KR101848420B1

KR101848420B1 - 발효에 의한 아스탁산틴 제조방법

Info

Publication number: KR101848420B1
Application number: KR1020127026736A
Authority: KR
Inventors: 카즈아키 히라사와; 히로시 사토; 히사시 요네다; 테츠히사 야타; 미츠토시 아즈마
Original assignee: 제이엑스티지 에네루기 가부시키가이샤
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2018-04-12
Also published as: CA2793052A1; JP2011188795A; US20170029862A1; RU2012143727A; AU2011228185B2; JP5762691B2; EP2548968A1; AU2011228185C1; US9605323B2; KR20130049774A; CA2793052C; US10240215B2; AU2011228185A1; EP2548968A4; WO2011115099A1; RU2593951C2; EP2548968B1; CN102933718B; CL2012002554A1; NZ602927A

Abstract

본 발명의 목적은 칸탁산틴의 생성을 억제하면서 높은 농도의 아스탁산틴을 미생물학적으로 낮은 가격에서 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상세하게는, 본 발명은 배지에서 배양 완료 후의 배양 생성물 내 생성된 아스탁산틴 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 바이오틴-없는 배지에서 배양 완료 후의 배양 생성물 내 농도보다 낮은 것을 특징으로 하는, 바이오틴 함유 배지에서 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는 아스탁산틴을 함유한 카로테노이드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 아스탁산틴 제조방법{METHOD OF PRODUCING ASTAXANTHIN BY FERMENTATION}

본 발명은 미생물 발효에 의해서 아스탁산틴을 포함한 카로테노이드(carotenoids)의 제조방법에 관한 것이다.

카로테노이드는 사료 첨가제(feed additives), 식품 첨가제(food additives), 약제(pharmaceutical agents), 등등으로서 유용한 천연 색소이다. 카로테노이드의 예로서 아스탁산틴(astaxanthin), 칸탁산틴(canthaxanthin), 제악산틴(zeaxanthin), 베타-크립톡산틴(β-cryptoxanthin), 리코펜(lycopene), 베타-카로틴(β-carotin), 포에니콕산틴(phoenicoxanthin), 아도닉산틴(adonixanthin), 에키네논(echinenone), 아스테로이데논(asteroidenone), 및 3-하이드록시에키네논(3-hydroxyechinenone)이 포함된다.

카로테노이드 중에서 아스탁산틴은 사료첨가제로서 유용한데, 예로서 연어(salmon), 송어(trout), 도미(sea bream) 등 양식 어류를 위한 신체 색채-개선제(body color-improving agnet)로서 또는 가금(사육조류, poultry)을 위한 난황 색채 개선제(egg yolk color-improving agent)로서 이용된다. 또한, 아스탁산틴은 산업계에서 안전한 천연 식품 첨가제와 건강 식품 재료(health food materials)로서 높은 가치가 있다.

아스탁산틴과 유사하게, 아도닉산틴(adonixanthin)과 포에니콕산틴(phoenicoxanthin)도 이의 산업 제조방법이 정립된 이후, 사료 첨가제, 식품 첨가제, 약제 등등으로서 사용될 것으로 예상된다. 또한, 베타-카로틴은 사료 첨가제, 식품 첨가제, 약제, 등등으로 사용되며; 칸탁산틴(canthaxanthin)은 사료 첨가제, 식품 첨가제, 화장품으로 사용되며; 제악산틴(zeaxanthin)은 식품 첨가제, 사료 첨가제 등등으로 사용되고 있다. 이외에 리코펜(lycopene), 에키네논(echinenone), 베타-크립톡산틴(β-cryptoxanthin), 3-하이드록시에키네논(3-hydroxyechinenone) 및 아스테로이데논(asteroidenone) 같은 다른 카로테노이드 역시 사료 첨가제, 식품 재료, 등등으로 사용될 것으로 예상된다. 이들 카로테노이드 제조방법으로서 알려진 것에는 화학적 합성방법, 천연 자원으로부터 추출방법, 및 미생물을 이용한 제조방법이 포함된다.

아스탁산틴의 화학적 합성방법으로서, 베타-카로틴의 전환을 이용하는 방법(비특허문헌 1)과 C15포스포니움 염으로부터의 합성사용 방법(비특허 문헌2)이 알려져 있다. 이러한 화학적 합성방법으로 제조된 아스탁산틴은 사료 첨가제로 시판되고 있다. 또한 아스탁산틴은 도미와 연어 같은 어류에서도, 새우, 게, 크릴 새우 같은 갑각류에서도 존재하기 때문에 그로부터 추출할 수도 있다.

미생물을 사용하는 아스탁산틴 제조방법으로서 보고된 것에는 녹조류 해마토코커스 플르비알리스(green alga Haematococcus pluvialis)를 이용한 배양방법, 적효모균 파피아 로도지마(red yeast Phaffia rhodozyma)를 이용한 배양방법, 파라코커스 속(genus Paracoccus(이하 "파라코커스 박테리움(Paracoccus baterium)"으로 명명함)에 속하는 박테리아를 이용한 배양방법들이 포함된다.

아스탁산틴을 제조하는 파라코커스 박테리아의 예로서 균주 E-396 과 A-581-1가 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 3). 다른 아스탁산틴을 제조하는 파라코커스 박테리아의 예로서 파라코커스 마구시 균주 MH1(Paracoccus marcusii strain MH 1)(특허문헌 4), 파라코커스 해운대엔시스 균주 BC 74171(Paracoccus haeundaensis BC 74171(특허문헌 4), 파라코커스 박테리아 균주 N-81106(Paracoccus bacterial strain N-81106)(특허문헌 5) 및 파라코커스 속 균주 PC-1(Paracoccus sp. strain PC-1(특허문헌 6)들이 포함된다.

상기 카로테노이드 제조방법에 연관되어 몇몇 문제점들이 있다. 예로써, 화학적 합성방법은 안전성의 관점에서 소비자에게 바람직하지 못한 인상을 준다. 새우와 게같은 천연 자원으로부터의 추출방법은 고가의 제조비용이 관련된다.

또한, 녹조류 또는 효모를 이용하는 제조방법은 생산성이 낮고, 그로부터 카로테노이드를 추출하는 것은 녹조 또는 효모의 강한 세포벽 때문에 어렵다.

한편, 파라코커스 속에 속하는 박테리아는, 그 증식 속도가 빠르고, 그 카로테노이드 생산성이 높으며, 카로테노이드를 그로부터 쉽게 추출 할 수 있다는 등의 장점을 가진다.

이러한 박테리아를 배양하는 몇몇 방법이 보고되고 있다. 예를 들면 특허문헌 7은 배양중에 철염(iron salt)의 첨가를 특징으로 하는 방법을 밝히고 있다. 특허문헌 8은 탄소원 농도(carbon source concentration)의 한정을 특징으로 하는 방법을 밝히고 있다. 그러나 이러한 배양방법은 아스탁산틴의 제조과정에서 다량의 칸탁산틴이 축적된다는 점에서 문제가 있다.

칸탁산틴은 연어고기(salmon meat) 또는 닭 난황의 색조(color tone)를 개선시키기 위한 유용한 사료 첨가제로서, 유럽에서 일일 허용 섭취량(acceptable daily intake, ADI)은 0.03mg/kg 체중으로 제한되고 사료에 첨가 허용되는 칸탁산틴의 상한용량은 연어와 산란계(laying hens)에 각각 25mg/kg, 8mg/kg으로 규정되어 있다(비특허문헌 5). 그래서, 미생물을 사용하여 아스탁산틴을 제조할 때에는 칸탁산틴의 함량을 낮은 수준으로 조절할 필요가 있는 것이다. 특허문헌 9는 용존 산소 농도를 조절함으로써 칸탁산틴 생성을 감소시키는 방법을 밝히고 있다. 그러나 그러한 방법은 생성된 아스탁산틴 농도도 심각하게 감소하여 생산 가격의 측면에서 실용적이지 못하다.

특허문헌 1: 일본 특허출원 공개번호 2007-97584 A 특허문헌 2: 일본 특허출원 공개번호 11-69969 A(1999) 특허문헌 3: 일본 특허출원 공개번호 7-79796 A(1995) 특허문헌 4: 일본 특허출원 공개번호 2001-512030 A 특허문헌 5: 일본 특허출원 공개번호 2007-244205 A 특허문헌 6: WO 2005/118812 특허문헌 7: 일본 특허출원 공개번호 2007-143492 A 특허문헌 8: 일본 특허출원 공개번호 2008-167665 A 특허문헌 9: 일본 특허출원 공개번호 2001-352995 A

비특허문헌 1: Erich Widmer et al., "Pure Appl. Chem.," 1985, vol. 57, pp. 741-752 비특허문헌 2: Erich Widmer et al., "Helv. Chim. Acta," 1981, vol. 64, pp. 2436-2446 비특허문헌 3: Akira Tsubokura et al., "International Journal of Systematic Bacteriology," 1999, vol. 49, pp. 277-282 비특허문헌 4: Jae Hyung Lee et al., "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology," 2004, vol. 54, pp. 1699-1702 비특허문헌 5: Official Journal of the European Communities L 22/28-30, 25.1.2003

본 발명은 상기 상황의 관점에서 수행되었다. 본 발명의 목적은 칸탁산틴의 생성을 억제하면서 높은 농도의 아스탁산틴을 낮은 가격에서 미생물학적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 성취하기 위한 집중적 연구의 결과로서, 본 발명자들은 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아를 배양하는 동안에 배지에 바이오틴(biotin)을 첨가함으로써 생성된 칸탁산틴의 농도를 낮은 수준으로 유지하면서 높은 농도의 아스탁산틴을 제조할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 다음을 포함한다.

(1) 바이오틴-함유 배지에서의 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이, 바이오틴-없는 배지에서의 배양 완료 후의 배양 생성물에서 보다 더욱 낮은 것을 특징으로 하는, 바이오틴을 함유하는 배지에서, 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 아스탁산틴을 함유한 카로테노이드의 제조방법.

(2) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배지내의 바이오틴 농도가 0.001mg/L 내지 50mg/L 인 것을 특징으로 하는 방법.

(3) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 25질량%(25% by mass) 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(4) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 글루콘 산 농도가 30g/L 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(5) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 용존 산소 농도를 배양 중에 1ppm 또는 그 이상으로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.

(6) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 폴리-베타-하이드록시부티레이트(poly-β-hydroxybutyrate)(이하 "PHB"로 명명함) 함유량이 건조 세포를 기준으로 30질량%(30% by mass) 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(7) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 용존 산소 농도를 배양 중에 1ppm 또는 그 이상으로 조절하고, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 25질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(8) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 용존 산소 농도를 배양 중에 2ppm 또는 그 이상으로 조절하고, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 8질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(9) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 배양 중에 단계적으로 또는 계속적으로 증가하도록 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.

(10) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 최초 용존 산소 농도가 배양 중간 단계에서 1 내지 2.5ppm으로 조절되고 용존 산소 농도는 단계적으로 또는 계속적으로 증가하며, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 25질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(11) 상기 (1)의 방법에 있어서, 배양 생성물 내의 최초 용존 산소 농도가 배양 중간 단계에서 2 내지 3.5ppm으로 조절되고 용존 산소 농도가 단계적으로 또는 계속적으로 증가하며, 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴의 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 8질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

(12) 상기 (1)의 방법에 있어서, 박테리아는 파라코커스 속에 속하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.

(13) 상기 (1)의 방법에 있어서, 박테리아는 저하된 PHB 생성 능력을 가진 변종인 것을 특징으로 하는 방법.

(14) 상기 (1)의 방법에 있어서, 박테리아는 저하된 글루콘산 생성 능력을 가진 변종인 것을 특징으로 하는 방법.

(15) 상기 (1)의 방법에 있어서, 박테리아는 16S 리보좀 RNA(ribosomal RNA)에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1의 염기서열에 실질적으로 상동성인 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.

(16) 상기 (15)의 방법에 있어서, 박테리아는 균주 E-396(FERM BP-4283) 또는 A-581-1(FERM BP-4671) 또는 이들의 변종인 것을 특징으로 하는 방법.

(17) 생성된 카로테노이드 내의 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴 농도 비율이 25질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 상기 (1)의 방법에 따라 생성된 아스탁산틴을 함유한 카로테노이드를 포함하는 카로테노이드 조성물.

(18) 아스탁산틴을 포함하는 생성된 카로테노이드 내의 PHB 함량이 30질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는, 상기 (17)의 방법에 따른 사료용 카로테노이드 조성물.

(19) 생성된 카로테노이드 내의 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴 농도 비율이 8질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)의 방법에 따라 생성된 아스탁산틴을 포함하는 카로테노이드를 함유하는 식품용 카로테노이드 조성물.

본 명세서는 본 출원의 우선권 서류인 일본특허 출원 번호 2010-057321의 상세한 설명 및/또는 도면 내용의 일부 또는 전부를 포함하고 있다.

본 발명에 의하면, 칸탁산틴 농도를 낮은 수준으로 유지하면서 높은 농도의 아스탁산틴이 낮은 비용에서 미생물학적으로 제조될 수 있다. 본 발명에 의해서 제조된 카로테노이드는 사료 및 식품 재료로서 유용하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 아래의 명세서로 인해 제한되지 않으며, 본 발명의 정신에 벗어나지 않으면서 다음의 예시적 실시예에 의해서 적절하게 수정되고 달성될 것이다.

본 발명은 바이오틴 함유 배지에서, 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아[이하 "카로테노이드-생성 박테리아(carotenoid-producing bacterium)" 또는 아스탁산틴-생성 박테리아(astaxanthin-producing bacteria)" 로 명명함]을 배양함으로써 아스탁산틴을 포함하는 카로테노이드의 제조방법[이하 "본 발명의 방법(the method of the present invention)"으로 명명함]에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라서, 바이오틴 함유 배지에서 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 생성된 아스탁산틴 농도에 대한 생성된 칸탁산틴 농도 비율이, 바이오틴-없는 배지에서 배양 완료 후 유사한 카로테노이드-생성 박테리아를 사용하여 얻은 배양 생성물 내의 농도 비율보다 더욱 낮다. 본 발명의 방법에 따라서, 바이오틴을 배지에 첨가함으로써 생성된 칸탁산틴의 농도를 저하시키면서 높은 농도의 아스탁산틴을 낮은 가격으로 제조 가능하게 되었다.

본 발명의 방법에서 사용된 박테리아는 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 한 제한되지 않는다. 그러나 바람직하게는 파라코커스속에 속하는 박테리아가 사용될 수 있다. 바람직하게는 파라코커스 속에 속하는 박테리아 중 파라코커스 카로티니파시언스(Paracoccus carotinifaciens), 파라코커스 마쿠시(Paracoccus marcusii), 파라코커스 해운대엔시스(Paracoccus haeundaensis)가 사용될 수 있으며 더욱 바람직하게는 파라코커스 카로티니파시언스일 수 있다. 파라코커스 속에 속하는 박테리아 균주의 특정 예로서, 파라코커스 카로티니파시언스 균주 E-396(FERM BP-4283)과 파라코커스 박테리아 균주 A-581-1(FERM BP-4671)이 포함될 수 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 3). 이들 박테리아 균주 역시 본 발명의 방법에 사용이 바람직하다.

카로테노이드-생성 박테리아로서, 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1의 E-396 염기서열에 실질적으로 상동성인 박테리아가 바람직하다. 여기에서 "실질적으로 상동성(substantially homologous)"라는 말은 DNA서열에서의 오차 빈도 등을 고려하여 염기서열에서의 상동성이 95% 또는 그 이상이 바람직하고, 96% 또는 그 이상은 더 바람직하며, 97% 또는 그 이상은 더욱 바람직하고, 98% 또는 그 이상은 특별히 바람직하며, 99% 또는 그 이상은 가장 바람직하다는 것을 의미한다. 예로서, 상동성을 Clustal W gene analysis software를 사용하여 측정할 수 있다.

"16S 리보좀 RNA 에 대응하는 DNA의 염기서열"이라는 말은 16S 리보좀 RNA의 염기서열에서 U(우라실)를 T(티민)으로 치환하여 얻어지는 염기서열을 의미한다.

16S 리보좀 RNA의 염기서열의 상동성에 근거한 미생물 분류가 근래에 주류로 되고 있다. 종래의 미생물 분류가 이동성, 영양요구성, 당 활용성과 같은 종래 알려진 균학적 특성(mycological properties)에 근거하였기 때문에, 자연발생적 돌연변이(spontaneous mutation) 등에 의해 특성에 변화가 발생된다면 미생물이 부정확하게 분류될 수 있다. 반면에 16S 리보좀 DNA의 염기서열은 유전적으로 매우 안정적이서, 그 상동성에 근거한 분류는 종래의 분류방법에 비하여 그 신뢰성을 크게 향상시킨다.

파라코커스 카로티니파시언스 균주 E-396의 16S 리보좀 RNA의 염기서열과 다른 카로테노이드-생성 박테리아, 예를 들어 파라코커스 마쿠시 균주 DSM 11574[International Journal of Systematic Bacteriology(1998), 48, 543-548], 파라코커스 박테리아 균주 N-81106(특허문헌 5), 파라코커스 해운대엔시스 균주 BC 74171(비특허문헌4), 파라코커스 박테리아 균주 A-581-1, 파라코커스속 균주 PC-1(특허문헌 6)의 16S 리보좀 RNA의 염기서열 사이의 상동성은 각각 99.7%, 99.7%, 99.6%, 99.4% 및 95.4%으로서, 분류학 측면에서 이들 균주들은 매우 가까운 균주임을 나타낸다.

따라서, 이들 균주가 카로테노이드-생성 박테리아의 한 개 그룹을 형성하는 것으로 간주할 수 있다. 그래서, 이들 박테리아 균주들은 아스탁산틴의 효율적 제조를 위하여 본 발명의 방법에서 선호될 수 있는 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 개선된 아스탁산틴 생산성을 가지는 변이 균주 역시 사용될 수 있다. 그러한 변이 균주의 예로서 일본 특허 출원 공개번호 2001-95500 A 와 특허문헌 9에서 발표된 것들이 포함될 수 있다.

또한 개선된 아스탁산틴 생산성을 가지는 변이균주는 변이 처치 및 스크리닝으로서 얻을 수 있다. 변이처치 방법은 돌연변이를 일으키는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예로서 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG) 또는 에틸 메탄설포네이트(ethyl methanesulfonate, EMS) 같은 돌연변이 유도물(mutagen)을 사용하는 화학적 방법, 자외선 조사와 방사선 조사 같은 물리적 방법, 유전자 재조합과 트랜스포존(trnasposon) 같은 생물학적 방법들이 사용될 수 있다. 또한, 변이 균주는 자연 발생적 돌연변이에 의해 얻어지는 것일 수도 있다. 대중의 수용 또는 안전을 고려하여, 유전자 재조합 미생물이 아닌 미생물의 사용이 바람직하다.

개선된 아스탁산틴 생산성을 가지는 변이 균주의 스크리닝 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예로서 관심 돌연변이 균주를 한천 배지에서 집락(colony)의 색조에 따라 선택하는 방법 또는 변이균주가 시험관, 플라스크, 발효기 등에서 배양하는 방법 및 관심있는 돌연변이 균주를 흡광도(absorbance), 고성능 액상 크로마토그래피(high-performance liquid chromatogrphy), 박막 크로마토그래피(thin-layer chromatography) 등을 이용하는 카로테노이드 염료 분석방법에 따라 선택하는 방법일 수 있다.

변이 처치 및 스크리닝 과정은 1회 또는 2회 또는 그 이상 반복될 수 있는데, 예로서 변이 균주는 변이 처치 및 스크리닝으로 얻어질 수 있고, 얻어진 변이 균주는 개선된 아스탁산틴 생산성을 가지는 변이 균주를 얻기 위하여 다른 변이 처치 또는 스크리닝이 더 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 저하된 PHB 생성능력을 가지는 변이 균주를 사용할 수도 있다. 예로서, 상기 파라코커스 박테리아 균주 E-396 또는 A-581-1 으로 부터 그러한 변이 균주가 유발될 수 있다. 아스탁산틴-생성 박테리아가 탄소 저장원(storage carbon source)으로서 세포 내에서 PHB를 축적하는 것이 알려져 있다. PHB 축적은 배지에서 탄소원을 소모시키는 원인이다. 그러므로, 제조 비용을 낮추기 위해서 PHB 축적을 최소화하는 것이 좋다. 즉 변이 처치 및 스크리닝을 수행함으로써 소량의 PHB 축적 또는 PHB의 축적 없는 것이 특징인 변이 균주를 얻는 것이 효과적이다. 낮은 PHB 생성이 특징인 균주를 얻기 위한 방법의 특정 예는, 상기 방법으로 변이 처치를 수행하고 시험관, 플라스크, 한천 배지 등을 사용하여 , 각각의 변이 균주를 배양하여 PHB의 양을 정량하고 저하된 PHB 생성이 특징인 변이 균주를 선택하는 그 방법인 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 저하된 글루콘산 생성능력을 가지는 변이 균주도 사용될 수 있다. 예로서, 그러한 변이 균주는 상기 파라코커스 박테리아 균주 E-396 또는 A-581-1 등등으로부터 유도할 수 있다. 글루콘산 생성은 생성된 글루콘산에 대응하여 배지에서 탄소원의 소모를 일으킨다. 또한, 다량의 글루콘산 축적은 박테리아 생장 또는 카로테노이드 생성을 억제시킨다. 그러므로, 카로테노이드 생성을 위해서는 글루콘산 생성을 최소화하는 것이 효과적이다. 저하된 글루콘산 생성이 특징인 균주를 얻기 위한 방법의 특정 예는 상기 방법으로 변이 처치를 수행하고 각각의 변이 균주를 시험관, 플라스크 등등에서 배양하며 배양 용액의 pH에서 소량의 감소를 확인할 수 있도록 변이 균주의 선택을 위해 각각의 배양 결과물 용액의 pH를 측정하고, 다음에 각각 선택된 변이 균주의 배양 용액에서의 글루콘산량을 저하된 글루콘산 생성이 특징인 변이 균주를 선택하기 위해서 정량하는 것이다.

개선된 아스탁산틴 생산성을 가지는 변이 균주, 저하된 PHB 생성 능력을 가지는 변이 균주, 상기 저하된 글루콘산 생성 능력을 가지는 변이 균주와 같이 바람직한 특징을 가지는 변이 균주들이 알려졌는데, 이들은 분리되어 얻어질 수도 있다. 또한 두 개 또는 그 이상의 그러한 특징을 가지는 변이 균주를 얻기 위해서 변이 처치 및 스크리닝을 반복할 수도 있다. 1회의 변이 처치에 두 개 또는 그 이상 타입의 스크리닝 방법을 조합함으로써 두 개 또는 그 이상의 특징이 동시에 나타나는 변이 균주를 얻는 것 역시 가능하다. 두 개 또는 그 이상의 바람직한 특징을 가지는 변이 균주 역시 본 발명의 방법에서 사용되었을 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되고 카로테노이드-생성 박테리아로 예시가 된 균주 E-396 은 하기에 서술한 바와 같이 International Patent Organism Depositary(IPOD), the National Institute of Advancd Industrial Science and Technology(AIST)에 국제 기탁하였다.

국제 기탁 인가(International Depositary Authority):

The International Patent Organism Depositary(IPOD), the National Institue of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)(the former National Institute of Bioscience and Human-Technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry)

츠쿠바 센스랄 6, 1-1-1-히가시, 츠쿠바, 이바라키, 305-8566, 일본

Identification Indication : E-396

Accession No. : FERM BP-4283

Date of the original deposit : 1993년 4월 27일

본 발명의 방법에서 사용된 다른 카로테노이드-생성 박테리아로 예시된 균주 A-581-1은 하기와 같이 상기의 기관에 국제기탁하였다.

Identification Indication : A-581-1

Accession NO. : FERM BP-4671

Date of the original deposit : 1994년 5월 20일

아스탁산틴과 칸탁산틴 이외에 본 발명의 방법으로 생성된 카로테노이드의 예로서 특별히 제한되는 것은 아니지만 다음과 같은 것들이 포함되는데 아도닉산틴(adonixanthin), 포에니콕산틴(phoenicoxanthin), 베타-카로틴(β-carotene), 에키네논(echinenone), 아스테로이데논(asteroidenone), 3-하이드록시에키네논(3-hydroxyechinenone), 제악산틴(zeaxanthin), 베타-크립톡산틴(β-cryptoxanthin) 및 리코펜(lycopene)이다. 바람직하게는 아도닉산틴(adonixanthin) 및 아도니루빈(adonirubin)을 포함할 수 있다. 한 개의 카로테노이드 타입 또는 복수 유형의 카로테노이드 조합이 본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 방법에서 상기 박테리아를 배양하는 방법을 기술한다. 여기에서 사용되는 "배양 생성물(culture product)"이라는 말은 배양 용액(culture liquid)으로 제한되지 않으며, 따라서 고체(solid), 반-고체(semi-solid) 등등이 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에서 배양을 위해 사용되는 아스탁산틴 제조 배지는 바이오틴을 함유하고 아스탁산틴-생성 박테리아의 성장과 아스탁산틴 생성을 일으키는 어떠한 배지라도 해당될 수 있다. 바람직하게는 탄소원, 질소원(nitrogen source), 무기염(inorganic salt) 및 필요하다면 비타민 등등을 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 따라서 아스탁산틴-생성 박테리아의 성장과 아스탁산틴 생성을 일으키는 배지에 바이오틴을 첨가한 것이다.

탄소원(carbon source)의 예로는 : 포도당(glucose), 자당(sucrose), 락토오즈(lactose), 과당(fructose), 트레할로오스(trehalose), 만노오스(mannose), 만니톨(mannitol), 말토오즈(maltose) 등의 당류(sugars); 아세트산, 푸마린산(fumaric acid), 시트르산(citric acid), 프로피온산(propionic acid), 말릭산(malic acid), 말로닉산(malonic acid), 피부르산(pyruvic acid) 등의 유기산(organic acid); 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올, 글리세롤 등의 알코올; 두유(soybean oil), 쌀겨기름(rice bran oil), 올리브유(olive oil), 옥수수유(corn oil), 참깨유(sesame oil), 아마인유(linseed oil)등의 오일(oils)과 지방(fats)이 포함되는데, 바람직하게는 포도당(glucose) 또는 자당(sucrose)일 수 있다. 이들 탄소원의 한 개 또는 그 이상의 유형이 사용될 수 있다. 전 배양배지[preculture medium(개시배지,starting medium)]에 첨가되는 탄소원의 양은 탄소원의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 1L의 배지당 보통 1 내지 100g이고, 바람직하게는 2 내지 50g일 수 있다. 탄소원은 개시배지(starting medium) 뿐 아니라 바람직하게는 순차적 또는 계속적으로 배양 중에 추가적으로 공급할 수 있다.

무기 질소원(inorganic nitrogen sources)의 예로는 : 암모니움 나이트레이트(ammonium nitrate), 암모니움 설페이트(ammonium sulfate), 암모니움 클로라이드(ammonium chloride), 암모니움 포스페이트(ammonium phosphate) 등의 암모니아 염(ammonium salts); 포타시움 나이트레이트(potassium nitrate) 등의 질산염(nitrates); 암모니아(ammonia); 및 요소(urea)가 포함될 수 있다. 이들 무기 질소원의 한 개 또는 그 이상의 유형이 사용될 수 있다. 첨가되는 양은 질소원의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 1L의 배지당 보통 0.1g 내지 20g이고, 바람직하게는 0.2 내지 10g일 수 있다.

유기 질소원(organic nitrogen sources)의 예로서 옥수수 용액[corn steep liquor(여과액 포함)], 파마메디아(pharmamedia), 콩가루(soybean meal), 콩분말(soybean flour), 땅콩가루(peanut meal), 모노소디움 글루타메이트(monosodium glutamate), 증류 용액(distillers' solubles), 건조 효모(dried yeast)가 포함될 수 있다. 이들 중 한 개 또는 그 이상의 유기 질소원의 유형이 사용된다. 첨가되는 유기 질소원의 농도는 유기 질소원의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 배지당 보통 0 내지 80g/L이며, 바람직하게는 0 내지 30g/L일 수 있다.

무기 질소원과 유기 질소원은 보통 개시배지에 첨가되는데; 그러나, 바람직하게는 순차적 또는 계속적으로 추가 공급하는 것일 수 있다.

무기 염(inorganic salts)의 예로는 : 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 다이포타시움 하이드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate) 등의 인산염(phosphates); 마그네시움 설페이트(magnesium sulfate)와 마그네시움 클로라이드(magnesium chloride) 등의 마그네시움염(magnesium salts); 아이언 설페이트(iron sulfate) 와 아이언 클로라이드(iron chloride)등의 철염(iron salts); 칼시움 클로라이드(calcium chloride)와 칼시움 카보네이트(calcium carbonate)등의 칼슘염(calcium salts); 소디움 카보네이트(sodium carbonate)와 소디움 클로라이드(sodium chloride) 등의 나트륨염(sodium salts); 망간 설페이트(manganese sulfate) 등의 망간염(manganese salts); 코발트 클로라이드(cobalt chloride)등의 코발트염(cobalt salts); 구리 설페이트(copper sulfate) 등의 구리염(copper salts); 아연 설페이트(zinc sulfate) 등의 아연염(zinc salts); 소디움 몰리브데이트(sodium molybdate)등의 몰리브덴염(molybdenum salts); 니켈 설페이트(nickel sulfate) 등의 니켈염(nickel salts); 소디움 셀레네이트(sodium selenate)등의 셀레니움염(selenium salts); 보릭산(boric acid); 포타시움 아이오다이드(potassium iodide)가 포함될 수 있다. 이들 무기염의 한 개 또는 그 이상의 유형이 사용될 수 있다. 첨가되는 무기염의 양은 무기염의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 1L 배지당 보통 0.0001 내지 15g이다. 포스페이트(phosphate), 마그네시움염(magnesium salts), 칼슘염(calcium salts), 나트륨염(sodium salt) 또는 철염(iron salt)의 배지 내의 농도는 바람직하게는 0.02 내지 15g/L 이다. 망간염(manganese salt), 코발트염(cobalt salt), 구리염(copper salt), 징크염(zinc salt), 몰리브덴 염(molybdenum salt), 니켈염(nickel salt), 셀레니움염(selenium salt), 보릭산(boric acid), 포타시움 아이오다이드(potassium iodide) 등등이 첨가될 때, 그 농도는 바람직하게는 0.1 내지 15mg/L 이다. 무기염은 보통 개시배지에 첨가되는데, 그러나 순차적 또는 계속적으로 추가 공급할 수도 있다.

바이오틴 이외에 사용할 수 있는 비타민의 예로서, 시아노코발라민(cyanocobalamin), 리보플라빈(riboflavin), 판토테닉산(pantothenic acid), 피리독신(pyridoxine), 티아민(thiamine), 아스코르빈산(ascorbic acid), 폴릭산(folic acid), 니아신(niacin), p-아미노벤조산(p-aminobenzoic acid), 이노시톨(inositol), 콜린(choline)등이 포함될 수 있다. 첨가되는 비타민 비율은 비타민의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 1L 배지당 보통 0.001 내지 1000mg이며, 바람직하게는 0.01 내지 100mg일 수 있다. 비타민은 보통 개시배지에 첨가되는데; 그러나 순차적 또는 계속적으로 추가 공급할 수도 있다.

본 발명의 방법은 바이오틴이 첨가된 배지에서 아스탁산틴-생성 박테리아를 배양하는 특징을 가진다. 바이오틴이 첨가된 배지에서 아스탁산틴-생성 박테리아를 배양함으로써 칸탁산틴의 농도는 낮은 수준으로 유지하면서 높은 농도의 아스탁산틴을 제조할 수 있는 것이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 바이오틴은 DL-바이오틴 또는 D-바이오틴 일 수 있다. 바람직하게는 D-바이오틴일 수 있다. 바이오틴은 보통 개시배지에 첨가되는데; 그러나 배양 중에 바이오틴을 주기적으로 또는 계속적으로 첨가할 수 있다. 대안적으로, 바이오틴을 개시 배지에 첨가한 이후에, 배양 중에 주기적으로 또는 계속적으로 첨가할 수 있다.

바이오틴을 기본배지(basal medium)에 혼합하고 배지를 멸균할 수 있다. 대안적으로, 바이오틴을 개별적으로 멸균하고, 기본 배지에 첨가할 수도 있다. 바이오틴을 멸균하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 가열 멸균(heat sterilization) 또는 여과 멸균(filtration sterilization)을 이용할 수 있다.

배지에 첨가하는 바이오틴의 하한 농도는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 0.001 mg/L이고, 더욱 바람직하게는 0.005mg/L 이며, 더더욱 바람직하게는 0.01mg/L이고, 특별히 바람직하게는 0.02mg/L일 수 있다. 첨가하는 바이오틴의 상한 농도는 특별히 제한되지 않으며,바람직하게는 50 mg/L이고, 더욱 바람직하게는 20mg/L 이며, 더더욱 바람직하게는 10mg/L이고, 특별히 바람직하게는 5mg/L이며, 가장 바람직하게는 2mg/L일 수 있다.

배양 생성물에서 기포(bubble) 형성을 예방하기 위하여 본 발명의 방법에서 바람직하게는 소포제(antifoamer)가 사용될 수 있다. 아스탁산틴-생성 박테리아에 대하여 억제 효과가 낮으면서 기포의 발생을 예방하고 또는 발생된 기포를 제거할 수 있다면 어떠한 유형의 소포제라도 사용될 수 있다. 소포제의 예로서 알코올-베이스 소포제(alcohol-based antifoamers), 폴리에테르-베이스 소포제(polyether-based antifoamers), 에스터-베이스 소포제(ester-based antifoamers), 지방산-베이스 소포제(fatty acid-based antifoamers), 실리콘-베이스 소포제(silicone-based antifoamers), 설포닉산-베이스 소포제(sulfonic aicd-based antifoamers)가 포함될 수 있다. 첨가되는 소포제의 양은 소포제의 유형에 따라 달라지며 적절히 조절될 수 있는데, 보통 1L 배지당 0.01g 내지 10g 이다.

소포제는 보통 멸균 전에 개시배지에 첨가된다. 배양 중에 계속적으로 또는 주기적으로 추가 공급할 수도 있다. 배양 중에 소포제를 첨가하는 방법의 예로는 : 센서(sensor)를 사용하여 기포가 감지되면, 소포제를 자동적으로 첨가하도록 하는 방법; 프로그램 타이머(program timer)를 사용하여 일정한 간격으로 소포제가 첨가되는 방법; 소포제를 탄소원, 질소원, pH 조절제 등등과 혼합하여, 성장율의 변화에 따라 혼합물이 첨가되는 방법을 포함할 수 있다. 개시배지에 첨가되는 소포제는 배양 중에 배양 생성물에 첨가되는 것과 같은 것일 수 있다. 대안적으로 다른 유형의 소포제도 그 효과를 이용하도록 함으로써 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양 개시단계에서의 배지 pH는 2 내지 12이며, 바람직하게는 6 내지 9이고, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 8.0으로 조절될 수 있다. 배양 중에 이 범위의 pH가 유지되는 것이 바람직하다. pH를 유지하기 위해 바람직한 방법은 염기성 물질을 자동적으로 공급하도록 발효기 내부에 장치된 pH 전극을 사용하여 배양 용액의 pH가 온라인으로 측정되는 방법일 수 있다. pH 조절기의 예로서 수성 소디움 하이드록사이드 용액(aqueous sodium hydroxide solution), 수성 포타시움 하이드록사이드 용액(aqueous potassium hydroxide solution), 수성 소디움 카보네이트 용액(aqueous sodium carbonate solution), 암모니아 수 (ammonia water), 암모니아 가스(ammonia gas), 수성 설퍼릭산 용액(aqueous sulfuric acid solution) 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 배지는 박테리아를 배양하기 위해 사용 전에 멸균하였다. 멸균은 이 분야의 숙련자에 의해 수행되었다. 예로서, 적절한 용기 내의 배지는 가압 멸균기에서 가열 멸균시킬 수 있다. 대안적으로, 여과 소독은 멸균 여과기를 사용하여 수행할 수 있다. 다른 경우에, 멸균은 자켓 가열 및 스팀 주입(jacket heating and steam injection)으로서 수행될 수도 있다. 글루코즈같은 탄소원을 다른 배지 내용물과 같이 가열 멸균하려 한다면, 갈색으로 변하므로, 분리하여 멸균할 수도 있다. 비타민 또는 미량의 금속은 기본배지와 함께 가열 멸균시킬 수 있고 또는 불활성화 또는 침전(deactivation or precipitation)을 예방하기 위하여 분리 멸균을 할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 아스탁산틴-생성 박테리아를, 위에서 기술한 대로 준비하고 미리 정해진 상태로 배양한 바이오틴 함유 배지에 접종하였다. 접종은 시험관, 플라스크, 발효기 등등을 사용한 시드컬쳐(seed culture)로 박테리아 균주를 적절히 성장시키고, 결과 배양 생성물을 아스탁산틴을 제조하기 위한 바이오틴 함유 배지에 첨가함으로써 수행하였다. 시드컬쳐(seed culture)를 위한 배지는 특별히 제한되지 않으며, 아스탁산틴-생성 박테리아가 잘 성장되도록 한다면 바이오틴 함유 배지 또는 바이오틴-없는 배지 일 수 있다.

배양은 적합한 배양 용기에서 수행하였다. 배양 용기(culture container)는 배양 부피에 따라 적절히 선택할 수 있는데, 예로서 시험관, 플라스크, 발효기 등등이다.

배양 온도는, 예로서 15 내지 40℃이며, 바람직하게는 20 내지 35℃이고, 더욱 바람직하게는 25 내지 32℃일 수 있다. 배양은 호기성 상태에서 배양기간은 일반적으로 1일 내지 20일이며, 바람직하게는 2 내지 12일이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 9일이며, 특별히 바람직하게는 4 내지 7일 일 수 있다.

호기성 상태의 예로는 진탕 배양(shaking culture) 또는 통기배양/교반배양(aeration/agitation culture)이 포함될 수 있다. 산소 결핍은 아스탁산틴-생성 박테리아 성장 또는 카로테노이드 제조에 부정적 영향을 미칠 수 있다. 그래서 용존 산소 전극을 사용하여 용존 산소 농도를 계속 관찰하는 것이 바람직하다.

미생물의 수는 배양개시 직후 낮다. 그래서 용존 산소 농도는 포화 농도에 가깝다. 그러나, 미생물이 성장하고 그래서 산소 소비가 증가하기 때문에, 용존 산소 농도는 점차로 감소한다. 배양 단계(culture phase)는 다음과 같이 정의할 수 있다: 배양 개시부터 용존 산소 농도가 특정 수준으로 감소하는 시기 사이의 기간으로서 예로서 농도는 0 내지 5ppm이고, 바람직하게는 1 내지 4ppm인데, 이것은 배양 개시 단계에 부합하는 것이다; 배양 개시 단계의 끝에서 생성된 아스탁산틴 농도가 최고 수준에 도달하기 까지의 기간으로서, 배양 중간 단계에 부합한다; 생성된 아스탁산틴 농도가 최고 수준에 도달했을 때부터 배양 종료 사이의 기간으로서, 배양 최종 단계에 부합한다.

용존 산소 농도를 가능한 가장 짧은 시간에 조절 범위로 낮추기 위해서, 배양 개시단계에서 통기부피(aeration volume), 교반 회수(number of agitation rotation), 압력을 낮은 수준으로 맞추어야 될 수 있다. 배양 생성물의 혼합 상태를 적당하게 유지하기 위해서, 필요로 하는 교반 회수를 최소한으로 하는 것이 필요함을 주목해야 한다. 세균 오염을 예방하기 위해서, 필요로 하는 압력 수준을 최소한으로 하는 것 역시 필요하다.

배양 중간 단계에서 미생물에 의한 산소 소비가 가장 활발하게 된다. 여기에서 통기 교반(aeration agitation)이 불충분 하다면, 용존 산소 농도가 0(zero)으로 감소하는 것으로서, 즉, 산소 고갈이 발생하는 것이다. 이것은 미생물의 성장 또는 카로테노이드 생산에 부정적 영향을 미친다. 그래서 배양 중간 단계에서 산소 고갈을 예방하기 위하여 용존 산소 농도를 조절하는 것이 바람직하다. 용존 산소 농도는 예로서, 교반 회수, 통기 부피, 내압, 통기 가스 내의 산소 농도를 변화시킴으로써 조절할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 아스탁산틴-생성 박테리아의 배양 중에 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 높을 수록, 생성된 아스탁산틴 농도에 대한 생성된 칸탁산틴의 농도 비율이 낮아지게 된다. 그래서, 배양 중간 단계에서 배양 생성물 내의 용존 산소 농도는 바람직하게는 1ppm 또는 그 이상으로 조절되고, 더욱 바람직하게는 1.5ppm 또는 그 이상이며, 더더욱 바람직하게는 2ppm 또는 그 이상이고, 특별히 바람직하게는 2.5ppm 또는 그 이상으로 조절될 수 있다. 배양 중간 단계에서 배양 생성물 내의 용존 산소 농도의 상한이 조절 범위 내로 감소하는 것은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 8ppm이고, 더욱 바람직하게는 7ppm이며, 더더욱 바람직하게는 6ppm이고, 특별히 바람직하게는 5ppm일 수 있다.

배양 중간 단계에서 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 정해진 수준으로 조절될 수 있을지라도, 배양 생성물에서 칸탁산틴 농도를 저하시키면서 아스탁산틴 농도를 높은 수준으로 얻기 위해서 용존 산소 농도를 단계적으로 또는 계속적으로 증가시키는 것이 효과적이다. 최소한 한 개의 단계인 한 용존 산소 농도를 증가시키기 위한 단계의 숫자는 특별히 제한되지 않는다. 예로서, 용존 산소 농도는 20시간 동안 1시간에 0.2ppm씩 반-계속적으로 또는 계속적으로 증가될 수 있다. 배양 생성물에서 용존 산소 농도를 단계적으로 또는 계속적으로 증가시키기 이전의 용해 산소 농도(즉, 최초의 용해 산소 농도)의 하한은 제한되지 않는데, 바람직하게는 1ppm이고, 더욱 바람직하게는 1.5ppm이며, 더더욱 바람직하게는 2ppm일 수 있다. 최초 용해 산소 농도의 상한 역시 제한되지 않는데, 바람직하게는 3.5ppm이고, 더욱 바람직하게는 3ppm이며, 더더욱 바람직하게는 2.5ppm일 수 있다. 배양 생성물에서 용존 산소 농도의 단계적 또는 계속적 증가 이후의 용존 산소 농도 하한은 제한되지 않는데, 바람직하게는 2.5ppm이고 더욱 바람직하게는 3ppm이며 더더욱 바람직하게는 3.5ppm일 수 있다. 그 상한 역시 제한되지 않는데, 바람직하게는 8ppm이고, 더욱 바람직하게는 7ppm이며, 더더욱 바람직하게는 6ppm이고, 특별히 바람직하게는 5ppm일 수 있다.

배양 중간 단계에서 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 단계적으로 또는 계속적으로 증가되기 시작하는 시점은 특별히 제한되지 않는데, 배양 중간단계의 시작으로부터, 바람직하게는 0 내지 60시간이고, 더욱 바람직하게는 2 내지 50시간이며, 더더욱 바람직하게는 4 내지 40시간이고, 특별히 바람직하게는 6 내지 30시간 일 수 있다. 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 단계적으로 또는 계속적으로 증가하기 시작하여 가장 높은 용존 산소 농도에 도달하기 까지의 시간은 제한되지 않는다. 용존 산소 농도가 하나의 단계로 변환된다면 가장 높은 용존 산소 농도는 1시간 이내에 도달될 것이다. 용존 산소 농도가 그 이상의 단계에 의해 반-계속적으로 또는 계속적으로 증가된다면, 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 증가하기 시작하여 가장 높은 용존 산소 농도에 도달하기 까지의 시간은 제한되지 않는다. 그러나 이 경우에, 바람직하게는 2 내지 120시간이고, 더욱 바람직하게는 4 내지 100시간이며, 더더욱 바람직하게는 6 내지 90시간이고, 특별히 바람직하게는 8 내지 80시간이며, 가장 바람직하게는 10 내지 70시간 일 수 있다.

아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율을 원하는 수준으로 조절할 수 있도록 배양 생성물 표본을 채취하고 배양 중간 단계의 카로테노이드 조성물을 분석하는 동안에 배양 생성물 내의 용존 산소 농도가 배양 중에 증가 또는 감소하는 것이 바람직하다. 특히, 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율이 원하는 수준보다 높을 때 배양 생성물 내의 용존 산소 농도의 조절 수준을 높이는 것이 효과적인데, 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율이 바람직한 수준보다 낮을 때는 배양 생성물 내의 용존 산소 농도를 낮추는 것이 효과적이다.

배양 최종 단계에서, 미생물은 산소 소비 활동성이 감소하여 박테리아 성장과 카로테노이드 생성을 종료하게 된다. 따라서, 배양 중간 단계에서와 같이 배양 생성물 내의 용존 산소 농도를 엄격하게 조절할 필요는 없게 된다. 그러나, 배양 중간 단계의 후기에서 용존 산소 농도를 같은 수준으로 계속 조절하고, 일정한 통기부피로서 일정한 속도의 교반에 의해 배양을 수행하는 것은 가능하다.

상기의 방법으로 배양 완료 후의 최종 생성물로서 얻어진, 배양 생성물 내의 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율은 바람직하게는 25질량% 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 20질량% 또는 그 이하이며, 더더욱 바람직하게는 15질량% 또는 그 이하이고, 더더욱 바람직하게는 8질량% 또는 그 이하이며, 특별히 바람직하게는 6질량% 또는 그 이하이고, 가장 바람직하게는 4질량% 또는 그 이하일 수 있다. 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율의 하한은 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 0.5질량% 또는 그 이상이고, 더욱 바람직하게는 1.0질량%일 수 있다. 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율이 25질량% 또는 그 이하가 사료첨가제로 잘 사용된다. 또한 배양 생성물 내의 그 농도 비율이 8질량% 또는 그 이하인 것은 식품으로 선호될 수 있다.

아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아는 동시에 부산물인 아도닉산틴도 생성한다. 상기 방법에 따라 배양하여 얻어지는 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 아스탁산틴 농도에 대한 아도닉산틴의 농도 비율은 바람직하게는 100질량% 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 90질량% 또는 그 이하이며, 더더욱 바람직하게는 80질량% 또는 그 이하이고, 더더욱 바람직하게는 30질량% 또는 그 이하이며, 특별히 바람직하게는 25질량% 또는 그 이하이고, 가장 바람직하게는 20질량% 또는 그 이하일 수 있다. 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 아스탁산틴 농도에 대한 아도닉산틴의 농도 비율의 하한은 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 1질량% 또는 그 이상이고, 더욱 바람직하게는 5질량% 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 박테리아는 배양 용액에서 글루콘산을 생성한다. 글루콘산이 생성되면, 생성된 글루콘산에 부합되게 배지에서 탄소원의 소모를 일으킨다. 글루콘산이 다량 축적되면, 박테리아 성장 또는 카로테노이드 생성의 억제가 발생한다. 따라서, 카로테노이드 생성을 위해서는 글루콘산 생성을 억제하는 것이 효과적이다. 본 발명의 방법에 있어서, 생성된 글루콘산의 양은 배지에 바이오틴을 첨가함으로써 감소시킬 수 있다. 배양 완료 후의 최종 생성물로서 얻어지는 배양 생성물 내 글루콘산 농도는 바람직하게는 30g/L 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 20g/L 또는 그 이하이며, 더더욱 바람직하게는 10g/L 또는 그 이하이고, 특별히 바람직하게는 5g/L 또는 그 이하일 수 있다. 그 하한은 0g/L이다.

본 발명의 방법에 있어서, PHB(폴리-베타-하이드록시뷰티레이드, poly-β-hydroxybutyrate)의 생성은 배지에 바이오틴을 첨가함으로써 억제할 수 있다. 건조 세포를 기준으로 배양 완료 후의 최종 생성물로서 얻어지는 배양 생성물 내의 PHB 함량은 바람직하게는 30질량% 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 20질량% 또는 그 이하이며, 더더욱 바람직하게는 10질량% 또는 그 이하이고, 특별히 바람직하게는 5질량% 또는 그 이하일 수 있다. 그 하한은 0질량%이다. 특히, 건조 세포를 기준으로 배양 완료 후의 배양 생성물 내의 PHB 함량이 30질량% 또는 그 이하인 배양 생성물은 사료 첨가제로 잘 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 아스탁산틴-생성 박테리아의 배양으로 얻어지는 배양 생성물 내의 카로테노이드 또는 배양 생성물로부터 얻어진 카로테노이드는 예로서 고성능 액상 크로마토그래피에 의하여 정량될 수 있다.

위에서 기술한대로, 아스탁산틴-생성 박테리아의 배양으로 얻어지는 배양 생성물은 카로테노이드로 직접 사용할 수도 있다. 대안적으로 배양 상등액(culture supernatant), 세포 농축물[cell concentrate(세포 농축 용액(cell concentrate liquid))], 습식 세포(wet cells), 건조 세포(dry cells), 세포 용해물(cell lysate) 등등이 배양 용액 등의 배양 생성물로부터 제조되어 제품으로서 사용될 수 있다. 나아가, 카로테노이드는 이러한 배양 생성물 또는 추출, 정제 등등에 의해 제품에서 얻을 수 있다. 배양생성물을 원심분리 또는 여과시킴으로써 배양 생성물에서 박테리아 세포를 제거하여 배양 상등액을 만들 수 있다. 세포 농축물(세포 농축 용액)은 배양 생성물을 원심 분리, 세포막 여과 농축 또는 경사법(decantation)으로 얻을 수 있다. 건조 세포는 일반적인 건조 방법에 따라 배양 생성물, 습식 세포 또는 세포 농축물(세포 농축 용액)을 건조시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 방법으로 얻어지는 카로테노이드 함유 건조 세포는 사료 첨가물로서 직접 사용할 수 있다.

상기 배양 생성물 또는 제품으로부터 카로테노이드를 수집하는 방법은 본 발명의 방법에서 특별히 제한되지 않는다. 카로테노이드를 효과적이고 안정적으로 수집할 수 있다면 어떠한 방법이라도 좋다. 이 분야의 숙련자는 알려진 추출 및 정제 방법 중에서 적절한 방법을 선택함으로써 그러한 방법을 수행할 수 있다.

이외에, 추출 이전에 알칼리 시약(alkaline reagent) 또는 계면 활성제(surfactant)를 사용한 화학적 처리, 분해 효소(lytic enzyme), 지질-분해 효소(lipid-degrading enzyme), 프로테아제(protease) 등등을 사용한 생화학적 처치, 초음파 또는 분쇄(pulverization) 등의 물리적 처치 중에서 선택한 최소한 하나의 처치를 배양 생성물 또는 제품에 시행할 수 있다.

예를 들면 카로테노이드가 배양 생성물 또는 조제품에서 추출되었다면 추출과 세척에 사용된 용매는 특별히 제한되지 않는다. 그러나 그 예에는 저급 알코올[lower alcohols(예로서 메탄올, 에탄올, 이소프로판올)], 아세톤, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone), 메틸 이소부틸 케톤(methyl isobutyl ketone), 다이클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 다이메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 등이 포함될 수 있다.

추출 처리 중에 카로테노이드의 산화위험을 최소화하고자 한다면, 질소 가스 환경 등의 불활성 기체 환경 하에서 추출을 시행할 수 있다. 약제 또는 식품에 상용되는 항산화제를 선택하고 필요에 따라 그것을 추출 용매에 첨가하는 것도 가능하다. 대안적으로, 그러한 처치를 조합하여 수행할 수도 있다.

또한, 카로테노이드가 광선으로 인해 분해되는 위험을 최소화하기 위해서 광선 차폐(shielding light)를 포함하는 상태에서 추출을 수행할 수도 있다.

이렇게 얻어지는 추출물은 카로테노이드로 직접 사용하거나 사용 전에 더 정제할 수도 있다.

추출 처리 후에 얻어지는 추출물(예로서 용액 추출물)로부터 박테리아 등등을 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 그러나 그 예로서 세포막 여과, 원심분리 및 경사법이 포함될 수 있다.

일반적으로, 가열 및/또는 진공 농축(heating and/or vaccum concentration), 결정화(crystallization) 등등이 추출물로부터 카로테노이드 침전물을 얻는 방법으로 사용될 수 있다. 이러한 방법 이외에, 저온 침전 또는 산/알칼리 약제를 사용한 침전 또는 농축하지 않은 다른 염을 사용하여 카로테노이드 색소를 분리할 수 있다. 산업적 사용을 위해서는 추출물을 결정화하는 것이 바람직하다.

필요하다면, 카로테노이드 침전물을 저급 알코올 등의 용매를 소량 사용하여 세척하기 위하여 현탁/교반(suspension/agitation)할 수 있다.

세척 방법은 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 여과하고 현탁/교반 시키는 방법과 침전물 위쪽으로 용액을 통과시키는 방법이 포함될 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 배양 생성물, 제품, 추출물, 정제물은 각각 카로테노이드로 사용되기도 하고, 정해진 비율에 의해서 혼합하여 사용되기도 한다.

< 실시예 >

이하, 실시예 방식으로써 구체적으로 기술될 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

고성능 액상 크로마토그래피를 사용하여 아래 기술한대로 실시예에서 카로테노이드를 정량하였다.

두 개의 컬럼(Inertsil SIL-100A, 5㎛(φ:4.6x250mm)(GL Sciences)이 세로로 사용되었다. 실온과 비슷한 일정 온도에서 이동상(mobile phase)으로 n-헥산/테트라하이드로퓨란/메탄올 혼합액(n-hexane/tetrahydrofuran/methanol mixture liquid)(40:20:1)를 사용하여 분당 1.0ml로 회전시켜 용출(elution)을 수행하였다. 측정을 위하여, 테트라하이드로퓨란에 용해된 표본을 이동상에 100배 희석시키고 결과물 20μL을 주입하였다. 컬럼 용출은 470nm 파장으로 탐지하였다. 또한 아스탁산틴(Sigma 제조, Cat. No. A9335)을 정량을 위한 표준 조제품으로 사용하였다. 표준 용액 내 아스탁산틴 농도는, 측정 후 다음의 공식으로 결정되었다 : (A) 447nm에서의 표준 용액의 흡광도 (B): 상기 조건 하에서 HPLC 분석에서 얻어지는 아스탁산틴 피크(peak)의 면적 퍼센트(%).

아스탁산틴 농도(mg/L) = A/2150×B×100

<실시예 1>

배지 100mL[조성은 다음과 같다 : 수크로즈(sucrose) 30g/L; 옥수수 용액 30g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 3.8g/L; 칼슘 클로라이드 다이하이드레이트(calcium chloride dihydrate) 5.0g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 0.3g/L(pH7.2)]을 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 15분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하여, 분주(seeding)를 위하여 배지를 함유한 7개의 플라스크를 준비하였다.

다음에 배지 2.0L[조성은 다음과 같다 : 글루코즈(glucose) 20g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 0.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 2.25g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 5.7g/L; 칼슘 클로라이드 다이하이드레이트(calcium chloride dihydrate) 0.1g/L; 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 5g/L; 알콜-베이스 소포제(alcohol-based antifoamer) 0.5g/L]를 5L 발효기에 부었다. 7개의 발효기는 이렇게 준비되었다. D-바이오틴을 발효기에 첨가하여 그 농도를 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10, 50mg/L로 만들고 그 결과물을 30분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하였다.

백금 루프가득(platinum loopful)의 파라코커스 카로티니파시엔스 균주(Paracoccus carotinifaciens strain) E-396(FERM BP-4283)을 분주를 위해 위에서 준비한 플라스크 내 배지에 접종하였고, 2일간 28℃에서 100rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 다음에, 결과물 배양용액(각각 80mL)을 120시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위하여 발효기에 분리하여 접촉시켰다. pH는 15% 암모니아수로 계속해서 조절하여 배양 중에 pH 7.2로 유지되도록 하였다. 글루코즈 30g을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하여 글루코즈 고갈을 예방하였다. 또한 교반 회수(최소 교반 회수 :200rpm)를 변화시켜 배양 중간 단계에서 각 배양 용액 내의 용해 산소 농도를 2ppm으로 유지하였다. 기포 감지 센서로 기포 형성이 탐지되면, 기포 형성을 예방하기 위하여 알콜-베이스 소포제(alcohol-based antifoamer)가 자동으로 첨가되었다.

배양 완료 후의 배양 용액 내의 건조 세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 1과 같다. 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율이 바이오틴이 0.001 내지 50mg/L로 첨가된 각각의 실험 플랏(experimental plot)에서, 바이오틴이 첨가되지 않은 실험 플랏에서 보다 낮았다.

< 실시예 2>

배지 100mL[조성은 다음과 같다 : 수크로즈(sucrose) 30g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 3.8g/L; 칼시움 클로라이드 다이하드레이트(calcium chloride dihydrate) 5.0g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 0.3g/L(pH7.2)]를 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 20분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균하여, 분주(seeding)fmf 위하여 배지를 함유한 8개의 플라스크를 준비하였다.

다음에, 배지 2.0L[조성은 다음과 같다: 수크로즈(sucrose) 40g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 0.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 2.25g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 5.7g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(calcium chloride dihydrate) 0.1g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 5g/L; 알콜-베이스 소포제(alcohol-based antifoamer) 0.5g/L]를 5L 발효기에 부었다. 8개의 용기는 이렇게 준비되었다. 각각의 발효기에 0.1mg/L 농도가 되도록 D-바이오틴을 첨가하고 각각의 결과물은 30분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균되었다.

백금 루프가득(platinum loopful)의 파라코커스 카로티니파시엔스 균주 E-396(FERM BP-4283)을 분주를 위해 상기에서 준비한 플라스크 내 배지에 접종하였고, 2일간 28℃에서 100rpm으로 회전 진탕배양하였다. 다음에, 결과물 배양용액(각각 80mL)을 120시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위해서 발효기에 분리하여 접촉시켰다. pH는 15% 암모니아수로 계속해서 조절하여 배양 중에 7.2로 유지되도록 하였다. 수크로즈 고갈을 예방하기 위하여 수크로즈(30g)을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하였다. 또한, 교반회수(최소 교반 회수: 200rpm)를 변화시켜 배양 중간 단계에서 각 배양 용액 내 용존 산소 농도를 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ppm으로 유지되도록 하였다. 기포 감시장치로 기포 형성이 탐지되면, 기포 형성을 예방하기 위하여 알콜-베이스 소포제가 자동으로 첨가되었다.

배양 완료 후의 배양 용액 내의 건조 세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산농도, PHB함량이 측정되었다. 그 결과는 표 2와 같다. 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율은 용존 산소 농도가 증가하면 감소하는 경향을 보였으며, 그 비율은 1.4%까지 감소될 수 있다.

비교하기 위하여, 바이오틴-없는 배지를 사용하여 비슷한 실험이 수행되었다. 그 결과는 표 3과 같다. 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율은 최고 9%까지 감소될 수 있었다.

< 실시예 3>

파라코커스 카로티니파시엔스 균주(Paracoccus carotinifaciens strain) E-396(FERM BP-4283)은 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)으로써 변이 처치되었고, 강한 적색을 띄는 집락이 선택되었다. 선택된 균주의 배양 용액 내의 PHB 농도와 카로테노이드 농도를 측정하였고, 낮은 PHB 생성 능력과 높은 아스탁산틴 생성 능력을 가지는 LP-26 변이 균주가 선택되었다.

배지 100mL[조성은 다음과 같다: 수크로즈(sucrose) 30g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 3.8g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(calcium chloride dihydrate) 5.0g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 0.3g/L(pH 7.2)]를 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 20분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균하여, 분주(seeding)를 위하여 배지를 함유한 플라스크를 준비하였다.

다음에, 배지 2.0L[조성은 다음과 같다 : 글루코즈(glucose) 30g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 0.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 2.25g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 5.7g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(calcium chloride dihydrate) 0.1g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 5g/L; L-모노소디움 글루타메이트 모노하이드레이트(L-monosodium glutamate monohydrate) 6g/L; 알콜-베이스 소포제(alcohol-based antifoamer) 0.5g/L]를 5L 발효기에 부었다. 8개의 발효기가 이렇게 준비되었다. 각각의 발효기에서 0.1mg/L이 되도록 D-바이오틴을 첨가하고 각각의 결과물은 30분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하였다.

상기 방법으로 선택된 백금 루프가득의 파라코커스 박테리아 균주(a platium loopful of Paracoccus bacterial strain) LP-26을 분주(seeding)를 위해 플라스크 내 배지에 접종하였고, 2일간 28℃에서 100rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 결과물 배양 용액 (각각 80mL)을, 140시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위해서 발효기에 분리하여 접촉시켰다. pH는 15% 암모니아수로 계속해서 조절하여 배양 중에 7.2로 유지되도록 하였다. 글루코즈 고갈을 예방하기 위하여 글루코즈(50g)을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하였다. 또한 교반 회수(최소 교반 회수 : 100rpm)를 변화시켜 배양 중간 단계에서 각 배양 용액 내의 용존 산소 농도를 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ppm으로 유지되도록 하였다. 기포 감시 장치로 기포 형성이 탐지되면, 기포 형성을 예방하기 위하여 알콜-베이스 소포제가 자동으로 첨가되었다.

배양 완료 후의 배양 용액 내의 건조 세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 4와 같다. 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율은 용존 산소 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 그 비율은 1.6%까지 감소될 수 있었다.

비교를 위하여, 배양 중간 단계에서 용존 산소 농도를 2ppm으로 조절하면서 바이오틴-없는 배지를 사용하여 비슷한 실험을 수행하였다. 그 결과는 표 5와 같다. 용존 산소 농도를 2ppm으로 조절하면서 바이오틴이 첨가된 배지에서, 아스탁산틴 농도에 대한 칸탁산틴의 농도 비율은 8% 이었다. 반면에, 바이오틴-없는 배지에서는 26.8%로 높았다.

다음에 배양 중간 단계에서 용존 산소농도를 단계적으로 또는 계속적으로 변환(shifting)시키는 실험을 아래 기술하는 네 개의 다른 조건에서 수행하였는데, 이 조건은 D-바이오틴이 0.1mg/L로 되게 첨가되는 조건 및 용존 산소 농도가 적용되는 조건을 제외한 상기의 조건이다.

(변환 조건 1)

배양 중간 단계에서 최초의 용존 산소 농도는 2ppm으로 조절하였고, 40시간 동안 2ppm으로 유지하였다. 그 후에, 용존 산소 농도를 2.5ppm으로 변환하였고 배양 완료까지 2.5ppm으로 유지하였다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 8시간 내에 포화농도에서 2ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며, 8 내지 48시간 내에서 2ppm으로, 48 내지 140 시간 내에서는 2.5ppm으로 조절하였다.

(변환 조건 2)

배양 중간 단계에서 최초의 용존 산소 농도는 1ppm으로 조절하였고 1ppm 수준은 8시간 동안 유지하였으며 그 농도는 시간당 0.1ppm 씩 증가하여 40시간 내에 용존 산소 농도가 5ppm으로 증가하였고 5ppm 수준은 배양 완료까지 유지되었다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 9시간 내에 포화 농도에서 1ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며 9 내지 17시간 내에서 1ppm으로 조절하였고 17 내지 57 시간 내에서는 시간 당 0.1ppm 씩 증가하여 1ppm에서 5ppm으로 증가하였으며 57 내지 140시간 내에서 5ppm으로 조절하였다.

(변환 조건 3)

배양 중간 단계에서 최초의 용존 산소 농도는 3ppm으로 조절하였고 3ppm은 50시간 동안 유지하였다. 다음에, 용존 산소 농도를 3.5ppm으로 변환하였고 배양 완료까지 3.5ppm을 유지하였다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 7시간 내에 포화농도에서 3ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며 7 내지 57 시간 내에서 3ppm으로, 57 내지 140 시간 내에서는 3.5ppm으로 조절하였다.

(변환 조건 4)

배양 중간 단계에서 최초의 용존 산소 농도는 2ppm으로 조절하였고 2ppm은 4시간 동안 유지하였으며 그 농도는 2시간 당 0.1ppm 씩 증가하여 100시간 내에 용존 산소 농도가 7ppm으로 증가하였고 7ppm 수준은 배양 완료까지 유지되었다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 8시간 내에 포화농도에서 2ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며 8 내지 12시간 내에서 2ppm으로 조절하였고 12 내지 112시간 내에서는 2시간 당 0.1ppm 씩 증가하여 2ppm에서 7ppm으로 증가하였으며 112 내지 140시간 내에서 7ppm으로 조절하였다.

배양은 위의 네 가지 다른 조건에서 수행되었다. 배양 완료(배양 개시 140시간) 후 각각의 배양 용액 내에서 건조 세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 6과 같다. 결과는 정해진 수준으로 용존 산소 농도를 조절하여 얻은 결과(표 4)와 비교하였다. 또한, 높은 농도의 생성된 아스탁산틴과 낮은 비율의 생성된 칸탁산틴을 함유하는 배양 용액은 위의 조건 중 어떤 것에서도 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

파라코커스 카로티니파시엔스 균주 E-396(FERM BP-4283)는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)으로 변이 처치되었고 강한 적색의 집락이 선택되었다. 선택된 균주는 시험관에서 배양되었다. 변이 균주는 배양 용액의 pH의 감소가 작고 배양 용액이 강한 적색을 나타내는 조건에서 선택되었다. 선택된 변이 균주의 시험관 내 배양 용액에서 글루콘산 농도와 카로테노이드 농도를 판정하였고, 낮은 글루콘산 생성 능력과 높은 아스탁산틴 생성 능력을 가지는 LG-7 변이 균주가 선택되었다.

배지 100mL[조성은 다음과 같다 : 수크로즈(sucrose) 30g/L; 파르마메디아(pharmamedia) 10g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 0.8g/L; 다이포타시움 하이드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 4.2g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 1g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 12g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 1g/L(pH 7.2)]를 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 20분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균하여 분주를 위하여 배지를 함유한 플라스크를 준비하였다.

다음에, 배지 2.0L[조성은 다음과 같다: 수크로즈(sucrose) 30g/L; 파르마메디아(pharmamedia) 20g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 1.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 3.8g/L; ; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 0.1g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 4.5g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 5g/L; L-모노소디움 글루타메이트 모노하이드레이트(L-monosodium glutamate monohydrate) 6g/L; 실리콘-베이스 소포제(silicone-based antifoamer) 1g/L)]를 5L 발효기에 부었다. 2개의 발효기가 이렇게 준비되었다. 각각의 발효기에서 1mg/L이 되도록 D-바이오틴을 첨가하고 각각의 결과물은 30분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균하였다.

상기 방법으로 선택된 백금 루프가득의 파라코커스 LG-7 균주(Paracoccus LG-7 strain)를 분주(seeding)를 위해 상기 방법으로 준비된 플라스크 내 배지에 접종하였고 3일간 28℃에서 100rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 배양 용액 (각각 80mL)을 120시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위해서 발효기에 분리하여 접촉시켰다. pH는 15% 암모니아 수로 계속해서 조절하여 배양 중에 7.2로 유지되도록 하였다. 수크로즈 고갈을 예방하기 위하여 수크로즈(40g)을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하였다. 또한 교반 회수(최소 교반 회수: 200rpm)를 변화시켜 다음의 두 개의 조건하에서 용존 산소 농도를 조절하였다.

(변환 조건 5)

배양 중간 단계에서 최초 용존 산소 농도는 2.5ppm으로 조절하였고 2.5ppm은 35시간 동안 유지하였다. 그 후에, 용존 산소 농도는 3ppm으로 변환하였고 배양 종료까지 3ppm으로 유지하였다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 8시간 내에 포화 농도에서 2.5ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며 8 내지 43시간 내에서 2.5ppm으로, 43 내지 120시간 내에서는 3ppm으로 조절하였다.

(변환 조건 6)

배양 중간 단계에서 최초 용존 산소 농도는 3.5ppm으로 조절하였고 3.5ppm은 4시간 동안 유지하였으며 그 농도는 4시간 당 0.1ppm 씩 증가하여 60시간 내에 용존 산소 농도가 5ppm으로 증가하였으며 배양 종료까지 5ppm으로 유지하였다. 특히, 용존 산소 농도가 배양 개시 후 0 내지 7시간 내에 포화 농도에서 3.5ppm으로 자연적 감소하는 것은 허용하였으며 7 내지 11시간 내에서 3.5ppm으로, 11 내지 71시간 내에서는 4시간 당 0.1ppm 씩 증가하여 3.5 ppm에서 5ppm으로 증가하였으며 71 내지 120시간 내에서 5ppm으로 조절하였다.

배양은 상기 두 가지 다른 조건에서 수행되었다. 배양 완료(배양 개시 120시간) 후 각각의 배양 용액 내에서, 건조세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 7과 같다. 표 7은 비교를 위하여 바이오틴을 첨가하지 않고 배양 중간 단계와 배양 종료 단계에서 용해 산소 농도를 4ppm으로 일정하게 조절함으로써 얻어진 배양 결과도 나타내고 있다.

< 실시예 5>

배지 100mL[조성은 다음과 같다 : 수크로즈(sucrose) 20g/L; 옥수수용액(corn steep liquor) 5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 0.54g/L; 다이포타시움 하이드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 2.78g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 5g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 3g/L(pH 7.2)]를 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 20분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하여, 분주를 위하여 배지를 함유한 플라스크를 준비하였다.

다음에 배지 2.0L[조성은 다음과 같다: 글루코즈(glucose) 40g/L; 옥수수 용액(corn steep liquor) 30g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 0.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 2.25g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 5.7g/L; ; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 0.1g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 5g/L; L-모노소디움 글루타메이트 모노하이드레이트(L-monosodium glutamate monohydrate) 6g/L; 알콜-베이스 소포제(alcohol-based antifoamer) 0.5g/L)]를 5L 발효기에 부었다. D-바이오틴을 0.1mg/L 농도가 되도록 발효기에 첨가하고, 그 결과물은 30분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하였다.

백금 루프가득의 파라코커스 박테리아 균주(Paracoccus bacterial strain) A-581-1(FERM BP-4671)을 분주(seeding)를 위해 상기에서 준비한 플라스크 내 배지에 접종하였고 2일간 27℃에서 150rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 배양 용액(80mL)을 120시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위해서 발효기에 부었다. pH는 15% 암모니아수로 계속해서 조절하여 배양 중에 7.2로 유지되도록 하였다. 글루코즈 고갈을 예방하기 위하여 글루코즈(30g)을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하였다. 또한 교반 회수(최소 교반 회수 : 200rpm)를 변화시켜 배양 중간 단계에서 배양 용액 내 용존 산소 농도를 2ppm으로 조절하였다.

배양 완료 후 건조세포를 기준으로 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 8과 같다. 표 8은 비교를 위하여 바이오틴을 첨가하지 않고 배양 중간 단게에서 용존 산소 농도를 2ppm으로 일정하게 조절함으로써 얻은 배양 결과도 나타내고 있다.

< 실시예 6>

파라코커스 박테리아 균주 A-581-1(FERM BP-4671)를 변이 처치를 위하여 자외선 조사시켰다. 다음에, 강한 적색을 띄는 집락을 선택하였다. 선택된 균주의 배양 용액 내 카로테노이드를 분석하였다. 그래서 아스탁산틴 생성이 개선된 K-185 변이 균주가 선택되었다.

배지 100mL[조성은 다음과 같다 : 수크로즈(sucrose) 30g/L; 옥수수용액(corn steep liquor) 30g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이포타시움 하이드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 3.8g/L; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 5g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 0.3g/L(pH 7.2)]를 솜으로 틀어막은 500mL 원추형 플라스크에 붓고 20분간 121℃로 가압 멸균기에서 멸균하여 분주(seeding)를 위하여 배지를 함유한 플라스크를 준비하였다.

다음에, 배지 2.0L[조성은 다음과 같다: 글루코즈(glucose) 30g/L; 콩가루(soybean meal) 20g/L; 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 1.5g/L; 포타시움 다이하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate) 1.5g/L; 다이소디움 하이드로겐 포스페이트 도디카하이드레이트(disodium hydrogen phosphate dodecahydrate) 3.8g/L; ; 칼시움 클로라이드 다이하이드레이트(clacium chloride dihydrate) 5g/L; 마그네시움 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 0.7g/L; 아이언 설페이트 헵타하이드레이트(iron sulfate heptahydrate) 0.6g/L; L-모노소디움 글루타메이트 모노하이드레이트(L-monosodium glutamate monohydrate) 6g/L; 에스터-베이스 소포제(ester-based antifoamer) 0.2g/L)]를 5L 발효기에 부었다. D-바이오틴을 1mg/L 농도가 되도록 발효기에 첨가하고 그 결과물은 30분간 121℃로 가압멸균기에서 멸균하였다.

상기에서 선택된 백금 루프가득의 파라코커스 박테리아 균주 K-185를, 분주(seeding)을 위해 위에서 준비한 플라스크 내 배지에 접종하였고 2일간 27℃에서 150rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 배양 용액(80mL)을 120시간 동안 통기부피 1vvm으로 28℃에서 호기성 배양을 위해서 발효기에 첨가하였다. pH는 15% 암모니아 수로 계속해서 조절하여 배양 중에 7.2로 유지되도록 하였다. 글루코즈 고갈을 예방하기 위하여 글루코즈(30g)을 배양 1일, 2일, 3일, 4일에 첨가하였다. 또한, 교반 회전수(최소 교반 회전수 : 200rpm)를 변화시켜 배양 중간 단계에서 배양 용액 내 용존 산소 농도를 3.5ppm으로 조절하였다.

배양 완료 후 건조 세포를 기준으로 카르테노이드 농도, 글루콘산농도, PHB 함량이 측정되었다. 그 결과는 표 9와 같다. 표 9는 비교를 위하여 바이오틴을 첨가하지 않고 배양 중간 단계에서 용존 산소 농도를 3.5ppm으로 조절함으로써 얻은 배양 결과도 나타내고 있다.

여기에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원서는 전체적으로 본 발명의 명세서에 통합된다.

National Institute of Bioscience and Human-technology

FERMBP-4283

19930427

National Institute of Bioscience and Human-technology

FERMBP-4671

19940520

<110> JX Nippon Oil & Energy Corporation <120> Method for producing astaxanthin by fermentation <130> 12fpi-09-02 <150> JP 2010-057321 <151> 2010-03-15 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Paracoccus carotinifaciens <220> <221> misc_feature <222> (1350) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60 gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120 aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180 agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240 atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360 gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420 accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480 agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540 aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600 gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660 gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780 tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900 aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960 cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020 ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080 tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140 gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200 agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260 atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320 accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380 ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440 gatcacctcc tt 1452

Claims

1) 0.02 mg/L 내지 50 mg/L 농도의 바이오틴 함유 배지에서 아스탁산틴과 칸탁산틴을 동시에 생성하는 박테리아를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양 중 배양물 내 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)를 2 내지 3.5 ppm으로 제어하여 배양하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 배양 후에 배양물 내 용존 산소 농도를 단계적 또는 연속적으로 증가시켜 3.5 내지 7 ppm으로 제어하여 배양하는 단계;
를 포함하는, 배양 완료 후의 배양물 내 아스탁산틴(astaxanthin) 생산 농도에 대한 칸탁산틴(canthaxanthin) 생산 농도의 비율이 6 질량% 이하인, 아스탁산틴을 함유한 카로테노이드(carotenoids)의 제조방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 배양 완료 후의 배양 생성물 내 생성된 글루콘산(gluconic acid) 농도가 30g/L 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 배양 완료 후의 배양 생성물 내 건조 세포를 기준으로 폴리-베타-하이드록시부티레이트(poly-β-hydroxybutyrate, PHB) 함량이 20질량% 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 박테리아는 파라코커스속(genus Paracoccus)에 속하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 박테리아는 저하된 PHB 생성 능력을 가지는 변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 박테리아는 저하된 글루콘산 생성 능력을 가지는 변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 박테리아는 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1의 염기서열과 95% 상동성을 나타내는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.

제 15항에 있어서, 상기 박테리아는 기탁번호 FERM BP-4283의 E-396 균주 또는 기탁번호 FERM BP-4671의 A-581-1 균주, 또는 이의 변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.

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