JPH089964A - 新規微生物 - Google Patents
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- JPH089964A JPH089964A JP15207894A JP15207894A JPH089964A JP H089964 A JPH089964 A JP H089964A JP 15207894 A JP15207894 A JP 15207894A JP 15207894 A JP15207894 A JP 15207894A JP H089964 A JPH089964 A JP H089964A
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Abstract
新規な属に属する細菌の提供。 【構成】 カロチノイド色素を生産することができ、図
1に示す系統樹上の位置に存在する、新規な属に属する
細菌。
Description
から分離していた過程で、全く新規な微生物を分離する
ことに成功し、さらにその微生物群は今までに報告され
ているどの属とも性質が異なる新属を形成することが確
認された。
を提供しようとするものである。
題を解決すべく種々検討した結果、公知の属に属さな
い、すなわち新規な属に属する細菌株を見出し、本発明
を完成した。したがって、本発明は新規な属に属する細
菌を提供するものである。
る新規な属に属する細菌である。
オブ・システマティク・バクテリオロジー(Berge
y’s Manual of Systematic
Bacteriology)、2巻、1984年を参照
した結果、従来報告されているいずれの属にも該当しな
い新規な属の細菌群であると確認された。
り、しかもキノン系がQ−10である性質を有する属は
プロテオバクテリア(Proteobacteria)
のα−サブクラス(α subclass)に属するア
グロバクテリウム(Agrobacterium)属細
菌あるいは光合成能を有する細菌であるロドシュードモ
ナス(Rhodopseudomonas)属細菌、ロ
ドバクター(Rhodobacter)属細菌、ロドブ
ラム(Rhodovulum)属細菌、ロゼオバクター
(Roseobacter)属細菌、エリスロバクター
(Erythrobacter)属細菌がある。
ムを形成するが本発明の微生物は形成しない点で異な
る。よって本発明の微生物はアグロバクテリウムではな
い。また光合成能を有する上記の細菌はいずれもバクテ
リオクロロフィルを生成するが本発明の微生物は生成し
ない点から本発明の微生物は光合成細菌ではない。以上
のように上記の性質を具備する細菌は新規な属に属する
細菌と確認された。
げることができる。この菌株は、発明者らが新しく単離
したものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に
平成5年4月27日にFERM BP−4283として
寄託された。この菌株は、次の菌学的性質を有する。
NAの塩基配列 配列番号:1に示す。以上の結果からE−396株(F
ERM BP−4283)は下記の性質を具備する新属
に属する細菌であることが確認された。
で周毛を有していることからアグロバクテリウム(Ag
robacterium)属細菌と思われたが色素産生
能とスライム形成能、およびDNA−DNA相同性の結
果から否定された。また集落の色調からスフィンゴモナ
ス(Sphingomonas)属細菌や光合成細菌の
可能性も考えられたが、スフィンゴ脂質およびバクテリ
オクロロフィルが検出されずいずれの属の菌株でもない
ことが分かった。
らE−396株と近縁と推定される各菌種の保存菌株と
DNA−DNA相同性を調べたが高い相同値を示した属
は得られなかった。さらにE−396株の16Sリボソ
ームRNAの塩基配列から近隣結合法により分子系統樹
(図1)を作成した。その結果E−396株は近縁のい
ずれの属とも系統的に独立していることが分かった。よ
ってE−396株は既知の属ではない全く新規な属に属
する細菌であることが確認された。
−1株を挙げることができる。この菌株は、発明者らが
新しく単離したものであり、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成6年5月20日にFERM BP−46
71として寄託された。この菌株は、次の菌学的性質を
有する。
96株と同様に下記の性質を具備することおよびE−3
96株とのDNA−DNA相同性が高いことからE−3
96株と同一の新規な属に属する細菌であると判断され
た。
素を生産できるものであり、カロチノイド色素の製造の
ために用いることができる。この様なカロチノイドとし
ては、例えばアスタキサンチン、アドニキサンチン、β
−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン及びゼアキ
サンチンを挙げることができ、これらのカロチノイドは
次の式により表わされる。
るための培地は、例えば次の通りである。すなわち、生
産菌が生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、および必
要であれば特殊な要求物質(例えば、ビタミン、アミノ
酸、核酸塩基等)を含む。炭素源としてはグルコース、
シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロ
ース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖
類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ
酸、マロン酸、ピルビン酸等の有機酸、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノー
ル、イソブタノール、グリセロール等のアルコール類、
大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ
油、アマニ油等の油脂類等が挙げられる。添加割合は炭
素源の種類により異なるが、通常培地1L当たり1〜1
00g、好ましくは2〜50gである。
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の1種ま
たは2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類に
より異なるが、通常培地1Lに対し0.1g〜30g、
好ましくは1〜10gである。無機塩としてはリン酸二
水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸
鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、
塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭
酸ナトリウム等の1種または2種以上が用いられる。添
加割合は無機塩の種類により異なるが、通常培地1Lに
対し0.001〜10gである。
類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕、等の1種また
は2種以上が用いられる。添加割合は物質の種類により
異なるが、通常、培地1Lに対し0.2g〜200g、
好ましくは3〜100gである。培地のpHは2〜12、
好ましくは6〜9に調整する。培養条件は15〜80
℃、好ましくは20〜35℃の温度であり、通常1日〜
20日間、好ましくは2〜8日間振とう培養あるいは通
気攪拌培養を行う。
ド色素を得る。すなわち培養物より直接または遠心分
離、濾過等により菌体を分離したのち菌体から溶剤で抽
出する。また、培養上清にも色素が若干溶解しているの
で、それらも回収することができる。ここで用いる溶剤
はカロチノイド色素が溶解する化合物であればいずれの
溶剤を使用することができる。
メタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、二硫化炭
素、ジエチルエーテル等の有機溶剤が用いられ、好まし
くはクロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、メタノ
ール、エタノール、イソプロピルアルコールが用いられ
る。精製には吸着、溶出、溶解などの通常の方法を用い
ることができる。
スタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン、エ
キネノン、カンタキサンチン及びゼアキサンチンは同時
に生産され、培養物中に共存している。従って、前記の
精製法により、前記カロチノイド色素を単独で得ること
ができる。他方、前記カロチノイド色素を相互に分離す
ることなく、それらを含む混合物として得ることができ
る。この様に、前記の個々のカロチノイド色素を単独に
製造する方法に加えて、前記カロチノイド色素2種類以
上を含む混合物としてカロチノイドを製造することも可
能である。
互分離は、カロチノイド色素成分の相互分離に常用され
ている方法、例えば吸着分離カラムクロマトグラフィー
法、分別抽出法、向流分配抽出法、分別結晶法等を用い
て行うことができる。また、個々のカロチノイド色素を
製造するためには、培地組成、培養条件等を調整するこ
とにより、所望のカロチノイド色素を優先的に生産させ
ることができる。
ことにより、カロチノイド色素の生成量比を変えること
ができる。例えばフラスコ振とう培養においては液量や
振とう速度を変えることにより、また通気・攪拌培養に
より通気や攪拌条件を変えることによりカロチノイド色
素の生成比を変えることができる。一例としてフラスコ
振とう培養において、フラスコ当りの液量を増加するこ
とによりアスタキサンチンの生成量は増加する傾向にあ
り、アドニキサンチンの生産量は減少する。
のものを優先的に製造するためには、生産菌株を変異、
例えば人為的変異処理により、一方の成分を他方の成分
より優先的に生産するように改良することができる。こ
の様な変異処理としては、例えばX線照射、紫外線照射
のごとき物理的方法、化学的変異剤、例えばN−メチル
−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、
エチルメタンスルホネート(EMS)等による変異処理
のごとき化学的方法、遺伝子組換え法等の生物学的方法
を用いることができる。これらの方法、又は他の方法に
より改良された生産株も、本発明の微生物に属する。
キサンチンは(3S,3′S)−アスタキサンチンであ
りその純度はほぼ100%である。天然物であるザリガ
ニ、ヘマトコッカス(Haematococcus)、
サケ、マス、マダイに存在するアスタキサンチンは(3
S,3′S)体の含有率が高いことが知られている。一
方ファフィア・ロドチマ(Phaffia rhodo
zyma)は(3R,3′R)体の含有率が高く天然に
多く存在するアスタキサンチンとは反対の絶対配置を持
つことが知られている。
は100%の(3S,3′S)−アスタキサンチンであ
り天然において多数を締めるアスタキサンチンと同じ絶
対配置を有することは産業上価値が高い。また化学合成
法による(3S,3′S)−アスタキサンチンの製造法
(Helv.Chim.Acta, 61,2609, 1978) が知られているが
光学活性な(4R,6R)−4−ヒドロキシ−2,2,
6−トリメチルシクロヘキサノンを原料とするためコス
トが高く工業化には問題がある。
チンはall−trans体のアスタキサンチンの含有
率が高いことが特徴でall−trans:cisの比
は92:8〜96:4である。all−trans体の
アスタキサンチンは天然型であり本微生物は天然型のア
スタキサンチンを生産する点ですぐれている。cis体
のアスタキサンチンが必要であれば公知の方法によりa
ll−trans体から合成できる。しかしcis体か
らall−trans体のアスタキサンチンを合成する
ことは困難である。
スタキサンチンの13C核磁気共鳴スペクトルを図2に、
そして質量スペクトルを図3に示す。また、アドニキサ
ンチンの13C核磁気共鳴スペクトルを図4に、そして質
量スペクトルを図5に示す。
明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。
菌生理食塩水5mLに懸濁し、上清を100倍希釈し肉汁
平板寒天培地に塗末し30℃で3日間培養した。オレン
ジ色の集落を選択した。上記の方法によりE−396株
(FERM BP−4283)を取得することができ
た。この菌株は、前記の菌学的性質を有する。前記の性
質からE−396株(FERM BP−4283)は全
く新規な属に属する細菌であることが確認された。
菌生理食塩水5mLに懸濁し、上清を100倍希釈し肉汁
平板寒天培地に塗末し30℃で5日間培養した。オレン
ジ色の集落を選択した。上記の方法によりA−581−
1(FERM BP−4671)を取得することができ
た。この菌株は、前記の菌学的性質を有する。前記の結
果からA−581−1株はE−396株と同様の性質を
具備することおよびE−396株とのDNA−DNA相
同性が高いことからE−396株と同一の新規な属に属
する細菌であると判断された。以下、参考例により本発
明の細菌の用途を説明する。
3g/L、ペプトン10g/L、塩化ナトリウム5g/
Lの組成からなる培地10mLを直径18mmの試験管に入
れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これにE−396
株(FERM BP−4283)を1白金耳植菌し30
℃で6日間、300rpm の往復振とう培養を行った。こ
の培養液100本分(1L)を遠心分離し得た菌体をア
セトン500mLで抽出した後、ヘキサン500mLおよび
0.85%食塩水500mLを加え攪拌し、上層を分取し
た後、溶剤を35℃、減圧下で留去した。
に吸着させ、ベンゼン:酢酸エチル:メタノール(1
5:4:1)の溶剤でアスタキサンチン画分を溶出させ
溶剤を減圧下で留去した。抽出物を少量のピリジンに溶
解し水を滴下してアスタキサンチンを結晶化させ、アス
タキサンチンの結晶1.2mgを得た。このようにして得
られたアスタキサンチンは赤外吸収スペクトル、質量分
析、13C核磁気共鳴スペクトル、吸収スペクトルにおい
て公知のものと一致した。参考例2. 表16の組成からなる培地10mLを直径18
mmの試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。
283)を1白金耳植菌し30℃で2日間、300rpm
の往復振とう培養を行った。この培養液10mLを上と同
組成の培地が100mL入った500mL容量の坂口フラス
コに植菌し30℃、2日間、100rpm の往復振とう培
養を行った。次にこの培養液100mLを上と同組成の培
地が3.0L入った5.0L容量の発酵槽に植菌し30
℃,500rpm ,1.0vvm の好気培養を52時間行っ
た。
酵母エキス10g/L、シュークロース20g/L、N
H4 NO3 2.5g/L)の培地が35L入った50
L容量の発酵槽に植菌し30℃,250rpm ,1.0vv
m の好気培養を18時間行った。得られた培養液33L
を遠心分離し湿菌体790gを得、これをメタノール
1.3Lで洗浄し0.8Lのクロロホルムで3回抽出し
た。色素抽出物からのアスタキサンチンの精製は参考例
1と同様の方法により行い、アスタキサンチンの結晶1
0mgを得た。
は赤外吸収スペクトル、質量分析、 13C核磁気共鳴スペ
クトル、吸収スペクトルにおいて公知のものと一致し
た。さらに得られたアスタキサンチンの絶対配置を公知
の方法(J.High Resolut.Chromatogr.Chromatogr Commu
n., 2, 195, 1979)により決定し(3S,3′S)−ア
スタキサンチンが100%でありall−trans体
とcis体との比は95:5であることが確認された。
比較のために他の製法により製造したアスタキサンチン
の分析結果を次の表17に示す。
だしシュークロース30g/L)10mLを直径18mmの
試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これに
E−396株(FERM BP−4283)を1白金耳
植菌し25℃で5日間、300rpm の往復振とう培養を
行った。この培養液の遠心分離によって得た菌体10mL
分をアセトン10mLで抽出した後、ヘキサン10mLおよ
び0.85%食塩水10mLを加え攪拌し、上層を分取し
た後溶剤を35℃、減圧下で留去した。
速液体クロマトグラフィーにより分析したところ表18
のようになった。分析条件は、カラムにWakosil
5SIL−120(和光純薬工業株式会社製)4.6
mmI.D.×250mmを二連結して用い、移動相はヘキサ
ン:ジクロロメタン:メタノール(10:8:1)を用
いた。カロチノイドの検出は470nmにおける吸収で行
い、定量は試料と標準物質のアスタキサンチンとの高速
液体クロマトグラフィーにおけるピーク面積比から算出
した。さらに得られたアスタキサンチンの絶対配置を参
考例2に示した方法で決定し(3S,3′S)−アスタ
キサンチンが100%でありall−trans体とc
is体との比は95:5であることが確認された。
だしシュークロース30g/L)10mLを直径18mmの
試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これに
E−396株(FERM BP−4283)を1白金耳
植菌し25℃で2日間300rpm の往復振とう培養を行
った。この培養液を上と同組成の培地が25〜200mL
入った500mL容量の三角フラスコに1容量%になるよ
うに植菌し25℃、5日間120rpm の回転振とう培養
を行った。培養液からのカロチノイドの抽出および分析
は参考例3の方法により行ったところアスタキサンチ
ン、アドニキサンチンおよび総カロチノイド量は表19
のようになった。
をシリカゲルのカラムに吸着させ、ベンゼン:酢酸エチ
ル:メタノール(15:4:1)の溶剤でアドニキサン
チン画分を溶出させ溶剤を減圧下で留去した。抽出物を
エタノールに50℃で溶解し4℃で1日間放置すること
により結晶化させ、アドニキサンチンの結晶190mgを
得た。このようにして得られたアドニキサンチンは赤外
吸収スペクトル、質量分析、13C核磁気共鳴スペクト
ル、吸収スペクトルにおいて公知のものと一致した。
だしシュークロース30g/L)10mLを直径18mmの
試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これに
E−396株(FERM BP−4283)を1白金耳
植菌し28℃で5日間振とう培養した。この培養液から
参考例3の方法によりカロチノイドを抽出し、高速液体
クロマトグラフィーにより分析したところ、ピークの溶
出時間、及び各ピークの溶離剤と同じ溶剤中での極大吸
収波長は、表20に示す通りであった。なお、この場合
の溶出のプロフィールを図6に示す。
ては標準物質を用い、それらの前記と同一条件での溶出
時間及び極大吸収波長を測定したところ、これらの測定
値はピークNo. 1及びピークNo. 3の測定値とよく一致
し、ピークNo. 1はβ−カロテンを示し、そしてピーク
No. 3はカンタキサンチンを示すものと同定された。ま
た、エキネノン及びゼアキサンチンについては、前記の
結果と文献〔Davies B.H.1976, Carotenoids, 38-165,
In T.W.Goodwin(ed.), Chemistry and Biochemistry of
Plant Pigments, Vol.2, Academic Press, Inc.(Londo
n), Ltd., London. 〕記載の極大吸収とを比較したとこ
ろ、ピークNo. 2はエキネノンを示し、そしてピークN
o. 4はゼアキサンチンを示すものと同定された。
ブイヨン培地(栄研化学株式会社製、ただしNa2 CO
3 でpHを10に調整)10mLを直径18mmの試験管に入
れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これにA−581
−1株(FERM BP−4671)を1白金耳植菌し
33℃で4日間振とう培養した。この培養液から参考例
3の方法によりカロチノイドを抽出し、高速液体クロマ
トグラフィーにより定量分析したところ表21のように
なった。
に示した方法で決定し(3S,3′S)−アスタキサン
チンが100%でありall−trans体とcis体
の比は95:5であることが確認された(表22)。
mmの試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。
を1白金耳植菌し28℃で4日間振とう培養した。この
培養液から参考例3の方法によりカロチノイドを抽出
し、高速液体クロマトグラフィーにより定量分析したと
ころ表24のようになった。
図である。
サンチンの13C核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
サンチンの質量スペクトルを示す図である。
サンチンの13C核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
サンチンの質量スペクトルを示す図である。
クロマトグラフィーにおける溶出の様子を示す図であ
る。
Claims (3)
- 【請求項1】 次の性質: 【表1】 を具備し、新属に属する細菌。
- 【請求項2】 アスタキサンチン、アドニキサンチン、
β−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン及びゼア
キサンチンから成る群から選択された少なくともいずれ
か1種のカロチノイド色素を生産することができる、請
求項1に記載の細菌。 - 【請求項3】 前記細菌が生命工学工業技術研究所にF
ERM BP−4283として寄託されたE−396株
または同研究所にFERM BP−4671として寄託
されたA−581−1株。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP15207894A JP3429563B2 (ja) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | 新規微生物 |
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JPH089964A true JPH089964A (ja) | 1996-01-16 |
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ID=15532577
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JP15207894A Expired - Lifetime JP3429563B2 (ja) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | 新規微生物 |
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