JP2012139165A - 新規微生物及びそれを用いたリコペンの生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 乾燥菌体重量1gあたり25mg以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物により、前記課題を解決ずる。
【選択図】 なし
Description
TSTT052株を表1に示す培地3mLに植菌し、試験管中、25℃、150rpmで1晩振とう培養を行った。この培養液のうち1mLを1.5mLエッペンドルフチューブに移し、15,000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液(以下緩衝液Aとする)1mLに懸濁し、次いで3mg/mLのN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以下NTGとする)水溶液10μLを加え、30〜60分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Aに再懸濁する操作を2回繰り返してNTGを除去した。さらに、表1に示す培地1mLにこの菌体を懸濁し、試験管中、25℃、150rpmで4〜5時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表2に示す組成の平板培地に塗布して、25℃で1週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうちリコペン生産菌に特有の桃色を呈するコロニーを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
実施例1で選別した変異株を、表1に示す培地3mLに植菌し、試験管中、25℃、150rpmで1晩振とう培養した。次いでこの培養液0.5mLを、100mL容バッフル付三角フラスコに入れた表1に示す培地60mLへ植菌し、25℃、120rpmで6日間振とう培養を行った。培養中は培養液を適宜抜き取り、濁度(OD660nm)、残存グルコース濃度、培地pH、及びカロテノイド生産量を経時的に分析した。カロテノイド生産量の定量は以下のように行った。まず培養液0.8mLを1.5mL容エッペンドルフチューブに移し、15,000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を50μLの純水に懸濁し、次いで550μLのジメチルホルムアミド、及び1000μLのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出した。抽出残渣を15,000rpm、20分間の遠心分離により除去した後、TSKgel−ODS80TMカラム(東ソー社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCとする)で各種カロテノイドを定量した。なお、カロテノイドの分離はA液として純水とメタノールの5:95の混合溶媒、B液としてメタノールとテトラヒドロフランの7:3の混合溶媒を用い、1mL/minの流速で、A液を5分間カラムに通液させた後、同じ流速においてA液からB液へ5分間の直線濃度勾配溶出を行い、さらにB液を5分間通過させることにより行った。カロテノイド濃度は470nmの吸光度をモニターし、既知濃度のリコペン試薬(和光純薬社製)で作成した検量線より濃度を算出した。
実施例1と同様に、2D038株を表1に示す培地3mLに植菌し、試験管中、25℃、150rpmで1晩振とう培養を行った。この培養液のうち1mLを1.5mLエッペンドルフチューブに移し、15,000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を1mLの緩衝液Aに懸濁し、次いで3mg/mLのNTG水溶液10μLを加え、30〜60分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Aに再懸濁する操作を2回繰り返してNTGを除去した。さらに、表1に示す培地1mLにこの菌体を懸濁し、試験管中、25℃、150rpmで4〜5時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表2に示す組成の平板培地に塗布して、25℃で1週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうち桃色の強いものを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
表1に示す培地60mLにLGO3−2株を植菌し、100mLバッフル付三角フラスコ中、25℃、120rpmで1晩振とう培養を行い前々培養とした。次いでこの培養液3mLを、500mL容バッフル付三角フラスコに入れた表5に示す培地100mLへ植菌し、25℃、120rpmで1晩振とう培養を行い前培養とした。次いで、表6に示す培地1.8Lを全容3.0L発酵槽(サクラ精機社製、TFLC−3)に入れ、121℃、20分間で滅菌後、得られた前培養液を90mL植菌し、約140時間培養した。発酵槽の操作は次のようにした。まず、発酵槽の培養温度は28℃、pHは7.0〜7.6とし、pHの調整は10%のアンモニア水溶液を用いた。また発酵槽の攪拌速度は、培養開始時には516rpmとし、培養30時間において540rpmまで上昇させた。培養過程に発生する炭素源不足は、70%グルコースを適宜添加することにより補った。グルコース濃度は、10g/Lで培養を開始し、培養19時間においてグルコースの追加を開始して、0.01g/L〜2.5g/Lとなるように調節した。
Claims (5)
- 乾燥菌体重量1gあたり25mg以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物。
- 前記微生物は、リコペン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、3−ヒドロキシエキネノン、3’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、それらの合計量の95重量%以上をリコペンがしめるカロテノイド類を生産することを特徴とする請求項1の微生物。
- 前記微生物は、菌体乾燥重量で培地1リットルあたり20g以上増殖可能であることを特徴とする、請求項1又は請求項2の微生物。
- 前記微生物は、パラコッカス属微生物TSLGO3−2株(FERM AP−22035)であることを特徴とする、請求項1から3のいずれかに記載の微生物。
- 乾燥菌体重量1gあたり25mg以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物を培養し、菌体からリコペンを回収することを特徴とする、リコペンの製造方法。
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WO2020095881A1 (ja) * | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Jxtgエネルギー株式会社 | カロテノイドの血中滞留増加用組成物 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2007151474A (ja) * | 2005-12-06 | 2007-06-21 | Tosoh Corp | 新規微生物およびそれを用いたリコペンの製造法 |
WO2010044469A1 (ja) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | 新日本石油株式会社 | カロテノイドの発酵法 |
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