CN109207546A - 一种高虾青素产量的菌株及其应用 - Google Patents
一种高虾青素产量的菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高虾青素产量的菌株，通过转基因技术将Adketo1(SEQ ID No.1)和Adketo2(SEQ ID No.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；然后将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；并通过使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株，并对发酵条件进行优化。发酵生产得到的虾青素为自由态，98％为右旋光结构，并以反式结构为主，动物吸收率可达98％，沉积效果好。本发明的方法能够提高微生物源天然虾青素的生产效率，优化生产工艺，降低生产成本，可用于实现微生物源天然虾青素的较大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高虾青素产量的菌株及其应用。
背景技术
虾青素(astaxanthin)等含氧酮基类胡萝卜素具有抗氧化性能，能够清除体内自由基、延缓衰老。虾青素是一种呈红色的色素，主要在海洋生物体内积累，如，虾、螃蟹、鲑鱼等，在植物界中，虾青素主要存在于蓝细菌、地衣和藻类中，在高等植物中，仅存在与少数植物的花瓣中。虾青素具有超强的抗氧化能力和诸多生物活性，以及这种色素的艳丽红色使得它具有广泛的应用价值和市场潜力。虾青素主要应用于养殖业、食品、保健品和医药等工业。目前虾青素最大的市场是水厂养殖业和家畜养殖业，主要用作鱼类(如鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼等)、虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。虾青素具有良好的着色能力和增强动物免疫功能，并且对他们的生长繁殖也有很重要的作用，虾青素可促进鱼卵受精、减少胚胎发育的死亡率，促进个体生长、增加成熟速度和繁殖力。
虾青素的生产方法主要包括化学法合成法，甲壳类动物废物提取、藻类生物合成、细菌合成、真菌合成、植物基因改造等。然而化学合成虾青素的过程中可能被其他有害物质污染，产品中还含有天然的异构体。由于人们环保意识的增强，化学合成品的使用不仅为广大消费者所警惕，也更为各国法规所限制。并且，化学合成方法得到的虾青素大多数为顺式结构，在养殖物体内不能转化成天然的反式构型，因此，养殖物对化学合成的虾青素吸收能力较弱，利用率仅为40％左右。与天然虾青素相比，化学合成虾青素着色能力和生物效价低得多，因此推广应用受到限制。法夫酵母由于其生产迅速、虾青素产量高等优点，已成为天然虾青素生产的研究热点。
但是，法夫酵母菌株的发酵温度一般为18～22℃，温度较低，菌株的产量有限，而且易于退化是的其工业化生产受到限制。因此必须进行高产菌株选育和菌种改良，以期获得高产虾青素、耐高温发酵的优良菌种。另外，法夫酵母虾青素发酵条件对虾青素的产量也有着重要的影响，因此优化发酵条件也是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高虾青素产量的菌株及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种高虾青素产量的菌株，构建方法包括以下步骤：
1)通过转基因技术将Adketo1(SEQ ID No.1)和Adketo2(SEQ ID No.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；
2)将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；
3)使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株。
进一步地，目的菌株为红法夫酵母。
进一步地，复合酶抑制剂选自葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂、呼吸链抑制剂中的一种。
优选地，复合酶抑制剂选自抗霉素A、β～紫罗兰酮、二苯胺中的一种。
进一步地，电击转化的条件设定为：电压4～6KV/cm，以25～75mmol/L浓度的DTT处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.6～0.8μg/μL。
优选地，电击转化的条件设定为：电压5KV/cm，以50mmol/L浓度的DTT处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.7μg/μL。
一种虾青素生产方法，使用上述的高虾青素产量的菌株发酵制备。
进一步地，培养基中含有麦芽汁提取物和H2O2。
进一步地，培养基中含有3～7g/L麦芽汁提取物和2～6mmol/L H2O2。
优选地，培养基中含有6g/L麦芽汁提取物和5mmol/L H2O2。
进一步地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为4～10L/h。
优选地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6L/h。
进一步地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为400～800Lux。
优选地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为650Lux。
本发明的有益效果是：以微生物红发夫酵母发酵生产天然虾青素。发酵生产得到的虾青素为自由态，98％为右旋光结构，并以反式结构为主，动物吸收率可达98％，沉积效果好。本发明的方法能够提高微生物源天然虾青素的生产效率，优化生产工艺，降低生产成本，可用于实现微生物源天然虾青素的较大规模生产。
具体实施方式
一种高虾青素产量的菌株，构建方法包括以下步骤：
1)通过转基因技术将Adketo1(SEQ ID No.1)和Adketo2(SEQ ID No.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；
2)将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；
3)使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株。
进一步地，目的菌株为红法夫酵母。
进一步地，复合酶抑制剂选自葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂、呼吸链抑制剂中的一种。
优选地，复合酶抑制剂选自抗霉素A、β～紫罗兰酮、二苯胺中的一种。
进一步地，电击转化的条件设定为：电压4～6KV/cm，以25～75mmol/L浓度的DTT处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.6～0.8μg/μL。
优选地，电击转化的条件设定为：电压5KV/cm，以50mmol/L浓度的DTT处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.7μg/μL。
一种虾青素生产方法，使用上述的高虾青素产量的菌株发酵制备。
进一步地，培养基中含有麦芽汁提取物和H2O2。
进一步地，培养基中含有3～7g/L麦芽汁提取物和2～6mmol/L H2O2。
优选地，培养基中含有6g/L麦芽汁提取物和5mmol/L H2O2。
进一步地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为4～10L/h。
优选地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6L/h。
进一步地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为400～800Lux。
优选地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为650Lux。
下面结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
1.引物设计
根据GenBank中获得Adketo1和Adketo2的序列，设计上下游引物。
2.构建质粒
将设计好的上下游引物作为引物，以夏侧金盏花的基因组为模板扩增获得外源基因Adketo1和Adketo2的全长，再利用重组酶将外源基因和载体连接，形成重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，对转化子进行鉴定，再将鉴定成功的转化子摇瓶培养后，提取质粒进行测序。
PCR扩增基因反应过程如下表：
3.重组质粒转化
将测序成功的质粒电击转入红发夫酵母细胞中，对转化子进行鉴定，再将鉴定成功的转化子摇瓶培养后，提取质粒进行测序。
4.菌株筛选
将测序成功的重组菌株进行复合酶抑制剂多轮递推筛选。虾青素筛选中用到的复合酶抑制剂主要有葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂和呼吸链抑制剂，应用效果较好的有抗霉素A、β-紫罗兰酮、二苯胺等。
使用上述的几种复合抑制剂，采用多轮递推进行筛选，选育生长速度较快且虾青素含量更高的菌株，最终筛选到的目标菌株中虾青素含量为出发菌株的13.11倍。
5.发酵
A.培养基
斜面培养基(g/L)葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麦芽汁3，琼脂20，pH5。
液体种子培养基(g/L)葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麦芽汁3，pH5。
发酵培养基(g/L)混合碳源(葡萄糖、蔗糖以质量比4:1混合)30，混合氮源(蛋白胨、(NH4)2SO4)7，MgSO4·7H2O 1.5，(NH4)3C6H5O7 2，Na2HPO42，麦芽汁提取物7，5mmol/LH2O2，pH5。
B.培养方法
a)菌种保藏
(1)菌种接入斜面培养基，20℃培养48h，4℃保藏，每月传代1次；
(2)20℃培养48h，离心后加入无菌新鲜培养基和甘油，甘油浓度10％～20％，-70～-80℃低温冷冻保藏。
b)种子培养
将一环菌苔(20℃培养3～4d的斜面种)接种与250mL的锥形瓶，20℃、150r/min的恒温摇床培养48h。
c)摇瓶培养
250mL锥形瓶中装30mL培养基，灭菌后以8％的接种量接入培养48h的种子液，20℃、150r/min摇床培养。
d)生物反应器培养
反应器和培养基灭菌后以8％的接种量接入培养48h的种子液，控制通气和搅拌，按照一定的方式补料，并定时取样测定数据，培养过程中维持温度为20℃，培养液pH为5。培养过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6L/h，并提供光强为650Lux的光照。
6.虾青素的提取
取培养基，离心分离洗涤3次，加3mol/L HCl，沸水浴3min，迅速冷却，离心分离洗涤2次，加入甲醇震荡提取1min，离心取上清液。如果提取不完全，再加甲醇提取，直至菌体无色。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州立达尔生物科技股份有限公司
<120> 一种高虾青素产量的菌株及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1176
<212> DNA
<213> Adonis aestivalis
<400> 1
agcaatctca gtgttcagta caagttattc tttccacaag aatctcttgt tgcactcaaa 60
acaagacatt ctcaaccgcc catgtttgct cttctctcca gttgtggtgg agtcgcctat 120
gagaaagaaa aagacacatc gtgctgcatg tatctgctct gttgcagaga gaacaaggaa 180
ccttgatatt cctcaaattg aagaagagga agagaacgag gaagaactaa tagaacagac 240
ggattctggc ataattcata taaagaaaac gctagggggg aaacaatcaa gacggtccac 300
tggctccatt gtcgcacccg tatcttgtct tgggatcctt tcaatgatcg gacctgctgt 360
ttacttcaag ttttcacggc taatggagtg tggagatatt cctgtcgcag aaatggggat 420
tacgtttgcc gcctttgttg ctgctgcgat tggcacggaa tttttgtcag gatgggttca 480
caaagaactc tggcacgatt ctttgtggta cattcacaag tctcaccata ggtcacgaaa 540
aggccgcttc gagttcaatg atgtgtttgc tattattaac gcgcttcctg ctattgctct 600
tatcaattat ggattctcaa atgaaggcct ccttcctgga gcctgctttg gtaccggtct 660
tggaacgaca gtctgtggca tggcttacat ttttcttcac aatggccttt cacaccgaag 720
gttcccagta gggcttattg caaacgtccc ttatttccac aagctggctg cagctcacca 780
aatccatcac tcaggaaaat ttcagggtgt accatttggc ctgttccttg gaccccagga 840
attggaagaa gtaagaggag gcactgaaga attggagagg gtgatcagtc gtacagctaa 900
acgaacgcaa tcatctacat gaatcaactc ttttacattt atgaggtttt agtttatcgg 960
tgttacaagt cacacatttg tgtcgttgta gtaattcaaa gttaccatac tcttttttag 1020
aatttttttt tgatgtatag gtcgcggagt tacggttaca aaggccaaat ctattgttgt 1080
ggaattccat tattaaaaat aaaaattaga gtttgtagtt ttatctggtg atcaatatca 1140
atatatatta attaaagcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1176
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<211> 1112
<212> DNA
<213> Adonis aestivalis
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<400> 6
tcgttgtgga attccattat 20
Claims (10)
1.一种高虾青素产量的菌株，其特征在于：构建方法包括以下步骤：
1)通过转基因技术将Adketo1(SEQ ID No.1)和Adketo2(SEQ ID No.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；
2)将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；
3)使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：目的菌株为红法夫酵母。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：复合酶抑制剂选自葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂、呼吸链抑制剂。
4.根据权利要求3所述的菌株，其特征在于：复合酶抑制剂选自抗霉素A、β～紫罗兰酮、二苯胺。
5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：电击转化的条件设定为：电压4～6KV/cm，以25～75mmol/L浓度的DTT处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.6～0.8μg/μL。
6.一种虾青素生产方法，其特征在于：使用权利要求1～5任一项所述的菌株发酵制备。
7.根据权利要求6所述的虾青素生产方法，其特征在于，培养基中含有麦芽汁提取物和H2O2。
8.根据权利要求6所述的虾青素生产方法，其特征在于，培养基中含有3～7g/L麦芽汁提取物和2～6mmol/L H2O2。
9.根据权利要求6所述的虾青素生产方法，其特征在于，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为4～10L/h。
10.根据权利要求6所述的虾青素生产方法，其特征在于，发酵过程中，还需要提供光照，光强为400～800Lux。
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-
2018
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