~5에 비하여 흑효모로 추가발효한 제조예 7~9의 혼합추출물이 더 높은 발현율을 나타내었으며, 이를 다시 β-글루코시다아제 효소처리한 제조예 10~12의 혼합추출물에서 더 높은 발현율을 나타내었다.

그리고 상기 제조예 10~12의 혼합추출물에 글루코실세라마이드, 플루란을 혼합한 실시예 1 ~ 3의 시료에서 보다 우수한 콜라겐 생합성 촉진 효과를 나타내었다.

시험예 4: 보습관련인자 발현 증가효과 확인

CCD-986Sk 세포를 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 Hyaluronan Synthase-3(HAS-3)의 발현 증가율을 확인하였다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다.

HAS-3 발현증가율(%)=(시료 HAS-3 발현양/대조군 HAS-3 발현양)×100

구분	HAS-3 증가율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	20.2	26.8	35.2
제조예 2	25.6	32.8	40.2
제조예 3	22.5	32.8	42.3
제조예 4	35.2	42.1	44.5
제조예 5	41.2	49.1	51.2
제조예 7	43.5	46.2	49.5
제조예 8	44.8	49.2	50.6
제조예 9	44.2	45.6	47.6
제조예 10	49.5	51.4	53.8
제조예 11	50.3	53.6	58.7
제조예 12	52.5	56.8	63.2
실시예 1	56.3	59.2	62.1
실시예 2	61.2	68.4	71.5
실시예 3	71.5	75.6	81.6
Hyaluronic Acid	72.2	73.7	79.8

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드, 플루란을 혼합한 실시예 1 ~ 3의 시료에서 보다 높은 HAS-3 증가율을 나타내었으며 그중에서도 실시예 3이 가장 우수한 보습활성을 나타내었다.

시험예 5: 히알루로니다제의 활성 억제 효과 확인

히알루로니다제 활성억제 효과를 측정하였으며 모르간 엘손(Morgan-Elson)법을 응용한 방법이다. 히알루로니다제의 최종 효소 활성을 400NF unit/㎖, HA의 최종농도를 0.4㎎/㎖로 하고 활성제인 Compound 48/80 완충(buffer) 용액(0.1㎎/㎖)을 사용하여 불활성형 히알루로니다제의 활성화 단계의 저해작용을 중심으로 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 시료는 완충용액(buffer)에 용해하여 시료 용액으로 하고 대조군은 시료 용액 대신에 완충 용액을 사용하였다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다. 히아루로니다제의 활성 저해율(%)은 아래의 수학식으로 계산하였다.

히알루로니다제 활성 저해율(%)= [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소 활성

B : 시료를 첨가한 웰의 효소 활성

구분	히아루로니다제 활성 저해율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	30.5	38.5	55.8
제조예 2	29.7	33.5	49.5
제조예 3	23.5	30.2	41.2
제조예 4	33.5	36.5	55.8
제조예 5	30.5	35.6	59.6
제조예 7	33.4	35.6	56.8
제조예 8	39.8	41.2	55.5
제조예 9	40.2	41.5	58.6
제조예 10	41.2	48.2	57.4
제조예 11	46.8	50.4	58.4
제조예 12	51.4	59.1	61.7
실시예 1	52.3	62.3	65.2
실시예 2	55.3	57.2	61.3
실시예 3	71.5	73.6	78.6
Hyaluronic Acid	73.2	73.2	75.6

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드, 플루란을 혼합한 실시예 1 ~ 3의 시료에서 보다 우수한 히아루로니다제 활성억제효과를 나타내었다.

시험예 6: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

제조예 및 실시예의 시료를 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 9에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
TGase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
TGase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

TGase-1 발현 증가율(%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과는 표 10에 나타내었다.

TGase-1 발현증가율(%)=(시료 TGase-1 발현양/ 대조군 TGase-1 발현양)×100

구분	TGase-1 발현 증가율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	21	30	35
제조예 2	25	29	36
제조예 3	31	28	35
제조예 4	30	29	39
제조예 5	29	31	41
제조예 7	36	34	49
제조예 8	34	39	56
제조예 9	41	45	55
실시예 1	51	56	67
실시예 2	55	59	62
실시예 3	68	79	82
Control 0.1%	100

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 1 내지 3의 경우, 제조예에 비하여 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현효과를 나타내었으며, 실시예 3이 다른 실시예들에 비하여 상승작용에 의하여 더욱 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 7: 피부재생 효과

피부 상처 치유 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5×10⁵cells/well의 세포를 분주 후 제조예 및 실시예의 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다. 그 결과는 표 11에 나타내었다

세포재생율(%)=시료 세포 재생율/ 대조군 세포 재생율 × 100

구분	세포 재생율(%)
구분	0.5%	1.5 %	2.0 %
제조예 1	22	30	38
제조예 2	30	32	41
제조예 3	32	34	42
제조예 4	33	36	46
제조예 5	35	42	49
제조예 7	41	49	59
제조예 8	48	55	62
제조예 9	46	58	61
제조예 10	42	48	51
제조예 11	45	50	55
제조예 12	49	56	61
실시예 1	51	61	68
실시예 2	61	65	69
실시예 3	78	82	91
Dexamethason 500(㎍/㎖)	86

관찰결과, 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드, 플루란을 혼합한 실시예 1 ~ 3의 시료에서 보다 우수한 피부 재생효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 8 : 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균활성의 시험

제조예 및 실시예의 시료에 대하여, 평판배지 확산법(Agar diffusion method)을 이용하여 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성을 측정하였다.

본 시험에 사용된 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes 3314)균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.

plate에 Brain Heart Infusion agar를 멸균하여 plate당 25㎖씩 분주한다. 균주 도말 각각의 균주의 균수를 10⁶으로 맞춰 1000㎕ 도말한다. 10% Ethanol에 녹인 제조 및 실시예 시료를 0.1%, 0.5%, 1.0% 농도로 맞춘 후 40㎕씩 disc(paper disk(10mm), Advantec Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan)에 loading 한다. 양성 대조군으로 Salicylic acid를 사용하였으며 10% Ethanol에 녹인 Salicylic acid를 1.0% 농도로 맞춘 후 40㎕씩 disc(paper disk(10mm), Advantec Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan)에 loading 한다. 멸균된 핀셋으로 loading된 disc를 집어서 균이 도말된 plate에 심는다. 산소를 차단하는 anaerobic jar에 plate를 넣은 상태로 37℃에 배양한다. paper disk 주변에 형성된 원형 발육 저지환의 크기(mm 단위)를 측정하였으며, 모든 시험은 독립적으로 3회 반복하여 평균값을 구했다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

구분	지름(mm)
구분	0%	0.1%	0.5%	1.0%
제조예 1	0	3.2	5.6	9.2
제조예 2	0	3.9	6.1	9.5
제조예 3	0	4.0	6.2	9.7
제조예 4	0	4.2	6.6	9.5
제조예 5	0	4.6	6.8	9.6
제조예 7	0	4.8	6.9	9.9
제조예 8	0	4.9	7.0	9.8
제조예 9	0	5.2	7.1	10.0
제조예 10	0	5.3	7.2	10.3
제조예 11	0	5.5	7.2	11.6
제조예 12	0	6.2	7.6	12.5
실시예 1	0	15.2	21.5	31.2
실시예 2	0	19.5	24.5	35.6
실시예 3	0	29.6	52.4	65.8
양성대조군 (Salicylic Acid)	0	-	-	50

상기 표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제조예 및 실시예 1 내지 3은 농도 의존적으로 Clean Zone의 넓이가 증가하는 것을 볼 수 있다. 본 발명 실시예의 시료에서 제조예의 시료들에 비하여 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 3은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

제형 실시예 1: 세럼의 제조

상기 실시예 3의 혼합물을 함유한 세럼을 하기의 표 13의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
실시예 3의 혼합물	2.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

제형 실시예 2: 크림의 제조

상기 실시예 3의 혼합물을 함유한 크림을 하기의 표 14의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
실시예 3의 혼합물	2.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 9: 제형안정도 확인

상기 제형 실시예 1, 2로 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 결과는 표 15에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
온도조건	제형 실시예 1	제형 실시예 2
실온(25℃)	0	0
냉장(4℃)	0	0
항온(50℃)	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표에서 나타낸 바와 같이 제형 실시예 제형 모두 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

곤약감자 및 파인애플의 혼합물을 추출한 후 흑효모로 발효하고, β-글루코시다제로 처리하여 제조되는 곤약감자 및 파인애플의 혼합추출물, 글루코실세라마이드 및 플루란이 각각 5~10:1~2:1~2의 중량비율로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유되는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 혼합물은 곤약감자 및 파인애플이 각각 1~2:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 재생용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 여드름 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.