CN114317332A - 一种好氧光合细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的好氧光合细菌SY5及其应用;本发明的好氧光合细菌SY5可以在好氧、黑暗、无菌的条件下发酵生产,无需光照,节省能源,不会产生臭气,且获得的发酵产品质量可控,是一种可以适用于产业化发酵生产的优良菌株;本发明的好氧光合细菌SY5,可以作为益生菌应用于改善水质或者应用于水产养殖,特别是,用于水产养殖的饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种好氧光合细菌及其应用,具体涉及一种筛选出来的能够进行好氧光合作用的类球红细菌,以及其作为益生菌在改善水质方面的应用,以及其作为益生菌在水产养殖方面的应用,特别是,用于水产养殖的饲料添加剂。
背景技术
光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB),是一类具有原始光能合成体系的原核生物,能够以光作为能源,在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物和氨等作为供氢体和碳源进行光合作用;其广泛分布于湖泊、海洋和土壤中,在自然界物质循环中起着十分重要的作用。
光合细菌,在生态系统中扮演着“分解者”的角色,能够大量吸收分解水中的氨、氮、硫化氢等有害物质,把池塘中复杂的有机物分解成简单的无机物,释放到环境中,具有很高的水质净化能力。此外,光合细菌还能够有效避免“水华”的产生,抑制蓝藻、甲藻等有害藻类的生长。因此,光合细菌常作为益生微生物菌,应用于水产养殖领域或水环境治理。例如,鱼虾蟹养殖池中,常因饵料或排泄物过多而引起水质恶化,导致鱼虾蟹大批死亡,加入少量光合细菌就能够使水质得到改善。
光合细菌不仅富含诸如类胡萝卜素和辅酶Q1的生物活性物质,有促进生长的功效。据报道,光合细菌在繁殖时还会释放具有抗病力的酵素,对一些可引起诸如鱼虾蟹贝等水产动物的细菌性疾病的病原菌具有一定的抑制作用。因此,光合细菌也常作为饲料添加剂,应用于养殖水产动物(诸如鱼、虾、蟹、贝)等。
目前,中国国家农业农村部第105号公告中所列出的、允许作为饲料添加剂使用的微生物光合细菌为沼泽红假单胞菌。这种光合细菌为厌氧菌,发酵生产的过程中会产生大量臭气,且由于无法采用无菌发酵培养的方式,所以很容易产生杂菌污染,对于发酵生产的要求比较高,生产成本较高。
因此,本领域希望能够筛选获得好氧光合细菌,以作为益生菌应用于改善水质,或者应用于水产养殖。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题,本发明第一方面提供了一种类球红细菌SY5,该类球红细菌SY5保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No:M20211233。
本发明第二方面提供了上述的类球红细菌SY5,其作为益生菌在改善水质方面的应用。
优选的,所述应用为在水环境治理中改善水质的应用,或者改善水产养殖水体的水质的应用。
本发明第三方面提供了一种改善水质的益生菌剂,所述益生菌剂为液体制剂,其包含上述的类球红细菌SY5的发酵菌液;或者,所述益生菌剂为粉剂,其包含上述的类球红细菌SY5的发酵菌液经干燥制得的菌粉。
本发明第四方面提供了一种水质净化产品,所述水质净化产品包含上述的类球红细菌SY5。
优选的,该水质净化产品包含上述的改善水质的益生菌剂。
本发明第五方面提供了上述的类球红细菌SY5,其作为益生菌在水产养殖方面的应用。
优选的,所述类球红细菌SY5应用于中华绒螯蟹的养殖。
本发明第六方面提供了一种水产养殖的饲料添加剂,其中,所述饲料添加剂包含上述的类球红细菌SY5。
优选的,所述饲料添加剂包含如上述的类球红细菌SY5的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。
本发明第七方面提供了一种水产养殖的饲料,其中,所述饲料包括基础饲料和上述的饲料添加剂。
优选的,所述水产养殖的饲料为螃蟹饲料。
本发明提供了一种新的好氧光合细菌SY5及其应用;本发明的好氧光合细菌SY5可以在好氧、黑暗、无菌的条件下发酵生产,无需光照,节省能源,不会产生臭气,且获得的发酵产品质量可控,是一种可以适用于产业化发酵生产的优良菌株;本发明的好氧光合细菌SY5,可以作为益生菌应用于改善水质或者应用于水产养殖,特别是,用于水产养殖的饲料添加剂。
附图说明
图1为本发明类球红细菌SY5经染色后在100倍光学显微镜下的菌体形态图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明,但本发明并不限于这些具体实施方式。
下面具体实施方式中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版,科学出版社)或按照产品说明书进行。
一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的好氧光合细菌——类球红细菌SY5(Rhodobacter sphaeroides SY5)CCTCC No:M 20211233的操作过程。
1)初筛
称取养殖池底泥10g(取自山东省威海荣成市虎山镇进丰水产养殖场),加入盛有15mL培养基(光合细菌富集培养基,购自上海傲之珊实业发展有限公司)的带螺口的塑料离心管中;置于光照强度1000Lx、30℃的恒温培养箱培养7天后,从变浑浊的塑料离心管中取出1mL液体,采用稀释涂布平板法在分离培养基(光合细菌分离培养基,购自上海傲之珊实业发展有限公司) 平板上进行菌株分离;然后,再于光照强度1000Lx、30℃恒温培养7天后,无菌操作挑取生长情况良好的光合细菌单菌落,作为候选菌株,在营养琼脂平板上进行划线纯化,于30℃恒温培养3天后保存备用。
2)以类胡萝卜素为指标进行进一步筛选;无菌操作将上述步骤1)分离获得的候选菌株(菌浓度为8.0×108CFU/mL,培养液5.0mL)接种至营养肉汤中,于光照强度1000Lx、180r/min、30℃恒温摇床培养36小时后,于4000 r·min-1离心5分钟,用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤,再于相同条件下反复离心并洗涤3次后悬浮于60%蔗糖溶液中;最后,采用紫外可见分光光度计在波长476nm和530nm处测定各候选菌株细胞中的类胡萝卜素的吸光度值,吸光度值最高的候选菌株,即为本发明筛选获得的具有好氧光合作用的优良菌株,命名为SY5。
二、关于本发明的本发明的好氧光合细菌SY5的鉴定过程如下:
(1)分子生物学鉴定
根据细菌16S rRNA序列,采用系统发育分析对筛选获得的菌株SY5进行分子生物学的鉴定。
具体的,将筛选获得的菌株SY5,在光合细菌富集培养基中,28℃环境下培养至对数期,以12000转/分钟离心5分钟收集菌体;采用天根生化科技 (北京)有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组总DNA;以总DNA为模板,对其16S rRNA基因进行PCR扩增,其中正向引物序列为:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.1),反向引物序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.2);PCR反应体系 50.0μL(10×Easy taqBuffer(Mg2+)5.0μL,High Pured NTP 4.0μL,正向反向引物各0.5μL,Easy Taq酶1.0μL,双蒸水补足至50.0μL);PCR的扩增条件为:95℃预变性3min;95℃1min,60℃1min,72℃1min,共35个循环。
经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段,并采用上海天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收;回收样品送至上海迈普生物科技有限公司进行测序。
测定的菌株SY5的16S rRNA序列(如SEQ ID NO.3所示)。
利用GenBank数据库中的NCBI BLAST,将菌株SY5的16S rRNA序列进行同源性比对;从比对结果看,菌株SY5与数据库中的类球红细菌菌株自然聚类。
此外,利用MEGA6.0软件通过邻接法构建系统发育树 (Replications=1000,bootstrap值取百分比),经鉴定,本发明筛选获得的好氧光合细菌SY5为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
(2)形态学鉴定
菌株SY5为革兰氏染色阴性菌,在营养琼脂平板上形成的菌落特征为:红色、圆形、隆起、边缘整齐。在形态上与常见的呈卵球形的类球红细菌类似。
菌株SY5经革兰氏染色后,在100倍光学显微镜下的照片参见图1。
(3)生理生化鉴定
参照东秀珠等编订的《常见细菌系统鉴定手册》(第一版)中相应属、种鉴定的有关内容选择生理生化试验性状,采用细菌微量生化鉴定管,对菌株 SY5进行生理生化鉴定。
从生理生化结果来看,菌株SY5呈过氧化氢酶阳性,可发酵葡萄糖、果糖、甘油、甘露糖、甘露醇、乙醇和山梨醇,但不能发酵半乳糖醇;能够利用甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠和酒石酸钠,但不能利用丙酸钠、苯甲酸钠、硫代硫酸钠和硫化钠,与《常见细菌系统鉴定手册》中类球红细菌的生理生化特征基本一致。
综合第(1)~(3)部分的鉴定结果,最终认定本发明筛选获得的好氧光合细菌SY5为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
三、关于菌株的保藏
本发明的好氧光合细菌SY5,属于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides),已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2021年09月 29日,其保藏编号为CCTCC No:M20211233。
四、本发明的好氧光合细菌SY5的发酵培养方法
将本发明的好氧光合细菌SY5的单菌落接种至20mL类球红细菌发酵培养基(类球红细菌培养基可以采用市售的常规的类球红细菌培养基),于30℃恒温黑暗摇床振荡培养36小时;再将其转接至200mL类球红细菌发酵培养基,于30℃恒温黑暗摇床振荡培养36小时,获得的深红色发酵液为本发明的好氧光合细菌SY5的发酵液。经检测,该发酵液的菌浓度大约为 108~109CFU/ml。
本发明的好氧光合细菌SY5的生长速度快,并且发酵培养的操作条件较为简单,一方面可以在好氧、黑暗的情况下进行发酵生产,无需光照,节省能源;另一方面,可以在无菌发酵培养基环境下进行发酵生产,能够减少杂菌污染,获得的发酵产品质量可控。此外,不同于现有技术的厌氧光合细菌,本发明的好氧光合细菌SY5的整个发酵生产过程中,不会产生臭气/臭味。综上,本发明的好氧光合细菌SY5是一种可以适用于产业化的发酵生产的优良菌株。
五、对本发明的好氧光合细菌SY5所产生的色素进行分析
具体的试验方法为:取上述第四部分获得的菌株SY5的发酵液5.0mL, 4000r·min-1离心5分钟,用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤,再于相同条件下反复离心并洗涤3次后悬浮于60%的蔗糖溶液中,采用紫外可见分光光度计在波长200~700nm范围测定吸光值。
测定结果:菌株SY5在波长370nm、476nm、530nm和560nm处有特征吸收峰;这表明菌株SY5除了能产生类胡萝卜素(476nm和530nm)外,还含有叶绿素a(370nm)和叶绿素b(560nm)。
这表明,本发明的好氧光合细菌SY5,能够生产类胡萝卜素、叶绿素a 和叶绿素b等生物活性物质,有促进生长的功效。
六、本发明的好氧光合细菌SY5的耐药性分析
从上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定可以看出,本发明的好氧光合细菌SY5呈过氧化氢酶阳性,可发酵分解包括葡萄糖、果糖、甘油、甘露糖、甘露醇、乙醇和山梨醇在内的有机物,还能够利用包括甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠和酒石酸钠在内的物质,因此,本发明的好氧光合细菌SY5,也像其他光合细菌一样,具有很高的水质净化能力,能够应用于水环境治理,改善水环境的水质,或者应用于水产养殖水体,例如,投入鱼虾蟹养殖池中,改善水产养殖水体的水质(改善因饵料或排泄物过多而引起水质恶化的状况)。
考虑到对于水环境/养殖水体的安全性影响,发明人测定了本发明的好氧光合细菌SY5的耐药性;具体的,采用K-B纸片扩散法,并根据杭州滨河微生物试剂有限公司提供的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》,判定菌株对19种常见抗生素药物的敏感性。
测定结果见下表1。
表1菌株SY5的药物敏感性检测结果
注:S-高度敏感;I-中度敏感;R-耐药。
从表1的结果可以看出,菌株SY5对15种常见抗生素(阿莫西林、氟苯尼考、新霉素、庆大霉素、奈替米星、四环素、诺氟沙星、多粘菌素B、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、卡那霉素、罗红霉素、吡哌酸和链霉素) 高度敏感,对多西环素中度敏感;其仅对杆菌肽、萘啶酸和磺胺异噁唑这3 种抗生素有耐药性。这说明,菌株SY5对于绝大多数常见的抗生素没有耐药性,不存在成为超级细菌,对水环境/水体带来生物安全风险。
这表明,本发明的好氧光合细菌SY5应用于水环境治理或水产养殖水体是安全的。
基于光合细菌本身的特性以及上述的生理生化鉴定结果和耐药性分析结果,本领域技术人员可以将本发明的好氧光合细菌SY5作为益生菌应用于改善水质;具体的,可以应用于水环境治理中改善水质,或者,应用于改善水产养殖水体的水质。
关于本发明的好氧光合细菌SY5的改善水质应用产品,可以将发酵生产获得的发酵液直接应用或将发酵液处理制成菌液制剂来应用,也可以将获得的发酵液进行干燥处理,例如微囊包埋处理或冷冻干燥处理,制成菌粉制剂来应用。
本发明的好氧光合细菌SY5的发酵液或菌液制剂或菌粉制剂,可以直接泼洒于水环境中或者水产养殖的水体中;或者,也可以将本发明的好氧光合细菌SY5与其他已知的改善水质的益生菌,或者其他已知的改善水质的光合细菌进行组合,制成复合益生菌剂,直接泼洒于水环境中或水产养殖水体中。
七、本发明的好氧光合细菌SY5的毒力测定
毒力测定实验所采用的水产动物模型为中华绒螯蟹。
试验包括1个对照组和5个实验组,每组3个平行水族缸,每个水族缸盛有60L曝气自来水并放入健康中华绒螯蟹10只。在试验组中华绒螯蟹的第三步足基部注射0.1mL终浓度分别为5.0×105、5.0×106、5.0×107、5.0×108、 5.0×109CFU mL-1的菌株SY5;对照组注射等量的无菌生理盐水。连续7天每天观察各组中华绒螯蟹的临床表现,并记录各组中华绒螯蟹的死亡数量。试验期间水温为26℃,pH为8.0,溶解氧为8.0mg L-1。每天(8:00、18:00)正常投饲中华绒螯蟹基础饲料,投喂量为蟹体质量的3%。
实验结果见表2。
表2菌株SY5对中华绒螯蟹的毒力测定结果
从表2结果可以看出,以终浓度为5.0×105~5.0×109CFU/mL的菌株SY5 注射健康中华绒螯蟹,中华绒螯蟹摄食正常,应激敏捷,未出现任何发病和死亡现象,且对照组也未出现任何死亡与不正常现象。这说明,本发明的好氧光合细菌SY5对中华绒螯蟹的LC50至少大于5.0×109CFU/mL。
表2的结果证明了,即使将本发明的好氧光合细菌SY5注射到中华绒螯蟹体内,也不会对中华绒螯蟹生长带来不利影响,本发明的好氧光合细菌SY5 对中华绒螯蟹的LC50至少大于5.0×109CFU/mL。
八、本发明的好氧光合细菌SY5对于中华绒螯蟹抗病原菌感染的效果
参照文献(杨剑,黄明,陈明,王瑞,李莉萍,梁万文,胡庭俊.三黄连合剂对罗非鱼人工感染海豚链球菌病的预防效果[J].南方农业学报,2015,46(5):911-916.)的方法检测本发明的好氧光合细菌SY5对中华绒螯蟹抗弗氏柠檬酸杆菌的感染能力的影响。
检测试验设置1个对照组和5个实验组,每组3个平行水族缸,每个水族缸盛有60L曝气自来水并放入健康中华绒螯蟹10只。试验期间水温为26℃,pH为8.0,溶解氧为8.0mgL-1。
试验前,分别制备含本发明的SY5菌株的实验饲料和含弗氏柠檬酸杆菌 (采用来源于国家水生动物病原库的中华绒螯蟹黑鳃病病原菌,弗氏柠檬酸杆菌C1)的毒饵。
其中,实验饲料采用购自江苏洪祥饲料科技有限公司穆墩岛牌的螃蟹饲料作为基础饲料,将SY5菌株的发酵液50mL添加到500g基础饲料中充分搅拌均匀,33℃风干48h配制而成。5个实验组配制好的实验饲料,含SY5 菌株的浓度分别为6.0×105、6.0×106、6.0×107、6.0×108、6.0×109CFU/g饲料。
毒饵,也采用上述的基础饲料,将弗氏柠檬酸杆菌50mL添加到500g 基础饲料中分搅拌均匀,33℃风干48h配制而成;配制好的毒饵,含弗氏柠檬酸杆菌的浓度为6.0×107CFU/g饲料。
实验组的中华绒螯蟹投喂新鲜制备的含上述不同浓度菌株SY5的实验饲料,对照组投喂基础饲料,每日8:00、18:00各投喂1次,投喂量为幼蟹体质量的3%,连续投喂21天。
之后,立即对各组中华绒螯蟹通过投喂毒饵的方式进行人工感染试验,毒饵于每日8:00、18:00各投喂1次,投喂量为幼蟹体质量的3%,连续投喂 7天。
每天观察并记录各实验组与对照组的中华绒螯蟹的发病及死亡情况。
附注:在本试验中,死亡的中华绒螯蟹均出现了黑鳃、肝胰腺呈灰黑色等病症,且从死蟹体内分离到了与本试验所采用的弗氏柠檬酸杆菌生理生化特征一致的菌株,说明本试验对照组中华绒螯蟹的死亡是弗氏柠檬酸杆菌感染所致。
实验组与对照组的中华绒螯蟹的死亡情况和平均死亡率(%)结果,参见下表3。
表3
表3的结果可以看出,与投喂基础饲料的对照组相比,投喂含本发明SY5 菌株的实验饲料(SY5菌株终浓度分别为6.0×105、6.0×106、6.0×107、6.0×108和6.0×109CFU/g)的实验组中华绒螯蟹的死亡率分别降低了50.00%、66.70%、76.67%、80%、80%,对应计算出的有效保护率分别为62.50%、83.33%、 95.83%、100%和100%。结果证明:本发明的SY5菌株对中华绒螯蟹抗弗氏柠檬酸杆菌感染具有良好的保护能力。
为了进一步验证,发明人还检测了本发明的SY5菌株对于中华绒螯蟹抗维氏气单胞菌HXH1(中华绒螯蟹肝胰腺坏死病病原菌,采自国家水生动物病原库)感染的效果,按照上述同样的方法进行了试验。试验结果显示,投喂含本发明SY5菌株的实验饲料(SY5菌株终浓度分别为6.0×105、6.0×106、 6.0×107、6.0×108和6.0×109CFU/g)的实验组中华绒螯蟹的死亡率分别降低了43.3%、63.3%、73.3%、80%、80%,对应计算出的有效保护率分别为54.1%、 79.1%、91.6%、100%和100%。
发明人还检测了本发明的SY5菌株对于中华绒螯蟹抗点状产气单胞菌 DD5(中华绒螯蟹肠炎病病原菌,采自国家水生动物病原库)感染的效果,按照上述同样的方法进行了试验。试验结果显示,投喂含本发明SY5菌株的实验饲料(SY5菌株终浓度分别为6.0×105、6.0×106、6.0×107、6.0×108和6.0×109 CFU/g)的实验组中华绒螯蟹的死亡率分别降低了46.7%、60.0%、70.0%、 80%、80%,对应计算出的有效保护率分别为58.4%、75.0%、87.5%、100%和100%。
基于光合细菌本身的特性,以及上述第四-八部分的结果,本领域技术人员可以将本发明的好氧光合细菌SY5应用于水产养殖方面,特别是应用于螃蟹,尤其是应用于中华绒螯蟹的养殖。
具体的,本发明的好氧光合细菌SY5的发酵液或菌液制剂或菌粉制剂,也可以作为水产养殖的饲料添加剂拌入水产养殖饲料中。
例如,将发酵液或菌液制剂喷洒到水产养殖的基础饲料中,充分搅拌均匀,于阴凉通风处晾干即获得水产养殖饲料产品。也可以将本发明的好氧光合细菌SY5的菌粉制剂,直接拌入到水产养殖的基础饲料中搅拌均匀获得水产养殖饲料产品,或者再继续加入适量的液态的饲料增效剂(例如每1Kg饲料基础组分加入22g液态的饲料增效剂)并混合搅拌均匀,在饲料颗粒外部形成包膜,最后将拌好的饲料于阴凉通风处晾干获得水产养殖饲料产品。
将获得的水产养殖饲料产品,按照常规养殖方法投喂鱼虾蟹贝类水产动物。
优选的,本发明的好氧光合细菌SY5的发酵液或菌液制剂或菌粉制剂,作为螃蟹饲料添加剂拌入螃蟹饲料中。优选的,获得的螃蟹饲料产品,按照常规养殖方法投喂中华绒螯蟹。
关于饲料中的好氧光合细菌SY5的菌含量,本领域技术人员可以根据好氧光合细菌SY5的有效剂量的统计实验结果和实际的饲料投喂量进行调整。例如,结合上述第八部分实验中的饲料投喂量以及表3的实验结果,建议螃蟹饲料中,类球红细菌SY5的浓度大于等于1.0×105CFU/g饲料。
应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施方式中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明,它们并非用以限制本发明的保护范围,凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种类球红细菌SY5,该类球红细菌SY5保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No:M 20211233。
2.如权利要求1所述的类球红细菌SY5,其作为益生菌在改善水质方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于:所述应用为在水环境治理中改善水质的应用,或者改善水产养殖水体的水质的应用。
4.一种水质净化产品,其特征在于:所述水质净化产品包含如权利要求1所述的类球红细菌SY5。
5.如权利要求1所述的类球红细菌SY5,其作为益生菌在水产养殖方面的应用。
6.如权利要求5所述应用,其特征在于:所述类球红细菌SY5应用于中华绒螯蟹的养殖。
7.一种水产养殖的饲料添加剂,其特征在于:所述饲料添加剂包含如权利要求1所述的类球红细菌SY5。
8.如权利要求7所述的水产养殖的饲料添加剂,其特征在于:所述饲料添加剂包含如权利要求1所述的类球红细菌SY5的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。
9.一种水产养殖的饲料,其特征在于:所述饲料包含基础饲料和采用如权利要求7或8所述的饲料添加剂。
10.如权利要求9所述水产养殖的饲料,其特征在于:所述水产养殖的饲料为螃蟹饲料。
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