CN114350532A - 一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其整体步骤为：步骤一、YM斜面培养基活化；步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选；步骤三、YM培养基摇瓶产量验证；步骤四、高产菌株传代稳定性验证。本发明通过活化、复壮获得的高产量菌株，其产量较之前提高83.2％，菌株传代稳定，适合进一步研究或者作为生产用菌种。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)的化学名为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素。其分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键，是一种萜烯类不饱和化合物。虾青素作为一种高效的纯天然抗氧化剂，具有清除人体内自由基，提高人体抗衰老能力的功能。天然虾青素能够穿透血脑屏障、血胰腺屏障、血睾丸屏障这三大人类主要屏障，并且是唯一能穿透血脑屏障的类胡萝卜素，因此是可能作用于脑细胞和眼球视网膜的唯一一种类胡萝卜素，在医药、保健品等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔开发前景。
红法夫酵母能够利用多种糖作为碳源进行异养代谢；培养时间短，并且不需要光照；能够在发酵罐中实现高密度培养；提取后的酵母细胞还可以提供其它营养物质，如蛋白质、脂类和维生素B等特征，因此，采用红法夫酵母生产虾青素具有更加广阔的开发前景。
随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正变(自发突变)和负变两种，其中负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降。由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
菌种的复壮(rejuvenation)：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变(正变)不断地从生产中选种。
目前，红法夫酵母退化菌株造成虾青素生产效率低，急需寻找一种高产虾青素红法夫酵母的复壮方法。
发明内容
为克服所述不足，本发明的目的在于提供一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，本发明针对虾青素特性和红法夫酵母菌株特性，建立了一种可以快速复壮红法夫酵母退化菌株，得到高产虾青素的红法夫酵母菌株，而且菌株传代稳定，适合作为生产用菌株。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于18～25℃下培养4d～7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于18～25℃下培养4d～7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于添加不同筛选剂的YM培养基平皿中，于18～25℃下培养4d～7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落数十株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将单菌落接种YM液体培养基中，于18～25℃下培养36h～72h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于18～25℃下培养3d～6d，放瓶验证产量；
步骤四、反复进行平皿筛选及单菌落产量验证：将步骤三筛选到的高产单菌落重复步骤二和步骤三，直至筛选得到高产虾青素的红法夫酵母单菌落；
步骤五、高产菌株传代稳定性验证：将步骤四得到的单菌落接种YM斜面，于18～25℃下培养4d～7d，依次进行传代，每隔5代验证其产量，共计传20～30代。
进一步地，所述YM固体培养基、YM液体培养基在接种之前，均经过121℃、25min高压灭菌处理。
进一步地，所述YM培养基平皿添加的筛选剂为：β-紫罗兰酮、氟伐他汀、亚硝酸钠等其中的一种或其中几种的组合；
进一步地，所述产量验证摇瓶培养均置于全程避光的条件下进行。
本发明具有以下有益效果：本申请通过添加相关筛选剂可以对退化的红法夫酵母菌株进行快速复壮，可显著提高红法夫酵母生产虾青素的产量，对于在工业上采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研究价值及良好的应用前景。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为200mg/L的β-紫罗兰酮，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于21℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落62株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于21℃下培养60h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于21℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为200mg/L的β-紫罗兰酮的YM培养基筛选平皿中，于21℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落54株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于21℃下培养60h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于21℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
实施例2
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于23℃下培养6d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于23℃下培养6d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为200mg/L的氟伐他汀，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于23℃下培养6d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落55株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于23℃下培养48h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于23℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为200mg/L的氟伐他汀的YM培养基筛选平皿中，于23℃下培养6d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落48株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于23℃下培养48h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于23℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
实施例3
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于20℃下培养7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于20℃下培养7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为0.3g/L的亚硝酸钠，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于20℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落49株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于20℃下培养66h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于20℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为0.3g/L的亚硝酸钠的YM培养基筛选平皿中，于20℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落41株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于20℃下培养66h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于20℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
实施例4
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为200mg/L的β-紫罗兰酮，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于21℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落62株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于21℃下培养60h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于21℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为200mg/L的氟伐他汀的YM培养基筛选平皿中，于23℃下培养6d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落36株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于23℃下培养48h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于23℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
实施例5
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于21℃下培养7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为200mg/L的β-紫罗兰酮，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于21℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落62株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于21℃下培养60h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于21℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为0.3g/L的亚硝酸钠的YM培养基筛选平皿中，于20℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落37株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于20℃下培养66h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于20℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
实施例6
一种基于高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，整体步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于23℃下培养6d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于23℃下培养6d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：YM固体培养基经121℃灭菌后，添加浓度为200mg/L的氟伐他汀，混匀后倾倒平皿，将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于YM培养基筛选平皿中，于23℃下培养6d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落55株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于23℃下培养48h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于23℃下培养5d，放瓶验证产量，得虾青素高产菌株；
步骤四、YM培养基平皿二次筛选：将步骤三筛选到的高产菌株涂布于添加浓度为0.3g/L的亚硝酸钠的YM培养基筛选平皿中，于20℃下培养7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落40株；
步骤五、二次筛选产量验证：将筛选出的平皿单菌落接种于YM液体培养基中，于20℃下培养66h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于20℃下培养5d，放瓶验证产量，得复壮虾青素高产菌株。
本实施例中，菌株活化培养、筛选培养及摇瓶产量验证培养均置于避光条件下进行。
为了对上述实施例的具体使用效果做进一步验证，以复壮前菌株为对照，对各实施例中虾青素的产量进行比较，结果表1所示：
表1
本发明利用红法夫酵母产虾青素的代谢途径特性，在复壮培养基中添加β-紫罗兰酮、氟伐他汀、亚硝酸钠等酶的抑制剂或者产生氧自由基，对红法夫酵母菌株进行定向筛选。结果表明，以此种方法复壮的红法夫酵母菌株，可以显著促进虾青素的合成，对于在工业上采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研究价值及良好的应用前景。
本发明不局限于所述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (5)
1.一种高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其特征在于：所述方法的步骤为：
步骤一、YM斜面培养基活化：取退化的红法夫酵母菌种，接种于YM培养基斜面中，于18～25℃下培养4d～7d，得一代活化斜面；将一代活化菌种接种于新的YM培养基斜面中，于18～25℃下培养4d～7d，得红法夫酵母活化菌种；
步骤二、添加筛选剂的YM培养基平皿筛选：将红法夫酵母活化菌种稀释一定梯度，涂布于添加不同筛选剂的YM培养基平皿中，于18～25℃下培养4d～7d，挑取颜色最红，菌落最大的单菌落数十株；
步骤三、YM培养基摇瓶产量验证：将单菌落接种YM液体培养基中，于18～25℃下培养36h～72h，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于YM液体培养基中，于18～25℃下培养3d～6d，放瓶验证产量；
步骤四、反复进行平皿筛选及单菌落产量验证：将步骤三筛选到的高产单菌落重复步骤二和步骤三，直至筛选得到高产虾青素的红法夫酵母单菌落；
步骤五、高产菌株传代稳定性验证：将步骤四得到的单菌落接种YM斜面，于18～25℃下培养4d～7d，依次进行传代，每隔5代验证其产量，共计传20～30代。
2.根据权利要求1所述的高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其特征在于：所述YM固体培养基、YM液体培养基在接种之前，均经过121℃、25min高压灭菌处理。
3.根据权利要求1所述的高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其特征在于：所述YM培养基平皿添加的筛选剂为：β-紫罗兰酮、氟伐他汀、亚硝酸钠等其中的一种。
4.根据权利要求1所述的高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其特征在于：所述YM培养基平皿添加的筛选剂可以是β-紫罗兰酮、氟伐他汀、亚硝酸钠等其中几种的组合。
5.根据权利要求1所述的高产虾青素红法夫酵母的复壮方法，其特征在于：所述产量验证摇瓶培养均置于全程避光的条件下进行。
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