KR102414136B1 - 제아잔틴을 생산하는 재조합 야로위아 리폴리티카 및 제아잔틴 생산방법 - Google Patents

제아잔틴을 생산하는 재조합 야로위아 리폴리티카 및 제아잔틴 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주에 crtZ, carB, carRP 유전자를 도입시키고, HMG1, GGS1 유전자를 과발현시키는 대사공학적인 재설계를 하여, 제아잔틴을 높은 수율 및 생산량을 가지고 안정적으로 생산할 수 있는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주 및 그 균주를 이용한 제아잔틴 생산방법에 관한 것이다.

Description

제아잔틴을 생산하는 재조합 야로위아 리폴리티카 및 제아잔틴 생산방법 {Recombinant yarrowia lopolytica for zeaxanthin production and method for the production of zeaxanthin}
본 발명은 제아잔틴을 자연적으로 생산하지 못하는 야로위아 리폴리티카 (yarrowia lopolytica) 균주를 유전적으로 재조합하여, 제아잔틴을 생산할 수 있도록 형질전환한 야로위아 리폴리티카 (yarrowia lopolytica) 균주 및 이 균주를 이용한 제아잔틴 생산방법에 관한 것이다.
노란색을 띠는 카로티노이드의 일종인 제아잔틴은 카로티노이드류 중 하나로, 시력 감퇴의 예방에 좋은 것으로 알려져 있다. 따라서, 식품 및 화장품의 색소 또는 영양제의 원료로서의 산업적 가치가 큰 화합물이다.
기능성 화장품 및 건강보조제 등의 수요 증가에 따라 제아잔틴의 수요는 점점 증가하고 있다. 대량생산을 위해서 메리골드를 포함한 다양한 식물들로부터 추출하여 사용되고 있으나, 추출 수율이 낮은 문제가 있다. 또한, 화학 합성의 방법도 있는데, 이 방법은 인체 섭취 용도로는 사용이 불가하고, 낮은 활성을 가지는 등의 본질적인 문제점을 내재하고 있다.
따라서, 미생물로부터 제아잔틴을 생산하고자 하는 연구가 다방면으로 이루어지고 있다. 하지만, 자연적으로 제아잔틴을 생산하는 미생물들은 유전적으로 다루기 쉽지 않아 대사공학을 통한 생산량 증가 측면에서 불리한 특징을 가지고 있다. 이에, 유전공학적 방법이 적용되는 산업용 미생물을 이용하여 대사경로에 필요한 외래유전자들을 도입시켜 제아잔틴을 생산하고자 하는 대사공학적 시도가 이미 많은 이루어진 바가 있다. 하지만, 아직 산업적으로 요구되는 제아잔틴 생산성을 충족하는 사례가 없다.
한편, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는 유지 효모의 일종인데, 자연적으로는 제아잔틴을 합성할 수는 없다. 하지만, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는 지방을 탄소원으로 사용할 수 있으며, 건조균체중량(dry cell weight)의 90%까지 지방으로 축적할 수도 있고, 카로티노이드류 생산의 필수 대사경로인 메발론산 경로의 전구체 (Acetyl-CoA, NADPH, ATP)가 풍부하며 리코펜(lycopene) 및 베타-카로틴(beta-carotene) 등의 생산에 관한 선행연구가 누적되어 왔기 때문에, 제아잔틴 생산 균주로서 유리한 측면이 많다.
대한민국 등록특허 제10-1848426호(공개일자: 2013.04.24)는 미생물 발효를 이용하여 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 글루콘산의 농도를 낮게 억제하면서도, 제아잔틴의 농도를 높게 하여 생산비용을 절감시킬 수 있는 제아진탄의 생산방법이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1677899호(공개일자: 2016.11.15)는 카로티노이드 과생산능을 갖는 돌연변이주 및 상기 돌연변이주를 이용한 카로티노이드 생산방법에 관한 것으로, 유전자 재조합 및 방사선 조사를 통해 우수한 카로티노이드 생산능을 갖도록 돌연변이된 균주가 기재되어 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 여러 장점이 있는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주를 이용하여 대사공학적인 설계를 통해 제아잔틴을 높은 수율 및 높은 생산성으로로 생산할 수 있는 재조합 균주를 개발하고자 하며, 그 균주를 이용한 제아잔틴 생산방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 피토엔 합성효소 (phytoene synthase) 및 리코펜 고리화효소 (lycopene cyclase)가 발현되도록 carRP 유전자를 도입하고, 피토엔 탈수소효소 (phytoene dehydrogenase)가 발현되도록 carB 유전자를 도입하고, 베타-카로틴 수산화효소 (beta-carotene hydroxylase)가 발현되도록 crtZ 유전자를 도입하여 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 제공한다.
한편, 상기 본 발명의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 있어서, 상기 carRP, carB, crtZ 유전자는 바람직하게 플라스미드에 삽입되서 에피조말(episomal) 상태로 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 형질전환하는 것이 좋다.
한편, 상기 본 발명의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 있어서, 상기 carRP, carB, crtZ 유전자는 바람직하게 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)의 염색체 상에 삽입(integration)되서 형질전환하는 것이 좋다.
한편, 상기 본 발명의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 있어서, 상기 carRP 및 carB 유전자는 바람직하게 뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides)로부터 유래하고, 상기 crtZ 유전자는 판토에아 안아나티스 (Pantoea ananatis)로부터 유래한 것을 사용하는 것이 좋다.
한편, 상기 본 발명의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 있어서, 상기 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는, 바람직하게 추가로 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 자체 보유의 히드록시-메틸글루타릴 보조효소 A (HMG-COA reductase)를 암호화하는 HMG1 유전자 및 제라닐제라닐 2인산염 합성효소 (GGPP synthase)를 암호화하는 GGS1 유전자가 과발현되도록 형질전환되는 것이 좋다.
본 발명은 상기 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 배양하는 것을 특징으로 하는 제아잔틴 생산방법을 제공한다.
한편, 상기 제아잔틴 생산방법에 있어서, 상기 제아잔틴은 바람직하게 오일과 같이 생산하는 것이 좋은데, 이때 제아잔틴은 더욱 바람직하게 오일에 소수성 결합으로 바인딩(binding) 되어 있는 상태로 생산하는 것이 좋다.
한편, 상기 오일과 같이 생산하는 제아잔틴 생산방법에 있어서, 상기 제아잔틴은, 바람직하게 오일과 같이 또는 오일과 소수성 결합되어 있는 상태로 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)로부터 추출 또는 분리되는 것을 특징으로 하는 것이 좋다.
본 발명의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주는 제아잔틴을 높은 수율 및 고 생산량으로 안정적으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 2는 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 3은 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 4는 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 5는 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 6은 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 7은 본 발명에서 이용한 유전자의 서열을 보여준다.
도 8은 본 발명에서 제아잔틴을 생산하기 위해 도입한 대사경로를 모식화해서 보여주는 모식도이다.
도 9는 형질전환하고자 하는 유전자들을 이용하여 본 발명의 재조합 균주를 제작하는 과정을 보여준다.
도 10은 야생형 균주 및 본 발명의 재조합 균주를 배양하며 측정한 OD 측정 결과이다.
도 11는 야생형 균주 및 본 발명 재조합 균주를 이용한 베타-카로틴과 제아잔틴의 생산량을 보여주는 결과이다.
본 발명에서는 대사공학적인 재설계를 통하여 제아잔틴을 안정적으로 생산할 수 있고, 높은 생산량을 발휘하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 개발했다.
야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는 메발론산 경로 (Mevalonate pathway)를 통해 생성된 5 탄소 물질인 이소펜테닐 2인산염 (IPP)과 디메틸알릴 이인산염 (DMAPP)으로부터 20 탄소 물질인 제라닐제라닐 2인산염 (GGPP)를 생산한다. 제라닐제라닐 2인산염 (GGPP)은 피토엔 합성효소(phytoene synthase), 피토엔 탈수소효소 (phytoene dehydrogenase), 리코펜 고리화효소 (lycopene cyclase), 베타-카로틴 수산화효소 (beta-carotene hydroxylase)가 있는 경우 제아잔틴으로 합성이 가능하다.
따라서, 본 발명에서는 피토엔 합성효소 (phytoene synthase) 및 리코펜 고리화효소 (lycopene cyclase)가 발현되도록 carRP 유전자를 도입하고, 피토엔 탈수소효소 (phytoene dehydrogenase)가 발현되도록 carB 유전자를 도입하고, 베타-카로틴 수산화효소 (beta-carotene hydroxylase)가 발현되도록 crtZ 유전자를 도입하여 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 형질전환하였다. 하기 실험예에 따르면, 상기 유전자들이 도입되어 형질전환된 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는 제아잔틴을 생산할 수 있는 것으로 확인되었다. 이때, 상기 유전자들을 이용한 형질전환은 바람직하게 에피조말(episomal) 상태로 하거나, 염색체 상에 삽입(integration)하는 방법을 통해 수행할 수 있다. 이때, 상기 에피조말(episomal) 상태의 형질전환은 목적 유전자를 플라스미드에 삽입하여 호스트 균주의 세포질에 위치시켜 발현시키는 형태를 말한다.
한편, 상기 carRP 및 carB 유전자는 뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides)로부터 유래한 것을 사용하는 것이 좋고, 상기 crtZ 유전자는 판토에아 안아나티스 (Pantoea ananatis)로부터 유래한 것을 사용하는 것이 좋다.
뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides) 유래의 CarRP는 피토엔 신타아제 (phytoene synthase)와 리코펜 시클라아제 (lycopene cyclase)라는 두 가지 기능을 동시에 수행한다. 뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides) 유래의 CarB는 피토엔 탈수소효소 (phytoene dehydrogenase) 역할을 한다. CrtZ는 베타-카로틴(beta-carotene)을 제아잔틴(zeaxanthin)으로 전환하는 반응을 촉진시키는 효소인 베타-카로틴 수산화 효소(beta-carotene hydroxylase) 역할을 수행하는데, 중간산물로 크립토잔틴(cryptoxanthin)을 경유하여 반응이 이루어진다. 이때, CrtZ는 베타-카로틴(beta-carotene)을 제아잔틴(zeaxanthin)으로 전환하는 반응뿐만 아니라 다른 여러 개의 기질을 반응시킬 수 있기에 특이성이 있는 효소의 선택이 중요하다. 본 발명에서는 판토에아 안아나티스 (Pantoea ananatis) 유래의 CrtZ를 사용하는 것이 좋은데, 카탁산틴(cathaxanthin)을 아스타잔틴(astaxanthin)으로 전환하는 반응보다 베타-카로틴(beta-carotene)을 제아잔틴(zeaxanthin)으로 전환하는 반응에 대한 활성이 더 뛰어나 제아잔틴의 생산에 유리함을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 본 발명의 상기 carRP, carB, crtZ 유전자가 도입되어 형질전환된 재조합 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에 추가로 자체 보유의 히드록시-메틸글루타릴 보조효소 A (HMG-COA reductase, HmgR)를 암호화하는 HMG1 유전자 및 제라닐제라닐 2인산염 합성효소 (GGPP synthase)를 암호화하는 GGS1 유전자를 과발현시켜 형질전환시킬 수 있다.
HMG1(YALI0_E04807g) 유전자는 히드록시-메틸글루타릴 보조효소 A (HMG-COA reductase, HmgR)을 코딩하는 유전자이다. GGS1(YALI0_D17050g) 유전자는 제라닐제라닐 2인산염 합성효소 (GGPP synthase)를 코딩하는 유전자이다. 본 발명의 실험에 따를 경우 HMG1 및 GGS1 유전자를 추가로 과발현시킬 경우, 제아잔틴 생산량이 매우 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상기 carRP, carB, crtZ 유전자가 도입되어 형질전환된 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 또는 carRP, carB, crtZ 유전자가 도입되고, Hmg1 및 GGS1 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 배양하는 것을 특징으로 하는 제아잔틴 생산방법을 제공한다. 하기 실험예에 따르면, 본 발명의 상기 균주를 이용할 경우 높은 제아잔틴 생산량을 확인할 수 있다.
한편, 상기 제아잔틴 생산방법에 있어서, 상기 제아잔틴은 바람직하게 오일과 같이 생산하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게 오일에 소수성 결합으로 바인딩(binding) 되어 있는 상태로 생산될 수 있다.
본 발명에서 이용하는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는 유지 효모 (oleaginous yeast)로 균체 내에 오일을 생산하는 것으로 널리 알려져 있다. 따라서, 하기 화학식 1의 구조에서 보듯이 소수성 부분을 길게 갖는 제아잔틴은 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 내에 존재하는 오일과 결합할 수 있는 것이다. 즉 균체 내에서 생산된 제아잔틴은 오일과 소수성 결합으로 바인딩(binding)한 상태로 균체 내에 존재하게 되는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112021122984216-pat00001
한편, 오일과 제아잔틴이 소수성 결합을 형성하는 경우 제아잔틴은 균체 외부로 배출되지 않게 된다. 따라서, 제아잔틴을 회수하기 위해서는 일 예로 균체를 파쇄해야 하는데, 제아잔틴은 오일과 같이 또는 오일과 소수성 결합되어 있는 상태로 균체로 추출 또는 분리된다. 오일과 같이 결합되어 있는 제아잔틴은 통상적으로 오일을 분리해 내는 방법을 사용하여 오일과 결합된 형태로 분리 또는 추출될 수 있다. 분리 또는 추출 측면에서는 오일과 결합되어 있는 형태가 오일과 결합되지 않는 것보다 더 유리할 수도 있다. 이렇게 오일과 결합된 제아잔틴은 오일로부터 순수하게 분리해서 사용할 수도 있고, 오일과 같이 결합된 상태로도 활용할 수 있다. 오일과 같이 결합된 상태로 활용되는 일 예로는 화장품 등의 원료로 사용하는 것이 있다.
한편, 상기 carRP 유전자는 바람직하게 PTEFin 프로모터를 가지고, TCYC1 양방향 터미네이터를 역방향으로 가지도록 발현시스템을 구축하는 것이 좋다. 상기 carB 유전자는 바람직하게 PILV5 프로모터를 가지고, TPEX16 터미네이터를 가지도록 발현시스템을 구축하는 것이 좋다. 상기 crtZ 유전자는 PTDH1 프로모터를 가지고, TMIG1 터미네이터를 가지도록 발현시스템을 구축하는 것이 좋다. 상기 HMG1 유전자는 PGPM1 프로모터를 가지고, TXPR2 터미네이터를 가지도록 발현시스템을 구축하는 것이 좋다. 상기 GGS1 유전자는 PEXP1 프로모터를 가지고, TLIP2 터미네이터를 가지도록 발현시스템을 구축하는 것이 좋다. 하기 실험예에 따르면, 상기와 같이 프로모터 및 터미네이터를 구축한 경우 높은 제아잔틴 생산량을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예, 제조예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 균주를 하기 표 1, 플라스미드를 하기 표 2, 프라이머를 하기 표 3 및 표 4, 유전자를 하기 표 5에 나타내었다.
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 균주
균주이름 관련특징 출처
E. coli
Mach-T1R E. coliF- 80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74 hsdR(rK-mK+)ΔrecA1398 endA1 tonA Invitrogen
NEB® C2925I ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm-6 hisG4 rfbD1 R(zgb210::Tn10) TetS endA1 rspL136 (StrR) dam13::Tn9 (CamR) xylA-5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2 NEB
NEB® C3019 Δ(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ΔlacX74 galK16 galE15 e14- φ80dlacZΔM15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) NEB
Y. lipolytica
PO1g ku70Δ PO1g ku70Δ::loxP 선행연구
CH1201 PO1g ku70Δ, AXP::carRP-carB-crtZ 본 발명
CH1202 PO1g ku70Δ, AXP::carRP-carB-crtZ, A08::hmg1-ggs1 본 발명
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 플라스미드
플라스미드 이름 관련특징 출처
pLEUyl CEN1-1, LEU2, Ori1001, AmpR, ColE1 본 발명
pLEUyl-carRP pLEUyl, PTEFin-carRP-TCYC1t(rev) 본 발명
pLEUyl-carRP-carB pLEUyl-carRP, PTEFin-carB-TCYC1t(rev) 본 발명
pZEX1 pLEUyl, PTEFin-carRP-TCYC1t(rev)-PTEFin-carB-TCYC1t(rev)-PTEFin-crtZ-TCYC1t(rev) 본 발명
pZEX2 pLEUyl, PTEFin-carRP-TCYC1t(rev)-PILV5-carB-TPEX16-PTDH1-crtZ-TMIG1 본 발명
pMD19(simple) lacZ, AmpR, pBR322 TARAKA
TA-PILV5 pMD19, PILV5 본 발명
TA-PILV5-carB-TPEX16 pMD19, PILV5-carB-TPEX16 본 발명
pLEUyl-carRP-carB(ver2) pLEUyl-carRP, PILV5-carB-TPEX16 본 발명
pZEX2-HMG1-GGS1 pZEX2, PGPM1-HMG1-TXPR2-PEXP1-GGS1-TLIP2 본 발명
pCRISPRyl PUAS1B8-TEF(136)-Cas9-TCYC, PSCR1-tRNA-sgRNA, CEN1-1, Ori1001, LEU2, AmpR, ColE1 Addgene #70007
pCRISPRyl-AXP AXP sgRNA cloned into pCRISPRyl 본 발명
pCRISPRyl-A08 A08 sgRNA cloned into pCRISPRyl 본 발명
pHR-AXP-hrGFP 1kb_AXP_up-PUAS1B8-TEF(136)-hrGFP-TCYC-1kb_AXP_down, CEN1, Ori1001, URA3, AmpR, ColE1 Addgene #84613
pDonor-AXP-module1 AXPup-PTEFin-carRP-TCYC1(rev)-PILV5-carB-TPEX16-PTDH1-crtZ-TMIG1-AXPdw, AmpR, ColE1 본 발명
pDonor-A08-module2 A08up-PGPM1-HMG1-TXPR2-PEXP1-GGS1-TLIP2-A08dw, AmpR, ColE1 본 발명
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 프라이머 및 프라이머 서열
프라이머 이름 서열 서열번호
For cloning replicative vectors
SalI-AO-F AGGGTCGACCTTTTCGGGGAAATGTGTGC 서열번호 1
NheI-AO-R TCCGCTAGCACAGAATCAGGGGATAACGC 서열번호 2
ClaI-CLO-F2 GCTATCGATTTCCTTGGTACCTTCGAACC 서열번호 3
SalI-CLO-R AGGGTCGACAAATAGGCGTATCACGAGGC 서열번호 4
AvrII-TEFin-F2 AGGCCTAGGTGAGGGCGTCTGGAAGTCGA 서열번호 5
TEFin-R2 CTGCGGTTAGTACTGCAAAAAGTGC 서열번호 6
RV CAGGAAACAGCTATGAC 서열번호 7
ClaI-NheI-terminator-R AGGATCGATCGTGTTAGCTAAAGGTGTAAGCTAGCCTCATG 서열번호 8
TEFin-caRP-F CACGTCATCCGACCAGCACTTTTTGCAGTACTAACCGCAGCTGCTGACCTACATGGAG 서열번호 9
TEFin-carB-F CACGTCATCCGACCAGCACTTTTTGCAGTACTAACCGCAGTCTAAGAAGCACATCGTG 서열번호 10
TEFin-crtZ-F CACGTCATCCGACCAGCACTTTTTGCAGTACTAACCGCAGCTGTGGATCTGGAACGCCCTGATCG 서열번호 11
Terminator-carRP-R2 TTTGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTAGATGGTGTTCAGGTTTCGCA 서열번호 12
Terminator-carB-R2 TTTGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTAGATCACGTTAGAGTTGTGCAC 서열번호 13
Terminator-crtZ-R2 TTTGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTACTTGCCAGAAGCAGGC 서열번호 14
AvrII-ILV5p-F3 AGGCCTAGGTCCGAGGAGCTTAGAGTG 서열번호 15
ClaI-SpeI-ILV5p-R AGAATCGATCTTAATTCATATCACGCGACACTAGTTACTGTGGTGTTGTGTTGG 서열번호 16
ILV5p-SpeI-carB-F CCAATCCCCCCCAACACAACACCACAGTAACTAGTATGTCTAAGAAGCACATCGTG 서열번호 17
PEX16t-carB-R TAACCCATGTGTGTGTTTCCAATCATCAATCGCTTTTAGATCACGTTAGAGTTGTGCAC 서열번호 18
PEX16t-F AAGCGATTGATGATTGGAAACAC 서열번호 19
ClaI-NheI-PEX16t-R GAAATCGATTTACACCTTTAGCTAACACGGCTAGCATGTCCGACGGACCAAG 서열번호 20
AvrII-TDH1p-F AGGCCTAGGGACGCAGTAGGATGTCCTG 서열번호 21
BglII-TDH1p-R AGATCTTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAG 서열번호 22
TDH1p-BglII-crtZ-F TTCATTCTTGAATTAAACACACATCAACAAGATCTATGCTGTGGATCTGGAACG 서열번호 23
mig1t-crtZ-R TGAGCTCAGCACGTTAAATTATCGACCGGCCAGTGTTACTTGCCAGAAGCAGGC 서열번호 24
mig1t-F CACTGGCCGGTCGATAATTTAAC 서열번호 25
XmaI-NheI-mig1t-R GAACCCGGGTTACACCTTTAGCTAACACGGCTAGCAAACCCAAAAGGGCCGAAG 서열번호 26
pZEX2-AflII-GPM1p-F ACATAGCGGCCGCTTCGACTCTTAAGCTCGTTCTCAAGCTCTTGTC 서열번호 27
GPM1p(full)-R TTTTGTATGTGTTTTGGTGATGTC 서열번호 28
GPM1p(full)-HMG1-F TGACATCACCAAAACACATACAAAAATGCTACAAGCAGCTATTGGAAAG 서열번호 29
XPR2t-HMG1-R GTAGGAGGCAAGACCGGCAACGTGGGGACAGGCCATGGAGCTATGACCGTATGCAAATATTCG 서열번호 30
XPR2t-F CTCCATGGCCTGTCCCCAC 서열번호 31
EXP1p-Bsu36I-XPR2t-R TAACACCCCACCTTAGGGAATTCGGACACGGGCATC 서열번호 32
XPR2t-Bsu36I-EXP1p-F GTCCGAATTCCCTAAGGTGGGGTGTTAGTGTGGGAC 서열번호 33
EXP1p-R TGCTGTAGATATGTCTTGTGTG 서열번호 34
EXP1p-GGS1-F ACCACCCCAACCCCCTTACACACAAGACATATCTACAGCAATGGATTATAACAGCGCGG 서열번호 35
LIP2t-GGS1-R TAGTTGAGGTAGAAGTTGTAAAGAGTGATAAATAGCTTATCACTGCGCATCCTCAAAG 서열번호 36
LIP2t-F TAAGCTATTTATCACTCTTTAC 서열번호 37
pZEX1-AflII-LIP2t-R TATCACGAGGCCCAGATCCTCTTAAGCCTCCACCTGTGTCAATCT 서열번호 38
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 프라이머 및 프라이머 서열
프라이머 이름 서열 서열번호
For cloning CRISPR/cas9 sgRNA expression vectors and donor template vectors
AvrII-AXPsgRNA-FR2-F AGGCCTAGGGACCAGGTCGAAGTAGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 서열번호 39
NdeI-FR2-R AGGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGC 서열번호 40
A08_gRNA1 GATTCCGGGTCGGCGCAGGTTGACGAGTACGGCATTGATTCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT 서열번호 41
AmpR-pUC-F GGTGCCTTTCCATAGGCTCC 서열번호 42
AmpR-pUC-R CTTTTCGGGGAAATGTGCGC 서열번호 43
NB_AXPup-F TAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGCCCGGGGAACGGCACCAGCTGGTTAATG 서열번호 44
NB_AXPup-R ACACAAATACGCCGCCAACCCGGTCTCTGGTCGACTACTTCGACCTGGTCCTCAG 서열번호 45
NB_AXPdw-F TCGGCCCAGCCTTCGGCCCTTTTGGGTTTGCTAGCAAAAGTGGTTGTACCAGAAAAC 서열번호 46
NB_AXPdw-R TCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAGGCACCCCCGGGAATTGCATCCAACAATGTTGAAC 서열번호 47
NB_A08up-F2 GTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTTAATTAATGCATAAAACCCGCATACACG 서열번호 48
NB_A08up-R TGGAGCTGTTTGACAGAGCTTGAGAACGAGTCTAGAAATCAATGCCGTACTCGGCTC 서열번호 49
NB_A08dw-F CAGCTTGAGAAGATTGACACAGGTGGAGGCTTAAGCTTCTTTGCTCTCGAGACCCAG 서열번호 50
NB_A08dw-R2 GGGGCGGAGCCTATGGAAAGGCACCTTAATTAACAACGGAACGCACTTCCGTAC 서열번호 51
본 발명의 실시예 및 실험예에서 이용한 유전자 및 유전자 서열
유전자 이름 서열 서열번호
carRP (codon optimized) 도 1 서열번호 52
carB (codon optimized) 도 2 서열번호 53
crtZ (codon optimized) 도 3 서열번호 54
PTEFin 도 3 서열번호 55
TCYC1t(rev) 도 3 서열번호 56
PILV5 도 4 서열번호 57
TPEX16 도 4 서열번호 58
PTDH1 도 5 서열번호 59
TMIG1 도 5 서열번호 60
PGPM1 도 6 서열번호 61
TXPR2 도 6 서열번호 62
PEXP1 도 7 서열번호 63
TLIP2 도 7 서열번호 64
[실시예 1: 재조합 균주 제작]
1)개요
본 실시예에서는 제아잔틴을 생산할 수 없는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 carRP, carB 및 crtZ 유전자를 도입하고, HMG1 및 GGS1 유전자를 과발현시켜 제아잔틴 생산량이 높은 재조합 균주를 제작하고자 했다. 상기 유전자들이 제아잔틴 합성경로에서 작용하는 모식도를 도 8에 나타내었다. 상기 유전자들을 이용하여 본 발명의 재조합 균주를 제작하는 과정을 도 9에 나타내었다.
2) carRP, carB 및 crtZ 유전자 도입 및 HMG1 및 GGS1 유전자 과발현을 위한 DNA 준비
뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides) 유래의 carRP(AJ250827.1)과 carB(AJ238028.1) 유전자를 NCBI에서 확보 후 인트론(intron)을 제외한 엑손(exon) 서열만으로 코딩서열(CDS)을 확보했다. 그리고 판토에아 안아나티스 (Pantoea ananatis) 유래의 crtZ(PANA_4163 in CP001875) 유전자 서열을 NCBI로부터 가져왔다. 각 유전자들을 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) codon usage table (kazusa.or.jp/codon/)을 참고해 OPTIMIZER로 코돈최적화(codon optimization) 후 반복서열 및 GC 함량을 줄이기 위해 수정을 거쳐 합성했다 (gBlocks, Integrated DNA Technologies).
한편, pCRISPRyl 벡터로부터 CEN1-1, LEU2 및 ORI1001을 포함한 fragment 1과 AmpR 및 colE1 origin을 포함한 fragment 2를 PCR 증폭한 뒤 SalI 제한효소를 처리한 뒤 ligation을 진행하고 PCR 증폭했다. 그 후 blunt-end ligation을 통해 공벡터 pLEUyl으로 클로닝했다.
한편, pCRISPRyl 벡터로부터 TCYC1t(rev)를, Yarrowia lipolytica의 게놈으로부터는 PTEFin을 PCR 증폭했다. 각 DNA 조각들을 overlap-extension PCR (OE-PCR)을 통해 PTEFin-carRP-TCYC1t(rev), PTEFin-carB-TCYC1t(rev), PTEFin-crtZ-TCYC1t(rev) cassette들을 제작했다.
한편, PTEFin-carRP-TCYC1t(rev) cassette을 AvrII 및 ClaI 제한효소 처리하고 탈메틸화된 상태에서 NheI 및 ClaI 처리된 pLEUyl과 ligation해 pLEUyl-carRP를 제작했다. 이 벡터로 C2925I를 형질전환하고 탈메틸화(demethylation)된 상태로 확보해 다시 NheI 및 ClaI 제한효소 처리했고, AvrII 및 ClaI 처리된 PTEFin-carB-TCYC1t(rev) cassette과 ligation해 pLEUyl-carRP-carB를 확보했다. 해당 벡터를 다시 C2925I에 형질전환 후, 상기와 마찬가지 방법으로 PTEFin-crtZ-TCYC1t(rev) casstte을 클로닝해 pZEX1을 제작했다.
한편, PILV5, TPEX16, PTDH1, TMIG1 유전자를 Yarrowia lipolytica의 게놈 에서부터 PCR 증폭했고, OE-PCR을 통해 carB-TPEX16과 PTDH1-crtZ-TMIG1 cassette을 제작했다.
한편, PILV5를 pMD19(simple)에 TA-ligation 한 뒤 C2925I를 형질전환해 탈메틸화된 TA-PILV5를 제작했다. TA-PILV5 벡터와 carB-TPEX16을 ClaI 및 SpeI 제한효소 처리한 후, ligation해서 TA-PILV5-carB-TPEX16을 확보했다. 이후 TA-PILV5-carB-TPEX16을 AvrII 및 ClaI 제한효소 처리하여 PILV5-carB-TPEX16을 확보했다.
한편, NheI 및 ClaI 제한효소 처리된 탈메틸화 pLEUyl-carRP와 PILV5-carB-TPEX16을 ligation해 pLEUyl-carRP-carB를 클로닝했다. 해당 벡터를 NheI 및 XmaI 제한효소 처리하고 PTDH1-crtZ-TMIG1를 AvrII 및 XmaI 처리한 뒤 ligation해 pZEX2를 제작했다.
PGPM1, HMG1, TXPR2, PEXP1, GGS1, TLIP2 유전자를 Yarrowia lipolytica의 게놈으로부터 PCR 증폭했고 OE-PCR를 통해 PGPM1-HMG1-TXPR2 및 PEXP1-GGS1-TLIP2 cassette을 제작했다. 제작된 cassette을 PCR 증폭하고, XbaI 제한효소 처리한 pZEX2 벡터와 NEBuilder assembly해 C3019H에 형질전환함으로써 pZEX2-HMG1-GGS1을 제작했다.
한편, pCRISPRyl 벡터를 AvrII 및 NdeI 제한효소 처리하여 fragment 1 (8568 bp) 확보하였다. 또한, pCRISPRyl 벡터를 template으로 증폭한 fragment 2 (AvrII-AXPsgRNA-FR2-F/NdeI-FR2-R)도 AvrII 및 NdeI 제한효소 처리 후, 두 fragment를 ligation해 pCRISPRyl-AXP를 완성했다. 또한, pCRISPRyl 벡터를 AvrII 제한효소 처리한 뒤 A08_gRNA1 oligo와 NEBuilder assembly해 pCRISPRyl-A08을 제작했다.
AXPup, AXPdw 및 AmpR-pUC를 pHR-AXP-hrGFP로부터 PCR 증폭했고, pZEX2를 SalI 및 NheI 제한효소 처리하여 module1(PTEFin-carRP-TCYC1(rev)-PILV5-carB-TPEX16-PTDH1-crtZ-TMIG1)을 확보하였다. 확보한 DNA 조각들을 NEBuilder assembly해 pDonor-AXP-module1을 제작했다.
A08up 및 A08dw를 Yarrowia lipolytica의 게놈으로부터 PCR 증폭했고, module2(PGPM1-HMG1-TXPR2-PEXP1-GGS1-TLIP2)는 pZEX2-HMG1-GGS1을 AflII 제한효소를 처리해 분리 확보했다. 확보한 DNA 조각들을 AmpR-pUC와 Gibson assembly해 pDonor-A08-module2를 제작했다.
3) 재조합 균주 제작
CRISPR-cas9을 이용해 게놈에 상기 유전자 cassette들을 상동적 재조합 방법으로 형질전환해 재조합 균주를 제작하였다. pCRISPRyl-AXP와 XmaI으로 자른 pDonor-AXP-module1을 PO1g ku70Δ에 One-step 형질전환 방법을 사용하여 CH1201 균주를 제작하였고, pCRISPRyl-A08과 PacI으로 자른 pDonor-A08-module2을 CH1201에 추가로 형질전환하여 CH1202 균주를 제작했다.
잘 도입이 되었는지 확인을 하기 위해 CH1201 및 CH1202 균주에 대하여 yeast synthetic complete (YSC)-LEU 배지에서 30℃로 배양했다. 색이 진한 콜로니를 1차 선별 후 colony PCR로 AXP locus로 carRP-carB-crtZ가 도입되었는지 확인했다. 펩톤한천배지(YPD)에서 배양해서 pCRISPRyl-AXP 벡터를 curing 하였으며 소량 추출해 펩톤한천배지(YPD) 및 YSC-LEU 배지 플레이트에 스트리킹을 했다. YSC-LEU 플레이트에서 콜로니가 자라지 않는 것이 확인되면, 콜로니를 펩톤한천배지(YPD) 플레이트에 접종하고, GeneAll EXgene cell SV kit를 사용해 유전체 DNA(gDNA)를 추출했다. gDNA를 기반으로 Sanger sequencing을 진행해 게놈에 도입된 서열을 확인함으로써 CH1201 및 CH1202 균주가 잘 제작이 되었는지 확인할 수 있었다.
[실험예 1: 야생형 및 재조합 균주 CH1201 및 CH1202의 제아잔틴 생산량 비교]
야생형 균주 PO1g ku70Δ 와 재조합 균주 CH1201 및 CH1202의 콜로니를 5 mL 펩톤한천배지(YPD)에 접종 후, 배양기에서 30℃, 250 rpm으로 배양을 진행했다. 300 mL 플라스크에 25 mL 펩톤한천배지(YPD)를 넣고, 상기 배양한 균주를 초기 OD(OD600)가 0.2가 되도록 계대배양 후, 배양기에서 30℃, 250 rpm으로 배양했다. 24 시간마다 배양액의 OD를 측정하였고, 이를 도 10에 나타내었다. 72시간 배양 후에는 일정량의 배양액을 회수해 원심분리하여 세포 펠렛을 얻어 냈다. 펠렛을 700 uL DMSO로 재현탁 후 55°C에서 10분 배양하였다. 700 uL 아세톤을 넣고 45℃에서 15분 배양하였다. 원심분리기 13,000 g에서 5분동안 처리한 뒤 상층액을 카로테노이드 추출물로서 확보했다. 펠렛에 색이 남아 있을 경우, 다시 반복하여 추출했다. 추출한 샘플 및 카로테노이드 스탠다드 물질(리코펜, 베타-카로틴, 제아잔틴)을 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 컬럼(150 mm x 4.6 mm, 4 μm, Agilent)과 variable wavelength detector (VWD)가 장착된 High-pressure liquid chromatography(HPLC)로 정량 분석했다. 분석 조건으로는 65:35 부피 비율의 아세톤니트릴-메탄올(aetonitrile-methanol)을 이동상으로 사용해 25℃에서 1.0 mL/min 유속으로 진행했다. 배양과 분석 모두 3회 반복 수행하였고, 이를 도 11에 나타내었다. 이를 통해, 야생형인 PO1g ku70Δ 균주는 베타-카로틴과 제아잔틴을 생산하지 못했으나, CH1201은 40.0±4.6 mg/L의 베타-카로틴과 3.3±0.6 mg/L의 제아잔틴을 생산하는 것을 볼 수 있었다. 또한, CH1202는 359.5±83.9 mg/L의 베타-카로틴과 16.2±6.7 mg/L의 제아잔틴을 생산함으로써 CH1201 대비 생산 증가량을 확인하였다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Recombinant yarrowia lopolytica for zeaxanthin production and method for the production of zeaxanthin <130> YP-21-111 <160> 64 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SalI-AO-F <400> 1 agggtcgacc ttttcgggga aatgtgtgc 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NheI-AO-R <400> 2 tccgctagca cagaatcagg ggataacgc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI-CLO-F2 <400> 3 gctatcgatt tccttggtac cttcgaacc 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SalI-CLO-R <400> 4 agggtcgaca aataggcgta tcacgaggc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvrII-TEFin-F2 <400> 5 aggcctaggt gagggcgtct ggaagtcga 29 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFin-R2 <400> 6 ctgcggttag tactgcaaaa agtgc 25 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RV <400> 7 caggaaacag ctatgac 17 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI-NheI-terminator-R <400> 8 aggatcgatc gtgttagcta aaggtgtaag ctagcctcat g 41 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFin-caRP-F <400> 9 cacgtcatcc gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag ctgctgacct acatggag 58 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFin-carB-F <400> 10 cacgtcatcc gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag tctaagaagc acatcgtg 58 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFin-crtZ-F <400> 11 cacgtcatcc gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag ctgtggatct ggaacgccct 60 gatcg 65 <210> 12 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator-carRP-R2 <400> 12 tttgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg ttagatggtg ttcaggtttc 60 gca 63 <210> 13 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator-carB-R2 <400> 13 tttgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg ttagatcacg ttagagttgt 60 gcac 64 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator-crtZ-R2 <400> 14 tttgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg ttacttgcca gaagcaggc 59 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvrII-ILV5p-F3 <400> 15 aggcctaggt ccgaggagct tagagtg 27 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI-SpeI-ILV5p-R <400> 16 agaatcgatc ttaattcata tcacgcgaca ctagttactg tggtgttgtg ttgg 54 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ILV5p-SpeI-carB-F <400> 17 ccaatccccc ccaacacaac accacagtaa ctagtatgtc taagaagcac atcgtg 56 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEX16t-carB-R <400> 18 taacccatgt gtgtgtttcc aatcatcaat cgcttttaga tcacgttaga gttgtgcac 59 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEX16t-F <400> 19 aagcgattga tgattggaaa cac 23 <210> 20 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI-NheI-PEX16t-R <400> 20 gaaatcgatt tacaccttta gctaacacgg ctagcatgtc cgacggacca ag 52 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cctcccaacc acactcactt ttttgcccgt 960 cttcccttgc taacacaaaa gtcaagaaca caaacaacca ccccaacccc cttacacaca 1020 agacatatct acagca 1036 <210> 64 <211> 205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLIP2 <400> 64 taagctattt atcactcttt acaacttcta cctcaactat ctactttaat aaatgaatat 60 cgtttattct ctatgattac tgtatatgcg ttcctctaag acaaatcgaa accagcatgc 120 gatcgaatgg catacaaaag tttcttccga agttgatcaa tgtcctgata gtcaggcagc 180 ttgagaagat tgacacaggt ggagg 205

Claims (9)

  1. 피토엔 합성효소 (phytoene synthase) 및 리코펜 고리화효소 (lycopene cyclase)가 발현되도록 carRP 유전자를 도입하고,
    피토엔 탈수소효소 (phytoene dehydrogenase)가 발현되도록 carB 유전자를 도입하며,
    베타-카로틴 수산화효소 (beta-carotene hydroxylase)가 발현되도록 crtZ 유전자를 도입하여 형질전환 하되,
    상기 carRP 유전자는, PTEFin 프로모터를 가지고, TCYC1 양방향 터미네이터를 역방향으로 가진 상태로 도입하고,
    상기 carB 유전자는, PILV5 프로모터를 가지고, TPEX16 터미네이터를 가진 상태로 도입하며,
    상기 crtZ 유전자는, PTDH1 프로모터를 가지고, TMIG1 터미네이터를 가진 상태로 도입한 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 carRP, carB, crtZ 유전자는,
    플라스미드에 삽입되서 에피조말(episomal) 상태로 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 형질전환한 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 carRP, carB, crtZ 유전자는,
    야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)의 염색체 상에 삽입(integration)되어 형질전환한 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 carRP 및 carB 유전자는 뮤코 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides)로부터 유래하고,
    상기 crtZ 유전자는 판토에아 안아나티스 (Pantoea ananatis)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)는,
    추가로 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 자체 보유의 히드록시-메틸글루타릴 보조효소 A (HMG-COA reductase)를 암호화하는 HMG1 유전자 및 제라닐제라닐 2인산염 합성효소 (GGPP synthase)를 암호화하는 GGS1 유전자가 과발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica).
  6. 제1항 또는 제5항의 재조합 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)를 배양하는 것을 특징으로 하는 제아잔틴의 생산방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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