KR100697313B1 - 신규한 베타-카로틴 케토라제 활성을 가지는 단백질 - Google Patents

신규한 베타-카로틴 케토라제 활성을 가지는 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제주연안 해수로부터 분리된 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) S76 균주, 이로부터 유래한 신규한 베타-카로틴 케토라제 단백질 및 이를 이용하여 칸타잔틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) S76, 베타-카로틴 케토라제, 카로테노이드, 항산화제, 착색제

Description

신규한 베타-카로틴 케토라제 활성을 가지는 단백질{Novel beta-carotene ketolase}
도 1은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주(이하, S76으로 약칭됨)의 고체 배지 상의 사진이다. 배지 상에서 오렌지색은 칸타잔틴이 생합성되고 있음을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 S76의 온도에 따른 생장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 S76의 pH에 따른 생장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 S76의 NaCl농도에 따른 생장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 S76에서 추출한 색소화합물에 대한 TLC 분석 결과이다. 이때, 레인 1은 칸타잔틴 표품의 TLC 결과이고 레인 2는 S76의 추출물이며 레인 3은 S76의 칸타잔틴 분획만을 정제한 시료의 TLC 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 S76 및 칸타잔틴 표준시료 의 HPLC 결과이다.
본 발명은 제주연안 해수로부터 분리된 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) S76 균주, 이로부터 유래한 신규한 베타-카로틴 케토라제 단백질 및 이를 이용하여 칸타잔틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
칸타잔틴(4-4' diketo-b-carotene: 4-4' 디케토-베타-카로틴)은 베타-카로틴의 산화로 생성되는 카로티노이드 색소의 한 종류로, 오렌지색을 가진다. 칸타잔틴은 버섯((Botanical Gazette 112, 228-232, 1950) 등의 식물, 어류 또는 각갑류(Carotenoids of Aquatic Organisms, Nippon Suisan Gakukai, 1978), 브레비박테리윰(Brevibacterium; Applied and Environmental Microbiology, 55(10), 2505, 1989) 러더코커스(Rhodococcus; Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-138996) 속에 속하는 미생물 등에 의해 생성하는 것으로 알려졌다. 또한 칸타잔틴은 베타-카로틴을 산화시켜서 합성하거나 (J. Amer. Chem. Soc., 78, 1427 (1956)) 3-오소-C15 포스포니늄염 (3-oxo-C15 phosphonium salt) (Pure Appl. Chem. 51, 875 (1979))을 합성하여 생성할 수도 있다.
칸타잔틴은 사료첨가제; 화장품 및 식품 착색제; 항산화제( Palozza, P et al., Arch . Biochem . Biophys., 297, 291-295, 1992; Palozza, P et al., Arch . Biochem. Biophys ., 325, 145-151, 1996); 항암제(Tanaka, T. et al., Cancer Res., 55, 4059-4064, 1995; Tanaka, T. et al., Carcinogenesis, 16, 2957-2963, 1995; Grubbs, C. J. et al., 48, 239-245, 1991; Katsumura, N. et al., Nutr . Cancer, 26, 203-208, 1996) 등으로 널리 사용되고 있다.
산업상 다양하게 이용되는 칸타잔틴을 식물로부터 이를 추출하는 방법은 그 수율이 낮고, 생산 단가가 높으며, 계절의 영향을 받는 식물 생육을 고려하는 경우 지속적인 공급이 어렵다는 단점이 있고, 화학적으로 합성할 경우, 안전하지 않다는 단점이 있다. 따라서, 칸타잔틴을 생합성하는 미생물을 분리해 내는 것은 칸타잔틴을 대량으로 공급하기 위하여 매우 중용하다.
이에 본 발명자는, 사료첨가제, 화장품 및 식품 착색제, 항산화제, 항암제 등의 유용한 용도를 갖는 천연 칸타잔틴 색소를 안정적으로 대량 공급하기 위하여 칸타잔틴을 생합성하는 균주를 스크리닝하고자 노력한 결과, 제주연안 해수로부터 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) S76 균주를 분리하고 상기 균주 유래의 신규한 베타-카로틴 케토라제를 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산 능을 갖는 에리스로박터 종 S76를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종 S76를 배양하고 배양배지로부터 칸타잔틴을 함유하는 에리스로박터 스페시즈 S76 (canthaxanthin-containing Erythrobacter sp. S76)을 회수하는 단계를 포함하여, 칸타잔틴-함유 에리스로박터 종 S76을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종 S76을 배양하고 배양배지로부터 칸타잔틴을 함유하는 에리스로박터 종 S76 을 회수하는 단계 및 회수된 균체로부터 축적된 칸타잔틴을 추출하는 단계를 포함하여, 칸타잔틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 칸타잔틴을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 가지는 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제 공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) S76에 관한 것이다.
본 발명의 “에리스로박터 종 S76”는 제주도 연한 해수에서 분리한 세균으로, 16S rRNA 염기 서열 분석 결과, 에리스로박터 속의 알려진 종과 97.6 내지 99.0% 정도의 유사도를 보이는 에리스로박터 속의 신종 균주이다. 에리스로박터 종 S76는 덱스트린(Dextrin), 트윈 40 (Tween 40), 트윈 80(Tween 80), α-D-글루코즈(α-D-Glucose), D-피시코즈(D-Psicose), D-트레할로즈(D-Trehalose), β-하이드록시부틸산(β-Hydroxybutyric Acid), L-아스파라진(L-Asparagine), L-글루타민산(L-Glutamic Acid) 등을 탄소원으로 이용하는 그람 음성의 간균으로, 25℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게는, 30℃의 온도, 7 내지 8의 pH, 1% 내지 6% NaCl 농도, 보다 바람직하게는, 3% NaCl 농도에서 최적의 생장을 나타낸다(그림 3). 그리고 칸타잔틴을 생산능을 가짐을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종 S76를 배양하고 배양배지로부터 칸타잔틴을 함유하는 에리스로박터 스페시즈 S76를 회수하는 단계를 포함하여, 칸타잔틴-함유 에리스로박터 종 S76을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 스페시즈 S76는 칸타잔틴의 생성을 촉진시킬 수 있는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있으며, 이러한 발효 방법으로는 배치, 페드-배치(fed-batch) 및 연속 배양 등을 예시할 수 있다. 배지중에 포함될 수 있는 동화성 탄소원으로는 슈가 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용될 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기 질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등이 사용될 수 있고, 기타 비타민, 성장 촉진제, 색소 형성 촉진제 등이 배지 중에 포함될 수 있다. 배양에 따른 칸타잔틴의 생산능을 증대시키기 위해 다양하게 조절할 수 있다.
배양된 에리스로박터 스페시즈 S76 으로부터 생성된 칸타잔틴은 균주내에 존재하며, 칸타잔틴-함유 에리스로박터 스페시즈 S76 은 원심분리, 여과 등 당 분야의 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 회수된 칸타잔틴-함유 에리스로박터 스페시즈 S76 은 이를 배양물로부터 회수하여 동물 사료 첨가제로서 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10731BP로 기탁된, 칸타잔틴의 생산능을 갖는 에리스로박터 종 S76을 배양하고 배양배지로부터 칸타잔틴을 함유하는 에리스로박터 종 S76 을 회수하는 단계 및 회수된 균체로부터 축적된 칸타잔틴을 추출하는 단계를 포함하여, 칸타잔틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
배양된 에리스로박터 스페시즈 S76 균주내에 존재하는 칸타잔틴은 당 분야의 통상의 방법으로 분리 정제할 수 있다. 균체내에 존재하는 칸타잔틴은 유기 용매, 예를 들어, 아세톤(acetone), 클로로포름(xhloroform), 메틸 알콜(methyl alchol), 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 사이크로헥산(cyclohexane), 에탄올(ethanol), 벤젠(benzene), 카본 디설피드(carbon disulfide), 디에틸 에테르(diethyl ether) 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 칸타잔틴에 관한 것이다.
본 발명의 에리스로박터 종 S76로부터 분리 정제한 칸타잔틴은, 화장품 및 식품 착색제, 항산화제, 항암제 등에 다양하게 사용될 수 있고, 합성법으로 만들어진 칸타잔틴에 비하여 안전하다는 장점이 있다.
본 발명자는 베타-카로틴 케토레이즈 게놈 정보를 토대로 에리스로박터 스페시즈 S76에서 베타-카로틴 케토레이즈 유전자를 클로닝하여, 클로닝된 유전자가 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 지닌다는 것을 규명하고, 에리스로박터 스페시즈 S76 유래의 신규한 베타-카로틴 케토레이즈 단백질을 제공한다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 베타-카로틴 케토레이즈를 유사성 분석 결과, Brevundimonas aurantica 유래의 베타-카로틴 C4 옥시게나제(crtW : beta-carotene C4 oxygenase)와 49.2%의 유사도(identity), Bradyrhizobium sp.의 베타-카토틴 케토라제(crtW: beta-carotene ketolase)와 44.7%, Agrobacterium aurantiacum의 베타-카토틴 케토라제(crtW)와 41.7%의 유사도를 보이는 신규한 crtW 단백질임을 확인할 수 있었다.
따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 “베타-카로틴 케토레이즈”는 베타-이오논(β-ionone) 링에 4-메틸렌(4-methylene) 그룹을 케토 그룹(keto group)으로 전환하는 활성을 가지는 케토-그룹 도입 효소(keto group-introducing enzyme)를 의미한다. 이런 효소 활성의 대표적인 예 중 하나가 기질 베타-카로틴으로부터 에치네논(echinenone)을 거쳐 칸타잔틴을 합성하는 것이다.
또한 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 카토레이즈 단백질과 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 가지는 단백질의 경우, 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 베타-카로틴 케토레이즈를 코딩하는 아미노산 서열과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
또한 본 발명의 베타-카로틴 케토레이즈 단백질 또는 이의 상동체는 효소 활 성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이는 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 베타-카로틴 케토레이즈 단백질에 반응하는 기질 특이성을 강화되거나 단백질과 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산분자에 관한 것이다.
바람직하게는, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
상기 베타-카로틴 케토레이즈 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
“재조합 발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 베타-카로틴 케토레이즈를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 “작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 구체적인 양태에서는, 에리스로박터 종 S76로부터 분리한 crtW 유전자가 포함된 플라스미드인 pS76crtWZ를 제작하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 원핵 세 포인 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 원핵세포로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
적절한 숙주세포에는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 베타 카로틴을 생산하는 세포이다. 베타 카로틴을 생산하는 세포를 칸타잔틴 생합성 경로에 관여하는 유전자인 베타-카로틴 케토레이즈를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하여, 과발현을 유도할 경우, 기질 베타-카로틴으로부터 생산되는 칸타잔틴의 양을 증대시킬 수 있다. 이 경우, 합성법으로 생산한 색소보다 안전한 천연의 색소를 대량으로 생산할 수 있기에 매우 유용하다.
본 발명의 구체적인 양태에서는, 상기 pS76crtWZ로 형질전환된 대장균 DH5@pS76crtWZ를 2004년 11월 19일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 어은동 52번지 한국생명공학연구원 생물자원센 터)에 수탁 번호 KCTC 10730BP로 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고 형질전환체로부터 칸타잔틴을 분리하는 단계를 포함하여, 칸타잔틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
칸타잔틴 생산 방법은 상술한 에리스로박터 종 S76러부터 칸타잔틴 생산하는 방법과 동일하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예1 - 균주의 분리 및 배양
1) 균주의 분리
제주도 서귀포시 섶섬 부근 연안 해수를 채취하여 마린 아가 플레이트 2216(제조원 : Difco Laboratories, MD USA)에 100μL씩 도말한 후 25℃에서 3일~5일 동안 배양하였다. 3일~ 5일 후 오렌지색을 띄는 콜로니를 동일한 배지에서 계대배양을 3차례를 실시하여 단일 균주를 얻었으며, 이를 잠정적으로 S76으로 명명하였다(그림1).
2) S76 균주의 배양
분리된 균주 S76의 배양에는 마린 브로스 배지 2216 (제조원 : Difco Laboratories, MD USA)을 사용하였다. 액체배지의 경우 37.4g의 가루 배지를 증류수 1L에 넣은 후 2분 동안 끓여 모든 화합물을 안전히 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하며, 고체배지의 경우 55.1g의 가루 배지를 증류수 1L에 넣은 후 2분동안 끓여 모든 화합물을 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하여 사용하였다. 배양적 특성을 조사하기 위해 TSB(Tryptic Soy Broth, 제조원 : Difco Laboratories, MD USA) 배지를 사용하였다. 액체배지의 경우 30g의 가루 배지를 증류수 1L에 넣은 후 모든 화합물을 안전히 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하며, 고체배지의 경우 TSB 배지 1L에 agar powder 15g을 넣은 후 2분동안 끓여 모든 화합물을 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하여 사용하였다. 배양체의 준비는 300mL 배플드 플라스크(baffled flask)에 100mL씩 분주한 액체 배지에 분리된 균주의 단일집락을 접종하고 30℃, 150rpm에서 진탕배양하였다.
실시예2 - 분리 균주 S76 의 동정
1) 균주의 형태적, 배양적 특성
TSA 배지를 사용하여 30℃에서 48 내지 60시간 배양한 후 단일 콜로니를 취하여 현미경 하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 간균으로 판명되었으며 그람 염색 결과 그람 음성으로 조사되었다. catalase와 oxidase 반응을 조사한 결과 catalase 양성, oxidase 음성 반응으로 나타났다. 또한 분리 균주의 최적 생장 온도, 최적 pH, 최적 NaCl 농도를 확인하기 위하여 TSB에 NaCl이 3%의 농도가 되도록 첨가하여 24시간 배양한 배양체를 1mL씩 접종한 후 6시간 간격으로 O.D600nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 25℃ 내지 35℃에서 생장을 보였으며, 30℃에서 최적의 생장을 보였다. pH는 7과 8에서 최적의 생장을 보였고, NaCl 농도별 생장에서는 1% 내지 6%에 생장하였으며, 3% NaCl 농도에서 최적의 생장을 보였다(그림 3).
2) 균주의 생리적 특성과 탄소원 이용성
분리 균주 S76의 생리적 특성과 탄소원 이용성을 조사하기 위하여 BiologGN2 kit를 사용하였다. 본 발명에 따른 분리 균주 S76를 마린 브로스 2261에서 30℃에서 3일 배양한 후 키트의 기질에 접종하였으며, 그 결과는 표 1 에 나타내었다.
Figure 112006041126329-pat00001
3) 분리 균주 S76의 16S rRNA 염기 서열을 통한 동정
분리 균주 S76을 마린 브로스 2216(제조원: Difco Laboratories, MD USA)에서 25℃에서 48시간 동안 배양한 후 이로부터 추출된 염색체를 PCR 반응의 주형으로 사용하였고, 아래의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하였다.
Eub27F : 5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3' (서열번호 1)
Eub1522R : 5' -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA- 3' (서열번호 2)
상기 중합효소 연쇄반응은 PTC-100 Peltier Thermal Cycler(제조원 : MJ Research, USA)를 사용하여 수행하였고, 95℃에서 5분간 반응시키고, 95℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 반응을 33회 수행한 후, 72℃에서 10분간 반응시키는 조건으로 수행하여 1.5kb의 단편을 획득하였다. 얻어진 단편은 1.2% 아가로즈 젤에서 추출한 다음 이를 pGEM-T easy(제조원 : promega, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다(서열번호 3). 분석된 염기서열을 NCBI의 BLAST-N을 통하여 타종간의 유연관계를 확인한 결과, Erythrobacter vulgaris strain 022 2-10과 99% 유사도(similarity)를 보여 S76 균주는 Erythrobacter 속에 속하는 신종 균주로 동정되었다(표 2). 분리 균주를 에리스로박터 종 Ｓ76(Erythrobacter sp. S76)로 명명하였으며, 이 균주를 2004년 11월 19일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 어은동 52번지 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁 번호 KCTC 10731BP로 기탁하였다.
Figure 112006041126329-pat00002
4) 분리 균주 에리스로박터 종 S76 의 지방산 분석을 통한 동정
본 발명에 따른 분리 균주 에리스로박터 종 S76의 동정을 위하여 균체 내 지방산 조성을 분석하였다. 이를 위하여 분리 균주 에리스로박터 종 S76를 마린 아가 플레이트 2216에서 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 분석 기기는 미생물 동정 시스템(Microbial Identification System MIDI, 제조원: Microbial ID. Inc., DE, USA)을 사용하였으며, 분석된 테이터는 TSBA40 (Sherlock Version 4.0; 제조원:MIDI사, USA)에서 검색하였다. 배양체 40mg을 루프로 캡튜브에 취한 후 메탄올:증류수 (methanol:D.W) 1:1 혼합용액에 15% 수산화나트륨이 포함된 시약 1ml을 가하여 100℃에서 25분간 반응시켜 세포내 지방산을 추출하였다. 추출된 지방산의 메틸화를 위하여 6N HCl 2ml을 첨가하고 80℃에서 10분간 반응 시킨 후 재빨리 냉각시켰으며, 수용성의 상태인 지방산을 유기상으로 전환시키기 위하여 헥산:메틸-3급 부틸 에테르 (Hexan:Methyl-tert Buthyl Ether) 1:1 혼합용액 1.25ml을 첨가한 후 10분 동안 회전시켜주어 상층액만을 취했다. 마지막으로 포화된 수산화나트륨 용액 3ml으로 샘플을 씻어준 후 분석기기를 통하여 분석하였다. 지방산 분석을 수행하여 분포를 조사한 결과 주된 지방산은 C18 :1ω7c 였으며 전체 대비 점유비율은 42%에 달하였다 (표 3 참조). 전체적인 지방산 분포는 Erythrobacter citreus와 Erythrobacter longus type strain 들과 유사한 분포를 보였으나 종을 동정할 정도의 높은 유사성을 보이지는 않았다.
Figure 112006041126329-pat00003
실시예3 - 분리 균주 S76 의 칸타잔틴 생성능의 검정
1) TLC ( thin layer chromatography )를 통한 칸타잔틴 생성능 검정
본 발명에 따라 분리 균주 S76의 칸타잔틴 생성능을 조사하기 위하여, TLC(thin layer chromatography)를 수행하였다. 분리균주 S76내에 포함된 색소화합물은 아세톤(acetone)을 통해 추출하였다. 색소 추출물을 건조시킨 후 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:1 혼합용매에 용해시켰다. TLC의 매질은 실리카겔(Silica gel 60F254, 제조원: Merck, Germany)을 사용하였고, 추출된 색소 추출물을 헥산:아세톤(cloroform:acetone) 70:30 용매에서 전개시켰다.
그 결과가 도 5에 나타내었다. 표준 칸타잔틴 (제조원 : Dr. Ehrenstorfer GmbH, Germany)과 S76 균주의 Rf 값( Rf = 균주 색소 추출물의 전개 길이/ 전기용매의 전개 길이)을 산출한 결과, 모두 Rf = 3.2/5.2 = 0.615로 동일한 값을 가졌다. 따라서 S76 균주가 칸타잔틴을 생성한다는 것을 검증할 수 있었다(도 5)
2) HPLC ( high - pressure liquid chromatography )를 통한 칸타잔틴 생성능 검정
HPLC를 통하여 분리 균주 S76이 칸타잔틴을 생성하는지 조사하였다. 분리균주 S76 내에 포함된 색소 화합물은 아세톤을 통해 추출한 후 Hexane : 20% KCl(1:1)를 동량을 첨가하여 분리 조작하였다. Hexane 층에 동량의 물을 넣어 분리 조작하여 색소가 함유한 hexane층을 감압 농축하였다. 감압 농축된 색소 추출물을 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:1 혼합용매에 용해시켰다. HPLC에 사용된 컬럼은 C18 역상 컬럼(Ultrasphere ODS 4.6㎜ x 25㎝, 제조원: Beckman Coulter, CA, USA)을 사용하였고, 용매는 아세토나이트릴:메탄올:이소프로파놀(acetonitrile :methanol:isoprophanol) 90:6:4로 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 하였고, 흡광도는 UV 475nm에서 감지하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 표품 칸타잔틴은 HPLC 분석 결과 10.4분대에 피크로 나타났으며, 분리 균주 S76에서 또한 동일한 10.4분대의 피크를 보였다. 표품과 S76 균주에서 추출된 색소 화합물을 혼합하여 함께 분석한 HPLC에서도 역시 단일의 10. 4분대 피크(도 6)를 보였으므로 분리 균주 S76이 칸타잔틴을 생성한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예4 - 에리스로박터 종 Ｓ76으로부터 crtW 유전자의 클로닝
crtW 유전자는 베타 카로틴(beta-carotene)을 기질로하여 칸타잔틴을 생성하는 베타 카로틴 케토라제(beta-carotene ketolase)를 코딩하는 유전자로, 분리 균주 에리스로박터 종 Ｓ76으로부터 칸타잔틴 생합성 유전자인 crtW를 확보하기 위하여 기존에 알려진 유전자들 간의 유사성을 기초로 프라이머를 제작하였고 PCR방법을 통해 유전자를 확보하였다. 에리스로박터 종 Ｓ76을 마린 브로스 2216(제조원: Difco Laboratories, MD USA)에서 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 이로부터 추출된 염색체를 PCR 반응의 주형으로 사용하였고, 아래 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머를 사용하였다.
프라이머 2: 5'-CAY GAY GCN ATG CAY GG-3' (서열번호 6)
프라이머 7: 5'-TAN CCR AAR TGR TAR CA-3' (서열번호 7)
상기 중합효소 연쇄반응은 써멀 사이클러(Thermal Cycler; 제조원: Takara, Japan)를 사용하여 수행하였고, 94℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 35회 수행한 후, 72℃에서 15분간 반응시키는 조건으로 수행하여 약0.5kb의 단편을 획득하였다. 얻어진 단편은 0.9% 아가로스 겔에서 분획한 다음 이를 pKST에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 브라디리조비움 종(Bradyrhizobium sp.)의 crtW 유전자와 41%의 유사도(Similarity)를 보인 0.5kb의 유전자 단편을 프로브로 만들기 위하여 DIG-dUTP가 첨가된 DIG 라벨링과 함께 서열번호 1및 2의 프라이머를 사용하여 다시 PCR을 수행하였다. 전체 crtW 유전자를 분리하기 위하여 에리스로박터 종 Ｓ76의 게놈성 DNA에 대하여 서던블럿을 수행하였다. 먼저 여러 가지 제한효소로 각각 처리한 게놈성 DNA를 0.9% 아가로스겔에서 전기영동하여 크기별로 분획한 후 나일론 멤브레인(Schleicher & Schuell, 독일)으로 모세관 이동(capillary transfer) 방법으로 옮겼다. 하이브리드화는 42℃에서 50% 포름아미드를 포함하는 표준용액(5 X SSC, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 5% blocking regent, 50% formamide)을 사용하여 프로브를 첨가한 후 6시간 이상 지속하였다. 제조사(Boehringer-Mannheim, 독일)의 매뉴얼에 따라서 멤브레인을 알칼라인 포스파타제와 연결된 DIG에 대한 항체와 반응시킨 후 기질인 NBT와 X-포스페이트를 첨가하여 발색반응을 수행하였다. 제한효소 BamHⅠ으로 처리한 게놈성 DNA의 4kb 위치에서 선명한 갈색 시그널을 확인하였다. 따라서 crtW 유전자가 포함된 미니-라이브러리를 제작하기 위하여 에리스로박터 종 Ｓ76의 게놈성 DNA를 BamHⅠ으로 처리하여 0.9% 아가로스 겔에서 분획하였다. 4kb 주위의 DNA 단편을 겔 추출 키트를 사용하여 회수하였으며 BamHⅠ으로 처리한 pBluescriptⅡ 벡터와 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하여 미니-라이브러리를 제작하였다. 미니-라이브러리로부터 약 300여개의 플라스미드를 정제한 후 동일한 프로브를 사용하여 서던블럿을 반복 수행하여 crtW 전체 유전자를 포함하는 플라스미드를 선별하였다. crtW 유전자가 포함된 부위의 염기서열을 분석한 결과 서열번호 4과 같고 이로부터 추정된 단백질 서열은 서열번호 5와 같다. 서열번호 5를 기초로 유사성 분석결과 Brevundimonas aurantica 유래의 beta-carotene C4 oxygenase(crtW)와 49.2%의 유사도(identity)를 보였으며 Bradyrhizobium sp.의 beta-carotene ketolase(crtW)와 44.7%, Agrobacterium aurantiacum의 beta-carotene ketolase(crtW)와 41.7%의 유사도를 보여 본 발명에서 얻은 유전자가 crtW 유전자임이 확인되었으며 기존 유전자와 낮은 유사도로 판단하여 신규한 crtW 유전자임을 확인할 수 있었다. 본 발명에서 얻은 신규 crtW 유전자가 포함된 플라스미드인 pS76crtWZ가 형질전환된 대장균 DH5α를 2004년 11월 19일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 어은동 52번지 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁 번호 KCTC 10730BP로 기탁하였다
본 발명에 의해 제공되는 칸타잔틴 생합성 세균 에리스로박터 종 S76는 항산화제, 항암제, 착색제, 동물사료 보조제 등으로 사용될 수 있는 유용한 천연색소 칸타잔틴을 안정적으로 공급할 수 있을 뿐만 아니라 신규 칸타잔틴 생합성 유전자 crtW는 다양한 유전자 조작 방법을 사용하여 칸타잔틴 생산에 응용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 베타-카로틴 케토레이즈 활성을 가지는 단백질.
  2. 제1항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 4로 기재되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 원핵세포인 형질전환체.
  6. 제5항에 있어서, 기탁번호 제 KCTC 10730BP호의 형질전환체.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Arch. Biochem. Biophys., Vol. 325(2), pp. 145-151
Crit. Rev. Food. Sci. Nutr., Vol. 18(1), pp. 59-97

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