NO313204B1

NO313204B1 - Bakterier som tilhörer en ny slekt og fremgangsmåte for fremstilling av karotenoider ved bruk av disse

Info

Publication number: NO313204B1
Application number: NO19942731A
Authority: NO
Inventors: Akira Tsubokura; Hisashi Yoneda; Mikihiro Takaki; Takashi Kiyota
Original assignee: Nippon Mitsubishi Oil Corp
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1994-07-21
Publication date: 2002-08-26
Also published as: EP0635576B1; DE69425706D1; EP0635576A1; NO942731D0; CA2128549C; NO942731L; DE69425706T2; US5858761A; US5607839A; CA2128549A1

Abstract

Bakterie som tilhører en ny slekt, og fremgangsmåte for fremstilling av karotenoid-pigment valgt fra gruppen som består av astaxantin, adonixantin,3-karoten, echinenon, cantaxantin og zeaxantin, som omfatter trinnene å dyrke en bakterie som kan danne minst ett av karotenoid-pigmentene, og utvinne et individuelt karotenoid-pigment.Produksjonsbakterien tilhører en ny slekt.I henhold til den foreliggende fremgangsmåte kan forskjellige karotenoider fremstilles i industriell målestokk.Ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte kan (S,S)-astaxantin fremstilles med en renhet på nesten 10%.

Description

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer bakterier som tilhører en ny slekt, og en fremgangsmåte for fremstilling av karotenoider ved anvendelse av en bakterie som tilhører den nye slekt. Karotenoidene ifølge den foreliggende oppfinnelse er naturlige pigmenter som er egnet som fortilsetningsstoffer, matvare-tilsetningsstoffer o.s.v. Astaxantin er særlig verdi-fullt ut fra et industrielt synspunkt som f6r-tilsetningsstoff så som fargeforbedringsmiddel for oppdrettsfisk så som laks,

ørret, flekkpagell o.s.v., og ufarlige tilsetningsstoffer for naturlige matvarer. Dessuten er adonixantin, når den indus-trielle fremstillingsprosess for det er utarbeidet, lovende som matvaretilsetningsstoff og fortilsetningsstoff, likesom astaxantin.

Videre er /?-karoten blitt anvendt som matvare-tilset-ningsstof f, fortilsetningsstoff, tilsetningsstoff i farmasøy-tiske preparater o.s.v.; echinenon er lovende som matvare-tilsetningsstof f, fortilsetningsstoff o.s.v.; cantaxantin er blitt anvendt som matvare-tilsetningsstoff, fortilsetnings-stof f, i kosmetikken o.s.v.; og zeaxantin er blitt anvendt som matvare-tilsetningsstoff, fortilsetningsstoff o.s.v.

Det er kjent at astaxantin finnes i fisk så som flekkpagell, laks, ørret o.s.v., og i Crustacea så som reker, krabbe, kreps, krill (Carotenoids in Marine Organisms; red. Nippon Suisan Gakukai, 1978). Rødgjær ("red yeast"), Phaffia rhodozyma (Phytochemistry, 15, 1009, 1976), Brevibacterium

(Journal of General and Applied Microbiology, 15, 127, 1969)

og den grønne alge Haematococcus pluvialis (Phytochemistry, 20, 2561, 1981) er kjent som mikroorganismer som danner astaxantin. Omdannelse av /3-karoten (Pure Appl. Chem. 57, 741, 1985) og syntetisering ut fra fosfonium-salt (Heiv. Chim. Acta. 64, 2436, 1981) er kjent som kjemiske synteseprosesser.

Den kjente fremgangsmåte for fremstilling av astaxantin er ikke fordelaktig på grunn av høye omkostninger, siden innholdet av astaxantin i naturlige produkter så som krill, kreps o.s.v., er meget lavt, og ekstrahering av dette er vanskelig. Dessuten er stabil tilgjengelighet av kildene problematisk. Dessuten er veksthastigheten for rødgjær, Phaffia rhodozyma, lav, produktiviteten av astaxantin hos rødgjær er lav, og ekstrahering av astaxantin er vanskelig siden denne gjærsopp har hard cellevegg. Industriell fremstilling av astaxantin fra rødgjær er derfor vanskelig.

Veksthastigheten for grønne alger, Haematococcus pluvialis, er også lav, kulturen forurenses lett, og ekstrahering av astaxantin er vanskelig. Industriell fremstilling av astaxantin ut fra røde alger er derfor vanskelig.

Det er kjent at adonixantin finnes i gullfisk og karpe (Carotenoids of Marine Organisms, Nippon Suisan Gakukai, 1978), men det antas at kjemisk syntetisering av adonixantin er vanskelig. Ingen industriell prosess for fremstilling av adonixantin er kjent.

Skjønt syntese ut fra /3-ionon (Pure & Appl. Chem. 63(1), 45, 1991), og ekstrahering fra grønne eller gule grønnsaker så som gulrot, søtpotet, gresskar o.s.v. er kjent som fremstil-lingsprosesser for /3-karoten (Natural Coloring Agent Handbook, Korin (1979), red. av redaksjonskomitéen for Natural Coloring Agent Handbook), er fremstillingsomkostningene ved disse prosesser høye. Som fremgangsmåter for fremstilling av Ø-karoten ved hjelp av mikroorganismer, er fremstilling ved hjelp av algen Dunaliella kjent (J. Appl. Bacteriol., 70, 181, 1991), og fremstilling ved hjelp av soppen Blakeslea (J. Appl. Bacteriol., 70, 181, 1991). Fremstilling av /3-karoten ved hjelp av bakterier er imidlertid ikke kjent.

Echinenon ekstraheres fra naturlige produkter, for eksempel fra sjøstjerner så som "tornekrone"-sjøstjerne, de indre organer hos fisker så som flekkpagell, sjøpinnsvin og de indre organer hos Crustacea så som hummer o.s.v. (Carotenoids of Marine Organisms, red. Nippon Suisan Gakukai, 1987). Fremstilling av echinenon ved hjelp av mikroorganismer er imidlertid ikke kjent.

Det er kjent at cantaxantin finnes i en type sopp (Bota-nical Gazette, 112, 228-232, 1950), fisk, Crustacea o.s.v.

(Carotenoids of Marine Organisms, red. Nippon Suisan Gakukai, 1978). Fremstilling av echinenon ved hjelp av mikroorganismer er eksemplifisert ved fremstilling ved hjelp av mikroorganis-

mer som tilhører slekten Brevibacterium (Applied and Environ-mental Microbiology, 55(10), 2505, 1989) og mikroorganismer som tilhører slekten Rhodococcus (Japansk ikke-gransket pa-tentpublikasjon nr. 2-138996) . Som kjemiske synteseprosesser er det dessuten kjent oksyder ing av /3-karoten (J. Amer. Chem. Soc, 78, 1427, 1956) og syntetisering ut fra den nye forbindelse 3-okso-C15-fosfoniumsalt (Pure & Appl. Chem. 51, 875, 1979) .

Som fremgangsmåter for fremstilling av zeaxantin, er det kjent en kjemisk syntese som starter ut fra et hydroksyketon oppnådd ved asymmetrisk reduksjon av oksoisoforon (Pure & Appl. Chem., 63(1), 45, 1991), ekstrahering fra maisfrø (Sei-tai Shikiso, 1974, Asakura Shoten), og en fremgangsmåte hvor det anvendes Flavobacterium (Carotenoids, In Microbial Technology, 2. utg. vol. 1, 529-544, New York: Academic Press).

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer bakterier som tilhører en ny slekt.

De nærværende oppfinnere fant at nye bakteriestammer som ikke hører til noen kjente slekter, danner forskjellige typer karotenoid-pigmenter.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig videre en fremgangsmåte for fremstilling av et karotenoid valgt fra gruppen som består av astaxantin, adonixantin, karoten, echinenon, cantaxantin og zeaxantin, som omfatter at man dyrker en mikroorganisme som tilhører en ny slekt og som kan danne minst ett av karotenoidene, og gjenvinner et karotenoid eller en kombinasjon av karotenoidene fra kulturen.

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 viser et kjernemagnetisk <13>C-resonans-spektrum av astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte. Fig. 2 viser et massespektrum av astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte. Fig. 3 viser en kjernemagnetisk <13>C-resonans av adonixantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte. Fig. 4 viser et massespektrum av adonixantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte. Fig. 5 viser en elueringsprofil for karotenoid-pigmenter ifølge den foreliggende oppfinnelse ved høy-ytelses-væske-kromatograf i. Fig. 6 viser et fylogenetisk tre over E-396-stammen og nære arter.

Karotenoidene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er representert ved følgende formel:

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan det anvendes hvilken som helst bakterie som kan danne de ovennevnte karotenoider og som har følgende egenskaper. En gruppe bakterier som har slike egenskaper, tilhører ikke noen av de kjente slekter beskrevet i Bergey's Manual of Systematic Bacterio-logy, og er derfor en gruppe bakterier som tilhører en ny slekt.

Blant disse bakterier kan det som en spesiell mikroorganisme nevnes E-396-stammen. Denne stamme ble nylig isolert av de nærværende oppfinnere, og er blitt deponert i National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency og Industrial Science and Tehnology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken Japan, 27. april 1993 som FERM BP-4283 under Budapest-traktaten.

Denne stamme har følgende egenskaper:

(a) Morfologiske karakteregenskaper

(b) Dyrknings-karakteregenskaper

(1) Buljongagarplatekultur

Sirkulær oransje glinsende koloni dannes. Diffunderbart pigment dannes ikke.

(2) Buljong-væskekultur

Veksten er noe dårlig; helt uklar;

utfelt. Overflatevekst er ikke tilstede. (3) Buljong-gelatin-stikkultur Veksten er dårlig; gelatinen blir ikke fly-tende .

(4) Lakmus-melk

Ikke forandret

(c) Fysiologiske egenskaper

(d) André fysiologiske egenskaper (e) Kjemotaksonomiske karakteregenskaper

Ut fra ovenstående resultater ble stammen E-396 betraktet som en bakterie tilhørende slekten Agrobacterium, siden den er en aerob, gramnegativ og peritrikøs stav, men dette ble motbevist ved resultatene med hensyn til pigment-produktivitet, slimdannende evne og DNA-DNA-homologi. Stammen ble dessuten ansett for å være en bakterie tilhørende slekten Sphingomonas eller en fotosyntese-bakterie ut fra kolonifargen, men dette ble også motbevist på grunn av at sfingolipid og bakterie-klorofyll ikke ble påvist.

En del oppbevarte stammer som ble ansett for å ligge nær opp til stammen E-396 når det gjaldt likhet i kolonifarge, peritrikøse flageller, GC-innhold og kinon-type, ble utvalgt, og DNA-DNA-homologi mellom stammen E-396 og de utvalgte stammer ble undersøkt. Resultatet av dette var at det ikke er noen slekt som viser likhet med stammen E-396 når det gjelder DNA-DNA-homologi. Det ble dessuten laget et fylogenetisk tre på basis av nukleotid-sekvensen av 16S-ribosom-RNA av stammen E-396 ifølge nabosammenføyningsmetoden. Det ble funnet som resultat at stammen E-396 er uavhengig av en hver nær slekt. Det ble derfor bekreftet at stammen E-396 er en bakterie som tilhører en ny slekt, men som ikke tilhører noen kjent slekt.

Som en ytterligere spesiell mikroorganisme nevnes stammen A-581-1. Denne stamme er nylig blitt isolert av de nærværende oppfinnere og er blitt deponert i National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, 20. mai 1994 som FERM BP-4671 under Budapest-traktaten.

Denne stamme har følgende egenskaper:

(a) Morfologiske karakteregenskaper

(b) Dyrknings-karakteregenskaper (c) Fysiologiske egenskaper (d) Andre fysiologiske egenskaper (e) Kjemotaksonomiske egenskaper

Av ovenstående resultater så vel som ut fra de fakta at stammene A-581-1 har følgende karakteregenskaper som stammen E-3 9 6 har, og at stammen A-581-1 har høy DNA-DNA-homologi med stammen E-396, bestemmes det at stammen A-581-1 tilhører den nye slekt som stammen E-396 også tilhører.

Medium for fremstilling av karotenoider under anvendelse av de foreliggende mikroorganismer er for eksempel som følger. Nærmere angitt inneholder det en karbonkilde, en nitrogenkilde og uorganiske salter nødvendige for vekst av produsent-mikroorganismer, så vel som, hvis nødvendig, spesielle fordrede substanser (for eksempel vitaminer, aminosyrer, nukleinsyrer o.s.v.). Som karbonkilder nevnes sukkerarter så som glukose, sakkarose, laktose, fruktose, trehalose, mannose, mannitol, maltose o.s.v., organiske syrer så som eddiksyre, fumarsyre, citronsyre, propionsyre, eplesyre, pyrodruesyre, malonsyre; alkoholer så som etanol, propanol, butanol, pentanol, heksa-nol, isobutanol, glycerol; olje eller fett så som soyaolje, riskliolje, olivenolje, maisolje, sesamolje, linfrøolje og liknende. Mengde tilsatt karbonkilde varierer i henhold til karbonkilde-type, og er vanligvis fra 1 til 100 g, fortrinnsvis fra 2 til 50 g, pr. liter medium.

Som nitrogenkilde anvendes for eksempel kaliumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumklorid, ammoniumsulfat, ammoniumfos-fat, ammoniakk, urea o.s.v., alene eller i kombinasjon. Mengden tilsatt nitrogenkilde varierer i henhold til nitrogenkilde-type, og er vanligvis fra 0,1 til 30 g, og fortrinnsvis fra 1 til 10 g, pr. liter medium.

Som uorganiske salter kan anvendes kaliumdihydrogenfos-fat, dikaliumhydrogenfosfat, dinatriumhydrogenfosfat, magnesi-umsulfat, magnesiumklorid, jern(III)sulfat, jern(II)sulfat, jern(III)klorid, jern(II)klorid, mangansulfat, manganklorid, sinksulfat, sinkklorid, kobber(II)sulfat, kalsiumklorid, kalsiumkarbonat, natriumkarbonat o.s.v., alene eller i kombinasjon. Mengden av uorganisk syre varierer i henhold til typen uorganisk salt og er vanligvis fra 0,001 til 10 g pr. liter medium.

Som spesielle fordrede substanser kan anvendes vitaminer, nukleinsyrer, gjærekstrakt, pepton, kjøttekstrakt, malt-ekstrakt, maisbløtingsvæske, soyamel, tørket gjær o.s.v., alene eller i kombinasjon.

Mengden av den spesielle fordrede substans som anvendes, varierer ifølge typen substans, og er vanligvis fra 0,2 g til 200 g, og fortrinnsvis fra 3 til 100 g, pr. liter medium. En pH-verdi for et medium justeres til pH 2-12, fortrinnsvis 6-9. Dyrking utføres ved en temperatur på 15-80°C, fortrinnsvis 20-35°C, vanligvis i fra 1 til 20 dager, og fortrinnsvis fra 2 til 8 dager, under aerobe betingelser tilveiebrakt ved rysting eller lufttilførsel/agitering.

Til slutt kan den foreliggende forbindelse isoleres og renses fra kulturen. Mer spesifikt skilles mikrobe-cellene fra kulturen på vanlig måte, så som ved sentrifugering eller filtrering, og cellene underkastes ekstrahering med et løs-ningsmiddel. Siden en liten mengde karotenoider oppløses i én supernatant eller et filtrat, kan karotenoidené også utvinnes fra dem. Som løsningsmiddel for ekstraksjonen kan det anvendes hvilken som helst substans hvor den foreliggende forbindelse er løselig. For eksempel anvendes organiske løsnings-midler så som aceton, kloroform, diklormetan, heksan, cyklo-heksan, metanol, etanol, isopropanol, benzen, karbondisulfid, dietyleter o.s.v., og fortrinnsvis anvendes kloroform, diklormetan, aceton, metanol, etanol eller isopropanol. Rensingen kan utføres ved hjelp av vanlige fremgangsmåter så som ved absorpsjon, eluering, oppløsing og liknende, alene eller fortrinnsvis i kombinasjon.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse dannes det i mange tilfeller samtidig astaxantin, adonixantin, /?-karoten, echinenon, cantaxantin og zeaxantin, som er tilstede i et dyrkningsprodukt. Ved en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse kan det følgelig enkeltvis oppnås hvilket som helst av de ovennevnte karotenoider ved ovennevnte fremgangsmåte. Alternativt kan det også oppnås en blanding av karotenoidene. På denne måte innbefatter fremgangsmåten for karotenoid-fremstilling ifølge den foreliggende oppfinnelse, en fremgangsmåte for fremstilling av et individuelt karotenoid, og en fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av karotenoidene.

Astaxantin og adonixantin kan skilles fra hverandre ifølge en vanlig fremgangsmåte for innbyrdes separasjon av karotenoider, så som ved adsorpsjons/eluerings-kolonnekromato-grafi, differensial-ekstrahering, motstrøms-ekstrahering eller differensialkrystallisering.

For fremstilling av et individuelt karotenoid kan det ønskede karotenoid fortrinnsvis fremstilles ved regulering av sammensetning av mediet, dyrkningsbetingelser og liknende.

For eksempel kan et forhold mellom fremstilte karotenoider forandres ved forandring av aerobe betingelser. For eksempel kan et forhold mellom dannede karotenoider forandres ved forandring av en mengde av et medium eller hastighet for rysting i en kolberystekultur, eller ved forandring av hastig-heten av lufttilførsel eller agitasjonshastighet i lufttilfør-sels/agiterings-kultur. Som et spesielt eksempel er det en tendens ved kolbedyrkning til at mengden av dannet astaxantin øker, mens mengden adonixantin minsker, etter hvert som.volu-met av et dyrkningsmedium i en kolbe øker.

For preferensiell fremstilling av et spesielt karotenoid kan alternativt en produsent-mikroorganisme forbedres ved en mutasjon så som en kunstig mutasjon av produsent-mikroorga-nismen slik at en mutant-mikroorganisme fortrinnsvis danner det ønskede karotenoid blant andre. Slike mutasjonsbehandlin-ger innbefatter for eksempel fysiske metoder så som røntgen-bestråling, UV-bestråling og liknende; kjemiske metoder så som anvendelse av N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), etyl-metansulfonat (EMS); og en biologisk metode så som en gen-rekombinasjonsteknikk. Fremgangsmåter for fremstilling av karotenoidene under anvendelse av en slik forbedret mutant er innbefattet ved den foreliggende fremgangsmåte for fremstilling av karotenoider..

Når det gjelder astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, er renheten av (3S, 3'S)-astaxantin nesten 100%. Det er kjent at andelen av (3S, 3'S)-astaxantin i astaxantin som finnes i naturlige produkter så

som kreps, Haematococcus, laks, ørret og flekkpagell er høy.

På den annen side er det kjent at Phaffia rhodozyma inneholder (3R, 3'R)-astaxantin i en stor andel, hvilken absolutte konfigurasjon er det motsatte av den som finnes hos astaxantin i de fleste naturlige produkter.

Nesten 100% av astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte er (3S, 3'S)-astaxantin hvis absolutte konfigurasjon er den samme som for hovedmengden av naturlig forekom-mende astaxantin, og astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte er derfor industrielt verdifull. Selv om kjemisk syntetisering as (3S, 3'S)-astaxantin videre er kjent (Heiv. Chim. Acta, 61, 2609, 1978), og siden optisk rent (4R, 6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon anvendes som ut-gangsmateriale, er omkostningene ved fremgangsmåten høye, og prosessen er derfor ikke industrielt fordelaktig.

Dessuten inneholder astaxantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte hel-trans-astaxantin i en høy andel, mens andelen av hel-trans-form : cis-form er fra 92:8 til 96:4. Astaxantin som bare er trans, er i naturlig form, og de foreliggende produsent-mikroorganismer er fordelaktige ved at de danner naturlig astaxantin-type. Når cis-astaxantin er nød-vendig, kan dette fås ut fra hel-trans-astaxantin ifølge en kjent fremgangsmåte, mens det er vanskelig å fremstille astaxantin som er hel-trans ut fra cis-astaxantin.

Kjernemagnetisk <13>C-resonansspektrum og massespektrum av astaxantinet fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte er vist på henholdsvis fig. 1 og 2. Kjernemagnetisk <13>C-resonans-spektrum og massespektrum for adonixantin fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte er vist på henholdsvis fig. 3 og 4.

EKSEMPLER

I det følgende er den foreliggende oppfinnelse forklart ved eksempler. Rammen for den foreliggende oppfinnelse må imidlertid ikke begrenses til eksemplene.

Eksempel 1

Ett gram jord fra Midori-ku, Kanagawa-prefekturet, Japan, ble suspendert i 5 ml sterilisert fysiologisk saltløsning, supernatanten ble fortynnet 100 ganger og utplatet på et buljong-agarplatemedium, fulgt av dyrkning ved 30°C i 3 dager. Kolonier med oransje farge ble valgt for tilveiebringelse av en stamme E-396 (FERM BP-4283).

Ut fra de ovenfor beskrevne taksonomiske egenskaper bekreftes det at stammen E-396 (FERM BP-4283) er en bakterie som tilhører en ny slekt.

Eksempel 2

Ett gram jord fra Midori-ku, Kanagawa-prefekturet, Japan, ble suspendert i 5 ml sterilisert fysiologisk saltløsning, supernatanten ble fortynnet 100 ganger og utplatet på et buljong-agarplate-medium, fulgt av dyrking ved 3 0°C i 5 dager. Kolonier med oransje farge ble valgt for tilveiebringelse av stammen A-581-1 (FERM BP-4671).

Ut fra de ovenfor beskrevne taksonomiske egenskaper er det påvist at stammen A-581-1 (FERM BP-4671) har liknende egenskaper som E-3 96 og tilhører den nye slekt som stammen E-396 tilhører, siden A-581-1 har høy DNA-DNA-homologi med E-396.

Eksempel 3

Ti milliliter av et medium inneholdende 2 g/l glukose, 3 g/l kjøttekstrakt, 10 g/l pepton og 5 g/l natriumklorid, ble innført i et forsøksrør med en diameter på 18 mm, som så ble autoklavert ved 121°C i 15 minutter. En del av cellene av stamme E-396 (FERM BP-4283) ble inokulert i mediet og dyrket ved 30°C i 6 dager ved 3 00 omdreininger pr. minutt med rysting. 100 rør av den dyrkede buljong (1 liter) ble sentrifugert under oppnåelse av celler som så ble ekstrahert med 500 ml aceton, og til den fraskilte aceton-fase ble det tilsatt 500 ml heksan og 500 ml 0,85% saltløsning, og det hele ble blandet. Den øvre fase ble gjenvunnet, og løsningsmidlet ble avdampet ved 35°C under redusert trykk.

Det således oppnådde ekstrakt ble adsorbert på en silika-gelkolonne og eluert med en blanding av benzen/etylacetat/- metanol (15:4:1) under oppnåelse av en astaxantinfraksjon fra hvilken løsningsmidlet deretter ble avdampet under redusert trykk. Ekstraktet ble oppløst i en liten mengde pyridin, og vann ble tilsatt dråpevis til pyridinløsningen under utkrystallisering av astaxantin, og man fikk 1,2 mg krystallinsk astaxantin. Det således oppnådde astaxantin var identisk med autentisk astaxantin når det gjaldt IR-spektrum, massespektrum, kjernemagnetisk <13>C-resonansspektrum og absorpsjonsspektrum.

Eksempel 4

Ti milliliter av et medium med sammensetning som vist i tabell 1, ble innført i hvert av forsøksrør med en diameter på 18 mm, og autoklavert ved 121°C i 15 minutter.

En del celler av E-396 (FERM BP-4283) ble inokulert i rørene og dyrket ved 30°C i 2 dager med rysting frem og til-bake ved 300 omdr. pr. min. 10 ml av kulturen ble inokulert i 100 ml av et medium med samme sammensetning som beskrevet ovenfor, i en 500 ml Sakaguchi-kolbe, og dyrking med rysting frem og tilbake ved 100 omdr. pr. min. ble utført ved 30°C i 2 dager. Deretter ble 100 ml av den således fremstilte kultur inokulert i 3,0 1 av et medium med samme sammensetning som beskrevet ovenfor, i en 5,0 1 fermenteringsanordning, og dyrking ble utført aerobt ved 30°C og 1,0 wm i 52 timer.

Deretter ble 3 1 av kulturen inokulert i 35 liter av et medium med samme sammensetning som beskrevet ovenfor (bortsett fra at det ble anvendt 10 g/l gjærekstrakt, 20 g/l sakkarose og 2,5 g/l NHAN03) i en 50 1 f ermenteringsanordning, og dyrking ble utført aerobt ved 30°C, 250 omdr. pr. min. og 1,0 wm i 18 timer. 33 liter av den således oppnådde dyrkede buljong ble sentrifugert, hvorved man fikk 790 g våte celler, som så ble vasket med 1,3 1 metanol og ekstrahert tre ganger med 0,8 1 kloroform. Astaxantin ble renset ut fra pigmentekstraktet i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 3, hvorved man fikk 10 mg krystallinsk astaxantin.

Det således oppnådde astaxantin svarte til et autentisk astaxantin når det gjaldt IR^spektrum, massespektrum, kjernemagnetisk <13>C-resonansspektrum og absorpsjonsspektrum. Dessuten ble den absolutte konfigurasjon av det således oppnådde astaxantin bestemt ved hjelp av kjent fremgangsmåte (J. High Resolut. Chromatogr. Chromatogr. Commun., 2, 195, 1979). Resultatet var at 100% astaxantin var (3S, 3'S)-astaxantin, og forholdet mellom hel-trans-astaxantin og cis-astaxantin var 95:5. For sammenlikningsformål er et resultat av analysering med hensyn til astaxantin dannet ved andre fremgangsmåter, vist i tabell 2.

Eksempel 5

Ti milliliter av et medium med samme sammensetning som

vist i tabell 1 (bortsett fra at det ble anvendt 30 g/l sakkarose) ble innført i hvert av forsøksrør med en diameter på 18 mm, og autoklavert ved 121"C i 15 minutter. En del celler av E-396 (FERM BP-4283) ble inokulert i mediet og dyrket ved 25"C i 5 dager med rysting frem og tilbake ved 3 00 omdr. pr. min. 10 ml av kulturen ble sentrifugert under oppnåelse av celler, som så ble ekstrahert med 10 ml aceton. Til den fraskilte acetonfase ble det tilsatt 10 ml heksan og 10 ml 0,85% salt-løsning, den øvre fase ble gjenvunnet og løsningsmidlet ble avdampet ved 35°C under redusert trykk.

Det således oppnådde pigment-ekstrakt ble analysert med hensyn til karotenoid-innhold ved hjelp av høy-ytelses-væske-kromatografi, og man fikk resultatet vist i tabell 3. Ana-lysebetingelsene var som følger: Det ble tillaget en kolonne ved sammenknytting av to kolonner åv typen Wakosil 5SIL-120 (Wako Pure Chemical) med dimensjoner 4,6 mm I.D. x 250 mm, og den mobile fase var en blanding av heksan/diklormetan/metanol (10:8:1). Påvisning av karotenoider ble utført ved absorpsjon ved 47 0 nm, og kvantitativ analysering ble utført ved sammen-likning av arealet av toppen av astaxantin i en forsøksprøve med arealet for et autentisk preparat. Dessuten ble den absolutte konfigurasjon av astaxantin bestemt ifølge den samme metode som beskrevet ovenfor. Resultatet viste at 100% astaxantin dannet var (3S, 3'S)-astaxantin, og forholdet mellom hel-trans-form og cis-form var 95:5.

Eksempel 6

Ti milliliter av et medium med samme sammensetning som vist i tabell 1 (bortsett fra at det ble anvendt 30 g/l sakkarose) ble innført i hvert av forsøksrør med en diameter på 18 mm, og autoklavert ved 121°C i 15 minutter. En del celler fra E-396 (FERM BP-4283) ble inokulert i mediet og dyrket ved 25°C i 2 dager med rysting frem og tilbake med 3 00 omdr. pr. min. Kulturen ble inokulert med en mengde på 1 volum% i forskjellige volum på mellom 2 5 og 200 ml medium med samme sammensetning som beskrevet ovenfor i 500 ml koniske kolber, og dyrking med roterende rysting ble utført ved 25°C i 5 dager med 120 omdr. pr. minutt. Ekstrahering og analysering av karotenoider fra dyrkningsbuljongene ble utført i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 5. Mengder av astaxantin, adonixantin og total mengde karotenoider er vist i tabell 4.

Eksempel 7

Pigment-ekstraktet oppnådd i eksempel 4 ble adsorbert på en silikagel-kolonne, og en adonixantin-fraksjon ble eluert med et blandet løsningsmiddel av benzen, etylacetat og metanol (15:4:1), og løsningsmidlet ble avdampet under redusert trykk. Ekstraktet ble oppløst i etanol ved 50°C, og løsningen fikk stå ved 4°C i 1 dag for utkrystallisering av adonixantin. Man fikk 190 mg krystallinsk adonixantin. Det således oppnådde adonixantin svarte til autentisk adonixantin når det gjaldt IR-spektrum, massespektrum, <13>C-NMR-spektrum og absorpsjonsspektrum.

Eksempel 8

Ti milliliter av et medium med samme sammensetning som vist i tabell 1 (bortsett fra at det ble anvendt 30 g/l sakkarose) ble innført i hvert av forsøksrør med en diameter på 18 mm, og autoklavert ved 121°C i 15 minutter. En del celler av E-396 (FERM BP-4283) ble inokulert i mediet og dyrket ved 28°C i 5 dager med rysting. Karotenoider ble ekstrahert fra kulturen i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 5, og karotenoidene ble analysert ved hjelp av høy-ytelses-væskekromatografi. Elueringstid for hver topp, og bølgeleng-den ved maksimal absorpsjon for hver topp i det samme løs-ningsmiddel som det eluerte materiale, er vist i tabell 5.

Elueringstid og bølgelengde for maksimal absorpsjon ble målt for autentisk /3-karoten og cantaxantin i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Målingsresultatene viste at topp nr. 1 og topp nr. 3 var i god overensstemmelse med resultatene for henholdsvis /3-karoten og cantaxantin. Topp nr. 1 og topp nr. 3 ble derfor identifisert til å representere henholdsvis /3-karoten og cantaxantin. Dessuten ble andre topper sammenliknet med maksimalabsorpsjons-toppene beskrevet i B.H. Davies 1976, Carotenoids, 38-165, i T.W. Goodwin (red.), Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, vol. 2, Academic Press, Inc. (London), Ltd., London. Ut fra resultatene ble topp nr. 2 og topp nr. 4 identifisert til å representere henholdsvis echinenon og zeaxantin.

Eksempel 9

Ti milliliter hjerne-hjerte-infusjons-buljongmedium (Eiken Chemical Co., Ltd., pH-verdi ble justert til 10 med Na2C03) ble innført i hvert av forsøksrør med diameter 18 mm, og autoklavert ved 121°C i 15 minutter. En del celler av stamme A-581-1 (FERM BP-4671) ble inokulert i mediet og dyrket ved 33°C i 4 dager med rysting. Karotenoider ble ekstrahert fra kulturen og analysert kvantitativt ved hjelp av høy-ytel-ses-væskekromatografi, i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 5. Resultatet er vist i tabell 6.

Dessuten ble den absolutte konfigurasjon for det således oppnådde astaxantin bestemt i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 4, og det ble bekreftet at 100% av det dannede astaxantin var (3S, 3'S)-astaxantin og at forholdet mellom hel-trans-astaxantin og cis-astaxantin var 95:5. Resultatet er vist i tabell 7.

Eksempel 10

Ti milliliter av et medium med sammensetningen vist i tabell 8, ble innført i hvert av forsøksrør med en diameter på 18 mm, og autoklavert ved 121°C i 15 minutter.

En del av stammen A-581-1 (FERM BP-4 671) ble inokulert i mediet og dyrket ved 28°C i 4 dager med rysting. Karotenoider ble ekstrahert fra kulturen og analysert kvantitativt ved hjelp av høy-ytelses-væskekromatografi i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 5. Resultatet er vist i tabell 9.

Claims

1. Bakterier som tilhører en ny slekt, karakterisert ved at de har følgende egenskaper:

2. Bakterie ifølge krav 1, karakterisert vedat bakterien er stammen E-396 (FERM BP-4283) eller H-581-1 (FERM BP-4671).

3. Fremgangsmåte for fremstilling av karotenoid-pigment valgt fra gruppen som består av astaxantin, adonixantin, karoten, echinenon, cantaxantin og zeaxantin, karakterisert ved. at den omfatter følgende trinn: dyrking av en bakterie som kan danne minst ett av nevnte karotenoid-pigmenter, og utvinning av et individuelt karotenoid-pigment eller en blanding av karotenoid-pigmentene, hvor bakterien har følgende egenskaper:

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at bakterien er av stammen E-396 (FERM BP-4283) eller H-581-1 (FERM BP-4671).