CN117715630A - 用于改善皮肤屏障的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素的组合物，以及使用其诸如用于改善皮肤屏障功能性的方法。

Description

用于改善皮肤屏障的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年6月16日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FORIMPROVING SKIN BARRIER”的美国临时专利申请号63/211,072(其内容通过引用以其整体并入本文)的优先权权益。

技术领域

本发明总体上涉及类胡萝卜素领域，以及使用其诸如用于改善皮肤屏障的方法。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是一种全世界都食用的水果。番茄富含包括维生素C、钾、必需氨基酸和各种抗氧化剂在内的营养物。番茄是强效抗氧化剂番茄红素的主要膳食来源。食用番茄被证明防御氧化应激相关疾病，包括癌症和心血管疾病。

在全球范围内，膳食补充剂的使用一直在增加。一项涵盖2015-2019年的美国消费者调查显示，各种补充剂的使用呈上升趋势。使用最多的补充剂按使用量的降序排列为：鱼油、氨基葡萄糖/软骨素、益生菌/益生元、褪黑激素、辅酶Q10、紫锥菊、蔓越莓丸、大蒜提取物、人参和银杏。其中一些补充剂已证明对健康有益，而其它补充剂存在争议。

Lumenato^TM是一种由黄番茄的经干燥果肉制成的膳食补充剂。其富含类胡萝卜素，包括番茄红素(lycopene)(0.5mg/粒胶囊)、15-顺式-八氢番茄红素(7.33mg/粒胶囊)、六氢番茄红素(2.06mg/粒胶囊)、β-胡萝卜素(0.18mg/粒胶囊)、γ-胡萝卜素(0.03mg/粒胶囊)、ζ-胡萝卜素(2.27mg/粒胶囊)以及生育酚(1.14mg/粒胶囊)。一般来说，类胡萝卜素和生育酚是抗氧化剂，提供多种健康益处。

在过去20年中，为研究口服摄取类胡萝卜素对皮肤的潜在影响而进行的实验主要集中在β-胡萝卜素和番茄红素的作用上，很少有关于八氢番茄红素和六氢番茄红素的信息。番茄红素和/或β-胡萝卜素的具体益处包括抗UV诱导的红斑和日光损伤、降低氧化应激和抗氧化/抗炎活性。β-胡萝卜素当然是维生素A的前体，因此支持胶原蛋白的合成。番茄红素已显示使培养的人皮肤成纤维细胞免受UV损伤。此外，其在动物模型中还显示抑制化学诱导的皮肤癌。这一点以及其改善4-羟基雌二醇诱导的DNA损伤的能力被认为归因于其抗氧化特性。除抗氧化活性外，八氢番茄红素和六氢番茄红素还都是吸收紫外光的无色类胡萝卜素。这种特性可为皮肤提供额外水平的保护。

人皮肤暴露于各种来源的氧化应激，包括紫外光、臭氧和其它空气污染物以及常驻微生物的代谢。这些应激源会加速皮肤衰老，导致皱纹、弹性下降和质地粗糙。

成纤维细胞是真皮中最丰富的细胞。它们合成胶原蛋白并维持细胞外基质。在衰老过程中，胶原纤维逐渐丢失，导致皱纹。成纤维细胞通过产生细胞因子将白细胞吸引到真皮，在皮肤的先天免疫中发挥重要作用。成纤维细胞还与表皮基底层的黑色素细胞通信，以影响黑色素合成。角质化细胞是表皮的主要细胞类型。它们分化产生角质层，角质层由扁平的角蛋白填充细胞组成，周围有脂质基质。角质层提供皮肤的渗透屏障。其作用是限制水和电解质的丢失，以及限制污染物和有害化学物质、细菌和病毒渗透到皮肤中以及穿过皮肤。角质层的脂质主要由神经酰胺、胆固醇和长链脂肪酸组成。其中一种神经酰胺即酰基神经酰胺是非常不寻常的，因为它含有与长链碱连接的30至34个碳长的ω-羟基酸酰胺，其中亚油酸酯与ω-羟基连接。这种含亚油酸酯的脂质对于脂质的组织是必需的，也是屏障功能所必需的。

仍然非常需要用于减少经表皮失水(TEWL)并因此增加和/或改善皮肤屏障的组合物和方法。

发明内容

结合系统、工具和方法描述和说明了以下实施方式及其各方面，这些实施方式和方面意在是示例性和说明性的，而不是对范围的限制。

在一些实施方式中本发明部分地基于一个令人惊讶的发现，即特定类胡萝卜素组合物的消耗改善皮肤屏障，正如TEWL减少所证明的。

根据第一方面，提供用于治疗有需要的对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素(phytoene)、量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素(phytofluene)、量为所述组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素，从而治疗所述对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍。

根据另一方面，提供组合物，其包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素，所述组合物用于治疗有需要的对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍。

在一些实施方式中，所述方法还包括在所述施用步骤之前的选择步骤，包括确定所述对象的皮肤的经表皮失水(TEWL)值，其中至少12(g·h/m²)的TEWL值指示所述对象适合所述治疗。

在一些实施方式中，所述TEWL值是关于所述对象的面部皮肤、前额皮肤、前臂皮肤、手部皮肤、手掌皮肤、腿部皮肤、肘部皮肤或其任意组合来确定的。

在一些实施方式中，所述皮肤屏障相关疾病是表皮皮肤疾病或障碍。

在一些实施方式中，所述皮肤屏障相关疾病的特征在于角质层的改变：脂质含量、氧化状态、布置或其任意组合。

在一些实施方式中，所述皮肤屏障相关疾病的特征在于含亚油酸酯的酰基神经酰胺的量减少。

在一些实施方式中，所述皮肤屏障相关疾病选自：特应性皮炎、银屑病、2型高歇综合征(type 2Gaucher syndrome)、斯-拉二氏综合征(Sjogren-Larsson syndrome)、片层状鱼鳞癣(lamellar ichthyosis)、伴X鱼鳞癣(X-linked ichthyosis)、大疱性鱼鳞癣样红皮病(bullous ichthyosiform erythroderma)、必需游离脂肪酸缺乏、寻常痤疮、老化干性皮肤、少汗性外胚叶发育异常(hypohidrotic ectodermal dysplasia)和特应性湿疹。

在一些实施方式中，治疗包括减少所述对象的皮肤的：TEWL、毛孔数量、毛孔覆盖的面积、发红程度、发红覆盖的面积、粗糙度或其任意组合。

在一些实施方式中，减少是与对照相比减少至少5％。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与ζ胡萝卜素的重量比范围为15:1(w/w)至2:1(w/w)。

在一些实施方式中，所述组合物还包含另外的类胡萝卜素，所述另外的类胡萝卜素选自：番茄红素、β胡萝卜素、γ胡萝卜素及其任意组合。

在一些实施方式中，所述组合物包含：量为少于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的番茄红素、量为少于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的β胡萝卜素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)的γ胡萝卜素、或其组合。

在一些实施方式中，所述组合物包含的总类胡萝卜素的量为所述组合物的10-15％(w/w)。

在一些实施方式中，所述组合物还包含生育酚。

在一些实施方式中，所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-30％(w/w)的生育酚。

在一些实施方式中，所述组合物还包含植物甾醇。

在一些实施方式中，所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的5-15％(w/w)的植物甾醇。

在一些实施方式中，施用包括口服施用、局部施用或两者。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明实施方式的实践或测试，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，这些材料、方法和实例只是说明性的，并不旨在是必然限制性的。

根据下文给出的详细描述，本发明的进一步的实施方式和可适用的全部范围将变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是只是通过说明的方式给出的，因为根据此详细描述，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。

除了上述示例性方面和实施方式之外，通过参考附图并通过研究以下详细描述，进一步的方面和实施方式将变得显而易见。

附图说明

图1包括显示金番茄提取物(golden tomato extract，GTE，在本文中也称为“Lumenato^TM”)对经表皮失水(TEWL)的影响的图。A，高TEWL-GTE(N＝18，1名对象错过8周临床访视，4周p＝0.428，8周p＝0.11，16周p<0.001)；B，高TEWL-安慰剂(N＝14，1名对象错过8周临床访视，4周p＝0.382，8周p＝0.506，16周p＝0.293)；C，低TEWL-GTE(N＝14，4周p＝0.129，8周p＝0.49，16周p＝0.421)；以及D，低TEWL-安慰剂(N＝15，1名对象错过8周和16周临床访视，4周p＝0.099，8周p＝0.838，16周p＝0.231)。

图2包括小组成员处理“前”和“后”的正面标准视图的图像，其中TEWL改善53％。

图3A-3C包括小组成员处理“前”和“后”的的图像，显示TEWL减少26％。(3A)正面；(3B)左侧；(3C)右侧。红色区域高亮显示。

图4包括小组成员处理“前”和“后”的左侧视图的图像，其中毛孔TEWL分析改善33％。

图5包括小组成员处理“前”和“后”的右侧视图的图像，其中毛孔TEWL分析改善48％。

图6A-6B包括小组成员处理“前”和“后”的左侧(6A)视图和右侧(6B)视图的图像，其中质地TEWL分析分别改善21％和33％。

图7包括对本文公开的金番茄提取物增强皮肤物理和生物学屏障的两种机制的非限制性理论的构想(scheme)。

图8A-8F包括竖直条形图，其显示了Lumeneto胶囊口服施用12周之前和之后不同参数的平均评分。如(8B)中观察到的，使用补充剂12周后，在皮肤弹性(21.54％)和紧实性(firmness)(27.18％)方面有极其显著的(p<0.001)改善。(8A)显示了对皮肤调性(tonality)的各种测量。如图中所观察到的，尽管色素斑没有改善，但皮肤均匀性仍改善了21％(p<0.001)＝。皮肤看起来亮29.75％(p<0.001)，并且面部深色斑减少10.96％(p<0.001)。眼周黑眼圈看起来也减少17.9％(p<0.001)。(8C)显示使用补充剂12周后，感知皮肤水合作用改善21.6％(p<0.001)，并且皮肤质地改善18.18％(p<0.001)。(8D)显示使用补充剂12周后虽然深度皱纹无改善，但面部细纹和皱纹有12.97％的显著改善(p<0.001)。如(8E)中所观察到的，皮肤发红的趋势略有改善。使用补充剂后，老化/不健康皮肤的总体外观显著减少(p<0.001)，减少了23.53％。(8F)显示补充剂处理12周前后整体皮肤状况的平均评分。如图中所观察到的，使用补充剂后，整体皮肤状况有极其显著的(p<0.001)改善，改善了28.22％。

图9A-9E包括的图显示了处理前和Lumeneto胶囊口服施用4、8和12周后以及又在处理停止2周后的FACE-QTM皮肤满意度量表(FACE-QTM Satisfaction with Skin Scale)结果。呈现的数据来自满意度评分，其中评分1表示非常不满意，2表示有点不满意，3表示有点满意，以及4表示非常满意。对报告评分为3和4的对象的数量进行了计数，并在图中表示为显示认可的群体百分比。(9A)显示“您的面部皮肤看起来怎么样”是一天早上和晚上的第一件事。最初，评分处于满意和不满意的边缘；然而，在处理后，长达8周一直有稳定的改善，达到84％-75％(p<0.001)，之后趋于平缓。中断处理两周后，效果得以保留。(9B)显示了对健康和有吸引力的面部外观的感知的类似趋势。对于这两个参数，在12周的处理过程中一直有稳定的改善，此时健康和有吸引力的皮肤存在统计学显著的(p<0.001)改善，分别为74.6％和65.08％(p<0.001)。尽管中断处理两周，这些感知仍持续提高。(9C)对清新和有光彩的面部的感知。对于这两个参数，在12周的处理过程中有稳定的改善，此时与基线相比存在统计学显著的(p<0.001)变化。尽管中断处理两周，这些感知仍持续提高。(9D)面部皮肤调性。在处理后，颜色和调性的均匀性在长达8周期间一直有稳定的改善，达到61.9％-74.6％(p<0.001)。到处理的第12周，群体中超过71％(p<0.001)认为处理对皮肤调性和色调均匀性有效。处理中断两周后，皮肤色调和调性的均匀性存在进一步改善，分别为81％和72.41％。(9E)显示群体中有38.71％注意到在使用补充剂4周和8周后皮肤发红减少，在使用补充剂12周后增加到41.94％。使用4周后，群体中有35％观察到健康皮肤的外观和感觉得到改善，使用8周和12周后分别增至56.45％和58.06％。使用4周后，35.48％的对象的总体皮肤外观得到改善，在8周和12周后分别增至66.13％和62.9％。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及包含多种类胡萝卜素的组合物及其使用方法。本发明部分地基于这样的令人惊讶的发现，即包含大量八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素的番茄提取物以两种互补的形式即生物学形式(先天免疫)和物理形式(角质层屏障)改善皮肤屏障和完整性。

治疗方法

根据一些实施方式，提供用于治疗有需要的对象中的受损皮肤屏障功能的方法，包括向对象施用治疗有效量的本文公开的组合物的步骤。

在一些实施方式中，需要治疗的对象是遭受受损屏障功能的健康对象。在一些实施方式中，需要治疗的对象是遭受受损皮肤屏障的健康对象。

在一些实施方式中，治疗包括改善对象中的皮肤屏障或屏障功能。

在一些实施方式中，治疗包括减少对象中的TEWL。

根据一些实施方式，提供用于治疗有需要的对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍的方法，包括向对象施用治疗有效量的本文公开的组合物的步骤，从而治疗对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍。

在一些实施方式中，皮肤屏障疾病或障碍包括受损屏障功能或受损皮肤屏障。

在一些实施方式中，组合物包含：量为组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素、量为组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素、量为组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素。

在一些实施方式中，方法还包括选择步骤，选择步骤包括确定对象的皮肤的经表皮失水(TEWL)值。

在一些实施方式中，选择步骤在施用步骤之前。

在一些实施方式中，TEWL值为至少1(g·h/m²)、至少2(g·h/m²)、至少4(g·h/m²)、至少5(g·h/m²)、至少7(g·h/m²)、至少10(g·h/m²)、至少11(g·h/m²)、至少12(g·h/m²)、至少13(g·h/m²)、至少14(g·h/m²)、至少15(g·h/m²)、至少16(g·h/m²)或至少20(g·h/m²)，指示对象适合根据本文公开的方法进行治疗，或者其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，TEWL值为10-14(g·h/m²)、1-15(g·h/m²)、2-8(g·h/m²)、3-12(g·h/m²)、5-13(g·h/m²)、4-10(g·h/m²)、10-18(g·h/m²)、11-20(g·h/m²)、13-17(g·h/m²)或12-20(g·h/m²)，指示对象适合根据本文公开的方法进行治疗。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，适合根据本发明方法治疗的对象的特征在于具有损伤和/或受损的屏障功能和/或受损的皮肤屏障。

在一些实施方式中，TEWL值为至少10(g·h/m²)、12(g·h/m²)、14(g·h/m²)、17(g·h/m²)或20(g·h/m²)，指示损伤和/或受损的屏障功能和/或受损的皮肤屏障，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，TEWL值为12-20(g·h/m²)、11-18(g·h/m²)、12-19(g·h/m²)或10-20(g·h/m²)，指示损伤和/或受损的屏障功能和/或受损的皮肤屏障。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，TEWL值是关于对象的面部皮肤、前额皮肤、前臂皮肤、前臂掌侧皮肤(volar forearm skin)、手部皮肤、手掌皮肤、腿部皮肤、肘部皮肤或其任意组合来确定的。在一些实施方式中，TEWL值是关于对象的面部皮肤确定的。在一些实施方式中，面部皮肤包括对象的脸颊。

如本文所用，术语“经表皮失水”或“TEWL”是指水通过扩散和蒸发从体内通过表皮损失到周围环境。测量TEWL的能力可用于检测皮肤损伤，例如，指示屏障疾病或障碍。

适用于确定皮肤TEWL的方法和装置是常见的，并且对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，并且例如由Sotoodian和Maibach,2012(Clinics in Dermatology)综述。

在一些实施方式中，对象的特征在于下列中的至少一种或遭受下列中的至少一种：营养不良，血液供应减少，暴露于辐射，氧化应激，免疫功能低下，情绪应激，皮肤干燥，遭受慢性炎性疾病，遗传倾向，遭受皮肤生态失调，卫生减少，卫生过度，皮肤脂质含量、皮脂含量降低或两者，及其任意组合。

在一些实施方式中，辐射包括光谱内的任意辐射波长。如本文所用，术语“光谱”涵盖范围从10^-9m到10^-3m的波长。在一些实施方式中，光谱内的辐射波长包括UV辐射、可见光辐射、红外辐射或其组合。在一些实施方式中，暴露于辐射包括暴露于阳光。

如本文所用，术语“紫外(UV)”涵盖UV范围内的任意波长。在一些实施方式中，UV是UV辐射。在一些实施方式中，UV辐射是UVA辐射、UVB辐射、UVC辐射或其任意组合。

在一些实施方式中，慢性炎性疾病包括选自下列的皮肤障碍：痤疮、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和红斑痤疮。

在一些实施方式中，慢性炎性疾病包括全身性炎性疾病。

在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病是表皮皮肤疾病或障碍。在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病的特征在于或包括皮肤的表皮层的畸变、形变、病理或其任意组合。在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病包括或特征在于表皮的角质层的改变。在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病包括或特征在于角质层的改变或修改：脂质含量、氧化状态、布置或其任意组合。

在一些实施方式中，角质层的脂质含量如此改变或修改使得降低角质层的功能性降低，例如，损害或降低皮肤屏障活性。

在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病的特征在于含亚油酸酯的酰基神经酰胺的量减少。

在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病选自：干燥病、特应性皮炎、接触性皮炎、银屑病、2型高歇综合征、斯-拉二氏综合征、片层状鱼鳞癣、伴X鱼鳞癣、大疱性鱼鳞癣样红皮病、必需游离脂肪酸缺乏、寻常痤疮、老化干性皮肤、少汗性外胚叶发育异常、特应性湿疹、或其任意组合。

如本文所用，术语“皮肤屏障相关疾病或状况”涵盖任意疾病或状况，其中受损的皮肤屏障、破坏的皮肤屏障、非功能性皮肤屏障、功能障碍性皮肤屏障或其任意组合在对象中将病理状态或稳态偏斜(趋异，divergence)进行引发、刺激、传播、增加、增强、其任意等同形式或其任意组合。在一些实施方式中，皮肤屏障相关疾病包括涉及皮肤屏障损伤、破坏、无功能性、功能障碍、功能性降低或抑制的任意疾病或状况作为疾病或状况发病机理和/或病理生理学的一部分。

在一些实施方式中，治疗包括减少：对象的皮肤的TEWL、毛孔数量、毛孔覆盖的面积、发红程度、发红覆盖的面积、粗糙度或其任意组合。

在一些实施方式中，减少是减少至少5％、至少15％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少85％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是减少5-50％、至少1-25％、10-55％、20-95％、50-99％、40-75％、5-85％、30-95％或25-100％。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

如本文所用，术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要对其进行治疗的任意对象，特别是哺乳动物对象，例如人。

在一些实施方式中，对象发展痤疮的风险增加。在一些实施方式中，对象具有增加的发展痤疮的倾向。在一些实施方式中，对象的特征在于皮肤易于发展痤疮。

在一些实施方式中，减少是与对照进行比较。

如本文所用的术语“对照”可与“基准”或“基线”互换。

如本文所用，对照包括健康对象的皮肤。在一些实施方式中，对照是源自、分离自或获自同一对象(例如，遭受皮肤屏障相关疾病的对象，使得可包括但不限于这样的皮肤：其包括具有受限区域的损伤屏障的块片(patches))的健康皮肤样品。在一些实施方式中，对照包括健康皮肤。在一些实施方式中，健康皮肤包括健康对象的皮肤。在一些实施方式中，如本文所公开的，健康皮肤包括在对象遭受皮肤屏障相关疾病之前，同一对象的皮肤。

在一些实施方式中，施用包括口服施用。在一些实施方式中，施用包括局部施用。在一些实施方式中，施用包括口服施用和局部施用组合。

如本文所用，短语“炎性疾病”是指涉及生物体(例如，免疫系统的细胞、分子信号介质如细胞因子等)对有害的外源实体例如细菌、真菌、病毒、原生动物、过敏原、污染物等的多组分应答的任意疾病。

如本文所用，术语疾病、障碍或状况的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括减轻其至少一种症状、降低其严重性或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病、障碍或状况被完全治愈。为了成为有效的治疗，本文中的有用组合物只需要降低疾病、障碍或状况的严重性、降低与其相关的症状的严重性或改善患者或对象的生活质量。

如本文所用，术语“疾病、障碍或状况的预防”涵盖对疾病、障碍或状况的发作的延迟、预防、阻抑或抑制。如根据当前描述的主题所使用的，术语“预防”涉及预防过程，其中使对象在疾病/障碍过程的诱导或发作之前暴露于当前描述的组合物或制剂。这可在个体具有指示发生待预防疾病/障碍的倾向的遗传谱系的情况下进行。例如，这对于祖先表现出对某些类型的疾病(例如，炎性障碍)的倾向的个体而言可能确实如此。术语“阻抑”用于描述这样的状况，其中疾病/障碍过程已经开始，但状况的明显症状尚未产生。因此，个体的细胞可能患有疾病/障碍，但临床上尚未识别出疾病/障碍的外部体征。在任一种情况下，术语预防均可适用于涵盖预防和阻抑两者。相反，术语“治疗”是指临床应用活性剂以对抗已经存在的状况，这种状况的临床表现已经在患者中实现。

在一些实施方式中，预防包括降低疾病严重性、延迟疾病发作、降低疾病累积发病率或其任意组合。

根据一些实施方式，提供用于修饰细胞中的基因的表达水平的方法，包括使细胞与本发明的组合物接触，从而修饰基因的表达。

在一些实施方式中，基因选自：IL6、CCL2、CXCL1、TNFPI3、DGAT2L6、ALOX5、BACH2、CYP4F11、CYP4A22、B3GALT1、B3GALT2、OR52N、OR5D15P、OR52B6、OR1F1、OR2L3、OR2V2、OR51AB1P、OR1B1、OR4C12、OR6C76、OR2AH1P、OR7A18P、OR1N2、OR10B1P、OR11L1、OR5BA1P、OR5M11、OR9A4、OR4U1P、或其任意组合。

在一些实施方式中，基因选自：IL6、CCL2、CXCL1、TNFPI3、DGAT2L6、ALOX5、BACH2、CYP4F11、CYP4A22、B3GALT1、B3GALT2、或其任意组合。

在一些实施方式中，基因选自：OR52N、OR5D15P、OR52B6、OR1F1、OR2L3、OR2V2、OR51AB1P、OR1B1、OR4C12、OR6C76、OR2AH1P、OR7A18P、OR1N2、OR10B1P、OR11L1、OR5BA1P、OR5M11、OR9A4、OR4U1P、或其任意组合。

在一些实施方式中，修饰包括增加或减少。

在一些实施方式中，修饰包括增强或降低。

在一些实施方式中，方法包括增加下列的表达水平：IL6、CCL2、CXCL1、TNFPI3、DGAT2L6、ALOX5、BACH2、CYP4F11、CYP4A22、B3GALT2、或其任意组合。

在一些实施方式中，方法包括降低或减少B3GALT1的表达水平。

在一些实施方式中，方法包括增加下列的表达水平：IL6、CCL2、CXCL1、TNFPI3、DGAT2L6、ALOX5、BACH2、CYP4F11、CYP4A22、B3GALT2、或其任意组合，和降低或减少B3GALT1的表达水平。

在一些实施方式中，方法包括增加下列的表达水平：OR52N、OR5D15P、OR52B6、OR1F1、OR2L3、OR2V2、OR51AB1P、OR1B1、OR4C12、OR6C76、OR2AH1P、OR7A18P、OR1N2、OR10B1P、OR11L1、或其任意组合。

在一些实施方式中，方法包括降低或减少下列的表达水平：OR5BA1P、OR5M11、OR9A4、OR4U1P、或其任意组合。

在一些实施方式中，方法包括增加下列的表达水平：OR52N、OR5D15P、OR52B6、OR1F1、OR2L3、OR2V2、OR51AB1P、OR1B1、OR4C12、OR6C76、OR2AH1P、OR7A18P、OR1N2、OR10B1P、OR11L1、或其任意组合，和降低或减少下列的表达水平：OR5BA1P、OR5M11、OR9A4、OR4U1P、或其任意组合

在一些实施方式中，降低或减少包括至少5％、至少15％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的减少或降低，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，增强或增加包括至少5％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少250％、至少500％、至少750％、或至少1,000％的增加或增强，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是角质化细胞。在一些实施方式中，细胞是上皮细胞。在一些实施方式中，细胞包括多个细胞。在一些实施方式中，所述多个细胞包括下列的任意组合：成纤维细胞、角质化细胞和上皮细胞。在一些实施方式中，细胞是对象的细胞，如本文所述。

组合物

根据一些实施方式，提供组合物，其包含：量为组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素、量为组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素、量为组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素，所述组合物用于治疗遭受皮肤屏障相关疾病的对象。

在一些实施方式中，组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素。在一个实施方式中，组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素和另外的类胡萝卜素。在一个实施方式中，组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素、番茄红素、β胡萝卜素、γ胡萝卜素、生育酚和植物甾醇。

在一些实施方式中，类胡萝卜素是从水果、蔬菜或植物(包括植物部分)中提取、分离或纯化的天然类胡萝卜素。在另一个实施方式中，类胡萝卜素是从番茄植物中提取的类胡萝卜素。在另一个实施方式中，类胡萝卜素是从番茄果实中提取的类胡萝卜素。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是富含类胡萝卜素的番茄提取物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是全天然的富含类胡萝卜素的番茄提取物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是番茄类胡萝卜素复合物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素复合物包括植物营养素的复合物，植物营养素包括多种类胡萝卜素(如八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素、β-胡萝卜素等)、生育酚和植物甾醇。在一些实施方式中，类胡萝卜素是合成类胡萝卜素。

在一些实施方式中，本发明提供通过创新的提取方案获得的番茄提取物。这种包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素(量如下文指定)的特定提取物具有降低的细胞毒性。在一些实施方式中，降低的细胞毒性是与其它番茄提取物相比。在一些实施方式中，降低的毒性使得能够以更高剂量向有需要的对象提供本发明的组合物而不降低对象的存活、健康或两者。在一些实施方式中，向有需要的对象施用本发明的组合物使得能够通过以增加治疗效果的更高的量提供活性成分如八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素来增加治疗的功效，但不会因高细胞毒性而降低对象的存活、健康或两者。

在一些实施方式中，本发明的组合物提供更大量的具有降低的毒性的类胡萝卜素——相比于其它植物来源、水果来源或蔬菜来源的提取物，如番茄。在一些实施方式中，本发明的组合物提供增加的治疗功效，同时毒性降低——相比于其它植物来源、水果来源或蔬菜来源的提取物，如番茄。

在一些实施方式中，本发明的组合物包含天然类胡萝卜素、合成类胡萝卜素、或其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含八氢番茄红素，其量为组合物的总类胡萝卜素的10-40％(w/w)、15-35％(w/w)、20-45％(w/w)、25-35％(w/w)、20-30％(w/w)或30-50(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含六氢番茄红素，其量为组合物的总类胡萝卜素的1-10％(w/w)、3-12％(w/w)、4-14％(w/w)、5-10％(w/w)、8-15％(w/w)或2-9％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含ζ胡萝卜素，其量为组合物的总类胡萝卜素的4-20％(w/w)、6-18％(w/w)、5-15％(w/w)、6-12％(w/w)、9-17％(w/w)或10-17％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与ζ胡萝卜素的重量比的范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)至6:1(w/w)、15:1(w/w)至2:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w/w)、10:1(w/w)至3:1(w/w)或15:1(w/w)至10:1(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物还包含另外的类胡萝卜素。如本文所用，“另外的类胡萝卜素”是指除了八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素之外或不同于八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素的任何类胡萝卜素或其代谢物。

在一些实施方式中，另外的类胡萝卜素选自番茄红素、β胡萝卜素、γ胡萝卜素及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含番茄红素，其量为组合物中总类胡萝卜素的少于10％(w/w)、少于7％(w/w)、少于5％(w/w)、少于3％(w/w)、少于2％(w/w)或少于1％(w/w)，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，组合物包含番茄红素，其量为组合物中总类胡萝卜素的1-3％(w/w)、1-5％(w/w)、2-6％(w/w)、0.5-4.5％(w/w)、0.1-3％(w/w)、0.6-4.8％(w/w)或2.5-4％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含β胡萝卜素，其量为组合物中总类胡萝卜素的少于10％(w/w)、少于7％(w/w)、少于5％(w/w)、少于3％(w/w)、少于2％(w/w)或少于1％(w/w)，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，组合物包含β胡萝卜素，其量为组合物中总类胡萝卜素的1-3％(w/w)、1-5％(w/w)、2-6％(w/w)、0.5-4.5％(w/w)、0.1-3％(w/w)、0.6-4.8％(w/w)或2.5-4％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含γ胡萝卜素，其量为组合物中总类胡萝卜素的至少0.15％(w/w)、至少0.18％(w/w)、至少0.2％(w/w)、至少0.25％(w/w)、至少0.35％(w/w)、至少0.5％(w/w)、至少0.75％(w/w)、至少0.9％(w/w)、至少1％(w/w)、至少1.2％(w/w)、至少1.35％(w/w)或至少1.7％(w/w)，或其间的任意值和范围。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，组合物包含γ胡萝卜素，其量为组合物中总类胡萝卜素的0.15-3％(w/w)、0.2-2％(w/w)、0.2-1.5％(w/w)、0.5-3％(w/w)、0.7-1.6％(w/w)、0.4-2.8％(w/w)或1.2-3.2％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含：量为组合物中总类胡萝卜素的少于5％(w/w)的番茄红素、量为组合物中总类胡萝卜素的少于5％(w/w)的β胡萝卜素、量为组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)的γ胡萝卜素、或其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含另外的类胡萝卜素，其量为0.1-3％(w/w)、0.2-3.5％(w/w)、0.5-2.5％(w/w)、0.15-1.75％(w/w)、0.35-2.75％(w/w)、0.8-4％(w/w)、1-5％(w/w)或1.5-4.75％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，番茄红素的量为少于组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)。

在一些实施方式中，组合物包含的总类胡萝卜素量为组合物的5-25％(w/w)、10-15％(w/w)、12-35％(w/w)、3-17％(w/w)、2-20％(w/w)或1-30％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物还包含生育酚(例如，维生素E)。在一些实施方式中，组合物包含生育酚，其量为组合物的1-30％(w/w)、3-35％(w/w)、5-25％(w/w)、2-20％(w/w)、4-41％(w/w)、8-32％(w/w)或13-39％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与生育酚的重量比范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)至6:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w/w)、10:1(w/w)至3:1(w/w)或15:1(w/w)至10:1(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，ζ胡萝卜素与生育酚的重量比范围为3:1(w/w)至1:3(w/w)、3:1(w/w)至1:2(w/w)、3:1(w/w)至1:1(w/w)、2:1(w/w)至1:1(w/w)、2:1(w/w)至1:2(w/w)、2:1(w/w)至1:3(w/w)、1:1(w/w)至1:2(w/w)或1:1(w/w)至1:3(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物还包含植物甾醇。

在一些实施方式中，植物甾醇选自：胆固醇菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷固醇、Δ5-燕麦甾醇、7-燕麦甾醇、Δ7-豆甾醇及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含植物甾醇，其量为组合物的1-20％(w/w)、2-19％(w/w)、10-25％(w/w)、5-25％(w/w)、8-16％(w/w)、6-18％(w/w)、3-20％(w/w)、4-17％(w/w)或5-15％(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与植物甾醇的重量比范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)至6:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w)、10:1(w/w)至3:1(w)或15:1(w/w)至10:1(w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，ζ胡萝卜素与植物甾醇的重量比范围为6:1(w/w)至2:1(w/w)、5:1(w/w)至2:1(w/w)、4:1(w/w)至2:1(w/w)、3:1(w/w)至2:1(w/w)、6:1(w/w)至3:1(w/w)、5:1(w/w)至3:1(w/w)、4:1(w/w)至3:2(w/w)或6:1(w/w)至3:1(w/w)。每一种可能性都代表本发明的一个单独的实施方式。

测定植物营养素如类胡萝卜素的量的方法是常见的，并且对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。这种方法的非限制性实例包括但不限于气相色谱法、液相色谱法和质谱法。

在一些实施方式中，组合物是口服组合物或局部组合物。在一些实施方式中，组合物是药物或营养药(nutraceutical)组合物。在一些实施方式中，组合物包含药物或营养药可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物是药妆(cosmeceutical)组合物。在一些实施方式中，组合物包含药妆可接受的赋形剂。在一些实施方式中，本文所述的组合物是可摄入的皮肤组合物。

在一些实施方式中，口服组合物是软凝胶胶囊的形式。在一些实施方式中，口服组合物是饮料、丸粒(shot)、胶质(gummy)或粉末的形式。在一些实施方式中，口服组合物被混合或同化到食物如巧克力、冰淇淋或其它食物中。

在一些实施方式中，本发明的组合物用于改善有需要的对象的皮肤屏障。在一些实施方式中，本发明的组合物用于治疗或预防有需要的对象的皮肤屏障相关疾病。在一些实施方式中，本发明的组合物用于增加有需要的对象的角质层中含亚油酸酯的酰基神经酰胺的量、浓度或两者。

在一个实施方式中，本发明的组合物本身可提供给个体。如本文所用，术语“本身”是指这样的情况，其中组合物未被进一步配制和/或与载体、稀释剂等混合。

在一个实施方式中，本发明的组合物可作为包含药学上可接受的载体的药物组合物或营养药组合物的一部分提供给个体。

在一个实施方式中，“药物组合物”、“药妆组合物”或“营养药组合物”是指本文所述的组合物与其它化学组分如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物、药妆组合物或营养药组合物的目的是促进向生物体施用组合物。

在一些实施方式中，提供用于生产组合物的方法，所述组合物包含：量为20-30％(w/w)的八氢番茄红素、量为5-10％(w/w)的六氢番茄红素、量为5-15％(w/w)的ζ胡萝卜素，以及可接受的载体。在一些实施方式中，方法包括提取本文公开的金番茄。在一些实施方式中，本发明的组合物包含通过本文公开的方法生产的金番茄提取物。

在一个实施方式中，“组合制剂”尤其限定了“各部分的套组(kit of parts)”，即如上定义的组合伴侣可独立地给药或通过使用具有不同量的组合伴侣的不同固定组合即，同时地(simultaneously)、并发地(concurrently)、分别地或依次地给药。在一些实施方式中，然后可例如同时地或按时间交错地施用各部分的套组中的各部分，即在不同的时间点并且对于各部分的套组中的任何部分具有相等或不同的时间间隔。在一些实施方式中，总量的一定比例的组合伴侣可在组合制剂中施用。在一个实施方式中，可改变组合制剂，例如，为了满足待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可能是由于具体疾病、疾病的严重性、年龄、性别或体重，对此本领域技术人员可以很容易地确定。

在一个实施方式中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对哺乳动物造成显著刺激并且不会消除所施用的组合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂被包括在这些短语下。

在一个实施方式中，“赋形剂”是指添加到组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一个实施方式中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和施用技术见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，MackPublishingCo.,Easton,PA，最新版(其通过引用以其整体并入本文)。

在一个实施方式中，合适的施用途径，例如，包括口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，其包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

在讨论时，除非另有说明，形容词如“基本上”和“约”修饰本发明实施方式的一个或多个特征的条件或关系特性，应理解成意为该条件或特性被定义为处在对于该实施方式预期应用时其操作而言可接受的公差内。除非另有指示，否则说明书和权利要求书中的“或”一词被认为是包含性的“或”而不是排他性的或，并且表示它所结合的项目中的至少一个或任意组合。

应当理解，如上文和本文其它部分使用的术语“一(a)”和“一个(an)”是指所列举组分中的“一个或多个”。除非另有明确说明，否则本领域普通技术人员将很清楚单数的使用包括复数。因此，术语“一”、“一个”和至少一个在本申请中可互换使用。

为了更好地理解本教导并且绝不限制本教导的范围，除非另有指示，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示数量、百分比或比例的数字以及其它数值，都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数都是可以根据寻求获得的所需特性而变化的近似值。至少，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并应用普通的舍入技术来解释。

在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包含(comprise)”、“包括(include)”和“具有”及其变位词中的每一个都用于表示该动词的一个或多个宾语不一定是该动词的一个或多个主语的成分、要素或部分的完整列举。

如本文所用的其它术语旨在由它们在本领域中公知的含义来定义。

除非具体说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为是包含性的。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等的变体表示包括任何叙述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“主要由……组成(consists essentially of)”或诸如“主要由……组成(consist essentially of)”或“主要由……组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何叙述的整数或整数组，以及任选地包括不实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何叙述的整数或整数组。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等可表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“主要由……组成(consisting essentially of)”或“主要……组成(consistsessentially)”等同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且该术语是开放式的，只要所叙述内容的基本或新颖特性不会因所叙述内容以外的内容的存在而改变，就允许存在所叙述内容以外的内容，但不包括现有技术的实施方式。在一个实施方式中，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(having)”可与“构成(consisting)”互换。

本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域的普通技术人员来说，在考察以下实施例后将变得显而易见，这些实施例并非旨在是限制性的。此外，如上所述和在权利要求部分中要求保护的本发明各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中都会找到实验支持。

实施例

总体上，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括化学、分子、生物化学和细胞生物学技术。此类技术在文献中得到了详尽的说明。参见，例如，"MolecularCloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"第I-III卷Ausubel,R.M.,ed.(1994)；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",第I-III卷Cellis,J.E.,ed.(1994)；John McMurry和Tadhg Begley所著的TheOrganic Chemistry of Biological Pathways(Roberts and Company,2005)；RichardSilverman所著的Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions(AcademicPress,2002)；Leroy"Skip"G Wade所著的Organic Chemistry(第6版)；T.W.GrahamSolomons和Craig Fryhle所著的Organic Chemistry。

材料和方法

Lumenato^TM(化合物列表见表1)由Lycored Corp.(Branchburg NJ,USA)提供。四氢呋喃(THF)购自Sigma Chemical Company(St.Louis MO,USA)。源自单一供体的包皮的原代人皮肤成纤维细胞、DMEM、胎牛血清和XTT细胞存活率试剂盒购自Thermo FisherScientific(Branchburg,NJ,USA)。用于RNA提取的Qiagen RNeasy试剂盒购自Qiagen(Germantown,MD,USA)。制备经干燥番茄提取物于THF中的0.1％(w/v)储备溶液用于基因表达实验。临床研究中使用软凝胶胶囊中的Lumenato^TM(110mg)。本研究的对照胶囊含有石蜡油，而不是番茄提取物。

表1.金番茄提取物的化合物(GTE；在本文也称为Lumenato^TM)

基因表达

使用微阵列分析评估两种浓度即0.001％和0.0005％下的Lumenato^TM提取物对培养的人皮肤成纤维细胞中基因表达的影响。

细胞毒性测定

根据制造商的说明书，采用XTT细胞存活率测定(Thermo Fisher Scientific)评估细胞毒性。将含10％胎牛血清的DMEM中的成纤维细胞接种于96孔板中，并在37℃、5％CO₂和95％相对湿度下培养过夜。在0.001％(v/v)和0.0005％的THF以及THF+0.001％(w/v)Lumenato^TM和THF+0.0005％ Lumenato^TM的存在下将细胞孵育24小时，然后在细胞培养基中再孵育24小时。将未处理的细胞纳入为阴性对照。所有处理均执行三次重复。超过对照值20％的存活率抑制被视为具有细胞毒性。测试化合物是无毒的。

人皮肤成纤维细胞的处理

将人皮肤成纤维细胞(HDF)在6孔板(Thermo Fisher Scientific/Nunc)中培养24小时，然后用THF或Lumenato^TM处理6小时。孵育后，在PBS中洗涤细胞，并根据制造商的说明书，使用Qiagen RNeasy试剂盒制备裂解物用于总RNA提取。使用Nanodrop IMPLEN分光光度计(Westlake Village CA,USA)测定RNA浓度和纯度。

总RNA的质量控制

将从表皮组织中分离的RNA置于干冰上运送到Advanced BioMedicalLaboratories(Cinnaminson,NJ,USA)进行处理。总RNA样品的整体完整性和RNA质量由Advanced BioMedical Laboratories(Cinnaminson,NJ,USA)确认。一种考虑数个QC参数(例如，核糖体RNA、28S/18S峰面积比、5S区非预期峰等)的专有算法用于计算RNA完整性数(RNA Integrity Numbers,RIN)。RIN数为10表示RNA质量完美；RIN数为1表示RNA降解。根据已发表的数据和发明人自身的经验，RIN数>8的RNA具有足够的质量用于基因表达图谱(gene expression profiling)实验。所有RNA样品的RIN数均>8。使用Affymetrix HumanClariom D阵列处理进行微阵列分析。

基因表达数据的统计分析

使用0.05的统计显著性阈值(p值)和绝对值至少为0.6的表达倍数变化的对数获得差异基因表达。经处理细胞与对照细胞中基因表达的比的倍数增加或减少在零附近是非对称的。为避免这个问题，上调或下调通常表示为以2为底该比的对数(base 2logarithmof the ratio)。因此，绝对值为0.6表示1.5倍的上调或下调。值为1表示两倍的上调或下调。

人类对象

对一百一十四(114)名年龄在35岁至60岁之间的日本女性进行了筛选，找到66名符合条件的对象。符合条件的对象均为II型或III型Fitzpatrick皮肤和II型Glogau皮肤分类。其它纳入标准包括理解研究的能力和遵守避免过度UV暴露和不服用可能会干扰研究的补充剂的意愿。在完成研究的63名对象中，两名违反了方案，因此未对其数据进行分析。本研究根据《赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)》进行，并经日本Aisei HospitalUeno Clinical Research Ethics Committee批准(IRB#12000071)。所有对象在研究开始前均给予书面知情同意。在基线、4周、8周和12周时对对象进行临床访视，以进行摄影、主观评估和仪器测量。由于COVID-19大流行，12周临床访视被取消，改为在第16周进行。对象每天随食物服用一粒Lumenato^TM胶囊。

TEWL的测量

TEWL是在临床访视时于标准条件下测量的。使用的是VapoMeter(DelfinInstruments,东京,日本)。测量是在左脸颊上自眼睛外角起的区域以及外耳(耳屏)尖小隆起的平面上进行的。为了测量TEWL，使对象在21℃和50％相对湿度的环境室内适应20分钟，然后进行皮肤测量。所有皮肤测量均由同一人进行。用直尺测量皮肤测量位置，以便在每个测试点都是同一位置。

摄影与摄影分析

使用VISIA Evolution摄影装置获取对象照片。主要终点：使用所有VISIA模态获得VISIA参数：对象定位至关重要，并且必须在每个时间点重复。保持对象所坐的凳子高度等项目以及对象的下巴和前额在成像装置中的细致放置。此外，将对象的头发从其脸上移开，摘掉珠宝，并用一张黑色帷帘对着装进行标准化。拍摄对象的前视图、左视图和右视图时，让其眼睛轻轻闭上。

Canfield Scientific(Canfield Scientific,新泽西州,USA)对图像进一步分析，以提取并报告与图像中各种变化对应的数值，如下所述。

红色区域和质地

通过对VISIA照片的详细分析检测红色区域和质地。为此，通过比较该区域相对于其局部区域的对比度进行检测。首先根据皮肤的背景强度分布对拍摄的图像进行标准化。这样的过程消除整个感兴趣区域的光照变化。应用对比度阈值来选择相对于其周围环境比最小强度水平差更暗的候选区域。最后，应用大小和形状标准来过滤候选区域并选择最终地点。

毛孔大小

通过对VISIA照片的详细分析检测毛孔大小。毛孔分析算法为可见的面部毛孔提供定量数据和评分。使用图像分析算法检测毛孔，这一算法旨在检测指定直径范围内的圆形目标，这些圆形目标也符合最小圆度阈值以及最小梯度阈值(比较毛孔相对于其紧接的周围环境的强度)。对用Canfield研究拍摄装置(Canfield research capture device)(Canfield Scientific,Inc.,新泽西州,USA)捕获的高分辨率图像进行分析。

实施例1

基因表达分析

在本研究中，通过用0.001％ Lumenato^TM处理人皮肤成纤维细胞6小时，发现97个基因显著上调。其中的55个基因没有轻易可用的与皮肤相关的信息。这其中很多都是假基因，并且7个是嗅觉受体基因。五十八(58)个基因显著下调，这其中的36个基因没有轻易可用的与皮肤相关的信息。Lumenato^TM为0.0005％时，121个基因上调，44个基因下调。这与0.001％ Lumenato^TM的结果有一些重叠，但也有一些差异。值得注意的是，鉴定了另外12个嗅觉受体基因。表2列出了待讨论的主要基因，以及表3列出了嗅觉受体基因。

表2.感兴趣基因

浓度^a＝0.001％Lumenato^TM。浓度^b＝0.0005％ Lumenato^TM。IL6和CCL2也因0.0005％Lumenato^TM显著上调。这些基因按本文讨论其的顺序从上到下列出。

表3.Lumenato^TM上调或下调嗅觉受体基因

实施例2

临床研究-Lumenato^TM对TEWL的影响

在临床研究中，32名对象在基线时具有相对高的TEWL值(值≥12.5g/h/m²)，而29名对象具有较低的TEWL值。分别对这两组数据进行分析。如图1所示，Lumenato^TM补充对低TEWL无影响。然而，在高TEWL队列中，Lumenato^TM补充显著降低TEWL 16周。

对于表现出显著变化的组，TEWL单项相对变化的计算表明，自基线的改善幅度在21％至53％之间。Canfield Scientific进一步分析的这些小组成员的VISIA照片指向皮肤外观的变化：发红、毛孔和质地。本文呈现了经选择的照片。

这些结果代表所分析的来自TEWL基线补充子组的经选择的照片。分析反映了分数面积，意即检测到的特征所占据的总面积与感兴趣区域(掩藏区域)之比。特征的检测基于强度/对比度。

图2表示TEWL值改善35％的小组成员的标准视图图像。将基线照片与第16周获得的照片进行比较时，皮肤明显看起来更光滑，毛孔明显更少。

图3A-3C表示TEWL值改善26％的小组成员的面部红色区域。将基线照片与第16周获得的皮肤照片进行比较时，观察到发红明显减少。

红色区域表示真皮乳头(papillary dermis)——其是一种赋予这些结构红色的皮肤亚层——中存在血管和血红蛋白，由已显示准确检测和定量皮肤红斑的RBXTechnology(Canfield scientific的商品名)检测。由此，红色区域采用交叉偏振照明拍摄，并以浅蓝色勾勒出轮廓。红色斑点表示红斑和瑕疵——它们是斑点，而血管红色是线性特征。RBX技术使装置能够观察皮肤表面之下的情况，从而将具体状况可视化为与血管障碍和着色过度两者有关。红色区域可能与多种状况如炎症或蜘蛛静脉有关。蜘蛛静脉或破裂的毛细血管的典型特征是短而细的线，并且可在致密的网络中相互连接。其它导致斑点或炎症的状况大小不同，但总体上较小且呈圆形。大而弥散的暗红色区域也可能表明存在问题区域。此技术的核心原理在于，血红蛋白以氧化形式和脱氧形式存在于真皮乳头(皮肤的一个亚层)处的血管结构内，并导致皮肤色调出现红色的色泽。一些皮肤状况，如痤疮和红斑痤疮，会导致人的血管结构发生器质性变化，并升高真皮中存在的血红蛋白水平。血红蛋白量的增加和新血管结构的形成将导致红色的色泽，并因此对皮肤色调的均匀性产生负面影响。本文呈现的结果(图3)显示红色区域明显减少，经数值上计算，自整个面部的基线减少26％。有趣的是，此小组成员的TEWL值也表现出26％的降低。

汗腺导管的圆形面开口处观察到毛孔。每个毛孔都用深蓝色勾勒出轮廓，由于阴影，扩大的毛孔看起来比周围的皮肤色调更暗，并通过更暗的颜色和圆形来识别。轮廓区域标识出扩大的毛孔。之前，已证明用于毛孔评估的VISIA-CR法与视觉分级具有高相关性，并且获得了孔径(r＝0.86)。此外，还证明其适用于区分毛孔的形状和毛孔分布不同的各个年龄组。

图4呈现了TEWL值改善33％的小组成员的面部区域。将基线照片与第16周皮肤获得的照片进行比较时，观察到毛孔数量明显减少。此小组成员还表现出更光滑的皮肤。

图5呈现了TEWL值改善48％的小组成员的面部红色区域。将基线照片与第16周皮肤获得的照片进行比较时，观察到毛孔数量明显减少。

除了毛孔评估外，VISIA-CR摄影还可评估皮肤质地的变化是更粗糙还是更光滑。例如，在一项旨在借助(vis)超声导入(sonophoresis)增强类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)提取物对皮肤渗透的研究中，获得了皮肤质地等属性的改善。

使用VISIA进行的质地分析在2D照片中表现为凸起(raised)和凹陷(depressed)区域的出现，这表明皮肤表面的变化影响皮肤的光滑度。因此，凸起区域为黄色，凹陷区域为蓝色(图6)。

图6A-6B分别呈现TEWL值改善21％的小组成员和TEWL值改善33％的小组成员的面部红色区域。将基线照片与第16周皮肤获得的照片进行比较时，观察到皮肤质地明显变光滑。

讨论

解决各种皮肤疾病和障碍的局部产品自古以来就有使用。近几十年来，随着人们认识到皮肤是由血液滋养的，以及健康等同于美丽的信念，化妆品和个人护理行业正在经历营养补充剂的增长，这些营养补充剂宣称对各种特性如皱纹、老年斑和光泽的皮肤外观有改善。总之，用于评估Lumenato^TM对皮肤作用的体外和体内研究表明，Lumenato^TM以两种互补的形式即生物学形式(先天免疫)和物理形式(角质层屏障)改善皮肤屏障和完整性。图7中概述了描述这两种形式的图示。

多个上调的基因似乎增强了皮肤防御机制。这些机制包括通过募集吞噬细胞和刺激产生抗微生物脂肪酸来增强先天免疫、增强DNA修复和增强对生物异源物质的解毒作用。

Lumenato^TM处理6小时后，IL-17表达未上调。推测其在较早时间上调，从而导致IL-17途径中的一些基因在6小时时上调。这些基因包括IL-6、CCL2和CXCL1。CCL2和CXCL1是趋化因子基因，导致对中性粒细胞和单核细胞的吸引。IL-17和IL-6协同作用以增加应激条件下细胞存活分子的产生。同样，TNF-α在6小时时未上调，但TNFIP3(TNFα诱导蛋白3)上调，表明TNF基因较早就上调了。TNF-α刺激皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白，从而抑制皱纹的形成或可能改善皱纹。TNFIP3是一种脱遍在蛋白酶。它从钙黏着蛋白中去除泛素以防止钙黏着蛋白降解。总之，这些观察结果表明，Lumenato^TM消耗会激活真皮成纤维细胞中的IL-17途径和TNF-α途径，从而导致抗微生物防御增强。这两种途径在激活抗微生物防御方面发挥协同作用。

DGAT2L6的基因产物增加皮脂产生。这可使月桂酸和杉皮酸(sapienic acid)在皮肤表面更易获得，而且这些都是抗微生物剂。

上调的ALOX 5蛋白作用于花生四烯酸产生5-过氧化氢二十碳四烯酸(hydroperoxyeiosatetraenoic)，然后转化为5-羟基二十碳四烯酸(5-HETE)或白三烯A4(LTA4)。LTA4会迅速转化为白三烯B4(LTB4)。5-羟基二十碳四烯酸可被氧化成5-氧代二十碳四烯酸(5-oxoeicosatetraenoic acid)。LTB4、5-HETE和5-氧代二十碳四烯酸充当趋化因子吸引中性粒细胞和单核细胞，从而增强先天免疫。ALOX5还可作用于高级ω-3必需脂肪酸(二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)，并且其中一些产物可能具有抗炎性。

BACH2显著上调。此基因的产物是衰老和DNA损伤的标志。它与B细胞分化和免疫系统稳态有关。

CYP4F11编码P450酶，P450酶可能会防御外源化学物质。此P450已显示可使多种药物羟基化。有趣的是，尽管0.0005％ Lumenato^TM提取物处理对CYP4F11的表达没有显著影响，但在此较低浓度下，CYP4A22这一不同的P450基因被上调。此酶已显示可ω-羟基化月桂酸和肉豆蔻酸，并能够羟基化多种脂族和芳族底物。

本研究的一个次要但非同寻常的发现是一系列编码嗅觉受体的基因上调。嗅觉受体是G蛋白偶联受体。在除嗅觉神经元外的一系列细胞类型包括表皮角质化细胞和黑色素细胞中都发现了它们。在一项研究中，在角质化细胞中鉴定出了一种对合成檀香气味剂有反应的嗅觉受体(OR2AT4)。气味剂与受体的相互作用导致钙摄取。后来的一项研究考察了此受体在人发干上皮细胞中的作用。在此情况下，受体的激活导致离体毛发生长延长。在另一项研究中，在角质化细胞中鉴定出了另外两种嗅觉受体。OR2A4/7对环己基水杨酸酯有反应，OR51B5对异壬基醇有反应。这些嗅觉受体的任一个激活导致胞内钙增加。在黑色素细胞中也检测到了嗅觉受体。此受体OR51E2对β-紫罗兰酮有反应，导致胞内钙增加并刺激黑色素合成。β-紫罗兰酮是来自紫罗兰的气味化合物。尽管已在3T3细胞——一种胚胎成纤维细胞衍生细胞系——中报告了嗅觉受体，但本研究可能是第一个鉴定出人皮肤成纤维细胞中大量嗅觉受体基因的研究。

还值得注意的是，两个半乳糖基转移酶基因受到Lumenato^TM的影响。其中一个即B3GALT1显著下调，而另一个即B3GALT2上调。

两种β-1,3-半乳糖基转移酶都将半乳糖基残基从UDP-半乳糖转移到糖蛋白或神经节苷脂的末端N-乙酰氨基葡萄糖上。B3GALT2的产物也可将半乳糖转移至末端半乳糖，但对此底物的亲和力低得多。半乳糖基转移酶活性的这些改变将改变细胞表面的碳水化合物展示。目前尚不清楚此修饰的后果。

如前所述，角质层的脂质主要由神经酰胺、胆固醇和脂肪酸组成。脂肪酸大多是20碳到28碳长的饱和种类。大部分神经酰胺也具有很少的易氧化的官能团。这些脂质是抵抗氧化损伤的理想物质。一个例外是含亚油酸酯的酰基神经酰胺。此脂质如果不受抗氧化剂的保护，则在暴露于空气时易被氧化。亚油酸对皮肤的屏障功能至关重要。来自循环的亚油酸被表皮摄入，并最初被并入到甘油三酯的小池中。它被迅速转化为磷酸甘油酯，然后转化为酰基葡糖神经酰胺。这是含亚油酸酯的酰基神经酰胺的葡糖基化前体。葡萄糖以β-糖苷键连接到长链碱的伯羟基上。这种含亚油酸酯的酰基葡糖神经酰胺与片层颗粒缔合。在角质化过程的后期，片层颗粒的内容物被挤出到细胞间隙中，而葡糖神经酰胺被去糖基化产生神经酰胺，包括含亚油酸酯的酰基神经酰胺。含亚油酸酯的酰基神经酰胺对屏障功能至关重要。分离的含亚油酸酯的酰基神经酰胺在暴露于空气时会迅速氧化。在最佳条件下，α-生育酚通过皮脂分泌递送到皮肤表面，这使脂质和蛋白质免受氧化。其它抗氧化剂也通过皮脂输送；然而，在大多数情况下，α-生育酚是主要的一种。在氧化应激条件下，如UV光暴露，角鲨烯、胆固醇和角蛋白显示被氧化，并且氧化的角蛋白显示处于外角质层中。在这种损伤条件下，含亚油酸酯的酰基神经酰胺似乎也可能会被氧化。这会损伤皮肤的屏障功能并导致TEWL升高。这可对基线时TEWL较高的对象作出解释。虽然某些类胡萝卜素从真皮扩散到表皮中，但真皮中的大部分类胡萝卜素通过皮脂分泌和/或出汗而输送到皮肤表面。这可为酰基神经酰胺提供额外的保护，导致通过降低TEWL恢复屏障功能。图1的当前结果显示，16周Lumenato^TM补充后，TEWL对象的TEWL值低于安慰剂对照。如果线性趋势继续，再补充10周就会使TEWL降低到与低TEWL组相同的范围。误差棒表示标准差的一半，A和C向上，B和D向下。

角质层脂质在角质层的细胞间隙中被组织成多层结构，主要周期率为13nm，这在透射电子显微照片和X射线衍射数据中是明显的。使用重构的角质层脂质观察到该13nm的周期率；然而，如果省略酰基神经酰胺，则通过电子显微术或X射线散射都看不到该周期率。唯一参与酰基神经酰胺合成的酶的突变导致各种常染色体隐性遗传的先天性鱼鳞病(ichthyoses)，屏障功能受损。这些基因包括ELOV4、CYP4F22、PNPLA1和ABHD5。ELOV4的产物是一种脂肪酸延长酶，其从C26-CoA延长至C30-CoA以上。CYP4F22编码使超长脂肪酸ω-羟基化的P450。PNPLA1的产物将亚油酸酯转移至ω-羟基，而ABHD5的产物是PNPLA1的共激活剂。此外，在必需脂肪酸缺乏中，油酸酯取代酰基神经酰胺中的亚油酸酯，并且TEWL增加到至少5倍。在高歇病中，去糖基化酰基葡糖神经酰胺产生酰基神经酰胺的β-葡糖脑苷脂酶是缺陷的。在这种情况下，角质层细胞间隙的超微结构发生改变，TEWL明显升高。这些观察结果强化了一个概念，即含亚油酸酯的酰基神经酰胺对正常屏障功能至关重要。

虾青素是一种在鲑鱼、鲑鱼子和某些虾中发现的类胡萝卜素，并且其据报道对皮肤健康和稳态有益处。在一项涉及36名男性对象的随机安慰剂对照研究中，与对照相比，每天摄入6mg虾青素6周后，虾青素组的TEWL值显著降低。据报道，虾青素还改善轻微皱纹、老年斑大小、弹性、水合和弹性。在另一项研究中，在以4mg/天补充虾青素9周后，虾青素显示提高了UV的最小红斑剂量。当在照射部位测量TEWL时，对照组和虾青素组中其均有增加，但虾青素组中的增加明显较少。

大量研究表明，当通过各种干预措施减少TEWL时，水合和皮肤表面光滑度增加，鳞屑和毛孔面积减少。同样，在局部施用化学物质或使用刺激性肥皂刺激皮肤的研究中，TEWL和红斑均增加。因此，TEWL与多个皮肤外观参数相关。在本研究中，通过VISIA摄影拍摄并进行定性和定量分析，发现TEWL减少与皮肤外观的各种属性之间存在相关性。具体地，已证明皮肤发红和皮肤毛孔减少以及皮肤质地总体改善(粗糙度减少)和外观的总体改善伴随TEWL的减少。皮肤发红是炎症的迹象，可能是潜在疾病的亚临床水平，这是一种原发性刺激或过敏反应的表现。由于类胡萝卜素是已知的抗炎剂和抗氧化剂，皮肤发红的减弱可通过这种活性来解释，但是皮肤发红的减少与TEWL减少强烈相关的事实指向了潜在更复杂的多功能途径。此外，已知皮肤屏障维持相对顽固的稳态，即使这种情况是异常的。这意味着当受到洗涤剂、异常pH值或其它刺激性条件的挑战时，大多数情况下它都会在数小时至数天内恢复至其基线。

VISIA照片显示集中的暗红色区域减少。这些代表真皮乳头即皮肤的一个亚层中的血管和血红蛋白使这些结构呈现红色，这是由RBX技术检测到的。红色区域可能与多种状况如炎症或蜘蛛静脉有关。蜘蛛静脉或破裂的毛细血管的典型特征是短而细的线，并且可在致密的网络中相互连接。

通过对皮肤涂抹局部类视黄醇，观察到TEWL减少与皮肤质地改善之间的相关性。效应上的相似性并不令人惊讶，因为类胡萝卜素是类视黄醇的氧化前体。

在本研究中，评估了含视黄醛的新型抗衰老面霜作为光老化皮肤治疗的功效和安全性。这项研究是对40名韩国女性志愿者进行的，她们每天涂抹两次视黄醛面霜，持续3个月。使用Antera系统对鱼尾纹和皮肤质地进行定量评估。还评估了TEWL、皮肤水合、黑色素指数和皮肤亮度。本研究的结果显示，治疗改善了光老化皮肤的状况。

总之，本文介绍的研究揭示了Lumenato^TM在真皮和表皮水平对皮肤的独特作用。这些类胡萝卜素和生育酚强化皮肤屏障，并为其配备应对环境侵袭的工具。此外，本发明人证明了屏障强度与特定皮肤外观相关益处(如发红和毛孔的减少)和皮肤光滑效果之间的相关性。此外，本发明人证明了人皮肤成纤维细胞中嗅觉受体的存在及其因Lumenato^TM显著上调。

实施例3

口服Lumenato对改善视觉和实验皮肤属性的作用

招募了年龄在35岁至55岁之间、对改善健康和正常面部皮肤外观感兴趣的健康女性进行研究。这些对象下载了一个应用程序(app)(ClaimIt,Obvio Health USA Inc.)，这是一个执行临床试验的在线和移动应用程序界面。此设置消除了实体场所访视，并将试验直接引领到每名对象的移动装置上。在开始筛选过程之前，参与者签署电子知情同意书(eIC)，之后他们填写一份研究专用的筛选问卷，其中包括纳入/排除标准，包括自我报告的种族特点(ethnicity)和皮肤类型。在获得资格后，他们填写病史和合用药物表并参与研究。合格的参与者会收到研究产品。参与者在主餐(早餐、午餐或晚餐)时间前后，每天服用1粒软胶囊，持续12周。在整个研究过程中，当在预定时间点展开问卷时，要求他们在应用程序内填写问卷。每周电子日记用于测量服用研究产品的依从性以及任何报告的健康或药物方面的变化，为的是确定不良事件(如果有的话)。在研究结束时(使用12周)，指导参与者安全丢弃任何剩余的含研究产品的软胶囊，并填写一系列与他们使用研究产品的经验相关的问卷。处理期结束后两周，参与者完成FACE-Q^TM皮肤满意度、研究结束时皮肤问卷和ClaimIt经验调查。

图8展示出使用补充剂12周之前和之后不同参数的平均评分。图8A显示了对皮肤调性的各种测量。如在图中观察到的，尽管色素斑没有改善，但皮肤色调均匀性仍有21％的改善(p<0.001)。皮肤变亮29.75％(p<0.001)，面部深色斑减少10.96％(p<0.001)。眼周黑眼圈也减少了17.9％(p<0.001)。图8展现出使用补充剂12周之前和之后不同参数的平均评分。如在图8B中观察到的，使用补充剂12周后，皮肤弹性(21.54％)和紧实性(27.18％)有极其显著的(p<0.001)改善。图8A显示了对皮肤调性的各种测量。如在图中观察到的，尽管色素斑没有改善，但皮肤均匀性仍有21％的改善(p<0.001)。皮肤变亮29.75％(p<0.001)，面部深色斑减少10.96％(p<0.001)。眼周黑眼圈也减少了17.9％(p<0.001)。图8C显示了使用补充剂12周后皮肤水合有21.6％的(p<0.001)感知改善，皮肤质地有18.18％的改善(p<0.001)。图4D显示尽管深度皱纹没有改善，但补充剂使用12周后，面部细纹和皱纹有12.97％的显著改善(p<0.001)。如在图8E中观察到的，皮肤发展发红的趋势略有改善。使用补充剂后，老化/不健康皮肤的总体外观显著减少(p<0.001)，减少23.53％。图8F显示补充剂处理12周之前和之后总体皮肤状况的平均评分。如在图中观察到的，使用补充剂后整体皮肤状况有极其显著的(p<0.001)改善，改善28.22％。

图5展示出处理前和处理4、8和12周后以及又在处理停止2周后的FACE-Q^TM皮肤满意度量表结果。呈现的数据来自满意度评分，其中评分1表示非常不满意，2表示有点不满意，3表示有点满意，以及4表示非常满意。对报告评分为3和4的对象的数量进行了计数，并在图中表示为表示认可的群体百分比。图9A显示“您的面部皮肤看起来怎么样”是一天早上和晚上的第一件事。最初，评分处于满意和不满意的边缘；然而，在处理后，长达8周一直有稳定的改善，为84％-75％(p<0.001)，之后趋于平缓。中断处理两周后，效果得以保留。图9B显示了对健康和有吸引力的面部外观的感知的类似趋势。对于这两个参数，在12周的处理过程中一直有稳定的改善，此时健康和有吸引力的皮肤存在统计学显著的(p<0.001)改善，分别为74.6％和65.08％(p<0.001)。尽管中断处理两周，这些感知仍持续提高。

图9C：对清新和有光彩的面部的感知。对于这两个参数，在12周的处理过程中一直有稳定的改善，此时与基线相比存在统计学显著的(p<0.001)变化。尽管中断处理两周，这些感知仍持续提高。

图9D：面部皮肤调性。在处理后，颜色和调性的均匀性在长达8周期间具有稳定的改善，为61.9％-74.6％(p<0.001)。到处理的第12周，群体中超过71％(p<0.001)认为处理对皮肤调性和色调均匀性有效。处理中断两周后，皮肤色调和调性的均匀性存在进一步改善，分别为81％和72.41％。

图9E显示群体中有38.71％注意到在使用补充剂4周和8周后皮肤发红减少，在使用补充剂12周后增加到41.94％。使用4周后，群体中有35％观察到健康皮肤的外观和感觉有所改善，使用8周和12周后分别增至56.45％和58.06％。使用4周后，35.48％的对象的总体皮肤外观得到改善，在8周和12周后分别增至66.13％和62.9％。

面部细纹和皱纹是衰老最受关注的表现。据报道，抗氧化剂水平低的个体的皮肤中沟纹和皱纹要更深且更密。在当前的研究中，使用产品12周后，细纹和皱纹有显著减少。本研究中的大多数对象表现出非常低的深皱纹评分；然而，61％的对象群体注意到在用补充剂处理后皱纹有所改善。

实施例4

评估口服补充剂的功效和服用者(consumer)感知的临床研究

本临床研究的第一个目的是评估口服补充剂在使用4周、8周和12周后改变面部皮肤特征的功效。第二个目标是通过使用问卷获得消费者对测试产品的感知。

大约66名对象被纳入本临床研究以评估口服补充剂在使用4周和12周后改变面部皮肤特征的功效，并通过使用问卷获得服用者对测试产品的感知。研究评估包括综合代谢组(comprehensive metabolic panel)、Cutometer测量、Canfield的VISIA-CR图像、VapoMeter测量和服用者感知问卷。

蒸汽计

VapoMeter是唯一可用于测量TEWL(经表皮失水)值和蒸发率的全便携式仪器。TEWL是皮肤屏障功能的公知指标。在每个指定时间点，从随机脸颊获得两个VapoMeter测量值。

Cutometer

Cutometer能够以非侵入方式评估皮肤的机械特性。该仪器测量皮肤表面在真空吸力(500mm Hg)拉动下通过小探头孔时的垂直形变情况。

可测量以下参数：最终拉伸(distention)，Uf，即在10秒钟时测量的(R0)；即刻拉伸，Ue，在0.1秒时测量；延迟拉伸，Uv；即刻回弹(retraction)，Ur；形变参数是取决于皮肤厚度的外在参数。为规避测量皮肤厚度，使用以下比率评估皮肤的弹性性质：

—R0：此参数表示皮肤对力的被动行为。此参数的减小表明紧实性改善。

—R1：皮肤恢复其原始状态的能力。此参数的减小表示改善。

—R2：总弹性，值越接近1(100％)，曲线越有弹性，非常重要的参数。R2表示皮肤的弹性及其恢复其原始位置的能力。此参数的增大表明弹性改善。

—R3：最后一条曲线，与第一条曲线的最大振幅相比。皮肤的疲劳效应是可见的，因为振幅随着每次新的抽吸而增加。R3与皮肤疲劳相关。使用Cutometer反复抽吸和释放引起皮肤疲劳，从而导致弹性下降和提高对形变位置的维持。此参数的减小表示改善。

—R4：与第一条曲线相比最后一个最小振幅，皮肤的疲劳效应是可见的，因为每次新的抽吸都会降低再形变的能力。R4与皮肤疲劳有关。使用Cutometer反复抽吸和释放引起皮肤疲劳，从而导致弹性下降和提高对形变位置的维持。此参数的减小表示改善。

—Ur/Ue(R5)是皮肤的生物弹性。它测量皮肤在形变后恢复其初始构型的能力。值为1将表示100％弹性。此比率的增加表示弹性改善。

Uv/Ue(R6)是延迟形变和即刻形变之间的比率，即它是粘弹性与弹性之比。此比率值的增大表示形变的粘弹性部分增大和/或弹性部分相对减小。这些比率的下降表示弹性改善。

Ur/Uf(R7)是皮肤净弹性的量度。此比率的增大表明弹性改善。

将获得R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R0的Cutometer测量值。

通过保持探头牢牢抵靠在皮肤的表面来获得测量值。真空泵将皮肤吸入一个小开口中，探头测量皮肤拉伸所达到的高度。

通过经历三个二十秒周期，自动产生三次重复的测量值。每个周期由一个抽吸阶段和一个松弛阶段组成，在抽吸阶段，皮肤被吸入探头，在松弛阶段，抽吸停止，皮肤被释放。数据以电子方式输入计算机，在计算机中计算比值。读数会显示出来，然后手动转录到评分表上。

在每个指定时间点都从随机脸颊获得一次Cutometer测量。

CANFIELD的VISIA-CR

Canfield的VISIA-CR高精尖技术会产生高质量、可再现的面部图像，通过对皮肤特征如皱纹和细纹、皮肤质地、色泽/均匀性、光损伤、血管特征和紫质(porphyrins)(痤疮丙酸杆菌(P.acnes))的主观临床评估，可表明处理功效。

VISIA-CR成像是在闭眼状态下拍摄的。对象将佩戴头带拉回头发，并穿一件斗篷来遮盖衣服。由技术人员决定是否要求对象摘掉珠宝。

将采集以下参数：细纹和皱纹(鱼尾纹、前额、脸颊)、毛孔、深色斑、色素沉着/同质性、质地/粗糙度和紫质的评估。

本研究是在3个时间点对66名对象进行的。对所有对象的VISIA图像进行分析。

本研究的规格如下：

66名对象：活性组33名，安慰剂组33名

2种产品(活性vs安慰剂)

3个时间点：基线、第4周和第12周

左侧、正面和右侧采集

交叉、平行、UV和标准偏振(所有Visia CR模式)

在整个研究过程中，测量和照明系统必须相同。此外，对象还务必在时间点之间很好地重新定位。

鱼尾纹分析

为了评估产品对鱼尾纹的功效，对左侧图像和右侧图像进行了分析。

对各鱼尾纹区域(左侧和右侧)上感兴趣区域进行定义。

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域。

在几张图像上对鱼尾纹提取参数进行研究与优化。

在所有图像上都用优化后的参数提取鱼尾纹。

鱼尾纹参数的提取：可见表面；可见深度；可见体积；以及可见长度。

前额皱纹分析

为了评估产品对前额皱纹的功效，对面部图像进行分析。

对前额区域上感兴趣区域进行定义

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域

在几张图像上对前额皱纹提取参数进行研究与优化

在所有图像上都用优化后的参数提取前额皱纹

前额皱纹参数的提取：可见表面；可见深度；可见体积；以及可见长度。

脸颊细纹分析

为了评估产品对脸颊的功效，对左侧图像和右侧图像进行分析。

对每个脸颊(左和右)上感兴趣区域进行定义。

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域。

在几张图像上对脸颊细纹提取参数进行研究与优化。

在所有图像上都用优化后的参数提取脸颊细纹。

脸颊细线参数的提取：可见表面；可见深度；可见体积；以及可见长度。

颜色和同质性分析

为了评估产品对皮肤颜色和瑕疵的功效，对正面图像、左侧图像和右侧图像进行分析。

选择基线时每张照片脸颊(右轮廓和左轮廓)上的一个区域和前额(正面)上的一个区域。

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域。

比色参数的数据提取：L*、a*、b*、ITA°和IWA°Newtone(增白指数)。

皮肤质地分析

为了评估产品对皮肤粗糙度的功效，对正面图像、左侧图像和右侧图像进行分析。

选择基线时每张照片脸颊(右轮廓和左轮廓)上的一个区域和前额(正面)上的一个区域。

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域。

Haralick提取参数：与皮肤光滑度和质地规则度相关的对比度和熵。

2D粗糙度参数的计算：Spa、Spq和Sdev。

毛孔分析

为了评估毛孔，对面部图像进行分析。

对面部左侧和右侧靠近鼻子的感兴趣区域进行定义。

对每名对象的图像间的区域进行空间配准，以便随时间推移追踪完全相同的区域。

在几张图像上对毛孔提取参数进行研究与优化。

在所有图像上都使用优化后的参数提取毛孔。

所提取区域特征的分析：数量；可见表面；可见深度；以及可见体积。

紫质分析

为了评估紫质，对面部图像上的脸颊上侧(靠近鼻子)进行分析。

对鼻子上且靠近鼻子的一个感兴趣区域进行定义。

对区域进行空间配准，以随时间推移分析相同区域。

紫质检测和分割(segmentation)的参数调整。

在所有图像上都用优化后的参数提取紫质。

对所有分割的图像进行质量控制。

紫质的分析：元素个数、数量及荧光表面。

深色斑分析

为了评估产品对深色斑的功效，对左侧图像和右侧图像进行分析。

选择T0时每名对象2个脸颊上的所有色素斑。

对所有时间点进行色素斑检测和自动分割。

色素斑表面的提取。

色素斑、周围皮肤的颜色(L*、a*、b*、ITA°、IWANewtone°)提取以及色素斑与周围皮肤之间的对比。

服用者感知问卷

对测试材料属性和测试材料的效果的评估，可通过使用后询问受处理对象有关服用者感知和测试材料的功效来确定。通过使用EvaSys或类似工具施行问卷调查，实现确定对象应答比例以评估临床研究群体的一致意见的高效且准确的方法。

综合代谢组

从每名对象中抽取血液，提交给综合代谢组。综合代谢组中包括以下参数：葡萄糖、钙、蛋白质(白蛋白和总蛋白)、电解质(钠、钾、二氧化碳和氯化物)、肾脏检查(血尿素氮和肌酐)以及肝脏检查[碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(也称SGPT)、天冬氨酸氨基转移酶(也称SGOT)和胆红素]。

静脉切开放血术程序按照CRL SOP AC 1.3执行。综合代谢组提供肝和肾功能结果，以确认测试材料在研究期间的安全性。数值超出可接受范围的对象不会被纳入研究或中止研究。

由认证技术人员在基线和第4周抽取血液。样品被送往实验室进行代谢组检查(metabolic panel)。

D-squame带剥离

角质层脱落或堆积成片状被称为脱屑。正常情况下，表皮每25到30天就会完全替换一次，这取决于皮肤部位。角质化过程结束时，角质细胞(Corneocytes)堆积至角质层。角化不全(银屑病)等隐晦状况或脂质和水合丧失(干燥病)导致的异常脱落引起鳞状疹(squamous eruptions)。D-Squame是一种采样装置，直径为22mm，晶莹透明、涂有粘合剂的圆盘。它有一层均匀的医疗级粘合剂，其安全地去除浅表角质细胞并提供对粘附的皮肤细胞最佳的可见性。

带剥离法

从同一部位依次获取一系列剥离带(tape strips)以去除数层角质层。使用D-Squame标准采样盘(圆形22mm粘性盘)进行带剥离。

研究程序：在随机的右脸颊或左脸颊上进行带剥离。将D-Squame标准采样盘施用于随机脸颊，然后连续移走3次，每次使用一片新的带，使用上述方法，在每3个剥离带之后获取TEWL读数。重复上述操作，直至达到20g/m²/hr的TEWL读数。

基线

对象到测试机构报道时，面部清洁，不化妆。照片发布表由对象填写。获得知情同意书。验证纳入和排除标准。对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。

进行以下研究评估：综合代谢组、Cutometer测量、Canfield的VISIA-CR图像和VapoMeter测量。

一名ECRL技术人员用D-squame对随机的脸颊左侧或右侧进行带剥离，直至达到大约20g/m²/hr的TEWL读数。指示对象在带剥离后大约3小时返回实验室。指示对象不要洗脸或对其施加任何产品。

带剥离后3小时(±30分钟)

对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。一名ECRL技术人员获得VapoMeter测量值。

第4周

对象返回测试机构时，面部清洁，不化妆。对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。进行以下研究评估：综合代谢组、Cutometer测量值、Canfield的VISIA-CR图像、VapoMeter测量和服用者感知问卷。

一名ECRL技术人员用D-squame对随机的脸颊左侧或右侧进行带剥离，直至达到大约20g/m²/hr的TEWL读数。指示对象在带剥离后大约3小时返回实验室。指示对象不要洗脸或对其涂抹任何产品。

带剥离后3小时(±30分钟)

对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。一名ECRL技术人员获得VapoMeter测量值。

第8周

对象返回测试机构。

进行以下研究评估：服用者感知问卷。

第12周(最后一次访视)

对象回到测试机构时，面部清洁，不化妆。对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。检查每天的日记以了解研究依从性并将其收集。

进行以下研究评估：Cutometer测量、Canfield的VISIA-CR图像、VapoMeter测量值和服用者感知问卷。

一名ECRL技术人员用D-squame对随机的脸颊左侧或右侧进行带剥离，直至达到大约20g/m²/hr的TEWL读数。指示对象在带剥离后大约3小时返回实验室。指示对象不要洗脸或对其施加任何产品。

带剥离后3小时(±30分钟)

对象适应周围实验室条件大约15分钟(±5分钟)。一名ECRL技术人员获得VapoMeter测量值。

尽管已具体描述了本发明，但本领域技术人员将理解，能够做出多种变型和修改。因此，本发明不应被解释为限于具体描述的实施方式，并且通过参考所附的权利要求，本发明的范围和构思将会更容易理解。

Claims (19)

1.用于治疗有需要的对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素，从而治疗所述对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述施用步骤之前的选择步骤，包括确定所述对象的皮肤的经表皮失水(TEWL)值，其中至少12(gh/m²)的TEWL值指示所述对象适合所述治疗。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述TEWL值是关于所述对象的面部皮肤、前额皮肤、前臂皮肤、手部皮肤、手掌皮肤、腿部皮肤、肘部皮肤或其任意组合来确定的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述皮肤屏障相关疾病是表皮皮肤疾病或障碍。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述皮肤屏障相关疾病的特征在于角质层的改变：脂质含量、氧化状态、布置或其任意组合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述皮肤屏障相关疾病的特征在于含亚油酸酯的酰基神经酰胺的量减少。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述皮肤屏障相关疾病选自：特应性皮炎、银屑病、2型高歇综合征、斯-拉二氏综合征、片层状鱼鳞癣、伴X鱼鳞癣、大疱性鱼鳞癣样红皮病、必需游离脂肪酸缺乏、寻常痤疮、老化干性皮肤、少汗性外胚叶发育异常和特应性湿疹。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述治疗包括减少所述对象的皮肤的：TEWL、毛孔数量、毛孔覆盖的面积、发红程度、发红覆盖的面积、粗糙度或其任意组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述减少是与对照相比减少至少5％。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中组合的所述八氢番茄红素和所述六氢番茄红素与所述ζ胡萝卜素的重量比的范围为15:1(w/w)至2:1(w/w)。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含另外的类胡萝卜素，所述另外的类胡萝卜素选自：番茄红素、β胡萝卜素、γ胡萝卜素及其任意组合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含：量为少于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的番茄红素、量为少于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的β胡萝卜素、量为少于所述组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)的γ胡萝卜素或其组合。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述组合物包含的总类胡萝卜素量为所述组合物的10-15％(w/w)。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含生育酚。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-30％(w/w)的所述生育酚。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含植物甾醇。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的5-15％(w/w)的所述植物甾醇。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用、局部施用或两者。

19.组合物，其包含：量为所述组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的八氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的六氢番茄红素、量为所述组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的ζ胡萝卜素，所述组合物用于治疗有需要的对象中的皮肤屏障相关疾病或障碍。