MXPA05001948A - Uso de plantas que contienen astaxantina o partes de plantas del genero tagetes como alimento para animales. - Google Patents

Uso de plantas que contienen astaxantina o partes de plantas del genero tagetes como alimento para animales.

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Abstract

La invencion se refiere al uso de plantas que contienen astaxantina o partes de las plantas del genero Tagentes o extractos que contienen astaxantina de plantas que contienen astaxantina o partes de plantas del genero Tagetes para administracion oral a animales. La invencion tambien se refiere a los metodos para la produccion de preparaciones de alimentos para animales, a las propias preparaciones de alimentos animales, a un metodo para la pigmentacion de animales o productos animales, y a un metodo para la produccion de animales y productos animales pigmentados.

Description

USO DE PLANTAS QUE CONTIENEN ASTAXANTINA O PARTES DE PLANTAS DEL GÉNERO TAGETES COMO ALIMENTO PARA ANIMALES La presente invención se relaciona con el uso de plantas que contienen astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o exractos portadores de astaxantina de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, para la administración oral a los animales, los procedimientos para la fabricación de preparados de forraje para los animales, los preparados de forraje propiamente tales, un procedimiento para el pigmentado de los animales o los productos de animales, como también un procedimiento para producir animales pigmentados y los productos de animales. Debido a sus propiedades colorantes se utiliza la astaxantina como agente colorante en la alimentación anima, especialmente de truchas, salmones y camarones. Actualmente se fabrica la astaxantina principalmente mediante procedimientos de síntesis química. La astaxantina natural se obtiene actualmente en pequeñas cantidades a través de procedimientos biotecnológicos mediante el cultivo de algas, por ejemplo Haematococcus pluvialis o en la fermentación de microorganismos optimizados tecnológicos de genes y reparación posterior.
La astaxantina obtenida mediante síntesis o por medio de aislación se estabiliza química - y/o físicamente mediante técnicas especiales de formulación destinada a aumentar la capacidad de almacenamiento y se elabora según la finalidad o el uso correspondiente en las respectivas áreas de aplicación y las biodisponibilidades .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION En la patente WO 9201754 se describe una planta silvestre portadora de astaxantina perteneciente a la especie Adonis aestivalis. Además, dicho documento divulga el uso de pétalos de la planta Adonis aestivalis portadores de' astoxantina como también susu extractos como alimento para peces o como aditivo de alimento para peces destinado a la pigmentación de los peces. Sin embargo, el uso de la planta Adonis aestivalis como fuente vegetal de la astaxantina para la pigmentación de los peces, de acuerdo al estado de la técnica, tiene el inconveniente que la producción de biomasa portadora de astaxantina y con ello el material de las plantas portadoras de astaxantina por superficie de cultivo es muy baja, siendo solamente posible obtener una cantidad satisfactoria de material vegetal o de plantas portadoras de astaxantina a través de cultivos cortos de grandes extensiones de terreno.
Esto genera altos costos en la producción de los respectivos agentes de pigmentación.
DESCRIPCION DE LA INVENCION Por ello, la invención tuvo como objetivo entregar un producto para la pigmentación, el cual no tenga el inconveniente del arte previo. De acuerdo a esto se encontró que es posible emplear plantas o partes de las plantas pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos que contienen astaxantina de plantas o partes de las plantas que contiene astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes para la administración oral a los animales. Es una modalidad de realización preferida se emplean las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos portadores de astaxantina proveniente de plantas o partes de plantas portadoras de estaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, para producir la pigmentación de los animales y de los respectivos productos de los animales. Bajo la expresión plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes se entienden preferentemente aquellas plantas de la especie Tagetes, las que contienen por lo menos en una parte de la planta astaxantina. La astaxantina puede encontrarse en forma libre como di-o monoéster de ácido graso. Las plantas preferidas pertenecientes a la especie Tagetes son aquellas plantas seleccionadas entre las especies Tagetes erecta, Tagetes patula, las cuales también se conocen como Mariglobal, Tagetes lucida, Tagetes psiuglei, Tagetes pudmesi, Tagetes minuta, Tagetes lemmonü, Tagetes termifolia o Tagetes campanlata, particularmente Tagetes eructa o Tagetes patula. Bajo la expresión partes de plantas portadoras de estaxantina de las plantas pertenecientes a la especie Tagetes se entienden preferentemente aquellas partes de las plantas que contienen por lo menos en una parte de la plantaa una cierta cantidad de astaxantina. Las partes de las plantas preferidas son, por ejemplo, las flores, los botones de floración o especialmente los pétalos de las floras. Las plantas de tipo natural o silvestre, pertenecientes a la especie Tagetes no contienen astaxantina en las floress, pero si caratinoides, como ser butina y zexantina. De acuerdo a la presente invención se encontró, sin embargo, que las plantas pertenecientes a la especie Tagetes son capaces de producir astaxantina mediante una modificación genética. En una realización preferida se permite la producción de astaxantina por las plantas pertenecientes a la especie Tagetes, produciendo en las plantas modificadas genéticamente, pertenecientes a la especie Tagetes, en comparación coneltipo natural o silvestre de la planta, una actividad-cetolasa . Por actividad cetolosa se entiende la actividad enzimática de na cetolasa. Por cetolasa se entiende una proteína que presenta la actividad enzimática de introducir en el anillo beta-iomona, opcionalmente sustituido, de las casotinoides en grupo ceto. En particular se entiende por una cetolosa una proteína que presenta la actividad enzimática de convertir la beta-carotina en cantaxantina . De acuerdo con esto, se entiende por actividad-cetolasa la cantidad de beta-caroteno o la cantidad de cantaxantina formada en un tiempo determinado por acción de la proteína cetilosa. Bajo la expresión "tipo silvestre o natural" se entiende según la invención la planta de partida o de origen perteneciente a la especie Tagetes, no modificada genéticamente . Dependiendo del contexto, se entiende por "planta" la planta de origen o de pertida (tipo material o sivestre) perteneciente a la especieTagetes o una planta modificada genéticamente, de acuerdo a la invención, perteneciente a la especie Tagetes, o ambas.
Preferentemente se entiende por "Tipo natural o silvestre" para la generación de la actividad-cetolasa, para el crecimiento de la actividad-hidroxilasa descrita a continuación, para el incremento de la actividad betacidasa descrita a continuación o la reducción de la actividad epsilon-ciclasa descrita anteriormente y el incremento del contenido de astoxantina, en cada caso una planta de referencia. Esta planta de referencia perteneciente a la especie Tagetes (clavel japonés o Tajetes es la agetes erecta, Tagetes patula, Tagetes leccida, Tagetes pinglei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta o Tagetess campanulata, de particular preferencia Tagetes erecta, en particular Tagetes erecta L, número de acceso: TAG 72, clase orangenpriuz que se puede obtener del banco de genes IPK, correnstr.3, 0-06466 Gratersleben, Alemania. La determinación de la actividad-cetolasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención de la especie Tagetes en las plantas de tipo silvestre o de referencia se realiza preferentemente bajo las siguientes condiciones : La determinación de la actividad-cetolasa en el material de las plantas se realiza basado en el método de Brozer y colaboradores (J. Biol. Chem. 272(10) : 6128-6135, 1997) . La actividad-cetolasa en los extractos vegetales se determina con los sustratos beta-caroteno y cantoxantina en presencia de lipicolo (lecitina de ropa) y detergente (colato de sodio) . Las relaciones substrato producto del ensayo cetolosa se determina mediante cromatografía HPLC. La planta modificada genéticamente de acuerdo a la invención, perteneciente a la especie Tagetes presenta en esta modalidad de realización preferida, en comparación con el tipo silvestre no modificado genéticamente una actividad-cetolasa, preferentemente en los pétalos, siendo así preferentemente capacitada para expresar trangénicamente una cetolasa . Según otra realización preferida se produce la actividad cetolasa en las plantas de la especie Tagetes a través de la generación de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica para una cetolasa. En esta realización preferida se genera la expresión genética de un ácido nucleico, que codifica una cetolasa de manera preferentemente mediante la incorporación de ácidos nucleicos, los que codifican para una cetolasa, en la planta de partida perteneciente a la especie Tagetes. Para ello, en principio se puede emplear cada gencetolasa, es decir, cada ácido nucleico, que codifica para una cetolasa. Todos los ácidos nucleicos mencionados en la descripción pueden ser, por ejemplo, una secuencia-ARN, ADN o un cADN.
En las secuencias-cetolasa genéricas provenientes de fuentes eucariotas, que llevan nitroness, para el caso que la planta hospedante pertenecientee a la especie Tagetas no pueda o no se puedaallevar a expresar la correspondiente cetolasa, se deben emplear preferentemente secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tales como los correspondientes cADN. Ejemplos de los ácidos nucleicos, que codifican para una cetolasa y las correspondientes cetolasas, que se pueden utilizar en el procedimiento de la invención, son por ejemplo, las secuencias de Haematococcus pluvialis, en particular de Haematococcus pluvialis Floton em. Wille (No. de acceso X86782; ácido nucleico: SEQ ID No. 1, proteico SEQ ID No. 2), Haematococcus pluvialis, NIES-144 (No de acceso: D45881; ácido nucleico: SEQ ID No. 3; proteínas SEQ. ID. No. 4) ; Agrobacterium aurantiacum (No. de acceso: D58420; ácido nucleico: SEQ-ID No. 5; proteína SEQ ID No. 6) ; Alicaligene spec. (No. de acceso No. : D58422; ácido nucleico: SEQ ID No 7; proteína SEQ ID No. 8) . Paracoccus marcusii (No. de acceso: Y15112, ácido nucleico: SEQQ ID No. 9; ptoteína SEQ ID No 10); Synechocytis sp. Cepa PC 6803 (No. de acceso NP442491; ácido nucleico: SEQ ID No. 11; proteína SEQ ID No. 12); Bradyrhizobium sp. (No. de acceso: AF 218415; ácido nucleico: SEQ ID No. 13, proteina SEQ ID No. 14); Nostec sp. Cepa PCC 7120 (No de acceso: AP 003592; BAB 74888; ácido nucleico: SEQ ID No. 15; proteina SEQ ID No. 16); Nostec punctiforme ATTC 29133; ácido nucleico: No. acceso: NZ_AABCO 1000195; par de bases 55.504 hasta 55.392 (SEQ ID No 81); proteina No. de acceso ZP_00111258 (SEQ ID No. 82) (anotada como proteina puntativa) , Nostec punctiforme ATTC 29133, ácido nucleico, No. de acceso NZ_AABCO1000196; par de bases 140.571 hasta 139.810 (SEQ ID No. 83), proteina (SEQ. IDN 84), (sin anotar), Synechococcus sp. WH 8102, ácido nucleico No. de acceso NZ_AABD01000001, par de bases 1,354,725-1,355.528 (SEQ ID No. 85); proteina No. de acceso ZP_00115639 (SEQ ID NO. 86) (anotada como proteina puntativa) , Haematococcus pluvialis (No. de acceso: AF534876, AA No. 3484; ácido nucleico: SEQ ID No. 97, proteina SEQ ID No. 98) ; Paracoccus sp. MBIC1143; (No. de acceso: D58420; P54972; ácido nucleico SEQ ID No. 99, proteina: SEQ ID No. 100); Brevundimonass aurantiaca (No. de acceso : AYl 66610; AAN86030; ácido nucleico: SEQ ID No. 101, proteina: SEQ ID No. 102); Nodularia spumigena NSOR10 (No. de acceso AY210783, AA064399; ácido nucleico: SEQ ID No. 103; proteina SEQ ID No. 104) y Deinococcus radiodurans Rl (No. de acceso: E75561; AE001872; ácido nucleico: SEQ ID No. 105; proteina SEQ ID No. 106); Otros ejemplos naturales de cetolasas y genes-cetolasa, adecuados para ser empleados en el procedimiento de la invención se pueden encontrar fácilmente a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica sea reconocida, mediante comparación de las identidades de las secuencias de los aminoácidos o de las respectivas secuencias de ácido nucleico retro-traducidas a partir de bancos de datos, en las secuencias descritas anteriormente, en particular en las secuencias SEQ ID No. 2 y/0 16. La hibridización se puede efectuar bajo condiciones moderadas (estrictez reducida) o preferentemente bajo condiciones estrictas (alta estrictez) . Tales condiciones de hibridización se describen, por ejemplo, en Samboock, J. Fritch, E.F; Maniaties, T, en molecular Cloring (A Laboratory Manual), 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57, o en Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, Nueva York (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, las condiciones "Boding" durante la etapa de lavado se pueden seleccionar entre las condiciones en el rango limitado por aquellas con una estrictez reducida o baja (2X SSC a 50°C) y aquellas de alta estrictez (con 0,2XSSC a 50°C, preferentemente 65°C) (20XSSC 0,3M citrato de sodio, 3M cloruro de sodio, pH 7,0) . Además, durante la etapa de lavado se puede subir la temperatura desde condiciones moderadas a temperatura ambiente, 22°C, hasta condiciones estrictas a 65°C. Ambos parámetros, la concentración salina y la temperatura, se pueden variar simultáneamente, también se puede mantener constante uno de los dos parámetros, vasiando el otro. Durante la hibriolizacion es posible aplicar agentes de desnaturalización, tales como formanida o SDS. En presencia de 50% formamida se desarrolla la hidrolización preferentemente a 42°C. A continuación se indican ejemplos de las condiciones de hibriolizacion y la etapa de lavado: (1) Condiciones de hibriolizacion con por ejemplo (i) 4 X SSC a 65°C, o (ii) 6 X SSC a 45°C, o (iii) 6 X SSC a 68°C, 100 mg/ml ADN-esparmo de pescado desnaturalizado, o (iv) 6 X SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml ADN-esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado a 68 °C, o (v) 6 X SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml ADN-esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, 50% formamida a 42 °C, o (vi) 50% formamida, 4XSSC a 42°C, ó (vii) 50% /vol/vol) formamida, 0,1% albúmina de suero de vacuno, 0.1% ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 50 mM tampón fosfato de sodio pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM citrato de sodio a 42°C, o (viii) 2 X 0 4 XSSC a 50°C (condiciones moderadas), o (iX) 30 hasta 40% formamida, 2X ó 4X SSC a 42°C (condiciones moderadas) . (2) Etapas de lavado para cada una 10 minutos, por ejemplo, (i) 0,015 MNaCl/0,0015 M citrato de sodio /0,1% SMS a 50_C, ó (ii) 0,1XSSC a 65°C, o (iii) 0,1XSSC, 0,5% SMS a 68°C, ó (iv) 0,1XSSC, 0,5%SMS, 50% formamida a 42°C, ó (v) 0,2XSSC, 0,1% SDS a 42°C, ó (vi) 2xSSC a 65°C (condiciones moderadas) En una modalidad preferida de las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención pertenecientes a la especie Tagetos, se incorporan ácidos nucleicos, que codifican para una proteina, portadora de la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 2, o una secuencia derivada a partir de esta secuencia mediante la sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, la que presenta una cantidad de por lo menos un 20%, preferentemente de por lo menos un 30%, particularmente de por lo menos un 40%, más preferentemente un 50%, más preferentemente por lo menos un 60%, más preferentemente de por lo menos un 70%, más preferentemente de por lo menos un 80%, de particular preferencia por lo menos un 90% a nivel de aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ ID No 2, y que tiene la propiedad enzimática de una cetolasa. En este caso se puede tratar de una secuencia cetolasa natural, la cual se puede encontrar, tal como se describe anteriormente, mediante una comparación de la identidad de las secuencias de otros organismos, o de una secuencia cetolasa artificial obtenida a partir de la secuencia SEQ ID No. 2 mediante una variación artificial, por ejemplo mediante sustitución, inserción o suspención de aminoácidos . En otra modalidad preferida del procedimiento de acuerdo a la invención se incorporan ácidos nucleicos los que codifican para una proteina, portadora de la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 16, o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o suspención de aminoácidos, con una identidad de por lo menos un 20%, preferentemente por lo menos un 30%, más preferentemente por lo menos un 40%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 60%, más preferentemente por lo menos un 70%, más preferentemente por lo menos un 80%, de particular preferencia por lo menos un 90%, a nivel de aminoácido, con la secuencia SEQ ID No. 16, y la que presenta la propiedad de una cetolasa.
Se puede tratar de una secuencia-cetolasa natural, encontrada tal como se describió anteriormente mediante una comparación de las identidades de las secuencias de otros organismos, o también de una secuencia -cetolasa artificial, modificada a partir déla secuencia SEQ ID No. 16, mediante una variación artificial, por ejemplo mediante la sustitución, inserción o suspensión de aminoácidos. Bajo la expresión "sustitución" se entiende en la presente descripción el intercambio de ' uno o más aminoácidos por uno o varios aminoácidos. Preferentemente se realizan los llamados intercambios conservadores, donde el aminoácido de recambio tiene una propiedad similar como el aminoácido original, como ser por ejemplo, intercambio de Glu por Asp. Glu por Asn, Vol por lie, Leu durch lie, Ser durch Thr. Por supresión o "delación" se entiende la sustitución de un aminoácido or un enlace directo. Las posiciones preferidas para una supresión son los extremos del polipéptido y los enlaces entre los dominios de proteinas individuales . Las inserciones son las incorporaciones de aminoácidos en la cadena polipeptidica, donde se reemplaza formalmente un enlace directo por uno o varios aminoácidos. Por identidad entre dos proteinas se entiende la identidad de los aminoácidos en toda la longitud de la proteina, especialmente la identidad calculadaa a través de la comparación con ayuda del Lasergene Software de la firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (E.E.U.U), con aplicación de método Clustal (Higgins DG, Sharp P.M. Fast and sensitive múltiple sequence alignment on a microcomputer; Comput Appl . Biosci. 1989, Abr. 5(2):151-1) con el ajuste de los siguientes parámetros: Parámetro de' alineamiento múltiple : Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Parámetros de alineamiento de a parer. K-tuple 1 Gap penality 3 Window (ventana) 5 Diagonals saved 5 Bajo una proteina, que presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ ID No. 2 o 16, se entiende por lo tanto una proteina la cual en una comparación de su secuencia con la secuencia SEQ ID No. 2 o 16, preferentemente según el logaritmo de programa con el conjunto de parámetros de programa con el conjunto de parámetros señalados anteriormente, presenta una identidad de por lo menos un 20%.
Las secuencias adecuadas de los ácidos nucléicos se obtienen, por ejemplo, por medio de la traducción inversa de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. Para ello se emplean preferentemente aquellos coclones, utilizados frecuentemente de acuerdo al uso de codón especifico para Tagetes. Este uso de codon se puede determinar fácilmente mediante evaluaciones computacionales de otros geness conocidos de plantas pertenecientes a la especie Tagetes. En una modalidad de realización particularmente preferida se introduce en la planta de la especie un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ ID No.l. Según otra modalidad especialmente preferida se introduce en la planta de la especie un ácido nucleico portador de la secuencia SEQ ID No. 15. Todos los genes-cetelasa mencionados Cetolasa mencionados anteriormente también se pueden preparar, en la forma conocida, mediante síntesis química a partir de los módulos constructivos nucleótidos, como ser por ejemplo, por medio de la condensación de fragmentos de los módulos constructivos de ácidos nucleicos individuales, complementarios, traslapados de la hélice doble. La síntesis química de los oligonucleótidos se puede realizar, por ejemplo en la forma conocida, mediante el método de fosfoamidita (Voet, Voet 2da Edición, Wiley Press, Nueva York, páginas 896-897). La colocación de los oligoncleótidos sintéticos y el rellenado de los espacios vacíos con el fragmento-Klenow de la ADN-polimerasa y las reacciones de ligazón, como también los procedimientos generales de clonación se describen en el texto de Sambrook y colaboradores (1989) , Molecular Cloning: A Laboratory y manual, Gold Spring Harbor Laboratory press. En una modalidad de realización particularmente preferida del procedimiento de la invención se utilizan plantas modificadas genéticamente pertenecientes a la especie Tagetes (Tagetes, clavel japonés), la que presentan en las flores la mayor tasa de expresión de una cetolasa. Esto se logra preferentemente efectuando la expresión del gen de la cetolsa bajo el control de un promotor específico para la flor. Con tal finalidad, se incorporan por ejemplo los ácidos nucleicos descritos anteriormente, según se describirá detalladamente a continuación, en una construcción de ácido nucleico enlazador con un promotor específico para la flor, en la planta perteneciente a la especie Tagetes. Las plantas particularmente preferidas de la especie Tagetes (Taagetes) como plantas de partida o plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención, son aquellas plantas seleccionadas de las especies Tagetes erecta, Tagetes patula, también conocida como Marigold, Tagetes lucidaa, Tagetes pringlei, Tagetes plameri, Tagetes minuta, Tagetes lemmonii, Tagetes tenuifolia, o Tagetess campanulata, de especial preferencia Tagetes erecta o Tagetes postula . En una modalidad de realización preferida se emplean plantas modificadas genéticamente de la especie Tagetes, las que adicionalmente presentan una actividad hidroxilasa aumentadaa y/o una actividad beta-ciclasa . Por actividad hidroxilasa se entiende la actividad enzimática de una hidroxilasa. Bajo la expresión hidroxilasa se entiende una proteina, la que presenta la actividad enzimática de introducir en el anillo-beta-ionona, opcionalmente sustituido, de las carotenoides un grupo hidroxilo. En particular, se entiende por hidroxilasa una porteina que presenta la actividad enzimática de convertir la beta-carotiria en zeaxantina o la cantaxantina en astaxantina. De acuerdo con lo anterior, se entiende por actividad hidroxilasa la cantidad de beta-carotina o de cantaxantina convertida o la cantidad de zeaxantina o astaxantina formada en un tiempo determinado por la proteina hidroxilasa . Asi en el caso de una actividad-hidroxilasa aumentada con respecto a aquella del tipo natural o silvestre, se aumenta la cantidad de beta-carotena o de cantaxantina convertida o la cantidad de zeaxantina o astaxantina formada por la proteina hidroxilasa durantee un tiempo determinado. Este incremento de la actividad-hidroxilasa asciende a preferentemente a un mínimo de 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, además preferentemente por lo menos un 50%, además preferentemente por lo menos un 100%, más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad-hidroxilasa del tipo silvestre. Por actividad beta-ciclosa se entiende la actividad enzimática de una beta-ciclasa. Bajo beta-ciclasa se entiende una proteína que presenta la actividad enzimática capaz de convertir un residuo terminal, lineal de la licoprina con un anillo beta-ionona . En particular, se entiende por beta-ciclosa una proteína que presenta la actividad enzimática capaz de convertir la gama-carotina en beta-carotina. De acuerdo con lo anterior, se entiende por una actividad beta-ciclosa la cantidad de gama-carotina convertida o la cantidad de beta-carotina formada por la acción de la beta-ciclosa en un tiempo determinado. En el caso de una actividad beta-ciclosa aumentada en comparación con aquella del tipo natural o silvestre se aumenta asi la cantidad de gama-carotina convertida o la cantidad de beta-carotina formada en un tiempo determinado por acción de la proteina beta-ciclosa. Este aumento de la actividad beta-ciclosa asciende a preferentemente por lo menos un 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, además preferentemente por lo menos un 50%, además preferentemente por lo menos un 100%, más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad beta-ciclosa del tipo silvestre. La determinación de la actividad-hidroxilasa en las plantas modificadas genéticamente y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se efectúa preferentemente bajo las siguientes condiciones: La actividad de la hidroxilasa se determina in vitro de acuerdo a Bouvier y colaboradores (Biochim. Biophys . Acta 1391- (1989), pág. 320-328). A una determinada cantidad de extracto de la planta se incorpora ferredoxina, ferrodoxina-NADP-oxidoreductasa, cátalas, NADPH y beta-carotina con mono-y digalactisilglicéridos . La determinación de la actividad hidroxilasa se realiza preferentemente en las siguientes condiciones según Bouvier, Keller, d'Harlingue y Camaara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functioanl characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328. El ensayo in vitro se realiza en un volumen de 0,250 mi. El preparado contiene 50 mM fosfato de potasio (pH 7,6), 0,025 mg ferredoxina de espinaca, 0,5 unidades ferreoxina-NADP+oxidoreductasa de espinaca 0,25 mM NADPH, 0,010 mg beta-carotina (mulsionada en 0,1 mg Tween 80), 0,05 mM de una mezcla de mono-y digalactosilglicéridos (1:1), una unidad catalysis, 200 mono-y digalactosil flicéridas (1:1), 0,2 mg albúmina de suero de bovino y extracto de planta en diversos volúmenes. La mezcla de reacción se incubó durante 2 horas a 30°C. Los productos de la reacción se extraen en solventes orgánicos como acetona o cloroformo/metanol (2:1) y se determinan por medio de HPLC. La determinación de la actividad beta-ciclosa en las' plantas modificadas genéticamente y en las de tipo silvestre o de referencia se efectúa preferentemente en las siguientes condiciones : La actividad de la beta-ciclosa se determina in vitro según Fraser y Sandmann (Bioc em. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992) -15) . A una cantidad determinada de extracto de planta se incorpora fosfato de potasio como tampón (pH 7,6), licopina como sustrato, proteina estroma de pimentón, NADP +, NADPH y ATP.
La determinación de la actividad hidroxilasa se realiza de particular preferencia bajo las condiciones siguientes según Bowvier, d'Harlingue y Cámara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys, 346 (1) (1997) pág. 53-64) : El ensayo in vitro se realiza en un volumen de 250 mi. El preparado contiene 50 mM fosfato de potasio (pH 7.6), cantidades variables de extracto de planta, 20 mM licopina, 250 mg de proteina de estroma cromo plastidiasia del pimentón 0,2 mM NADP+, 0,2 mM NADPH y 1 mM ATP. El NADP/NADPH y ATP se disuelven en 10 mi etanol con 1 mg Twenn 80 poco antes de la incorporación al medio de incubación. Después de un tiempo de reacción de 60 minutos a 30 °C se termina la reacción mediante la incorporación de cloroformo/metanol (2:1). Los productos de la reacción extraídos con cloroformo se analizan por medio de HPLC. Un método de ensayo alternativo con un sustrato radiactivo fue descrito por Ffrase y Sandmann (Biochem. Biohys. Res. Comm. , 185(1) (1992) pág. 9-15) . El aumento de la actividad-hidroxilasa y/o de la actividad beta-ciclosa se puede realizar a través de diferentes vías, por ejemplo, a supresión de los mecanismos inhibidores de la regulación a nivel de expresión y de proteína o aumentando la expresión genética de los ácidos nucleicos que codifican para una hidroxilasa y/o de los ácidos nucleicos que codifican una beta- ciclasa con respecto del tipo material o silvestre. El aumento de la expresión de los genes de los ácidos nucleicos que codifican para una hidroxilasa y/o el aumento de la expresión de los genes de los ácidos nucleicos que codifican para una beta-ciclosa con respecto del tipo silvestre también se puede realizar siguiendo diferentes vías, por ejemplo mediante la inducción del gen-hidroxilasa y/o del gen beta-ciclosa con ayuda de activadores o mediante la incorporación deuna o varias copias de genes-hidroxilasa y/o copias de genes beta-ciclasa, es decir por medio de la incorporación de por lo menos un ácido nucleico que codifica para una hidroxilasa y/o por lo menos un ácido nucleico que codifica para una epsilon-ciclasa en la planta de la especie Tagetes. Bajo la expresión de aumentar la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica para una hidroxilasa y/o una beta-ciclasa, de acuerdo a la invención también se entiende la manipulación de la expresión de la hidroxolasa y/o beta ciclosa engógenas de las plantas de la especie Tagetes (tajetas) . Esto se puede alcanzar, por ejemplo, mediante las modificación de la secuencia-ADN promotora para genes que codifican para las hidroxilasas y/o beta-ciclosas . Tal modificación, que tiene como resultado una mayor tasa de expresión del gen, se puede realizar por ejemplo por medio de la supresción o la inserción de secuencias-ADN. Tal como se explicó anteriormente, es posible modificar la expresión de la hidroxilasa y/o beta-ciclasa endógena mediante la aplicación de estímulos exógenos. Esto puede ocurrir mediante condiciones fisiológicas especiales, es decir mediante la aplicación de substancias extrañas . Por otra parte es posible obtener una expresión modificada, es decir aumentada, de un gen endógeno hidroxilasa y/o beta-ciclosa, mediante la interacción de una proteína-reguladora no presente en la planta sin transformar con el promotor de este gen. Dicho regulador puede ser una proteína quimérica, constituida por un dominio de enlace-ADN y un dominio-activaador de la transcripción, tal como se describe por ejemplo en la patente WO 96/06166. En una realización preferida se obtiene el aumento de la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica para una hidroxilasa y/o tal aumento de la expresión del gen de un ácido nucleico que codifica para una beta-ciclasa mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucleico codificando una hidroxilasa y/o la incorporación de por lo menos un ácido nucleico codificando una beta-ciclosa, en la planta de la especie Tagetes.
Aquí se puede utilizar básicamente cada gen-hidroxilasa o cada gen-beta-ciclosa, es decir, cada ácido nucleico que codifica para una -hidroxilasa y cada ácido nucleico, que codifica para una beta-ciclasa. En las secuencias-ácido nucleico-hidroxilasa o beta ciclasa proveniente de fuentes eucariotas, portadoras de nitrones, para el caso que la planta hospedante no sea capáz o no se pueda llevar a expresar la correspondiente hidroxilasa o beta-ciclasa, se deben emplear preferentemente secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tales como las correspondientes CADN. Un ejemplo de un gen-hidroxilasa es un ácido nucleico, que codifica una hidroxilasa de Haematococcs pluvialis, No. de acceso AX038729, ver WO 0061764); (ácido nucleico: SEQ ID No. 17; proteína SEQ ID No. 18) . Como también las hidroxilasas con los números de acceso siguientes: lemblCAB55626.1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443.1, NP_194300.1, NP_200070.1, AAG10430.1, CAC06712.1, AAM88619.1, CAC95130.1, AAL80006.1, AF162276_1, AA053295.1, AAN85601.1, CRTZ_ER HE, CRTZ_ER HE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1, CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1, ZP_00094836.1, AAC44852.1, BAC77670.1, NP_745389.1, NP_344225.1, NP_849490.1, ZP_00087019.1, NP 503072.1, NP 852012.1, NP 115929.1, ZP 00013255.1 Una hidroxilasa particularmente preferida sigue siendo la hidroxilasa del tomate (N de acceso Y14809) (ácido nucleico: SEQ ID No. 107; proteina: SEQ ID No. 108) . Ejemplos de genes beta-cielasa son los siguientes: en ácido nucleico que codifica para ser una beta-ciclasa del tomate (No. de acceso X 86452) (ácido nucleico: SEQ ID No. 19; proteina: SEQ ID No.20); además, las beta-ciclasas con los siguientes números de acceso: S66350 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1-) -tomate CA7A60119 lycopene synthase [Capsicum annuum] S66349 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1.-) - common tobáceo CAA57386 lycopene cyclase [Nicotiana tabacum] AAM21152 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensisl AAD38049 lycopene cyclase [Citrus x paradisi] ???86060 lycopene cyclase [Citrus unshiul AAF44700 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] 7???07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestinal AAG 10429 beta cyclase [Tagetes erecta] AAA81880 lycopene cyclase AAB53337 Lycopene beta cyclase AAL92175 beta-lycopene cyclase [Sandersonia aurantiaca] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta] ??01 8661 lycopene beta-cyclase [Zea mays] 7AAG21133 chromopiast-specific lycopene beta-cyclase [Lycopersicon esculentum] 7AAF1 8989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota] ZP-001 140 hypothetical protein [Prochiorococcus marinus str.
MIT93131 ZP001050 hylpothetical protein [Prochiorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378] ZP-001 046 hylpothetical protein [Prochiorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378] ZP-001 134 hypothetical protein [Prochiorococcus marinus str. MIT9313] ZP-001 150 hypothetical protein [Synechococcus sp. WH 8102] 7AAF1 0377 lycopene cyclase [Deinococcus radiodurans] BAA29250 393aa long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] ??077673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] AAL01 999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2] ZP000190 hypothetical protein [Chioroflexus aurantiacusl ZP000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. ORS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] CAA64855 lycopene cyclase [Streptomyces griseus] AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea aggiomerans] C37802 crtY protein - Er inia uredovora BAB79602 crtY [Pantoeá aggiomerans pv. milletiae] ???64980 lycopene cyclase [Pantoea aggiomerans] AAC44851 lycopene cyclase ???09593 Lycopene cyclase [Paracoccus sp. MBIC1 1431 ZP000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusúl ???20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus] ZP000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca] ZP000190 hypothetical protein [Chioroflexus aurantiacus] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestinal CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissusl ???53337 Lycopene beta cyclase BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] Una beta-ciclasa especialmente preferida es la beta-ciclasa especifica para el cromoplasto del tomate (AAG 21133) (ácido nucleico SEQ ID No. 109; proteina SEQ ID No. 110) .
En las plantas transgénicas preferidas de acuerdo a la invención perteneciente a la especie Tagetes se tiene esta modalidad de realización preferida, en relación al tipo silvestre, por lo menos un gen hidroxilasa y/o un gen beta-ciclasa adicional. En una modalidad de realización preferida, la planta modificada genéticamente contiene por ejemplo al menos un ácido nucleico exógeno, el cual codifica para una hidroxilasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos, gue codifican para una hidroxilasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno, que codifica para una beta-ciclasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos, que codifican para una beta-ciclasa . En la modalidad de realización preferida descrita anteriormente se utiliza preferentemente como gen-hidroxilasa ácidos nucleicos que codifican para proteínas, portadoras de la secuencia de amino ácido SEQ ID No. 18, o una secuencia derivada a partir de dicha secuencia mediante la sustitución, inserción o supresión de amino ácidos, con una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, de preferencia por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la secuencia SEQ ID No. 18, y las cuales tienen la propiedad de una hidroxilasa.
Otros ejemplos de hidroxilasas y genes-hidroxilasa se pueden encontrar, por ejemplo, en diferentes organismos, cuya secuencia genómica sea conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las respectivas secuencias de ácido nucleico retro traducidas a partir de bancos de datos, en la SEQ ID No. 18. Otros ejemplos de hidroxilasas y de genes-hidroxilasa se pueden encontrar, partiendo de la secuencia SEQ ID No. 17, a partir de diferentes organismos cuya secuencia genérica es desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante técnicas de hibridización y PCR, conocidas . En otra modalidad de realización particularmente preferida, con el objeto de incrementar la actividad hidroxilasa se incorporan ácidos nucleicos en los organismos, los que codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido de la hidroxilasa de la secuencia SEQ ID No. 18. En secuencias de ácido nucleico adecuadas son por ejemplo aquellas obtenidas mediante la retro-traducción de la secuencia polipéptido según el código genético. Para ello se emplean preferentemente aquellos codones, utilizados frecuentemente según el llenado "codónusage" específico para la planta. Dicho "codón usage" se puede determinar a través de evaluaciones computacionales de otros genes, conocidos de los respectivos organismos. En una modalidad de realización particularmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucleico correspondiente a la secuencia SEQ ID No. 17. En la modalidad de realización preferida, descrita anteriormente se emplea como genes-beta-ciclosa ácidos nucleicos, que codifican proteinas, portadoras de la secuencia aminoácido SEQ ID No. 20 o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustención, inserción o supresión de aminoácidos, con una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, preferentemente por lo menos un 70%, áun más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% anivel de los aminoácidos con la secuencia SEQ ID No. 20, y que presentan la propiedad enzimática de una beta-ciclasa . Otros ejemplos de beta-ciclasa y genes beta-ciclasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diversos organismos, con una secuencia genómica conocida, tal como se describió anteriormente mediante comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácido o las respectivas secuencias de ácido nucleico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ ID No. 20. Otros ejemplos de beta-ciclasas o genes beta-ciclasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ ID No. 19, a partir de diferentes organismos con una secuencia genómica desconocida, aplicando técnicas de hibridización y reacción PCR, en la forma conocida. En otra modalidad de realización especialmente preferida, para incrementar la actividad-beta-ciclasa se introducen en los organismos ácidos nucleicos, que codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido de la beta-ciclasa de la secuencia SEQ ID No.20. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son por ejemplo aquellas obtenidas por medio de la retroducción de la secuencia polipéptido según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente codones tales como aquellos usados frecuentemente según el llamado "codón usage" específico para las plantas. El mencionado "codón usage" se puede determinar a través de evaluaciones computacionales de otros genes, conocidos de los correspondientes organismos. En una modalidad particularmente preferida se introduce en el organismo un ácido nucleico, correspondiente a la secuencia SEQ ID No. 19. Todos los genes-hidroxilasa o beta-ciclasa mencionados anteriormente se pueden preparar, además, por medio de síntesis química a partir de módulos constructivos de nucleótidos, tal como por ejemplo la condensación de fragmentos de módulos constructivos de ácido nucleico individuales, complementarios y traslapados de la hélice doble . La síntesis química de los oligonucleótidos se pueden realizar, por ejemplo, en la forma conocida, según el método fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wily Press, Nueva York, páginas 896-897). La unión de las oligonucleótidos sintéticos y el' rellenado de los espacios vacíos con ayuda del fragmento-klenow de la ADN-polimerasa y reacciones de ligazón, como también los procedimientos generales de clonación se describen en la publicación de Sambook y colaboradores (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En otra modalidad de ralización preferida del procedimiento, las plantas pertenecientes a la especie Tagetes presentan con respecto del tipo natural o silvestre una actividad epsilon-ciclasa reducida. Por actividad epsilon-ciclasa se entiende la actividad enzimática de una epsilon-ciclasa. Baja epsilon-ciclasa se entiende una proteína que presenta la actividad enzimática capaz de convertir un radical lineal, terminal de licoprina en un anillo epsilon-ionona .
Por ello se entiende preferentemente por una epsitonciclasa una proteina que tiene la actividad enzimática capaz de convertir la licopina en delta-casotin . Por consiguiente, se entiende por actividad epsilon-ciclasa la cantidad de licopina convertida o la cantidad de delta-cenotina formada durante un tiempo determinado por la acción déla proteina epsilón-ciclasa . En el caso de una actividad epsilon-ciclasa reducida con respecto del tipo natural o silvestre se reduce asi, en comparación con el tipo silvestre la cantidad de licopina convertida o la cantidad de deta-carotina formada en la unidad de tiempo por acción de la proteina-ciclasa . Por una actividad epsilon-ciclasa reducida se entiende preferentemente la supresión o el bloqueo, parcial o subtancialmente completa, basada en diferentes mecanismos biológicos celulares, de la función de una epsilonciclasa en un célula de una planta, o en una parte derivada de la misma, tejido, órgano, células o semillas. La reducción de la actividad apseton-ciclasa en la plantas en relación al tipo natural o silvestre se puede realizar, por ejemplo, a través de una reducción de la cantidad de proteina epsilon-ciclasa o de la cantidad en ARN-epsilon-ciclasa en la planta. De acuerdo con lo anterior, se puede determinar directamente una actividad epsilon-ciclasa reducida con respecto del tipo natural o silvestre o a través de la determinación de la cantidad de proteina epsilon-ciclasa o de la cantidad de su ARN-epsilon-ciclasa de la plantaa de la invención en comparación con el tiempo natural. Una reducción de la actividad epsilon-ciclasa comprende una reducción de la cantidad de una epsilon-ciclasa hasta la ausencia subtancialmente completa de la epsilon-ciclasa (es decir la falta de determinación de una actividad epsilon-ciclasa o la ausencia de la comprobación inmunológica de la epsilon-ciclasa) . Preferen emente, se reduce la actividad epsilon-ciclasa (es decir, la cantidad de proteina epsilon-ciclasa o la cantidad en ARN-epsilon-ciclasa) en la planta, de particular preferencia en las flores, con respecto del tipo natural o silvestre en por lo menos un 5%, además preferentemente en por lo menos un 20%, áun más preferentemente en por lo menos un 50%, aún más preferentemente se reduce en un 100%. En particular, por "reducción" también se entiende la ausencia completa de la mencionada actividad epsilon-ciclasa (o de la proteina-epsilon-ciclasa o el mARN-epsilon-ciclasa) . La determinación de la actividad epsilon-ciclasa en las plantas modificadas genéticamente de la invención y en las plantas de tipo natural o de referencia, se realiza preferentemente bajo las condiciones siguientes: La actividad epsilon-ciclasa se puede determinar in vitro según Fraser y Sadmann (Biochem. Biophys . Res Comm. 185(1) (1992) 9-15), agregando a una cantidad determinadaa de extracto de la planta fosfato de potasio como regulador del pH (pH 7,6) licopina como sustrato, proteina de estroma del pimentón, NADP+, NADPH y ATP. La determinación de la actividad epsilon-ciclasa en las plantas modificadas genéticamente y en las de tipo silvestre o en las plantas de referencia se efectúa preferentemente según Bowvier, d'Harlingue y Cámara (Molecular Analysis of carotenoid cyclasa inhibition, Arch. Biochem. Biophys 346(1) (1997), pág 53-64) : El ensayo in vitro se desarrolla en un volumen de 0,25 mi el preparado del ensayo contiene 50 mM fosfato de potasio (pH 7,6), cantidades variables de extracto de la planta, 20 mM licopina, 0,25 mg estromaproteina cromo plastidinia del pimentón, 0,2 mM NAADP+, 0,2 mM NADPH y 1 m MATP. El NADP/NADPH y el ATP se disuelven en un 0,01 mi etanol con 1 mg Tween 80 poco antes de la incorporación al medio de incubación. Después de un tiempo de reacción de 60 minutos a 30°C se termina la reacción mediante la incorporación de cloroformo/Metanol (2:1) . Los productos de la reacción extraídos en el cloroformo se analizan mediante cromatografía HPLC. Un ensayo alternativo con aplicación de un sustrato radioactivo se describe en Fraser y Sandmann (Biochem Biographys Ress. Comm.185(1) (1992) 9-15) . Otro método analítico fue descrito por Beyer, Króncke y Nievestein (On the mechanism of the Lycopene isomerase/cyclase reaction in Narcissus pseudonarcissus, L. chromopast, : J. Biol. Chem. 266(26), (1991) páag. 17072-17078). La reducción de la actividad epsilon-ciclasa en al menos uno de los siguientes procedimientos: a) Incorporación de por lo menos una secuencia de ácido ribro nucleico epsilon-ciclasa de doble xxx a continuación también llamada ds ARN-epsilon-ciclasaa o una casette de expresión o casettes de expresión qe asguren su expresión. Están comprendidos aquellos procedimientos en los cuales el dsARN-epsilonciclasa está dirigido contra un gen epsilon-ciclosa (es decir, secuencias ADN genómicas como la secuencia promotora) o un transcripto epsilon-ciclasa (es decir secuencias mARN) , b) Introducción de por lo menos una secuencia ácido ribonucleico-antisentido epsilon-ciclosa, en lo siguiente también llamado ARN anti sentido epsilon-ciclasa o un casette de expresión que asegure su expresión. Están comprendidos aquellos procedimientos en los cuales el ARN anti sentido epsilon-ciclasa contra un gen epsilon-ciclasa (es decir, secuencias ADN genómicas) o una transcripción del gen epsilon-ciclasa (es decri, secuencias-ARN) . También están comprendidas las secuencias de ácido nucleico alfa-anomera, c) introducción de por lo menos un ARN antisentido epsilon-ciclasa con una ribozima o un casette de expresión que permite asegurar su expresión, d) introducción de por lo menos una secuencia de ácido nucleico-sentido epsilon-ciclosa, en lo que sigue también llamada ARN sentido-epsilon-ciclasa, para la inducción de una co-supresión o un casette de expresión que permite asegurar su expresión, e) introducción de por lo menos un factor-enlazado de proteina o del ADN en contra un gen-epsiton-ciclasa, -ARN ó -proteina, o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, f) introducción de por lo menos una secuencia de ácido nucleico nivel que produce la degradación -ARN epsilon-ciclasa o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, g) introducción de por lo menos una construcción para producir una pérdida de función, tal como por ejemplo, la generación de cordones de detención o un desplazamiento del envasador de lectura, en un gen epsilon-ciclasa, por ejemplo, a través de la generación de una inserción, supresión, inversión o mutación en un gen eepsilon-ciclasa . Preferentemente es posible generar mutantes-knockout mediante una inserción dirigida en el citado gen-epsilon-ciclasa con una recombinación homologa o la incorporación de nucleosas especificas para la secuencia en contra de las secuencias de gen epsilon-ciclasa . Tal como lo sabe el técnico en el arte, es posible aplicar otros procedimientos en el marco de la presente invención, con el fin. de reducir una epsilon-ciclasa o de suactividad o función. Asi, por ejemplo, también puede ser ventajosa la incorporación de una variante dominante-negativa de una epsilon-ciclasa o un casette de expresión que permita asegurar su expresión. Aquí, cada uno de estos procedimientos puede producir una reducción de la cantidad de proteína, la cantidad de mARN y/o la actividad de una epsilon-ciclasa. •También se puede pensar en una aplicación combinada. Otros procedimientos los conoce el técnico en el arte, pudiendo comprender el inpedimento o la inhibición del procesamiento de la epsilon-ciclasa, del transporte de la epsilon-ciclasa o de su mARN, la inhibición de la fijación de ribosomas, la inhibición déla partición del ARN, la inducciónde una enzima degradadora del ARN-epsilon-ciclasa y/o la inhibición de la elongación o el término de la traducción. A continuación se describen los procedimientos individuales preferidos a través de ejemplos de realización: a) Incorporación de una secuencia de ácido ribonucleico-epsilon-ciclasa de doble hebra (E-ciclasa-dsARN) El procedimiento de la regulación de los genes mediante el ARN de doble hebra ("double-stranded RNA inteferenci, dsRNA") _ es conocido, siendo descrito por ejemplo, por Matzke y colaboradoress (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. y colaboradores (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035 o WO 00/63364. Se hace especial referencia a los procesos y métodos descritos en dichas publicaciones bajo la expresión "secuencia de ácido ribonucleico de doble hebra" se entiende, de acuerdo a la invención, una o más secuencias de ácido ribonucleico, las cuales basado en las secuencias complementarias teóricamente es capaz in vitro o en vivo, por ejemplo de acerdo a las reglas de los pares de bases de Waston y Crick y de hecho, por ejemplo, basado en experiencias de hibrolización, de formar estructuras de ARN con doble hebra. El técnico en el arte está consciente que la formación de estructuras de ARN de doble hebra representa un estado de equilibrio. La relación de las moléculas de doble hebra con respecto ade los correspondientes formas disociadas es de por lo menos 1 es a 10, preferentemente 1:1, de particular preferencia 5:1, más preferentemente es de 10:1. Bajo la expresión secuencia de ácido ribonucleico-epsilon-ciclasa o también epsilon-ciclasa-dsARN se entiende preferentemente una molécula de ARN, la cual presenta una región con una estructura de doble hebra y en dicha región contiene una secuencia de ácido nucleico que a) es idéntica con al menos una parte del transcriptor epsilon-ciclasa propio de la planta y/o b) es idéntica con al menos una parte de la secuencia promotora-epsilon-ciclasa de la planta. En el procedimiento de acuerdo a la invención para lograr una reducción de la actividad epsilon-ciclasa se incorpora preferentemente en ARN en la planta, el cual presenta una región con una estructura de doble hebra, conteniendo en esta región una secuencia de ácido nucleico la cual : a) es idéntica con por lo menos una parte del transcripto epsilon-ciclosa propio de la planta y/o, b) es idéntica con por lo menos una parte de la secuencia-promotora-epsilon-ciclasa propio de la planta.
Bajo la expresión "transcripto-epsilon-ciclasa" se entiende la parte transcrita de un gen epsilon-ciclasa el cual fuera déla secuencia que codifica para la epsilon ciclasa también contiene, por ejemplo, secuencias no codificadoras, como ser por ejemplo también UTRA.
Bajo la expresión un ARN "que es idéntico con por lo menos una parte de la secuencia-promotora-epsilon-ciclasa" propia de la planta, se entiende preferentemente, que la secuencia-ARN- es idéntica con por lo menos una parte del transcripto teórico de la secuencia promotora epsilon-ciclasa, es decir, con la respectiva secuencia ARN. Bajo la expresión "una parte" del transcriptor-epsilon-ciclasa propio de la planta o la secuencia promotor-epsilon-ciclasa propio de la planta se entienden secuencias parciales, las que pueden comprender algunas pocos pares de bases hasta las secuencias completas de la transcripción o de la secuencia del promotor. La longitud óptima de las secuencias parciales puede ser determinada por el técnico en el arte mediante ensayos rutinarios. Generalmente la longitud de las secuencias parciales alcanza por lo menos 10 bases y como máximo 2 hb, preferentemente por lo menos 25 bases y un máximo de 1,5 bh, de particular preferencia por lo menos 50 bases y un máximo de 600 baes, de especial preferencia por lo menos 100 bases y un máximo de 500, particularmente por lo menos 200 bases o un mínimo de 300 bases y como máximo 400 bases. Las secuencias parciales se eligen preferentemente de tal manera de lograr, en lo posible, una alta especificidad sin reducir las actividades de las otras enzimas, cuya reducción no sea deseada. Por ello resulta ventajoso elegir para las secuencias parciales de la epsilon-ciclasa-dsARN del transcripto epsilon-ciclasa y/o las secuencias parciales de las secuencias-promotor-epsilon-ciclasa las que no aparecen en otras actividades. En una forma de realización especialmente preferida de epsilon-ciclasa-ds ARN contiene por ello una secuencia la cual es idéntica con una parte del transcripto-epsilon-ciclasa propio de la planta, llevando el extremo-5'? el extremo-3 ' el ácido nucleico propio de la planta que codifica para una epsilon-ciclasa. En particular, las regiones no traducidas en el 5? 3 'del transcriptor son adecuadas para producir estructuras de doble-hebra selectivas. Otro objetivo de la invención se refiere a moléculas -ARN de doble hebra (moléculas-dsARN) , las que al ser introducidas en el organismo de la planta (o una célula, tejido, órgano o material de reproducción derivado a partir de la misma) son capaces de producir una reducción de una epsilon-ciclasa . Una molécula-ARN de doble hebra adecuada para reducir la expresión deuna epsilon-ciclasa (epsilon-ciclasa-dsARN) comprende asó lo siguiente: a) una hebra-ARN-"sense" o sentido que comprende por lo menos una secuencia ribo nucleótido, la que es substancialmente idéntica con por lo menos una parte de la transcripción ARN-"sentido"-epsilon-ciclasa, y b) una hebra-ARN-xxantisentido" la cual es substancialmente, preferentemente totalmente, complementaria con la hebra-ARN-"descrita bajo el item (a) .
Para la transformación de la planta con una epsilon-ciclasa-dsARN se utiliza preferentemente una construcción de un ácido nucleico, la cual se incorpora en la planta y la cual se transcribe en la planta en la epsilon-ciclasa-dsRNA. Por ello, la presente invención también se refiere a una construcción de un ácido nucleico la cual se puede transcribir en: a) una hebra-ARN-"sentido" que comprende por lo menos una secuencia ribonucleótida, la que es substancialmente idéntica con por lo menos una parte deuna transcripción epsilón-ciclasa-ARN-"sentido", y b) una hebra-ARN-"antisentido" la cual es substancialmente, preferentemente totalmente complementaria con la hebra-ARN-"sentido" descrita en el item (a) . Estas construcciones de ácido nucleico se denominan a continuación también casettes de expresión o vectores de expresión. En relación a las moléculas dsARN se entiende por secuencia ácido nucleico-epsilon-ciclasa, o la correspondiente transcripción, preferentemente la secuencia de acuerdo a la SEQ ID No.38 o una parte de la misma. La expresión "substancialmente idéntico" significa que la secuencia dsARN también puede presentar inserciones, supresiones, como también mutaciones puntuales con respecto de la secuencia objetivo epsilon-ciclasa, pero a pesar de ello sigue produciendo una reducción eficiente de la expresión. La homología asciende a preferentemente a por lo menos un 75%, preferentemente por lo menos un 80%, de especial preferencia por lo menos un 90% y de particular preferencia un 100% entre la hebra -"sentido" dena inhibidora del ARN y por lo menos una parte de la transcripción-ARN-"sentido" de un gen-epsilon-ciclasa, es decir, entre la hebra "antisentido", la hebra complementaria de un gen-epsilon-ciclasa . No es imprescindible un 100% de identidad de las secuencias entre el dsARN una transcripción del gen epsilon-ciclasa, para lograr una reducción eficiente de la expresión de la epsilon-ciclasa. De acuerdo con lo anterior se tiene la ventaja, que el procedimiento es tolerante frente a las variaciones de secuencia, las que se pueden presentar como resultado de las mutaciones genéticas, poliformismos o las divergencias de evolución. Asi, por ejemplo, es posible con un dsARN, generado a partir de la secuencia epsilon-ciclasa de un organismo, suprimir la expresión epsilón-ciclasa en otro organismo. Con tal finalidad el dsARN comprende preferentemente regiones de secuencia de la transcripción del gen epsilon-ciclasa, las que corresponden a las regiones conservadas. Dichas regiones conservadas se pueden derivar fácilmente mediante comparaciones de las secuencias. Alternativamente también se puede definir un dsARN "substancialmente idéntico" como una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridizar con una parte de la transcripción del gen epsilon-ciclasa (por ejemplo, en 400 mM Nall, 40 mM PIRES pH 6,4,1 mM EDFA a 50°C o 70°C durante 12 hasta 16 horas) . La expresión "substancialmente complementario" significa que la hebra-ARN-^antisentido" también puede tener inserciones, supresiones y mutaciones puntuales individuales en comparación con el complemento de la hebra -ARN-"sentido" . La homología asciende preferentemente a por lo menos un 80%, más particularmente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95%, de particular preferencia 100% entre la hebra-ARN-"antisentido" y el complemento de la hebra-ARN-" sentido" .
En otra forma de realización la epsilon-ciclasa o dsARN comprende : a) una hebra-ARN-"sentido" que comprende por lo menos una secuencia ribonucleótido, la cual es substancialmente idéntica con por lo menos una parte de la transcripción-ARN-"sentido" de la región del promotor de · un gen epsilon-ciclasa, y b) una hebra-ARN-"antisentido" la cual es substancialmente-preferentemente totalmente-complementaria con la hebra-ARN-"sentido" del ítem (a) . La construcción del ácido nucleico empleada preferentemente en la transformación de las plantas, comprende: a) una hebra-ADN-"sentido" la cual es substancialmente idéntica con por lo menos una parte' de la región del promotor de un gen-epsilon-ciclasa, y b) una hebra-ADN-"antisentido" la cual es substancialmente-preferentemente totalmente complemenataria con la hebra-ADN-"sentido" del itera (a) .
Preferentemente, se entiende por región del promotor o región promotora deuna epsilon-ciclasa una secuencia de acuerdo a la SEQ ID No. 47 una parte de esta. Para las secuencias dsARN-epsilon-ciclasaa para la reducción de la actividad epsilon-ciclasa, en particular para Tagetes erecta, se utilizan preferentemente las siguientes secuencias parciales.
SEQ ID No. 40: fragmentó sentido de la región 5 '-terminal de la epsilon-ciclasa, SEQ ID No. 41: fragmentó antisentido de la región 5 '-terminal de la epsilon-ciclasa, SEQ ID No. 42: fragmentó sentido de la región 3 '-terminal de la epsilon-ciclasa, SEQ ID No. 43: fragmentó-antisentido de la región 3 '-terminal de la epsilon-ciclasa, SEQ ID No. 47: fragmentó-sentido del promotor epsilon-ciclasa, SEQ ID No. 48: fragmentó-antisentido del promotor epsilon-ciclasa.
El ds 7ARN puede estar constituido de una o varias hebras de polisobonucleótidos . Evidentemente también es posible introducir en la célula o en el organismo, con la misma finalidad, varias moléculas dsARN individuales, las que comprenden una de las tramas de secuencia ribonucleótido definidas anteriormente. La estructura del dsARN de doble hebra se puede formar partiendo de dos hebras-ARN separadas, complementarias o, preferentemente, partiendo de un tramo ARN individual, complementario consigo mismo. En este caso la hebra-ARN-"sentido" y la hebra -ARN-"antisentido" son preferentemente covalentes en forma de una "repetición" invertida unidas entre si. Tal como se describe por ejemplo en la patente WO 99/53050, el ARN también puede comprender una estructura de horquilla, en la cual se unen mediante una secuencia de unión la hebra "sentido" con la hebra "antisentido" ("linher", por ejemplo, un nitron) . Las estructuras -dsARN anticomplementarias son las preferidas, debido a que solamente requieren de la expresión de una secuencia-ARN y las hebras -ARN complementarias siempre están comprendidass en una relación equimolar. La secuencia de unión consiste preferentemente en un nitron (por ejemplo, un nitron del gen ST-LS1 de la papa, Vancanneyt GF y colaboradores (1990) Mol Gen Genet 220 (2) : 245-250) . La secuencia de ácido nucleico que codifica para un dsARN puede contener otros elementos elementos, como ser por ejemplo señales de termino de transcripción o señales de poliademilación.
Sin embargo, si el dsARN está dirigido en contra de la secuencia del promotor de una epsilon-ciclosa, entonces preferentemente no comprende señales de término de transcripción o señales de poliadenilación. Esto permite retener el dsARN en el núcleo de la célula y evita una distribución del dsARN en toda la planta, el llamdo "spreding" . Si se xxx reunir las dos hebras del dsARN en una célula o planta, entonces esto" se puede realizar, por ejemplo, como sigue. a) transformación de la célula o planta con un rector gue comprende ambos casettes de expresión; b) cotranformación de la célula o planta con dos rectores, comprendiendo uno de ellos los casettes de expresión con la hebra-"sentido", el otro los casettes de la expresión con la hebra-"antisentido"; c) cruzamiento de dos lineas de plantas individuales, comprendiendo una de ellas las casettes de expresión con la hebra "sentido", la otra las casettes de expresión con la hebra "antisentido". i La formación del dúplex de ARN se puede iniciar en el exterior de la célula o en el interior de la misma. El dsARN se puede sintetizar in vivo o in vitro. Para ello se puede incorporar una secuencia-ADN que codifica para un dsARN en un casette de expresión bajo el control de por lo menos un elemento de control genético (como ser por ejempl, un promotor) . No se requiere una poliademilación y tampoco es necesario que se encuentren elementos para la iniciación de una traducción. Preferentemente el casette de expresión para el MP-dsARN está contenido en la construcción de transformación o en el vector de transformación. En una modalidad de realización preferida se realiza la expresión del ARN partiendo de una construcción de expresión bajo el control funcional de un promotor específico para la flores, particularmente preferido bajo el control del promotor descrito por la SEQ ID No. 28 o de una parte funcional equivalente de la misma. Los casettes de expresión que codifican para la hebra -"antisentido"- y/o la hebra -"sentido" de una epsilon-ciclasa-dsARN o para la hebra anticomplementaria del dsARN, se insertan para ello preferentemente en un vector de transformación y se introducen mediante el procedimiento descrito a continuación enla célula de la planta. Para el procedimiento de acuerdo a la invención es ventajosa una inserción estable en el genoma. Es dsARN se puede introducir en una cantidad que presenta por lo menos una copia por célula. Las cantidades superiores (por ejemplo, por lo menos 5,10, 100, 500, o 1000 copias por célula) pueden producir eventualmente una reducción más eficiente. b) Introducción de una secuencia de ácido ribonucleico-antisentido de una epsilon-ciclasa (epsilon-ciclasa-ARN antisentido) . Los procedimientos para reducir una determinada proteina mediante la tecnologia-"antisentido" también se describen muchas veces en plantas (Sheehy y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci USA, 85: 8805-8809; US 4.801.340; Mol JN y colaboradores (1990); FEBS Lett 268 (2) : 427-430) . La molécula de ácido nucleico antisentido hibridiza o se enlaza con el dsARN celular y/o el ADN genómico que codifica para la epsilon-ciclasa a ser reducida. Con ello se suprime la transcripción y/o la traducción de la epsilon-ciclasa. La hibridización puede producirse de manera convencional a través de la formación de un dúplex estable o, en el caso del ADN genómico, mediante la fijación de la molécula de ácido nucleico antisentido con el dúplex del ADN genómico por la interacción especifica en el gran surco de la hélice-ADN. Un epsilon-ciclasa-ARN-antisentido se puede derivar aplicando la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta epsilon-ciclasa, por ejemplo la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEQ ID No.38, según las reglas de los pares de bases de atson y Crick. La epsilon-ciclasa-ARN antisentido puede ser complementaria para todo el mARN transcrito de la epsilon-ciclasa, limitarse a la región codificante o consistir solamente de un oligonucleico todo, siendo en parte complementario con la secuencia del mARN que codifica o que no codifica. Asi por ejemplo, el oligonucleotido puede ser complementario con la región que comprende el inicio de la traducción para la epsilon-ciclasa . Asi, por ejemplo, el oligonucleotido puede ser complementario con respecto de la región que comprende el inicio de la traducción para la epsilon-ciclasa el ARN antisentido-epsilon ciclasa puede tener una longitud de por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos, pero también puede ser más largo, comprendiendo por lo menos 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos. Los ARN antisentido -epsilonciclasa se recombinan y se expresan en la célula objetivo en el marco del procedimiento de la invención. En una modalidad de realización particularmente preferida se realiza la expresión del ARN antisentido partiendo de una construcción de expresión bajo el control funcional de un promotor especifico para las flores, de particular preferencia bajo el control del promotor descrito por medio de la SEQ ID No. 28 o de una parte equivalente funcionalmente déla misma.
Las mencionadas casettes de expresión pueden ser una parte de la construcción de transformación o del vector de transformación o ellas también se pueden introducir en el marco de una co-transformación . Según otra modalidad de realización preferida se puede inhibir la expresión de una epsilon-ciclasa por medio de secuencias de nucleótidas, que son complementarias con la región reguladora de un gen-epsilon-ciclasa (por ejemplo, un promotor epsilon-ciclasa y/oun mej orador o "Enhancer") , formando estructuras helicoidales triples con dicho ADN de doble hélice, de tal modo que se reduce la transcripción del gen-epsilon-ciclasa. Se han descrito los correspondientes procedimientos (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6) : 569-84; Helene C y Colaboradores (1992) nn NY Acad Sci 660:27-36; Maheer LJ (1992), Bioassays 14 (12) : 807-815) . En otra modalidad de realización el ARN antisentido-epsilon ciclasa puede ser un ácido nucleico alfa-anómero. Tales moléculas de ácido nucleico alfa-anómeras forman híbridos de doble hebra específicas con un ARN complementario en las que -a diferencia con los ácidos betanucleicos convencionales-, ambas hebras corren paralelas entre si (Gautier C. y colaboradores (1987), Nucleic Acids . Res. 15: 6625-6641) . c) Incorporación de un ARN antisentido-epsilon-ciclasa combinado con una ribozima. La estrategia-antisentido descrita anteriormente se puede acoplar ventajosamente con un procedimiento de ribozima. Las moléculas -ARN catalíticas o los riboenzimas se pueden aj star en cualquier ARN-objetivo y cortan la estructura del fosfodiéster en posiciones específicas, con lo cual se desactiva funcionalmente el ARN-objetivo (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol. Rev. 23 ( 3 ) : 257-275 ) . Con ello no se modifica la ribozima propiamente tal, sino que ella es capaz de cortar o desdoblar análogamente otras moléculas-ARN-objetivo, con lo cual adquiere las propiedades de una enzima. La incorporación de secuencias ribozimas en las ARN-"antisentido" la confiere a estos ARN-"antisentido" esta propiedad cortadora de ARN, similar a una enzima, aumentando la eficiencia de estas durante la desactivación del ARN-objetivo. La preparación y el uso de las correspondientes moléculas-ARN-"antisentido"-ribozima se describe en las siguientes publicaciones (entre otras, por Haselhoff y colaboradores (1988) Nature 334: 585-591; Haselhoff y Gerlach (1988) nature 334:585-591; Steinecke P y colaboradores (1952), EMBO J 11(4) : 1525-1530; de Feyter R y colaboradores (1996) Mol Gen Genet. 250 (3) : 329-338 ) . De esta manera se pueden emplear ribozimas (por ejemplo, las llamadas ribozimas-"Hammerhead"; Haselhoff y Gerlach (1988) nature 334:585-591) para cortar cataliticante el mARN de una epsilon-ciclasa a ser reducida, evitando asi la traducción. La tecnología de las ribozimas permite incrementar la eficiencia de una estratefia antisentido. Los procedimientos de expresión de ribozimas para la reducción de determinadas proteínas se han descrito en las patentes EP 0291533; EP 0321201, EP 0360257) . También se ha descrito la expresión de ribozima en las células de las plantas (Steinecke P y colaboradoress (1992) EMBO J. 11 (4 ): 1525-1530; de Feyter R y colaboradores (1996) Mol. Gen. Genet, 250 (3) : 329-338 ) . Las secuencias objetivo y las ribozimas adecuadas se pueden determinar mediante cálculos délas estructuras secudarias del ARN-ribozima y ARN-Obj etivo, como también de su interacción, según se describe en "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith y colaboradores, editores, Academia Press, Inc. (1995) , páginas 449-460", Bayley CC y colaboradores (1992), Plant Mol Biol. 18(2): 353-361; Lloyol AM y Davis RW y colaboradores (1994), Mol Gen Genet, 242 (6) : 653-657) . Por ejemplo, se pueden construir derivados del ARN L-19lVS-Tetrahymena, que persentan regiones complementarias con el mARN de la epsilon-ciclasa a ser suprimida (ver también las patentes US 4.287.071 y US 5.116.742). En forma alterativa también es posible identificar tales ribozimas mediante un proceso de relación a partir de una biblioteca de diversos ribozimas (Bartel D. y Szostk J (1993), Science 261:1411-1418) . d) Incorporación de una secuencia de ácido ribonucleico-sentido de una epsilon-ciclasa (ARN sentido-epsilon-ciclasa para la inducción de una co-supresión.
La expresión de una secuencia de ácido ribo nucleico epsilon-ciclasa (o de una parte de ella) con la orientación sense puede producir la co-supresión del respectivo gen-epsilon-ciclasa. La expresión del ARN-sentido con homología con un gen endógeno epsilon-ciclasa puede reducir la expresión del mismo o evitarla análogamente como se ha descrito para los preparados antisentido (Jorgensen y colaboradores (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5) : 957-973 ; Goring y colaboradores (1991) . Proc Nati Acad. Sci USA 88:1770-1774; Smith y colaboradores (1990) Mol. Gen. Genet 224:447-481; Napoli y colaboradores (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol y colaboradores (1990) Plant Cell 2:291-99). Aquí · la construcción introducida puede representar en una forma total o solamente parcial el gen homólogo a ser reducido. No es necesaria una posible traducción. La aplicación de esta tecnología en las plantas se ha descrito (por ejemplo, Napoli y colaboradores (1990) Plant Cell 2:279-289, en la patente ÜS 5.034.323) .
La co-supresión se realiza preferentemente aplicando una secuencia substancialmente idéntica con al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una epsilon-ciclasa, por ejemplo la secuencia de amino ácido según la SEQ ID No. 38. El ARN sentido-epsilon-ciclasa se elige preferentemente de tal forma que no se puede producir una traducción de la epsilon-ciclasa o de una parte de la misma. Para ello se puede elegir, por ejemplo, la región S-sin traducir a la 3 '-sin traducir o se puede suprimir o mutar el codón -ATG de partida. e) Incorporación de ores enlazadores del ADN o proteina en contre genes-apsilon ciclasa, ARNs proteínas .
También se puede lograr una reducción de una expresión epsilon-ciclasa mediante factores enlazadores del ADN específicos, por ejemplo con factores del tipo factores de transcripción "de dedos de zinc". Estos factores se fijan en la secuencia genómica del gen objetivo endógeno, preferentemente en las regiones reguladoras, produciendo una reducción de la expresión. Los correspondientes procedimientos de preparación de los respectivos factores han sido descritos por Dreier B y colaboradores (2001) J. Biol. Chem. 276 (31) : 29466-78 ; Dreier B y colaboradores (2000) J.
Mol. Biol. 303 (4): 489-502; Beerli RR y colaboradores (2000) Proc Nati. Acad. Sci. USA 97 (4) : 1495-1500; Beerli RR y colaboradores (2000) J. Biol. Chem. 275 (42) : 32617-32627; Segal DJ. y Barbas CF, 3o (2000), Curr Opin Chem. Biol. 4(l):34-39; Kang JS y Kim JS (2000) J. Biol. Chem. 275 (12) : 8742-8748; Beerli RR y colaboradores (1998) Proc Nati. Acad Sci USA 95 (25) : 14628-14633; Kim JS y colaboradores (1997) Proc Nati Acad. Sci USA, 94 (8) : 3616-3620; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293 ( 2 ) -. 215-218 ; Tsai SY y colaboradores (1998) Adv Drug Deliv Rev 30 (1-3) :23-31; Mapp AK y colaboradores (2000) Proc natl. Acad. Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD y colaboradores (1997) Int. Biochem Cell Biol. 29 ( 12 ) . 1371-1387 ; Zhang L y colaboradores (2000) J Biol. Chem. 275 (43) : 33850-33860) . Estos factores se pueden seleccionar utilizando cualquier trozo de un gen-epsilonciclasa . Este tramo se ubica preferentemente en la región del promotor. Para una inhibición delgentambién se puede ubicar en la región del exon codificante o del útron. Además, es posible incorporar factores en la célula los que inhiben a la epsilon-ciclasa misma. Estos factores inhibidores de proteina pueden ser, por ejemplo, aptámeros (Famulock M y Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena única. La obtención de estos factores se describe en las siguientes publicaciones (Owen M y colaboradores (1992) Biotechnology (NY) , 10 (7) : 790-794; Franken E y colaboradores (1997), Curr. Opin Biotechnol 8 (4) : 411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272). f) Incorporación de secuencias de ácido nucleico y de construcciones de expresión productoras de la degradación del ARN epsilon-ciclasa. La expresión de la epsilon-ciclasa también se puede realizar efectivamente mediante la inducción de la degradación específica de L ARN-epsilon ciclasa con ayuda de un sistema de expresión viral (Amplikon; Angelí SM y colaboradores (1999) Plant J. 20 (3): 357-362). Estos sistemas, también llamados "VIGS" ("viral induced gene silencing") incorporan enla planta con ayuda de vectores virales secuencia de ácido nucleico que presentan homología con la transcripción de una epsilon-ciclasa a ser reducida. Entonces se desconecta la transcripción, probablemente por efecto de los mecanismos de defensa de la planta contra los virus. Se han descrito las correspondientes técnicas y procedimientos (Ratcliff F y colaboradores (2001) Plant J. 25(2): 237-45; Fagard M y Vaucheret H (2000) Plant Mol. Biol . 43(2-3): 285-93; Anandalakshmi R y colaboradores (1998) Proc. Nati Acad. Sci. USA 95 (22 ): 13079-84 ; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10 (6) : 937-46) .
La reducción tipo VIGS se realiza preferentemente con aplicación de una secuencia, substancialmente idéntica con por lo menos una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una epsilon-ciclasa, como ser por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEQ ID No.l. g) Incorporación de una construcción para producir una pérdida de función o una reducción de función en los genes epsilon-ciclasa . El técnico en la materia conoce numerosos procedimientos mediante es posible modificar las secuencias genómicas en una forma dirigida. Entre tales procedimientos se tiene preferentemente aquellos tales como la producción de los llamados mutantes tipo "Knockout" mediante la recombinación homologa dirigida, por ejemplo, mediante la generación de codones de detención, desplazamientos en el ustramado de lectura, etc. (Hohn B y Puchta H. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci USA 96:8321-8323) o la supresión dirigida a la invención de secuencias con ayuda de recombinasan o nucleosas especificas para la secuencia (ver más adelante) . La reducción de la cantidad de epsilon-ciclasa, función y/o actividad también se puede realizar mediante una inserción dirigida de secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, en el marco del procedimiento de acuerdo a la invención, las secuencias de ácido nucleico a ser insertadas) en la secuencia que codifica para una epsilon-ciclasa (por ejemplo, con una recombinación homologa inetermolecular) . En el marco de esta forma de realización se utiliza preferentemente una construcción de ADN, que comprende al menos una parte de la secuencia de un gen epsilon-ciclasa o secuencias vecinas, y asi se puede recombinar en forma dirigida en la célula objetivo, para modificar mediante una supresión, adición o sustitución de por lo menos un nucleótido el gen epsilon-ciclasa, para reducir o eliminar totalmente la funcionalidad del gen epsilon-ciclasa. La modificación también puede comprender a los elementos reguladores (por ejemplo, el promotor) del gen -epsilon-ciclasa, de tal modo de no modificar la secuencia codificadora, pero se evita y reduce una expresión (transcripción y/o traducción) . En la recombinación homologa conencional, la secuencia a ser insertada está rodeada en su extremo 5 '-y/o 3'-por otras secuencias de ácido nucleico (A'o B'), las cuales presentan una longitud y homología suficientes con respecto a las respectivas secuencias del gen-epsilon-ciclasa (A o B) , para posibilitar la recombinación homologa. La longitud está comprendida generalmente en el rango de varios cientos de bases hasta varias hilobases (Thomas KR y Copecchi MR (1987) Cell 51:503; Strapp et al (1998), Proc Nati acad. Sci. USA 95 (8) : 4368-4373) . Para la recombinación homologa se transforma la célula de la planta con la construcción recombinante, aplicando los procedimientos descritos a continuación, seleccionando los clones recombinados exitosos en relación a la epsilon-ciclasa inactivada. En otra modalidad de ralización preferida se aumenta la eficiencia de la recombinación mediante la combinación con procedimientos que favorecen la recombinación homologa. Tales procedimientos han sido descritos y ellos comprenden, por ejemplo, la expresión de proteínas como ser RecA o el tratamiento con inhibidores-PARP . Se pudo demostrar que la recombinación homologa intracromosomal en las plantas del xxx se puede aumentar mediante el uso de inhibidores PARP. (Puchta H y colaboradores (1995) . Plant J 7:203-210). Con aplicación de estos inhibidores es posible seguir aumentando la tasa de recombinación homologa en las construcciones de recombinación después de la inhibición de la fractura de la hebra doble del ADN específico para la secuencia y con ello la eficiencia de la supresión de las secuencias transgénicas . Se pueden aplicar diferentes inhibidores-PARP. Preferentemente se emplean inhibidores como ser la 3-amino benzamida, 8-hidroxi-2-metilquimazolin-4-on (NS1025) , 1, llb-dihidro- [2H] -benzopirano- [4, 3, 2-de] -isoquinolin-3-ona (EPI6150) , 5-aminoisoquinolinon) , 3,4-dihidro-5- [4- (1-pirinidil) -butox] 1 (2H) -isoquinolina o las substancias descritas en los documentos O 00/26192, WO 00/29384, O 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 y WO 01/23390. Otros métodos adecuados son la introducción de mutaciones-sin sentido ("nonsense") en genes de proteina marcadora endógena mediante la incorporación de oligonecleótidos ARN/ADN en la planta (Zhu y colaboradores (2000) Nat. Biotechnol 18 (5):555-558) o la generación de mutantes-"Knockout" con ayuda de por ejemplo, mutagesa T-ADN (Koncz y colaboradores), Plant Mol. Biol . 1998, 20(5) :963-976) . Las mutaciones puntuales también se pueden producir mediante ADN-ARN híbridas, también conocidas como "Chimeraplasty" (Cole-Strauss y colaboradores (1999) Nucí Acids Res 27 (5) : 1323-1330, Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87 (3 ): 240-247 ) . Los métodos de la dsARNi, la co-supresion con ARN-sentido y del "VIGS" ("virus induced gene silencing") también se denominan "silenciado post-transcripción del gen" (PTGS) ó silenciado trancripcional del gen" (TGS) . Los procedimientos PTGS/TGS son particularmente ventajosas debido a las menores exigencias de homología entre el gen-proteina marcadora a ser reducida y la secuencia de ácido nucleico-dsARN o sentido-expresado transgénica que, por ejemplo, en un preparado "antisentido" clásico. Así, utilizando las secuencias de ácido nucleico-proteína marcadora pertenecientes a un tipo también es posible reducir efectivamente la expresión de las proteinas-proteina marcadora homologas en otros tipos, sin que sea obligatoriamente necesaria la aislación y aclaración de la estructura de las homólogos-proteina marcadora presentes. Esto permite simplificar considerablemente la cantidad de trabajo. En una forma de realización especialmente preferida del procedimiento de la invención se efectúa la reducción de la actividad epsilon-ciclasa con respecto del tipo natural o silvestre mediante: a) la incorporación de por lo menos una secuencia de ácido ribonucleico epsilon-ciclasa o de un casette de expresión que asegure su expresión o casettes de expresión en la planta y/o, b) la incorporación a las plantas de por lo menos una secuencia de ácido ribo nucleico-antisentido epsilon-ciclasa o un casette de expresiónque permita asegurar su expresión.
En una forma de realización especialmente preferida se produce la reducción de la actividad epsilon-ciclasa con respecto de aquella del tipo natural mediante la incorporación a las plantas de por lo menos una secuencia de ácido ribonucleico epsilon-ciclasa de doble hebra o una o varios casettes de expresión que permitan asegurar su expresión. En una forma de realización preferida se utilizan plantas modificadas genéticamente, las que presentan la menortasa de expresión de una epsilon-ciclasa en las flores. Esto se logra preferentemente, realizando una reducción de la actividad epsilon-ciclasa en una forma especifica para las flores, preferentemente especifica para los pétalos de las flores. En la modalidad de realización particularmente preferida, descrita anteriormente, ello se logra realizando la transcripción de las secuencias epsilon-ciclasa-dsARN bajo el control de un promotor especifico para las flores o aún más preferentemente de un promotor especifico para los pétalos de dichas flores . Según otra forma de realización preferida se cultivan plantas, las que adicionalmente, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan una mayor actividad de por lo menos una de las actividades, seleccionadas del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, actividad, €-4-hidroxi~3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, actividad 1-dioxi-D-xiclosa-5-fosfato-sintasa, actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto isomerasa, actividad isopentenil-difosfato-delta-isomerasa, actividad geronil-difosfato-sintasa, actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, actividad fitoen-sintasa, actividad fitoen-desaturasa, actividad zeta-corotin-desaturasa, actividad crtlSO, actividad FtsZ y actividad MinD. Por actividad HMG-COA-reductasa se entiende la actividad enzimática de unaHMG-CoA reductasa (3 hidroxi-3-metil-glutesil-coenzima-A-reductasa) . Por HMG-CoA-reductasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática de convertir la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima-A-en Mevalonato . De acuerdo con lo anterior se entiende por actividad HMG-CoA-reductasa la cantidad de 3-hidroxi-3-metil-glutanil-coenzima-A- convertida o la cantidad de mevalonato formado en un tiempo determinado por la acción de la proteina HMG-CoA-reductasa . En el caso de una actividad HMG-CoA-reductasa aumentada en comparación con el tipo natural o silvestre, se aumenta asi la cantidad de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima-A convertida o la cantidad de mevalonato formado, durante un tiempo determinado, por la proteina HMG-CoA-reductasa en comparación con el tipo natural. Este aumento de la actividad HMG-CoA-reductasa asciende a preferentemente a por lo menos un 5%, más preferentemente por lo menos , un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, más preferentemente por lo menos un 300%, aún preferentemente por lo menos un 500%, en particular preferentemente por lo menos un 600% de la actividad HMG-CoA-reductasa del tipo silvestre. Por actividad HMG-CoA-reductasa se entiende la actividad enzimática de una HMG-CoA-reductasa . La determinación de la actividad HMG-CoA-reductasa en las plantas modificadas genéticamente de la invención y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se efectúa preferentemente bajo las condiciones siguientes: El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva en nitrógeno liquido y se extrae con un tampón de extracción en la relación de 1:1 hasta 1:20. La respectiva relación depende de las actividades enzimáticas en el material existente de las plantas, de tal modo de permitir una determinación y una cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Típicamente se puede agregar un tampón de extracción constituido de 50 mM HEPES-KoH (pH 7,4), 10 mM MgC12, 10 mM KC, 1 mM EDTA, 1 Mm EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-aminocoprónico, 10% glicerina, 5mM khco3. Poco antes de la extracción u incorporación 2mM DTT y 0,5 mM PMSF. La actividad de la HMG-CoA-reductiva se puede medir de acuerdo a lo descrito en las publicaciones (por ejemplo, Schaller, Grausem, Benveniste, Chye, Tan, Song y chua, Plant Physiol 109 (1995), 761-770; Chappell, Wolf, Proulx, Cuellar y Saunders, Plant Physiol. 109, (1995), 1337-1343) . El tejido de la planta se puede homogenizar y extraer en una solución tampón será (100 mM fosfato de sotasio (pH 7,0), 4mM Mg C12, 5 mM DTT) . El homogenizado se centrifuga durante 15 minutos a 4°C y 10.000 g. El sobrenadante se vuelve a centrifugar luego a 100.000 g durante 45-60 minutos. La actividad de la HMG-CoA-reductasa se determina en el sobrenadante y en el pellet de la fracción microsomal (después de volver a suspender en 100 mM fosfato de potasio (pH 7,0) y 50 mM DTT). Se incubaron alienatos de la solución y de suspensión (el contenido de proteina de la supensión equivale alrededor de 1-10 mg) en 100 mM tampón -fosfato de potasio (pH 7,0 con3 mM NADPH y 20 mM NADPH y 20 mM (1 C) HMG-CoA (58mCi/mM) idealmente en un volumen de 26 mi durante 15-60 minutos a 30 °C. La reacción se termina incorporando 5 mi mevalonato lactona (lmg/ml) y 6 NHC1. Después de la incorporación se incuba la mezcla de durante 15 minutos a temperatura ambiente. El (1 C) -mevalonato formado en la reacción se cuantifica, agregando 125 mi de una solución saturada de fosfato de potasio (pH 6.0) y 300 mi acetato de etilo. La mezcla se agita bien y se centrifuga. La radiactividad se puede determinar mediante mediciones de centlleo. Por actividad E-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, también denominada lytB o IspH, se entiende la actividad enzimática de una E-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa.
Por (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa se entiende una proteina que tiene la actividad enzimática capaz de convertir el (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enilfosfato enisopentenildifosfato y dimetil alildifosfato . De acuerdo con lo anterior se entiende por actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-3-enil-difosfato reductasa, la cantidad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enildifosf to convertida o la cantidad de isopentenildifosfato y/o dimetil alildifosfato formada en un tiempo determinado por la proteina (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa. En el caso de una actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-anil-difosfato-reductasa incrementada con respecto de aquella del tipo natural o silvestre se aumenta, por lo tanto, la cantidad convertida de (E) -4-hidroxi~3-metilbut-3-enil-difosfato o la cantidad de isopentenildifosfato y/o dimetil etildifosfato formada durante un tiempo determinado por la proteina (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa . Este aumento de la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa es de preferentemente por lo menos un 5%, más preferentemente de por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad (E) -4-hidroxi-3~ metilbut-2-enil-difosfato-reductasa del tipo natural o silvestre . La determinación de la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa en las plantas modificadas genéticamente de la invención y en las plantas de tipo natural o de referencia, se efectúa preferentemente bajo las siguientes condiciones: El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensa en mortero o en presencia de nitrógeno líquido y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 hasta 1:20. La relación particular aplicada depende de las actividades enzimáticas en el material disponible de las plantas, de tal menera de posibilitar una determinación y cantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Típicamente la solución reguladora del pH para la extracción puede estar constituida de 50 mM HEPES-KOH (pH7,4), 10 mM Mg C12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 Mm EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100 2 mM ácido epsilo-aminocapríonico, 10% glicerina 5mM KHC03. Poco antes de la extracción se agrega 2mM DTT y 0,5 mM PMSF. La determinación de la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa se puede realizar a través de una comprobación inmunológica . La preparación de los anticuerpos específicos ha sido descrito por Rohdich y colaboradores (Rohdich, Hecht, Gártner, Adarn, Krieger, Amslinger, Arigoni, Bacher y Eisenreich: Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH ( (LytB) protein, Natural Acad Nati Sci. USA, 99(2002), 1158-1163) . Para determinar la actividad catalítica los investigadores Altincicek y colegas describen un sistema in vitro, el cual determina la reducción del (E) -4-hidroxi-3-metil-but-2-enil difosfato al isópentenildifosfato y el dimetilalildifosfato (Altincick, Duin, Reichenberg, Hedderich, Kollas, Hintz, Wagner, Wiesner, Beck y Jomaa : LytB protein calalyzer the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis ; FEBS Letters 532 (2002), pág. 437-440) . Por actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa se entiende la actividad enzimática de una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sin asa . Por l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa se entiende una proteina que presentaa la actividad enzimática capaz de convertir el hidroxietil-Th PP y el glicerinaldehido-3-fosfato en l-dioxi-D-xilaso-5-fosfato. De acuerdo con esto se entiende por actividad 1-dioxi-D-xilasa-5-fosfato-sintasa la cantidad de hidroxietil-Th PP y/o glicerinaldehido-3-fosfato convertida o la cantidad de -deoxi-D-xilosa-5-fosfato formada en un tiempo determinado por la proteina l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-sintasa .
En el caso de una actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato aumentada con respecto al tipo silvestre o natural se aumenta la cantidad de hidroxietil-ThPP y/o glicerinaldehido-3-fosfato convertido o la cantidad de -decoxi-D-xilosa-5-fosfato formada en un tiempo determinado por la acción de la proteina l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa . Este aumento en la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa asciende a por lo menos un 5%, más preferentemente a por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, de particular preferencia por lo menos un 300%, áun más preferentemente por lo menos un 500%, enparticular por lo menos un 600% de la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa del tipo silvestre o natural. La determinación de la actividad 1-deoxi-D-xilosa- 5-fosfato-sintasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se realiza bajo las siguientes condiciones. El material de las plantas congeladas se homogeniza mediante una molienda intensiva en nitrógeno liquido y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 hasta 1:20. La respectiva relación depende de las actividades enzimáticas existentes en el material de planta disponible, de tal modo que una determinación o la cuantificación de las actividades enzimáticas sea posible de realizar dentro del rango de medición lineal. Típicamente, la solución reguladora del pH para la extracción puede consistir en 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM mg C12, lOmM, KC1, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2mM ácido epsilon-aminocaprónico, 10% glicerina, 5mM KHC03. Poco antes de la extracción se agrega2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. La solución de reacción (50-200ul) para la determinación de la actividad D-l-deoxiixilulosa-5-fosfato-mitasa (DXS) consiste en 100 mM Tris-CHCl (pH 8, 0), 3 mM mgCl2, 3mM MnCl2, 3mMATP, 1 mM difosfato de tiamina, 0,1% Tween-60, 1 mM fluoruro de potasio, 30 mM (-2-14C) -piruvato (0,5 mCi) , 0,6 mM DL-glicerinaldehido-3-fosfato . El extracto de la planta se incuba durante 1 hasta 2 horas en la solución de reacción a 37 °C. A continuación se detiene la reacción calentando hasta 80°C durante 3 minutos. Después de centrifugar a 13.000 revoluciones/minuto durante 5 minutos, se evapora la fracción sobrenadante, el resto se resuspende en 50 mi metanol, se deposita sobre una placa TLCC de cromatografía en capa fina (silica-gel 60, Merck, Darmstadt, Alemania) y se separa en N-alcohol propilo/acetato de etilo/agua (6:1:3; v/v/v) . Con ello se separa el D-l-dioxi-xilulosa-5-fosfato (ó D-l-depxoxilulosa) marcado radiactivamente del (2-14C) -piruvato. La cuantificación se realiza mediante un contador de centello. El método fue descrito por Harker y Braamley (.FEBS Letters 448 (1999) 115-119) . Alternativamente Querol y colegas describieron un ensayo fuorométrico para determinar la actividad. DXS-mitasa (Analytical Biochemitry 296 (2001) pág. 101-105) . Por actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductoisomerasa-5-fosfato-reductoisomerasa . Por l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductoisomerasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de convertir el l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato en betacarotina . De acuerdoo con lo anterior se entiende por actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto isomerasa la cantidad de l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato convertida o la cantidad de isopentenil-difosfato formada en un tiempo determinado por la proteina l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reduciomerasa . En el caso de una actividad l-deoxi-D-xiclosa-5-fosfato-reductiisomerasa aumentada en comparación con aquella del tipo silvestre o natural se aumenta la cantidad de 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato convertida o la cantidad de isopentenil-difosfato formada durante un tiempo determinado por la proteina l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductoisomerasa . Este aumento de la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato asciende a por lo menos un 5%, más preferentementepor lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, aún más preferentemente por lo menos un 100%, áun más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductiisomerasa del tipo natural o silvestre. La determinación de la actividad 1-deoxi-D-xilosa- 5-fosfato-reductoisomerasa en las plantas modificadas genéticamente de la invención y en las plantas de tipo silvestre o en las plantas de referencia se realiza preferentemente bajo las siguientes condiciones. El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensa en un mortero en presencia de nitrógeno liquido y se extrae con una solución reguladora del pH enla relación desde 1:1 hasta 1:20. La respectiva realción depende de las actividades enzimáticas en el material disponible de las plantas, de tal modo de permitir realizar una determinación y una cuantificación de las actividades enzimáticas dentro de un rango de medición lineal . La solución tampón para extracción puede consistir típicamente en 50mM HEPES KOH (pH 7,4), 10 mM Mg C12, 10 mM KC1, lmM EDTA, lmM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2mM ácido epsilonaminocoprónico, 10% glicerina, 5 mM HC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. La actividad de la D-l-deoxicilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa (DXR) se mide en un tampón formado de 100 mM NADPH y 0,3 mM l-dioxi-D-xilulosa-4-fosfato, el cual se puede sintetizar, por ejemplo, enzimáticamente (Kuzuyama, Takahashi, Watanae y Seto: Tetrahedon letters 39, (1998) pag. 4509-4512) . La reacción se inicia mediante la incorporación del extracto de la planta. El volumen de reacción puede ser típicamente de 0,2 hasta 0,5 mi, la incubación se realiza a 30 °C durante 30-60 minutos. Durante este tiempo se hace un seguimiento de la oxidación de NADPH fotomáticamente a 340 nm. Por actividad isopentenil-difosfato-delta-isomerasa se entiende la actividad enzimática de una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa . Por isopentenil-difosfato-D-isomerasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de convertir el isopentenil-difosfato en dimetilalilfosfato . De acuerdo con lo anterior, se entiende por actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa la cantidad de isopentenil-difosfato convertido o la cantidad de dimetil alilfosfato formado durante un tiempo determinado por la proteina isopentenil-difosfato-D-isomerasa . En el caso de una actividad isopentenil-difosfato- D-isomerasa aumentada con respecto de aquella exhibida por el tipo natural o silvestre se aumenta la cantidad de isopentenil-difosfato convertida o la cantidad de dimetilclilfosfato formada por la proteina isopentenil-difosfato-D-isomerasa .
El aumento en la actividad isopentenil-difosfato-deltaisomerasa asciende a por lo menos al 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, además preferentemente por lo menos un 50%, además preferentemente por lo menos en 100%, con mayor preferencia por lo menos un 300%, áun más preferentemente por lo menos un 500%, en especial por lo menos un 600% de la actividad isopentenil-difosfato-deltaisomerasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad isopentenil-difosfato-delta-isomerasa en las plantas modificadas genéticamente y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se efectúa preferentemente en las condiciones siguientes : El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva en un mortero o en presencia de nitrógeno liquido y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 hasta 1:20. La relación particular de extracción depende de las actividades enzimáticas en el material de plantas disponibles, de tal modo que la determinación y la cuantificación de las actividades enzimáticas sea posible dentre del rango de medición típicamente en 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM Mg C12, 10 mM KC1, 1 M EDTA, 1 mM EGTA 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-aminocoprónico, 10% glicerina, TmM KHC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF.
Las determinaciones de la actividad de la isopentenil-difosfato-isomerasa (IPP-Isorrterasa) se pueden efectuar de acuerdo al método presentado por Fraser y colegas (Fraser, Romer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, Schuch y Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific maner; Proc Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002), 1092-1097, basado en la publicación de Fraser, Pinto, Holloway y Bramley, Plant Journal, 24 (2000) , pág. 551-558) . Para las mediciones de las enzimas se realizan incubaciones con 0,5 m Ci (1-14C) IPP (isopentenilpirofosfato) (56 m Ci/mmol Amersham pie) coo subtrato en 0,4 M Tris-HCl (pH 8,0) con 1 mM DTT, 4 mM Mg Cl2, 6 mM Mn Cl2, 3 mM ATP, 0,1% Tween 60, lmM fluoruro de potasio en un volumen de alrededor de 150-500 mi. Los extractos se mezclan con el tampón (por ejemplo, en la relación 1:1) y se incuban durante por lo menos 5 horas a 28 °C. A continuación se agregan alrededor de 200 mi metanol y mediante la incorporación de ácido clorhídrico concentrado (concentración final del 25%) se realiza una hidrólisis ácida durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Luego se extrae dos veces (cada vez con 500 mi) éter de petróleo con un 10% éter dietílico) . Se determina la radio actividad en una alícuota de la hiperfase con un contador de centello. La actividad enzimática específica se puede determinar con una breve incubación de 5 minutos, debido a que los tiempos de reacción cortos suprime la formación de subproductos de reacción (ver Lützow y Beyer: The isopenteyl-diphosphate-delta-isomerase y its relation to t e phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts; Biochim. Biophys . Acta 959 (1988); pág 118-126) . Por actividad geranzil-difosfato-sintasa se entiende la actividad enzimática de una geranil-difosfato-sintasa. Bajo la expresión geranil-difosfato-sintasa se entiende una proteina que tiene la actividad enzimática capaz de convertir el isopentenil-difosfato y el dimetil fosfato en generil-difosfato . De acuerdo con lo anterior se entiende por actividad genaril-difosfato-sintasa la cantidad de isopentenil-disfosfato y/o dimetildilfosfato convertido o la cantidad de geranil-difosfato convertido o la cantidad de geranil-difocfato formado en un tiempo determinado por acción déla geranil-difosfato-sintasa . En el caso de una mayor actividad geranil-difosfato-sintasa en comparación con el tipo silvestre o natural se aumenta, por lo tanto, la cantidad de isopentenil-difosfato y/o dimetilalilfosfato convertida o la cantidad de geranil-difosfato formada en un tiempo determinado por acción de la proteina geranil-difosfato-sintasa .
Este aumento de la actividad geranil-difosfato-sintasa, asciende a preferentemente a por lo menos un 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, además por lo menos un 50%, además por lo menos un 100%, más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad geranil-difosfato-sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad geranil-difosfato-sintasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo silvestre o natural y en las plantas de referencia se realiza preferentemente en las siguientes condiciones: El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva en un mortero en presencia de nitrógeno liquido y se extrae con un tampón de extracción en la relación desde 1:1 hasta 1:20. La relación particular de extracción depende de las actividades enzimáticas existentes en el material de plantas disponibles, de tal modo de permitir realizar una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro de un rango de mediación lineal. El tampón de extracción puede consistir típicamente en 50 mM HEPE-KOH (pH 7,4), 10 MM Mg C12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-aminocaprónico, 10% glicerina, 5 mM HC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF.
La actividad de la geranil-difosfato-sintasa (GPP-sintasa) se puede determinar en 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM Mg C12, 5 mM MnC12, 2 mM DTT, 1 mM ATP, 0,2% Tween-20, 5 mM (14 C) IPP y 50 mM DMAPP (dimerildilalilquifosfato) después de la incorporación del extracto de la planta (según el método descrito por Bouvier, Suire, d'Harlingue, Backhaus y cámara: Molecular cloning of geranyl diphosphate synthasa and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant Journal 24 (2000), 241-252). Después de la incubación durante, por ejemplo, 2 horas a 37°C se desfosfolizaron los productos de la reacción (según Koyama, Fuji y Ogura: Enzymatic Hydrolysis of polyprenyl pyrophosphats, Methods Enzymol. 110 (1985), 153-155) y se analizaron por medio de cromatografia en capa fina y medición de la radioactividad incorporada (Dogbo, Bardat, Quennemet y cámara: Metabolim of plastid terpenoids : In vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethyl pyrophosphate derivates, FEBS Letters 219 (1987) pág. 211-215) . Por actividad farnesil-difosfato-sintasa se entiende la actividad enzimática de una farmesil-difosfato-sintasa bajo una farneril-difosfato-sintasa s.e entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de convertir geranil-difosfato e isopentenil-difosfato en farmeril-difosfato .
De acuerdo con lo anterior se entiende por actividad farneril-difosfato-sintasa la cantidad de geranil-difosfato y/o isopentenil-difosfato convertida o la cantidad de farnesil-difosfato formada en un tiempo determinado por la proteina farnesil-difosfato-sintasa . En el caso de una actividad farnesil-difosfato-sintasa aumentada con respecto de aquella del tipo natural o silvestre se aumenta, por lo tanto, en comparción con el tipo natural de la cantidad de geranil-difosfato y/o isopentenil-difosfato convertida o cantidad de farmesil-difosfato formada en un tiempo determinado por la acción de la proteina farmesil-difosfato sintasa. Este aumento de la actividad formesil-difosfato-sintasa asciende a por lo menos un 5%, más preferentemente por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos en 100%, áun más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad farmesil-difosfato-sintasa del tipo silvestre o natural . La determinación de la actividad farmesil-difosfato-sintasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo silvestre y en las plantas de referencia se realiza en las siguientes condiciones : El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensa en un mortero en presencia de nitrógenoo liquido y se extrae con un tampón para extracción en una relacilón desde 1:1 hasta 1:20. La relación particular de la extracción depende de las actividades enzimáticas presentes en el material disponible de planta, de tal modo que la determinación y la cuantificación de las actividades enzimáticas sea posible dentro del rango de medición lineal. Al tampón para la extracción puede estar contenido típicamente de 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM Mg C12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido espsilon-aminocarónico, 10% gelatina, 5 mM KHC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM MTT y 0,5 mM PMSF. La actividad de la franesil pirofosfato-sintasa (FRP-sinasa) se puede determinar según las indicaciones de Joly y Edwards (Journal of Bilogical Chemestry 268. (1993), 26983-26989) . A continuación se mide la actividad enzimática en un tampón formado por 10 mM HEPES (pH 7,2), 1 mM Mg C12, 1 mM ditiotreitol, 20 mM geranipirfosfato y 40 mM (1-1 C) isopentenilpirofosfato (4 Ci/mmol) . Se incuba la mezcla de reacción a 37 °C; la reacción se detiene mediante la incorporación de 2,5 NHC1 (en 70% etanol con 19 mg/ml farnerol) . Asi se hidrolizan los productos de la reacción por medio de un hidrólisis ácida a 37 °C dentro de 30 minutos.
Agregando 10% NaOH se naturaliza la mezcla u luego se agita con hexano. Se puede medir una elienota de la fase hexano para determinar la radiactividad incorporada mediante un contador de centelleo. Alternativamente es posible después de la incubación del extracto de plantas y el IPP marcado radioactivamente separar los productos de reacción mediante cromatografía capa fina (silica-gel SE60, Merck) en benceno/metanol (9:1). Los productos marcado readioactivamente se eluyen, determinando la radioactividad (según Gaffe, Bru, Causse, Vidal, Stamitti-Bert, Carde y Gallusci: LEFPS1, a tomato farnesyl pyrophosphate gene highly expressed during early fruit development; Plant Physiology 123, (2000) 1351-1362) . Por actividad geranil-geranil-diphosphat-synthasa se entiende la actividad enzimática de una geranyl-gerange-difosfato-sintasa . Bajo geranil-geranil-difosfato-sintasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de convertir farnesil-difosfato e isopentenil-difosfato en geranil-geranil-difosfato . ¦ De acuerdo con esto, se entiende por actividad, geranil-geranil-difosfato-sintasa la cantidad convertida de farmesil-difosfato y/o isopentenil-difosfato o la cantidad de geranil-geranil-difosfato formada en un tiempo determinado por la proteina geranil-geranil-difosfato-sintasa . En él caso de una actividad-geranil-geranil-difosfato-sintasa aumentada con respecto de aquella del tipo silvestre o natural se aumenta la cantidad de farmesil-difosfato y/o isopentenil-difosfato convertida o la cantidad de geranil-geranil-difosfato formado en un tiempo determinado por acción de la proteina geranil-geranil-difosfato-sintasa . Este aumento en la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa asciende a por lo menos un 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, además preferentemente por lo menos un 100%, aún más preferentemente por lo menos un 300%, áun más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad beta-ciclasa del tipo silvestre o natural . La actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se determina preferentemente en las siguientes condiciones: El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva e un mortero en presencia de nitrógeno liquido, siendo extraído con una solución tampón de extracción en la relacilón desde 1:1 hasta 1:20. La relación particular de extracción depende de las actividades enzimáticas en el material de planta disponible, de tal modo que la determinación y la cuantificacion de las actividades enzimáticas se pueda hacer dentro del rango de medición lineal. La solución tampón para la extracción puede consistir en típicamente en 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 m E EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-aminocaprónico, 10% glicerina, 5 mM KH03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. Las mediciones de actividad de la geranil-geranil-pisofosfato-sintasa (GGPP-sintasa) se pueden realizar según el método descrito por Dogbo y Cámara (en Biocim. Biophis . Acta 920, (1987), 140-148: Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase y geranyl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinity chromatography) . Para ello se agrega a una solución tampón (50 mM tris-HCl (pH 7,6), LmM Mg C12, 1 mM MnC12, 2 mM ditrotreitol (1-14C) IPP (0,1 uCi, 10 mM) , 15 mM DMAPP, GPP o FPP) con volumen total de alrededor de 200 mi extracto de planta. La incubación puede ser de 1-2 horas (o más prolongada) a 30 °C. La incubación se inicia mediante la incorporación de 0,5 mi etanol y 0,1 mi HCl 6N. Después de una incubación durante 10 minutos a 37 °C se neutraliza la mezcla de reaccilón con Na OH6N, se mezcla con 1 mi agua y se agita con 4 mi éter diétilico. En una alícuota (por ejemplo, 0,2 mL) de la fase etérea se determina la cantidad de radioactividad mediante un recuento de centelle.
En un método alternativo es posible separar mediante agitación en éter, despúes déla hidrólisis ácida, las prenilalcoholes marcadas radioactivamente y luego separadas mediante cromatografía HPLC (columna de 25 m Spherisorb ODS-1, 5 mM; ilución con metanol/agua .(90:10, v/v) con un flujo de 1 ml/min.) y cuantificadas mediante un monitor de radioactividad (según, Widemann, Misawa y Sandmann: Purification and enzymatic characterization of the geranylgerange physophosphate synthase from Er inia unedovon after exprescin in Escharechic coli) . Por actividad fitoen-sintasa se entiende la actividad enzimática de una fitoen-sintasa . Por fitoen-sintasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de transformar un radical lineal de licopina en un anillo beta-ionona. En particular, se entiende por una fitoen-sintasa a una proteína que presenta la actividad enzimática capaz de convertir el geranil-geranil-difosfato en fitoen. En consecuencia, se entiende por actividad fitoeno-sintasa la cantidad de geranil-geranil-difosfato convertida o la cantidad de fitoeno producida durante un tiempo determinado por la proteína fitoeno-sintasa . En el caso de una actividad fitoeno-sintasa aumentada en comparación con aquella del tipo silvestre o natural se aumenta, por lo tanto, la cantidad de geranil-geranil-difosfato convertida por o la cantidad de fitoeno producida durante un tiempo determinado por la proteina iitoeno-sintasa . Este aumento de la actividad fitoeno-sintasa asciende a por lo menos un 5%, más preferentemente por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, de preferencia por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad fitoenosintasa del tipo silvestre. La actividad fitoeno-sintasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo natural o silvestre o de referencia se determina preferentemente en las condiciones siguientes: Se homogeniza el material de planta congelado mediante una molienda intensiva en un mortero en presencia de nitrógeno liquido y luego se extrae con un tampón para extracción en una relación desde 1:1 hasta 1:20. La relación particular empleada depende de las actividades enzimáticas existentes en el material de planta disponible, de tal modo que sea posible efectuar la determinación y la cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. El tampón para extracción puede estar típicamente constituido de 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) 10 mM MgC12, 10 m KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-araino caprónico, 10% glicerina, 5 m KHC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. Las determinaciones de la actividad fitoeno-sintasa (PSY) se pueden realizar siguiendo el método presentado por Fraser y colegas (Fraser, · Romer, Shipton, Mills, Kiano, Misa a, Drake, Schuch y Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002), páginas 1092-1097, basado en Fraser, Pinto, Holloway y Bramley, Plant Journal 24 (2000) páginas 551-558) . Para las mediciones de la enzima se efectúan incubaciones con (3H) geranilgeranil-pirofosfato (15 mCi/mM) , American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, EE.ÜU), como substrato en 0,4 M Tris HC1 (pH 8,0) con 1 mM DTT, 4 mM MgCl2, 6 mM Mn Cl2, 3 mM ATP, 0,1 % T een-60, 1 mM fluoruro de potasio. Los extractos de las plantas se mezclan con la solución tampón, por ejemplo, 295 mi tampón con el extracto en un volumen total de 500 mi. Se incuba durante, por lo menos, 5 horas a 28 °C. A continuación se extrae el fitoeno agitando dos veces con cloroformo (cada vez 500 mi) . El fitoeno marcado radioactivo formado durante la reacción se supera mediante cromatografía en capa delgada sobre placas de sílica en metanol / agua (95:5; v/v) . El fitoeno se puede identificar sobre placas de sílica en una atmósfera enriquecida con yodo (mediante el calentamiento de unos pocos cristales de yodo) como referencia sobre un standard de fitoeno. La cantidad de producto marcado radioactivamente se determina mediante una medición en el contador de centelleo. Alternativamente, también es posible cuantificar los fitoenos mediante cromatografía HPLC, provistas de un detector de radioactividad (ver Fraser, Albrecht y Sandmann: Development of high performance liquid chromatographic systems for the separation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specific enzymatic reactions; J. Chromatogr. 645 (1993) páginas 265-272) . Por actividad fitoeno-desaturasa se entiende la actividad fitoeno-desaturasa. Por fitoeno-desaturasa se entiende una proteína que presenta la actividad enzimática capaz de convertir el fitoeno en fitoflueno y/o fitoflueno en zetacarotina. En consecuencia, se entiende por actividad fitoeno-desaturasa la cantidad de fitoeno o fitoflueno o la cantidad de fitoflueno o zeta-carotina formada durante un tiempo determinado por la proteína fitoeno-desaturasa. En el caso de una actividad fitoeno-desaturasa aumentada con respecto de aquella del tipo natural se aumenta, por lo tanto, la cantidad de fitoeno o fitoflueno convertida o la cantidad de fitoflueno o de zeta-carotina formada por la acción de la proteína fitoeno-desaturasa durante un tiempo determinado. Este aumento de la actividad fitoeno-desaturasa asciende preferentemente a por lo menos un 5%, más preferentemente a por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, más preferentemente por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad fitoeno-desaturasa correspondiente al tipo silvestre. La determinación de la actividad fitoeno-desaturasa en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo a la invención y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se realiza preferentemente en las condiciones siguientes: El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva en un mortero en presencia de nitrógeno liquido y se extrae con una solución tampón para extracción en una relación desde 1:1 hasta 1:20. La relación particular de extracción depende de las actividades enzimáticas existentes en el material disponible de la planta, de tal modo de permitir efectuar una determinación y una centrifugación de las actividades enzimáticas dentro de un rango de medición lineal . El tampón para extracción puede consistir típicamente en 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) 10 mM gC12, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 p?? ácido epsilon-amino caprónico, 10% glicerina, 5 mM KHC03. Poco antes de la extracción se agrega 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. La actividad fitoeno-desaturasa (PDS) se puede medir mediante la incorporación de (1 C) -fitoeno marcado radioactivamente en caroteno sin saturar (según Rómer, Fraser, Kiano, Shipton, Misa a, Schuch y Bramley: Elevation of the provitamin ? content of transgenic tomato plants; Nature Biotechnology 18 (2000) páginas 666-669) . Un fitoeno marcado radioactivamente se puede sintetizar según Fraser (Fraser, De la Rivas, Mackenzie, Bramley: Phycomyces blakesleanus CarB mutants: their use in assays of phytoene desaturase; Phytochemistry 30 (1991) , páginas 3971-3976) . Las membranas de los plastidios del tejido objetivo se puede incubar con un tampón 100 mM MES (pH 6,0) con 10 mM MgCl2 y 1 mM ditiotreitol en un volumen total de 1 mL. Se incorpora (14C) -fitoeno disuelto en acetona (alrededor de 100.000 xxxxxxx / minuto para xxx incubación) , donde la concentración de la acetona no debe exceder los 5% (v/v) . Esta mezcla se incuba a 28 °C durante alrededor de 6 hasta 7 horas en la oscuridad con agitación. A continuación se extrajeron los pigmentos tres veces con alrededor de 5 mL de éter de petróleo (tratado en 10% éter dietilico) y reparado, y cuantificado con cromatografía HPLC.
En una forma alternativa se puede medir la actividd de la fitoeno-desaturasa según Fraser y colaboradores (Fraser, Misawa, Linden, Yamano, Kobayashi y Sandmann: Expression in Escherichia coli, purification, and reactivation of the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase, Journal of Biological Chemistry 257 (1992) , páginas 19891-19895) . Por actividad zeta-carotina-desaturasa se entiende la actividad enzimática de una zeta-carotina-desaturasa. Bajo la expresión zeta-carotina-desaturasa se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de transformar la zeta-carotina en neurosporina y/o neurosporina en licopina. De acuerdo con lo anterior, se entiende por actividad zeta-carotina-desaturasa la cantidad de zeta-carotina o neurosporina convertida o la cantida de neurosporina o licopina producida durante un tiempo determinado por la acción de la proteina zeta-carotina-desaturasa. En el caso de una actividad zeta-carotina-desaturasa conmutada con respecto del tipo natural o silvestre se aumenta, por lo tanto, la cantidad de zeta-carotina o de neurosporina convertida o la cantidad de neurosporina o licopina producida durante un tiempo determinado por la acción de la proteina zeta-carotina-desaturasa . Preferentemente, este aumento de la actividad zeta-carotina-desaturasa es de por lo menos un 5%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 100%, de preferencia por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad zeta-carotina-desaturasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad zeta-carotina-desaturasa en las plantas modificadas genéticamente y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se realiza preferentemente en las condiciones indicadas a continuación. El material de las plantas congelado se homogeniza con ayuda de una molienda intensiva en un mortero en presencia de nitrógeno liquido, siendo extraído con una solución tampón para extracción en una relación desde 1:1 hasta 1:20. La relación de extracción particular depende de las condiciones enzimáticas existentes en el material de las plantas disponibles, de tal modo que sean posibles la determinación y la cuantificación de las actividades enzimáticas dentro de un rango lineal de medición. La solución tampón para la extracción puede estar formada por 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) 10 mM MgC12, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-amino caprónico, 10% glicerina, 5 mM KHC03. Poco antes de la extracción se agregan 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. El análisis para la determinación de la zeta-carotina-desaturasa (ZDS-desaturasa) se puede efectuar en 0,2 M fosfato de potasio (pH 7,8, volumen del tampón de alrededor de 1 mi) . El correspondiente método de análisis fue publicado por Breitenbach y colegas (Breitenbach, Kuntz, Takaichi y Sandmann: Catalytic properties of an expressed and purified higher plant type zeta-carotene desaturasa from Capsicum annuum; European Journal of Biochemistry, 256 (1) : 376-383, 1999 Oct) . Cada preparado para el análisis contiene 3 mg fosfitidilcolina, suspendida en 0,4 M tampón fosfato de potasio (pH 7,8), 5 mg zeta-carotina o neurosporeno, 0,2 % butilhidroxitolueno, 10 mi decil-plastoquinona (mM solución madre metanólica) y extracto de planta. El volumen del extracto de la planta se debe agitar según la cantidad de actividad ZDS-desaturasa presente; de tal modo de permitir realizar cuantificación en el rango de medición lineal. La incubación se realizó típicamente durante aproximadamente 17 horas con agitación enérgica (200 xxxpm) a alrededor de 28 °C en la oscuridad. Los carotinoides se extraen por medio de la incorporación de 4 mi acetona a.50°C durante 10 minutos, con agitación. A partir de ésta mezcla se pasan los carotinoides a una fase de éter de petróleo (con 10% éter dietílico) . La fase éter dietílico / éter de petróleo se evapora bajo una atmósfera de nitrógeno, los carotinoides se volvieron a disolver nuevamente en 20 mi y se separaron mediante HPLC y se cuantificaron. Por actividad crtlSO se entiende la actividad enzimática de una proteina crtlSO. Bajo una proteina crtlSO se entiende una proteina que presenta la actividad enzimática capaz de transformar la 7, 9, 7' , 9' -tetra-cis-licopina convertida o la trans-total-licopina formada por la proteina b-ciclasa durante un tiempo determinado. En el caso de una actividad crtlSO aumentada con respecto de aquella observada en el tipo natural o silvestre se aumenta la cantidad 7, 9, T , 9r -tetra-cis-licopina convertida o la trans-total-licopina producida durante un tiempo determinado por la proteina crtlSO en comparación con el tipo silvestre o natural. El aumento de la actividad ctrlSO asciende a por lo menos un 5%, más preferentemente por lo menos un 20%, más preferentemente por lo menos un 50%, aún más preferentemente por lo menos un 100%, de preferencia por lo menos un 300%, aún más preferentemente por lo menos un 500%, en particular por lo menos un 600% de la actividad ctrlSO del tipo natural. La determinación de la actividad crtlSO en las plantas modificadas genéticamente y en las plantas de tipo silvestre o de referencia se efectúa preferentemente en las condiciones siguientes. El material de las plantas congelado se homogeniza mediante una molienda intensiva en un mortero en presencia de nitrógeno liquido y se extrae con una solución para extracción en una relación 1:1 hasta 1:20. La relación de extracción particular depende de las actividades enzimáticas presentes en el material de plantas existente, de tal modo de permitir la determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro de un rango de medición lineal. El tampón para extracción puede estar constituido típicamente de 50 mM HEPES-KOH (pH 7,4) 10 mM MgCl2, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM ácido epsilon-amino caprónico, 10% glicerina, 5 mM KHC03. Poco antes de la extracción se agregan 2 mM DTT y 0,5 mM PMSF. Por actividad Fts-Z se entiende la actividad fisiológica de una proteína Fts-Z. Bajo una proteína Fts-Z se entiende una proteína que presenta un efecto promotor de la división celular y de los plastidios y que tiene homología con las proteínas tubulina . Por actividad MinD se entiende la actividad fisiológica de una proteína MinD. Bajo una proteína MinD se entiende una proteína que desarrolla un papel multifuncional en la división celular. Se trata de un ATPase asociado con una membrana y puede demostrar dentro de una célula un movimiento oscilante de polo a polo. Por otra parte el incremento de la actividad de las enzimas de la via no-mevalonato puede producir un aumento del producto final cetocarotinoide deseado. Ejemplos de esto son la 4-disfosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol-sintasa, la 4-difosfocitidil—2-C-metil-D-eritritol-quinasa y la 2-C-metil-D-eritritol-2 , 4-ciclodifosfato sintasa. Mediante las modificaciones de la expresión genética de los respectivos genes es posible incrementar la actividad de las mencionadas enzimas. Las concentraciones modificadas de las proteínas relevantes se pueden comprobar en una forma estandarizada con ayuda de anticuerpos y las correspondientes técnicas de bloteo .
El aumento de la actividad HMG-CoA-reductasa y/o de la actividad (E) —4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o de la actividad de la l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o de la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa isomerasa y/o de la actividad isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o de la actividad geranil-difosfato-sintasa y/o de la formil-difosfato-sintasa y/o actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o de la actividad fitoen-sintasa y/o actividad fitoen-desaturasa y/o actividad zeta-carotina-desaturasa y/o actividad crtlSO y/o actividad FtsZ y/o actividad MinD se puede lograr a través de diferentes vías, por ejemplo, mediante la supresión de mecanismos inhibidores de la regulación a nivel de la expresión y proteina o mediante un incremento de la expresión genética de los ácidos nucléicos que codifican para una HMG-CoA-reductasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una (E)— -hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para un l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa isomerasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una formil-difosfato-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o los ácisod nucléicos que codifican para un fitoeno-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para un fitoeno-desaturasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una zeta-carotina-desaturasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para crtlSO y/o los ácidos nucléicos que codifican para una FtsZ-proteina y/o los ácidos nucléicos que codifican para una inD-proteina, con respecto del tipo natural o silvestre. El aumento de la expresión genética de los ácidos nucléicos que codifican para una HMG-CoA-reductasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una (E)—4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa isomerasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa isomerasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para un geranil-difosfato-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una farnesil-difosfato-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una fitoen-sintasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una fitoen-desaturasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una fitoen-desaturasa y/o los ácidos nucléicos que codifican para una zeta-carotina-desaturasa y/o los ácidos nucléicos que codifican una crtlSO-proteina y/o los ácidos nucléicos que codifican una FtsZ-proteina y/o los ácidos nucléicos que codifican una MinD-proteína, con respecto de aquella del tipo silvestre también puede ocurrir por diferentes vias, como ser por ejemplo mediante la inducción del gen-HMG-CoA-reductasa y/o del gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-3-enil-difosfato-reductasa y/o del gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o del gen 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa isomerasa y/o del gen isopentil-difosfato-delta-isomerasa y/o del gen geranil-difosfato-sintasa y/o del gen-formenil-difosfato-sintasa y / o del gen geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o del gen fitoen-sintasa y/o del gen fitoen-desaturasa y/o del gen zeta-carotina-desaturasa y/o del gen crtlSO y/o del gen FtsZ y/o del gen-MinD, mediante activadores o mediante la incorporación de una o más copias del gen HMG-CoA-reductasa y/o del gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-disfosfato-reductasa y/o del gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o del gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o del gen isopentil-difosfato-delta-isomersa y/o del gen geranil-difosfato-sintasa y/o del gen formenil-difosfato-sintasa y/o del gen geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o del gen fitoen-sintasa y/o del gen fitoen-desaturasa y/o del gen zeta-carotina-desaturasa y / o del gen crtlSO y/o del gen FtsZ y/o del gen-Mind, es decir, mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una HMG-CoA-reductasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difostato-reductasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una geranil-difosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una formenil-disfosfato sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una fitoen-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una fitoen-desaturasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una zeta-carotina-desactivasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una crtlSO-proteina y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una FtsZ-protéina y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una Mind-proteina en la planta . Bajo la expresión aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una o una HMG-CoA-reductasa y/o una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o una isopentil-difosfato-delta-isomerasa y/o un geranil-difosfato-sintasa y/o una farnesil-difosfato-sintasa y/o una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o una fitoen-sintasa y/o una fitoen-desaturasa y/o una zeta-carotina-desaturasa y/o una crtlSO-proteina, también se entiende en el marco de la presente invención la manipulación de la expresión propia, endógena, de la planta de la HMG-CoA-reductasa y/o (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enil-difosfato-reductasa y/o 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato reducto-isomerasa y/o isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o geranil-difosfato-sintasa y/o farnesil-difosfato-sintasa y/o geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o fitoen-sintasa y/o fitoen-desaturasa y/o zeta-caroteno desaturasa y/o la proteina crtlSO y/o la proteina FtsZ y/o la proteina MinD propia de la planta. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante una modificación de la correspondiente secuencia del ADN-promotor. Tal modificación, que tiene como resultado una mayor tasa de expresión del gen, se puede realizar por ejemplo mediante la supresión, dilación o inserción de secuencias de ADN. En una forma de realización preferida se produce el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una HMG-CoA-reductasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una geranil-difosfato-sintasa y / o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una forensil-difosfato-sintasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una fitoen-sintasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una fitoen-desaturasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una zeta-carotina-desactivasa y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una proteina crtlSO y el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una proteina FtsZ y/o el aumento de la expresión genética de un ácido nucléico que codifica para una proteina-MinD mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una HMG-CoA-reductasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una HMG-CoA-reductasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una geranil-difosfato-sintasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una farnesil-difosfato-sintasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una fitoen-sintasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una fitoen-desaturasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una zeta-carotina-desaturasa y/o mediante la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una proteina-crtlSO y/o la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una proteina FtsZ y / o la incorporación de por lo menos un ácido nucléico que codifica para una proteina-MinD en la planta. En principio, para ello se puede utilizar cualquier gen-HMG-CoA-reductasa o un gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2~ enil-difosfato-reductasa o un gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa o un gen isopentil-difosfato-delta-isomerasa o un gen geranil-difosfato-sintasa o un gen farnesil-difosfato-sintasa o un gen geranil-geranil-disfosato-sintasa o un gen fitoen-sintasa o un gen fitoen-desaturasa o un gen zeta-carotina-desaturasa o un gen crtlSO o un gen FtsZ o un gen-MinD. En el caso de las secuencias HMG-CoA-reductasa geno-micas o las secuencias (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa genómicas o las secuencias 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa genómicas o las secuencias 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa genómicas o las secuencias isopentenil-difosfato-delta-isomerasa genómicas o las secuencias geranil-geranil-difosfato-sintasa genómicas o las secuencias geranil-geranil-difosfato-sintasa genómicas o las secuencias fitoen-sintasa genómicas o las secuencias fitoen-desativasa genómicas o las secuencias zeta-carotina desaturasa genómicas o las secuencias crtlSO o las secuencias FtsZ o las secuencias MinD, todas genómicas, provenientes de fuentes eucarotas, portadoras de intrones, en el caso que la planta hospedante no esté en condiciones o no se pueda llevar a expresar las correspondientes proteínas, se deben utilizar secuencias de ácido nucléico ya procesadas, como ser los correspondientes cADNs . En las plantas transgénicas preferidas de la invención se tiene, por lo tanto, en esta modalidad preferida con respecto del tipo natural o silvestre, por lo menos un gen-H G-CoA-reductasa y/o un gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o un gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o un gen l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o un gen isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o un gen geranil-difosfato-sintasa y/o un gen farensil-difosfato-sintasa y/o un gen geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o un gen fitoen-sintasa y/o un gen fitoen-desaturasa y/o un gen zeta-carotina-desaturasa y/o un gen crtlSO y/o un gen FtsZ y / o un gen MinD adicionales. En otra forma de realización preferida la planta modificada genéticamente presenta, por ejemplo, por lo menos un ácido nucléico exógeno, que codifica para una HMG-CoA-reductasa, o por lo menos dos ácidos nucléicos exógenos que codifican una HMG-CoA-reductasa y/o por lo menos un ácido nucléico que codifica para una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno, que codifica para una isopentenil-disfosfato-delta-isomerasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos, que codifican para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa y/o por lo menos dos ácidos nucléicos exógenos que codifican para una geranil-difosfato-sintasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una geranil-difosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una farnesil-difosfato-sintasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una farnesil-difosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una geranil-geranil-difosfato-sintasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una fitoen-sintasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una fitoen-sintasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una fitoen-desaturasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una fitoen-desaturasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una zeta-carotina-desaturasa o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos ' que codifican para una zeta-carotina-desaturasa y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una proteina crtlSO o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una proteina crtlSO y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una proteina FtsZ o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una proteina FtsZ y/o por lo menos un ácido nucléico exógeno que codifica para una proteina- inD o por lo menos dos ácidos nucléicos endógenos que codifican para una proteina-MinD. Ejemplos de los genes HMG-CoA-reductasa son los siguientes: ün ácido nucléico que codifica para una HMG-CoA-reductasa de Arabidopsis thaliana, No. de Acceso NM_106299 (ácido nucléico: SEQ. ID No. 111; proteina: SEQ. ID No. 112), como también otros genes HMG-CoA-reductasa provenientes de otros organismos con las siguientes números de acceso: P54961, P54870, P54868, P54869, 002734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135, 064966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136, 064967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4, 076819, 028538, Q9Y7D2, P54960, 051628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, 024594, P09610, Q58116, 026662, Q01237, Q01559, Q12649, 074164, 059469, P51639,Q10283, 008424, P20715, P13703, P13702, Q96UG4, Q8SQZ9, 015888, Q9TÜM4,P93514,Q39628,P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84MM0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9KLM0.
Ejempos de los genes (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa son los siguientes: ün ácido nucléico que codifica para una (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa de Arabidopsis thaliana (lytB/ISPH) , No. de acceso AY168881, (ácido nucléico: SEQ. ID No. 113; proteina: SEQ. ID No. 114) . Como también otros genes (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa de otros organismos con los siguientes números de acceso: T04781, AF270978_1, NP_485028.1, NP_442089.1, NP_681832.1, ZP_00110421.1, ZP_00071594.1, ZP_00114706.1, ISPH_SYNY3, ZP_00114087.1, ZP_00104269.1, AF398145_1, AF398146_1, AAD55762.1, AF514843_1, NP_622970.1, NP_348471.1, NP_562001.1, NP_223698.1, NP_781941.1, ZP_00080042.1, NP_859669.1, NP_214191.1, ZP_00086191.1, ISPH_VIBCH, NP_230334.1, NP_742768.1, NP_302306.1, ISPH_MYCLE, NP_602581.1, ZP_00026966.1, NP_520563.1, NP_253247.1r NP_282047.1, ZP_00038210.1, ZP_00064913.1, CAA61555.1, ZP_00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067.1, ZP_0002916 .1, NPJ790656.1, NP_217899.1, NP_641592.1, NP_636532.1, NP_719076.1, NP_660497.1, NP_422155.1, NP_715446.1, ZP_00090692.1, NP_759496.1, ISPH_BURPS, ZP_00129657.1, NP_215626.1, NP_335584.1, ZP_00135016.1, NP_789585.1, NP_787770.1, NP_769647.1, ZP_00043336.1, NP_242248.1, ZP_00008555.1, NP_246603.1, ZP_00030951.1, NP_670994.1, NP_404120.1, NP_540376.1, NP_733653.1, NP_697503.1, NP_840730.1, NP_274828.1, NP_796916.1, ZP_00123390.1, NP_824386.1, NP_737689.1, ZP_00021222.1, NP_757521.1, NP_390395.1, ZP_00133322.1, CAD76178.1, NP_600249.1, NP_454660.1, NP_712601.1, NP_385018.1, NP_751989.1.
Ejemplos de los genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica para una 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa de Lycopersicon esculentum, No. de acceso AF143812, (ácido nucléico: SEQ. ID No. 115, proteina: SEQ. ID No. 116) . Como también otros genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286_1, NP_193291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXSJDRYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AAM65798.1, NP_566686.1, CAD22531 AAC33513.1, CAC08458.1, AAG10432.1, T08140, AAP14354.1, AF428463_1, ZP_00010537.1, NP_769291.1, AAK59424.1, NP_107784.1, NP_697464.1, NP_540415.1, NP_196699.1, NP_384986.1, ZP_00096461.1, ZP_00013656.1, NP_353769.1, ???83576.1, ZP_00005919.1, ZP_00006273.1, NP_420871.1, AAM48660.1, DXS_RHOCA, ZP_00045608.1, ZP_00031686.1, NP_841218.1, ZPJ30022174.1, ZP_00086851.1, NP_742690.1, NP_520342.1, ZP_00082120.1, NPJ790545.1, ZP_00125266.1, CAC17468.1, NP_252733.1, ZP_00092466.1, NP_439591.1, NP_414954.1, NP_752465.1, NP_622918.1, NP_286162.1, NP_836085.1, NP_706308.1, ZP_00081148.1, NP_797065.1, NP_213598.1, NP_245469.1, ZP_00075029.1, NP_455016.1, NP_230536.1, NP_459417.1, NP_274863.1, NP_283402.1, NP_759318.1, NP_406652.1, DXS_SYNLE, DXS_SYNP7, NP_440409.1, ZP_00067331.1, ZP_00122853.1, NP_717142.1, ZP_00104889.1, NP_243645.1, NP_681412.1, DXS_SYNEL, NP_637787.1, DXS_CHLTE, ZP_00129863.1, NP_661241.1, DXS_XANCP, NP_470738.1, NP_484643.1, ZP_00108360.1, NP_833890.1 , NP_846629.1, NP_658213.1, NP_642879.1, ZP_00039479.1, ZP_0006058 .1, ZP_00041364.1, ZP_00117779. NP 299528.1.
Ejemplos de genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerosa son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica para una 1-deoxi-D- xilosa-5-fosfato-reducto-isomersas de Arabidopsis thaliana, No. de acceso AF148852, (ácido nucléico: SEQ. ID No. 137, proteina: SEQ. ID No. 138) . Como también otros genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952, AJ242588, AB009053, AY202991, NP_201085.1, T52570, AF331705_1, BAB16915.1, AF367205_1, AF250235_1, CAC03581.1, CAD22156.1, AF182287_1, DXR_MENPI, ZP_00071219.1, NP_488391.1, ZP_0011307.1, DXR_SYNLE, AAP56260.1, NP_681831.1, NP_442113.1, ZP_00115071.1, ZP_00105106.1, ZP_0011348 .1, NP_833540.1, NP_657789.1, NP_661031.1, DXR_BACHD, NP_833080.1, NP_845693.1, NP_562610.1, NP_623020.1, NP_810915.1, NP_243287.1, ZP_00118743.1, NP_464842.1, NP_470690.1, ZP_00082201.1, NP_781898.1, ZP_00123667.1, NP_348420.1, NP_604221.1, ZP_00053349.1, ZP_00064941.1, NP_2 6927.1, NP_389537.1, ZP_00102576.1, NP_5195931.1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NPJ713472.1, NP_459225.1, NP_454827.1, ZP_00045738.1, NP_743754.1, DXR_PSEP , ZP_00130352.1, NP_702530.1, NP_841744.1, NP_438967.1, AF514841_1, NP_706118.1, ZP_00125845.1, NP_404661.1, NP_285867.1, NP_240064.1, NP_414715.1, ZP_00094058.1, NP_791365.1, ZP_00012448.1, ZP_00015132.1, ZP_00091545.1, NP_629822.1, NP_771495.1, NP_798691.1, NP_231885.1, NP_252340.1, ZP_00022353.1, NP_355549.1, NP_420724.1, ZP_00085169.1, EAA17616.1, NP_273242.1, NP_219574.1, NP_387094.1, NP_386721.1, ZP_00004209.1, NP_823739.1, NP_282934.1, BAA77848.1, NP_660577.1, NP_760741.1, NP_641750.1, NP_636741.1, NP_829309.1, NP_298338.1, NP_444964.1, NP_717246.1, NP_224545.1, ZP_00038451.1, DXR_KITGR, NP_778563.1.
Ejemplos de genes isopentenil-difosfato-delta- isomerasa son: ün ácido nucléico que codifica para una isopentenil-difosfato-delta-isomerasa de Adonis palaestina clon ApIP128, (ipiAal) , No. de acceso AF188060, publicado por Cunningham, F.X. Jr. y Gantt, E.: Identification of multi- gene families encoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol. 41 (1), 119-123 (2000) (ácido nucléico: SEQ. ID No. 117, proteina: SEQ. ID No. 118), Como también otros genes isopentenil-difosfato- delta-isomerasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: Q38929, Q48964, Q39472, Q13907, 035586, P58044, 042641, 035760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4 , Q42553, 027997, P50740, 051627, 048965, Q8KFR5, , Q39471, Q39664, Q9RVE2, Q01335, Q9HHE4 , Q9BXS1, Q9K F6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35, Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6, 013504, Q9HFW8, Q8NJL9, Q9UUQ1, Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6, 081691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3, Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, Q9ZVJ1, Q9AVG8, Q9M6 6, Q9AVJ5, Q9M6K2, Q9AYS5, Q9M6K8, Q9AVG7 , Q8S3L7, Q8W250, Q94IE1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9M6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382, CAD94476.
Ejemplos de los genes geranil-difosfato-sintasa son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica para una geranil-difosfato-sintasa a partir de Arabidopsis thaliana, No. de acceso Y17376, Bouvier, F. , Suire, C. , d'Harlingue, A., Backhaus, R.A. y Cámara, B.; Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant J. 24 (2), 241-252 (2000) (ácido nucléico: SEQ. ID No. 119, proteína: SEQ. ID No. 120), como también otros genes geranil-difosfato-sintasa provenientes de otros organismos con los números de acceso siguientes : Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3, Q9SBR3, Q9SBR4, Q9FET8, Q8L J1, Q84LG1, Q9JK86.
Ejemplos de los genes farnesil-difosfato-sintasa son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica para una farnesil-difosfato-sintasa de Arabidopsis thaliana (FPS1) , No. de acceso U80605, publicado por Cunillera, N. , Arro, M., Delourme, D. , Karst, F., Boronat, A., y Ferrer, A.: Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed farnesyl-diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 121, proteína: SEQ. ID No. 122) , como también otros genes farnesil-difosfato-sintasa provenientes de otros organismos con los siguientes No. de acceso: P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351, 024241, Q43315, P49352, 024242, P49350, P08836, P14324, P49349, P08524, 066952, Q08291, P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0, P22939, P45204, 066126, P55539, Q9S H9, Q9AVI7, Q9FRX2, Q9AYS7 , Q94IE8, Q9FXR9, Q9ZWF6, Q9FXR8, Q9AR37, O50009, Q94IE9, Q8RVK7, Q8RVQ7, O04882, Q93RA8, Q93RB0, Q93RB4, Q93RB5, Q93RB3, Q93RB1, Q93RB2, Q920E5.
Ejemplos de genes geranil-geranil-difosfato-sintasa son los siguientes : ' Un ácido nucléico que codifica para una geranil-geranil-difosfato-sintasa de Sinaps alba, No. de acceso X98795, publicado por Bonk, M. , Hoffmann, B., Von Lintig, J. , Schledz, M. , Al-Babili, S., Hobeika, E . , Kleinig, H. , y Beyer, P.: Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveáis differential fates prior to membrane binding and oligomeric assambly, Eur. J. Biochem. 247 (3), 942-950 (1997), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 123, proteína: SEQ. ID No. 124) , como también otros genes geranil-geranil-difosfato-sintasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: P22873, P34802, P56966, P80042, Q42698, Q92236, 095749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2, Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4 , Q9SXZ5, Q9AVJ7, Q9AYN1, Q9AVJ4 , Q9FXR7, Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC , Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0, Q9AVI9, Q9FR 3, Q9FXR5, Q94IF0, Q9FRX1, Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA31459.
Ejemplos de los genes fitoen-sintasa son los siguientes : Un ácido nucléico que codifica para una fitoen-sintasa de Erwinina uredovora, No. de acceso D90087; publicado por Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K. , y Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 125, proteina: SEQ. ID No. 126), como también otros genes fitoen-sintasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: CAB39693, BAC69364, AAF10440, CAA 5350, BAA20384, AAM72615, BAC09112, CAA48922, P_001091, CAB84588, AAF41518, CAA48155, AAD38051, AAF33237, AAG10427, AAA34187, ???73532, CAC1 567, AAM62787, CAA55391, AAB65697, AAM45379, CAC27383, AAA32836, AAK07735, BAA84763, P_000205, AAB60314, P_001163, P_000718, AAB71428, AAA34153, AAK07734, CAA42969, CAD76176, CAA68575, P_000130, P_001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957, BAC76563, P 000242, P 000551, AAL02001, AAK15621, CAB94795, AAA91951, P 000448.
Ejemplos de los genes fitoen-desaturasa son los siguientes: Un ácido nucléico, que codifica para una fitoen-desaturasa de Erwinia uredovora, No. de acceso D90087, publicado por Misawa, . , Nakagawa, ., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., y Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 127, proteina: SEQ. ID No. 128), como también otros genes fitoen-sintasa provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: AAL15300, A39597, CAA42573, AA 51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461, AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AA024235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP_001041, ZP_001163, CAA39004, CAA44452, ZP_001142, ZP_000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091, BAC09113, AAP79175, AAL80005, ???72642, AAM72043, ZP_000745, ZP_001141, BAC07889, CAD55814, ZP_001041, CAD27442, CAE00192, ZP_001163, ZP_000197, BAA18400, AAG10425, ZP_001119, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081, AAA91161, CAB56041, AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP_001117, ZPJD00448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP_000171, AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP_001133, CAA64853, BAB74484, ZP_001156, AAF23289, AAG28703, AAP09348, AA 71569, BAB69140, ZP_000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, AAG10645, ZP_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371, ZP_000612, BAC75676, AAF65582.
Ejemplos de los genes zeta-carotina-desaturasa son los siguientes : Un ácido nucléico que codifica para una zeta- carotina-desaturása de Narcissus pseudonarcissus, No. de acceso AJ224683, publicado por Al-Babili, S., Oelschleger, J. y Beyer, P. : A cDNA encoding for beta carotene desaturase (No. de Acceso AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L.
(PGR98-103), Plant Physiol. 117, 719-719 (1998), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 129, proteina: SEQ. ID No. 130), como también otros genes zeta-carotina-desaturasa provenientes de otros organismos con los siguientes No. de acceso : Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4, 049901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2, ZDS_NARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617_1, ZDS_TARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278a, ZDS_CAPAN, ZDS_LYCES, NP_187138.1, AAM63349.1, ZDS_ARATH, AAA91161.1, ZDS_MAIZE, AAG14399.1, NP_441720.1, NP_486422.1, ZP_00111920.1, CAB56041.1, ZP_00074512.1, ZP_00116357.1, NP_681127.1, ZP 00114185.1, ZP_00104126.1, CAB65434.1, NP_662300.1.
Ejemplos de los genes crtlSO son los siguientes: Un ácido nucléico gue codifica para una crtlSO de Lycopersicon esculentum; No. de acceso AF416727, publicado por Isaacson, T., Roñen, G. , Zamir, D., y Hirschberg, J. : Cloning of tangerine from tomato reveáis a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 131, proteina: SEQ. ID No. 132), como también otros genes crtlSO provenientes de otros organismos con el siguiente número de acceso: AA 53952 Ejemplos del gen FtsZ son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica para una FtsZ de Tagetes erecta, No. de acceso AF251346, publicada por Moehs, CP., Tian, L., Osteryoung, K.W. y Dellapenna, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 133, proteina: SEQ. ID No. 134), como también otros genes FtsZ provenientes de otros organismos con los siguientes números de acceso: CAB89286.1, AF205858_1, NP_200339.1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774, AF383876_1, BAC57986.1, CAD22047.1, BAB91150.1, ZP_00072546.1, NP_40816.1, T51092, ??_683172.1, BAA85116.1, ??_487898.1, JC4289, BAA82871.1, ??_781763.1, BAC57987.1, ??_00111461.1, T51088, ??_190843.1, ??_00060035.1, ??_846285.1, AAL07180.1, ??_243424.1, ??_833626.1, AAN04561.1, AAN04557.1, CAD22048.1, T51089, ??_692394.1, ??_623327.1, ??_565839.1, T51090, CAA07676.1, ??_113397.1, T51087, CAC442571, ?84778, ??_00105267.1, BAA82091.1, ??_00112790.1, BAA96782.1, ??_48319.1, ??_471472.1, ??_00115870.1, ??_465556.1, NP_389412.1r BAA82090.1, ??_562681.1, AAM22891.1, ??_371710.1, ??_764416.1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117_1, ??_827300.1, JE082, ??_626341.1, AAC45639.1, ??_785689.1, ??_336679.1, ??_738660.1, ??_00057764.1, AAC32265.1, ??_814733.1, FTSZ_MYCKA, ??_216666.1, CAA75616.1, ??_301700.1, ??_601357.1, ??_00046269.1, CAA70158.1, ??_00037834.1, ??_268026.1, FTSZ_ENTHR, ??_787643.1, ??_346105.1, AAC32264.1, JC5548, AAC95440.1, ??_710793.1, ??_687509.1, ??_269594.1, AAC32266.1, ??_720988.1, ??_657875.1, ??_00094865.1, ??_00080499.1, ??_00043589.1, JC7087, ??_660559.1, AAC46069.1, AF179611_14, AAC44223.1, ??_404201.1.
Ejemplos de los genes Min-D son los siguientes: Un ácido nucléico que codifica una Min-D de Tagetes erecta, No. de acceso AF251019, publicada por Moehs, CP., Tian, L . , Osteryoung, K.W., y Dellapenna D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development; Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (ácido nucléico: SEQ. ID No. 135, proteina: SEQ. ID No. 136), además de otros genes Min-D con los siguientes números de acceso : NP_197790.1, BAA90628.1, ??_038435.1, ??_045875.1, AAN33031.1, ??_050910.1, CAB53105.1, ??_050687.1, ??_682807.1, ??_487496.1, ??_00111708.1, ??_00071109.1, ??_442592.1, ??_603083.1, ??_782631.1, ??_00097367.1, ??_00104319.1, ??_294476.1, ??_622555.1, ??_563054.1, ??_347881.1, ??_00113908.1, ??_834154.1, ??_658480.1, ??_00059858.1, ??_470915.1, ??_243893.1, ??_465069.1, ??_00116155.1 , ??_390677.1, ??_692970.1, ??_298610.1, ??_207129.1, ??_000388774.1, NPJ778791.1, ??_223033.1, ??_641561.1, ??_636499.1, ??__00088714.1, ??_213595.1, NPJ743889.1, ??_231594.1, ??_00085067.1, ??_797252.1, ??_00136593.1, ??_251934.1, ??_405629.1, ??_759144.1, ??_00102939.1, ??_793645.1, ??_699517.1, ??_460771.1, ??_860754.1, ??_456322.1, ??_718163.1, ??_229666.1, ??_357356.1, ??_541904.1, ??_287414.1, ??_660660.1, ??_00128273.1, ??_103411.1, ??_785789.1, ??_715361.1, AF149810_1, ??_841854.1, ??_437893.1, ??_00022726.1, EAA24844.1, ??_00029547.1, ??_521484.1, ??_240148.1, ??_770852.1, AF345908_2, ??_777923.1, ??_00048879.1, ??_579340.1, ??_143455.1, ??_126254.1, ??_142573.1, ??_613505.1, ??_127112.1, ??_712786.1, ??_578214.1, ??_069530.1, ??_247526.1, ???85593.1, ??_212403.1, ??_782258.1, ??_00058694.1, ??_247137.1, ??_219149.1, ??_276946.1, ??_614522.1, ??_00019288.1, CAD78330.1 Preferentemente se utiliza en la forma de realización preferida descrita anteriormente como genes HMG-CoA-reductasa, ácidos nucléicos que codifican proteínas, portadores de una secuencia aminoácidos SEQ. ID. No. 112 o una secuencia derivada a partir de la misma por substitución, inserción o supresión o delección de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 112 y que tienen la propiedad enzimática de una HMG-CoA-reductasa. Otros ejemplos de HMG-CoA-reductasa y genes HMG-CoA-reductasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácidos nucléicos retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 112. Otros ejemplos de HMG-CoA-reductasa y genes HNG- CoA-reductasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de la secuencia SEQ. ID No. 111 de diferentes organismos cuya secuencia genómica es desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante técnica de hibridización y PCR conocidas. En otra forma de realización, con el objeto de incrementar la actividad HMG-CoA-reductasa se incorporan ácidos nucléicos en los organismos, los cuales codifican para proteínas portadoras de la secuencia aminoácido de la H G-CoA-reductasa de la secuencia SEQ. ID No. 112.
Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante la retro-traducción de la secuencia polipéptido de acuerdo al código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones que se utilizan frecuentemente de acuerdo al llamado "codonaje" especifico para la- planta. El mencionado "codonaje" se puede determinar fácilmente basado en los evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos . En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico de acuerdo a la secuenica SEQ. ID No. 111. En la forma de realización preferida descrita anteriormente se utilizan ácidos nucléicos genes (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, los que codifican para proteínas portadoras de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 114 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por medio de la substitución, inserción o deleción o supresión de aminoácidos, con una identidad igual o por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, aún más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 114, la cual tiene la propiedad enzimática de una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa . Otros ejemplos de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y genes (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de organismos con una secuencia genómica conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparación de homologación de las secuencias de los aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 114. Otros ejemplos de los (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y de los genes (4) -4-hidroxi-3-metilbu-2-enil-difosfato-reductasa también se pueden encontrar fácilmente, partiendo de la secuencia SEQ. ID. No. 113 de diferentes organismos con una secuencia genómica desconocida, tal como se descubrió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y PCR. Según otra forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, se incorporan en los organismos ácidos nucléicos, que codifican proteínas, portadores de la secuencia aminoácido de la (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasade la secuencia SEQ. ID No. 114.
Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante una retro-traducción de la secuencia polipéptido según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones utilizados frecuentemente de acuerdo al llamado "codonaje" especifico para la planta. Este "codonaje" se puede determinar mediante evaluaciones computacionales de los genes conocidos de los organismos correspondientes. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico correspondiente a la secuencia SEQ. ID No. 113. En la mencionada forma de realización especialmente preferida descrita anteriormente se incorporan como genes (1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) ácidos nucléicos que codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácido SEQ. ID No. 115 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por medio de substracción, inserción o supresión o deleción de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 116, y los que tienen la propiedad de una ( l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) .
Otros ejemplos de las (l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y de los genes (l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) se pueden encontrar fácilmente a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de los aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 116. Otros ejemplos de las ( l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) y de los genes (l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) también se pueden encontrar fácilmente, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 115 de diferentes organismos con una secuencia genómica desconocida, tal como se descubrió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y PCR. Según otra forma de realización especialmente preferida se incorporan en los organismos ácidos nucléicos que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácido de la ( l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) de la secuencia SEQ. ID No. 116 con el objeto de poder aumentar la actividad de la (l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa) . Las secuencias adecuadas de ácidos nucléicos se pueden obtener, por ejemplo, mediante la retro-traducción de la secuencia polipéptido según el códgio genético.
Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones que se utilizan frecuentemente de acuerdo al llamado "codonaje" especifico para la planta. El mencionado "codonaje" se puede determinar basado en evaluaciones computacionales de otros genes de los organismos respectivos. Según una forma de realización especialmente preferida se incorporan en el organismo un ácido nucléico que contiene la secuencia SEQ. ID No. 115. En la forma de realización preferida descrita anteriormente se usa como genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa ácidos nucléicos, que codifican para proteínas portadoras de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 138 o una secuencia derivada a partir de la misma mdeiante la sustitución, inserción o supresión (deleción de aminoácidos, con una identidad igual o por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 138, y los que presentan la propiedad enzimática de una l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa . Otros ejemplos de las l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa y de los genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidoso de las correspondientes secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de las bases de datos con la secuencia SEQ. ID No. 138. También es posible encontrar fácilmente otros ejemplos de l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasas y de genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 137 de diferentes organismos cuya secuencia genómica es desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y PCR. Según otra forma de realización preferida, con el objeto de aumentar la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasase incorporan ácidos nucléicos en los organismos, que codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido de la l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto-isomerasa de la secuencia SEQ. ID No. 138. Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante la retro-transmisión de la secuencia polipeptídica según el código genético. Por ello se utilizan preferentemente aquellos codones, los que se emplean frecuentemente de acuerdo al llamado "codón usaje" específico para la planta. El mecanismo "codón usaje" se puede determinar fácilmente a través de evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los organismos correspondientes. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora al organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 137. En la forma de realización preferida descrita anteriormente se utiliza preferentemente como genes-isopentenil-D-isomerasa ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 118 o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, la inserción o la supresión o deleción de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos el 30%, preferentemente de por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 118 y que tienen la propiedad enzimática de una isopentenil-D-isomerasa . Otros ejemplos de las isopentenil-D-isomerasa y de los genes isopentenil-D-isomerasa, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las respectivas secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 118.
Otros ejemplos de las isopentenil-D-isomerasa y de los genes isopentenil-D-isomerasa tam iénse pueden encontrar fácilmente partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 117 de diferentes organismos con una secuencia genómica desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de las técnicas conocidas de hibridización y de reacción PCR. Según otra forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad isopentenil-D-isomerasa, se incorporan en los organismos ácidos nucléicos, capaces de codificar para proteínas, portadores de las secuencia aminoácido de la isopentenil-D-isomerasa de la secuencia SEQ. ID No. 118. Aquellas secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, por medio de la retro-traducción de la secuencia polipeptidica según el código genético. Para ello se utilizan preferentementen aquellos codones, empleados con frecuencia según el llamado "codón usage" especifico de la planta, xxxxxx "codón usage" se puede determinar fácilmente basado enlas evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos . En una forma de realización opcionalmente preferida de la invención se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 117.
Preferentemente se utiliza en la forma de realización preferida descrita anteriormente, como genes-geranil-difsofato-sintasa ácidos nucléicos, los que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 120 o una secuencia derivada de esta secuencia por medio de la sustitución, inserción o supresión, o delación, de los aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lómenos un 30%, más preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, particularmente de por lo menos 95% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 120, y que tienen la propiedad enzimática de una geranil-difosfato-sintasa . Otros ejemplos de geranil-difosfato-sintasas y de genes-geranil-difosfato-sintasa se pueden encontrar fácilmente en diversos organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, mediante comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 120. Otros ejemplos de las geranil-difosfato-sintasas y de los genes-geranil-difosfato-sintasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 119 de diferentes organismos, cuya secuencia genómica sea desconocida, según se describió anteriormente, mediante la aplicación de las técnicas de hibridización y PCR. En otra forma de realización particularmente preferida, para producir un aumento de la actividad geranil-difosfato-sintasa, se incorporan ácidos nucléicos en los en los organismos, los cuales codifican proteínas, portadores de las secuencia aminoácido de la geranil-difosfato-sintasa de la secuencia SEQ. ID No. 120. Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, por medio de la retro-traducción de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. Preferentemente para ello se utilizan aquellos codones que se emplean frecuentemente de acuerdo al llamado "codón usage" especifico para la planta. El mencionado "codón usage" se puede determinar fácilmente a través de evaluaciones correspondientes de otros genes conocidos de los organismos correspondientes. En una forma de realización particularmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 119. En la mencionada forma de realización preferida se utilizan como genes farnesil-difosfato-sintasa ácidos nucléicos que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO. 112 o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la substitución, inserción o supresión de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de especial preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 122 y que tienen la propiedad de una farnesil-difosfato-sintasa . Otros ejemplos de las farnesil-disfosfato-sintasa y de los genes-farnesil-difosfato-sintasa se pueden encontrar fácilmente en diferentes organismos, cuya secuencia genómica sea conocida, tal comose describió anteriormente, a través de comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o de las correspondiente's secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos, con la secuencia SEQ. ID No. 122. Otros ejemplos de las farnesil-difosfato-sintasas y de los genes-farnesil-difosfato-sintasa también se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 121 de diferentes organismos, cuya secuencia genómica no desconocida, mediante la aplicación de técnicas de hibridización y PCR. Según otra forma de realización preferida, con el objeto de aumentar la actividad preferida con el objeto de aumentar la actividad farnesil-difosfato-sintasa se incorporan en los organismos ácidos nucléicos, las cuales codifican para una proteina portadora de la secuencia aminoácido de la farnesil-difosfato-sintasa de la secuencia SEQ. ID No. 122. Aquellas secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante una retro-traducción de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones que se emplean preferentemente de acuerdo al llamado "codón usage" especifico para la planta. El mencionado "codon usage" o utilización del codón se puede determinar fácilmente basado en las evaluaciones computacionales de otros genes de los respectivos organismos. En una forma de realización particularmente preferida de la invención se incorpora en el organismo un ácido nucléico correspondiente a la secuencia SEQ. ID No. 121. En la forma de realización particularmente preferida descrita anteriormente se utilizan genes-geranil-geranil-difosfato-sintasa ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, que contienen la secuencia de aminoácido SEQ. ID No. 124 o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la sustitución, inserción o supresión (delación) de aminoácidos, y las que presentan una identeidad de por lo menos un 30%, preferentemente de por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia de por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 124, y los que presentan la propiedad enzimática de una geranil-geranil-difosfato-sintasa . Otros ejemplos de las geranil-geranil-difosfato-sintasa y de los genes geranil-geranil-difosfato-sintasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de los aminoácidos o de las respectivas secuencias retro-traducidas de los ácidos nucleicos a partir de bases de datos con la secuencia SEQ. ID No. 124. También es posible encontrar fácilmente otros ejemplos de las geranil-geranil-difosfato-sintasa, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 123 a partir de diferentes organismos cuya secuencia genómica desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y PCR. En otra forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, se incorporan en los organismos ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido de la geranil-geranil-difosfato-sintasa de la secuencia SEQ. ID No. 124.
Aquellas secuencias adecuadas de ácido nucléico se pueden obtener mediante la retro-traducción de la secuencia polipeptidica según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones, empleados con frecuencia según el llamado "codón usage" o el uso de codón específico para la planta. El mencionado "codón usage" se puede determinar fácilmente basado en las evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 123. En la forma de realización especialmente preferida mencionada anteriormente se utilizan preferentemente como genes-fitoen-sintasa ácidos nucléicos, capaces de codificar para proteínas, portadoras de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 126 o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o supresión (delación) de aminoácidos, la cual tiene una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo meno sun 95% a nivel de los aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 126, y las cuales poseen la propiedad enzimática de una fitoen-sintasa .
Otros ejemplos de las fitoen-sintasa y de los genes-fitoen-sintasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las respectivas secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 126. Otros ejemplos de las fitoen-sintasas y de los genes fitoen-sintasas se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 125 de diferentes organismos cuya secuencia genómica es desconocida, tal como se explicó anteriormente, mediante la aplicación de las técnicas conocidas de hibridización y de reacción PCR. En otra forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad fitoen-sintasa, se incorporan en los organismos ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácido de la fitoen-sintasa de la secuencia SEQ. ID No. 126. Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante la retro-traducción de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones que se emplean frecuentemente según el llamado "codón usage" especifico para las plantas. El mencionado "codón usage" se puede determinar fácilmente basado en evaluaciones computacionales de los genes conocidos de los correspondientes organismos. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 125. En la forma de realización preferida descrita anteriormente se utilizan como genes-fitoen-desaturasa ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácido SEQ. ID No. 128 o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la sustitución, inserción o supresión (deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, aún más preferentemente por lo menos un 70%, de particular preferencia por lo menos un 90%, en particular por lo menos un 95% a nivel de aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 128 y las cuales tienen la propiedad enzimática de una fitoen-desaturasa . Otros ejemplos de las fitoen-desaturasa y de los genes fitoen-desaturasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, talcomo se describió anteriormente, a través de comparaciones de omologaciónde las secuencias de aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácido nucléico a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 128. Otros ejemplos de las fitoen-desaturasa y de los genes fitoen-desaturasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 127 de diferentes organismos cuya secuencia genómica es desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y reacción PCR. En otra forma de realización especialmente preferida de la invención, con el objeto de aumentar la actividad fitoen-sintasa-desaturasa, se incorporan en el organismo ácidos nucléicos, los que codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácido de la fitoen-desaturasa de la secuencia SEQ. ID No. 128. Las secuencias adecuadas de ácido nucléico se pueden obtener, por ejemplo de la retro-traducción de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. Para ello se utilizan preferentemente codones empleados con frecuencia de acuerdo al llamado "codon usage" específico de la planta. El mencionado "codon usage" se puede determinar fácilmente sobre la base de evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos .
En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 127. Preferentemente se utiliza en la forma de realización preferida descrita anteriormente en calidad de genes zeta-carotina-desaturasa ácidos nucléicos, los cuales codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido SEQ. ID No. 130 o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o supresión (deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente de por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 130 y las cuales tienen la propiedad enzimática de una zeta-carotina-desaturasa. Otros ejemplos de las zeta-carotina-desaturasa y de los genes-zeta-carotina-desaturasa se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de los aminoácidos p de las respectivas secuencias de ácidos nucléicos retro-traducidos a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 130.
Otros ejemplos de las zeta-carotina-desaturasa y de los genes-zeta-carotina-desaturasa también se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la memoria SEQ.ID No. 129 de diferentes organismos, cuya secuencia genómica sea desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas conocidas de hibridización y PCR. En una forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad zeta-carotina-desaturasa se incorporan ácidos nucléicos en el organismo, los que codifican proteinas, portadoras de la secuencia de aminoácidos de la zeta-carotina-desaturasa de la secuencia SEQ. ID No. 130 . Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, por medio de la retro-traducción de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. Para ello se utilizan perferentemente aquellos codones que se amplían frecuentemente de acuerdo al llamado "codonaje" o "utilización del codón" especifico para la planta. El mencionado "codón usage" se puede determinar fácilmente sobre la base de evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No.129 .
En la forma de realización preferida descrita anteriormente se utilizan en calidad de genes Crtlso ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácidos SEQ. ID. No. 132 o una secuencia derivada a partir de la misma que presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente de por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la memoria SEQ. ID No. 132, y los que tienen la propiedad enzimática de una Crtlso. Otros ejemplos de Crtlson y de genes Crtlso se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácidos nucléicos retro-traducidos a partir de los bancos de datos con la memoria SEQ. ID No. 132. También es posible encontrar otros ejemplos de Crtlson y de genes Crtlso, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 131 de diferentes organismos con una secuencia genómica desconocida, tal como se describió anteriormente, mediante la aplicación de técnicas de hibridización y PCR, en la forma conocida.
En otra forma de realización preferida de la invención, con el objeto de aumentar la actividad Crtlso se incorporan ácidos nucléicos en los organismos, los cuales codifican para proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido de la Crtlso de la secuencia SEQ. ID No. 132. Las secuencias de ácido nucléico adecuadas se pueden obtener por ejemplo mediante la retro-traducción de la secuencia polipeptídica según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones, los cuales se emplean con frecuencia de acuerdo al llamado "codón usaje" o wuso de codón" específico para la planta. El mencionado "codón usage" se puede determinar basado en evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los mencionados organismos. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 131. En la forma de realización preferida descrita anteriormente se incorporan comogenes FtsZ ácidos nucléicos, los cuales codifican proteínas, portadoras de la secuencia aminoácido SEQ. ID No. 134 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por medio de la substitución, inserción o supresión (o deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, de particular preferencia por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, en particular, por lo menos un 95% a nivel de aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 134, y que tienen la propiedad enzimática de una FtsZ. Otros ejemplos de FtsZn y de genes FtsZ se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, según se describió anteriormente, basado en comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las correspondientes secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 134. Otros ejemplos de FtsZn y de los genes FtsZ también se pueden encontrar, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 133 de diferentes organismos cuya secuencia genómica es desconocida, según se describió anteriormente, mediante la aplicación de las técnicas conocidas de hibridización y PCR, en la forma usual. En otra forma de realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad FtsZ, se incorporan ácidos nucléicos en los organismos, los cuales codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácido de la FtsZ de la secuencia SEQ. ID No. 134.
Aquellas secuencias adecuadas de ácido nucléico se pueden obtener por medio de retro-traducción de la secuencia polipeptidica según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones, los cuales se emplean frecuentemente según el llamado "codón usage", es decir, el "uso de codón", especifico para la planta correspondiente: El mencionado "codón usage" se puede determinar fácilmente sobre la base de evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos. En una forma de realización especialmente preferida se incorpora en el organismo un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 133. Preferentemente se utiliza en la forma de realización preferida descrita anteriormente como genes Min D, ácidos nucléicos, que codifican para proteínas, portadores de la secuencia de aminoácido SEQ. ID No. 136 o una secuencia derivada a partir de dicha secuencia mediante la substitución, inserción o supresión (deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 30%, preferentemente por lo menos un 50%, más preferentemente por lo menos un 70%, aún más preferentemente por lo menos un 90%, en especial por lo menos un 95% a nivel de aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 136, que tienen la propiedad de un MinD.
Otros ejemplos de MinDn y de los genes MinD se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, a partir de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, tal como se describió anteriormente, a través de comparaciones de homologación de las secuencias de aminoácidos o de las respectivas secuencias de ácido nucléico retro-traducidas a partir de bancos de datos con la secuencia SEQ. ID No. 136. Otros ejemplos de MinDn y de los genes MinD también se pueden encontrar fácilmente, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEQ. ID No. 135 de diferentes organismos, cuya secuencia genómica es conocida, según se describió anteriormente, mediante la aplicación de las técnicas hibridización y PCR. En otra realización especialmente preferida, con el objeto de aumentar la actividad MinD, se incorporatn ácidos nucléicos en los organismos, los cuales codifican para proteínas, portadores de la secuencia aminoácido de la MinD de la secuencia SEQ. ID No. 136. Las secuencias adecuadas de ácido nucléico se pueden obtener, por ejemplo, por medio de la retro-traducción de la secuencia polipeptidica según el código genético. Para ello se utilizan preferentemente aquellos codones, empleados con frecuencia según el llamado "codon usage" específicao para la planta. El mencionado "codon usage" se puede determinar fácilmente sobre la base de evaluaciones computacionales de otros genes conocidos de los respectivos organismos . En una forma de realización especialmente preferida se incorporan en los organismos un ácido nucléico portador de la secuencia SEQ. ID No. 135. También es posible preparar todos los genes mencionados anteriormente, en particular los genes HMG-CoA-reductasa, genes (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, genes l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, genes deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductasa, genes geranil-difosfato-sintasa, genes farnesil-difosfato-sintasa, genes geranil-geranil-difosfato-sintasa, genes fitoen-sintasa, genes fitoen-desaturasa, genes zeta-carotina-desaturasa, genes crtlSO, genes FtsZ o genes inD, en la forma conocida, mediante síntesis guímica a partir de los módulos constructivos nucleótidos, como ser por ejemplo, mediante la condensación de fragmentos de módulos constructivos de ácidos nucléicos individuales, de sobrelapamiento, complimentarios de la doble hélice. La síntesis química de los oligonucléotidos se puede realizar, por ejemplo, en la forma conocida, de acuerdo al método de la fosfoamidita (ver Voet, Voet, 2a. edición, Wiley Press New York, páginas 896-897) . La yuxtaposición o el acoplamiento de los oligonucleotidos y el rellenado de los espacios vacíos utilizando el fragmento Klenow de la ADN-polimerasa y reacciones de unión, como también los procedimientos generales de donación se describen en Sambrook y colaboradores (1989) , Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En otra forma de realización preferida del procedimiento de la invención, las plantas presentan en relación al tipo silvestre o natural una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida. Bajo la expresión de una actividad reducida, tal como se mencionó anteriormente, se entiende preferentemente una supresión o un bloqueo parcial o substancialmente completo, basado en diferentes mecanismos biológicos celulares, de una enzima en una célula de la planta, una planta o en una parte, tejido, órgano, células o semillas de las mismas. La reducción de una actividad en las plantas en comparación con aquella del tipo silvestre o natural, se puede realizar, por ejemplo, mediante una reducción de la cantidad de proteina o de la cantidad de un ARN en la planta. De acuerdo con lo .mencionado anteriormente es posible determinar una actividad reducida en relación a la de la planta silvestre en una forma directa o a través de la determinación de la cantidad de proteina o de la cantidad de ARN de la planta de acuerdo a la ubicación en comparación con el tipo silvestre.
Una reducción de la actividad comprende una reducción cuantitativa de una proteina hasta una falta substancialmente completa de la proteina (es decir, la comprobación de la secuencia de la respectiva actividad o falta de la verificación inmunológica de la correspondiente proteina) . Por actividad endógena beta-hidroxilasa se entiende la actividad enzimática de la beta-hidroxilasa endógena propia de la planta. Por actividad endógena beta-hidroxilasa se entiende la hidroxilasa endógena, propia de la planta, tal como se describió anteriormente por ejemplo la Tagetes errecta en la planta objetivo a ser modificada genéticamente, entonces se entiende por beta-hidroxilasa endógena la beta-hidroxilasa de la Tagetes errecta. De acuerdo con lo anterior, se entiende preferentemente por una beta-hidroxilasa endógenauna proteina propia de la planta, la cual presenta la actividad enzimática capaz de convertir beta-carotina en zeaxantina. En consecuencia, se entiende por una actividad beta-hidroxilasa endógena la cantidad de beta-carotina convertida o la cantidad de zeaxantina formada durante un tiempo determinado por la proteina endógena beta-hidroxilasa. En el caso de una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida en relación a aquella del tipo natural se reduce, por lo tanto, la cantidad de beta-carotina convertida o la cantidad de zeaxantina formada durante un tiempo determinado por la proteina endógena beta-hidroxilasa. Esta reducción de la actividad beta-hidroxilasa endógena asciende a preferentemene por lo menos un 5%, además preferentemente por lo menos un 20%, además preferentemente por lo menos un 50%, además preferentemente por lo meno sun 100%. De particular preferencia, está completamente ausente la actividad beta-hidroxilasa endógena. Sorprendentemente se encontró que en las plantas que producen principalmente carotinoides de la via alfa-carotinoide, como ser por ejemplo, luteina, tales como por ejemplo las plantas de la especie Tagetes (o Tajetes), es conveniente reducir la actividad de la beta-hidroxilasa endógena y aumentar eventualmente la actividad de una hidroxilasa heteróloga. Particularmente preferidas son utilizadas aquí las hidroxilasas ¦ o los equivalentes funcionales de las mismas, provenientes de plantas que producen principalmente carotinoides de la via beta-carotina, como ser por ejemplo, la beta-hidroxilasa del tomate descrita anteriormente (ácido nucléico: SEQ. ID No. 107, proteina: SEQ. ID No. 108) . La determinación de la actividad beta-hidroxilasa endógena se efectúa tal como se describió anteriormente análogamente a la determinación de la actividad hidroxilasa.
La reducción de la actividad beta-hidroxilasa endógena se realiza preferentemente mediante al menos uno de los procedimientos siguientes: a) incorporación de por lo menos una secuencia de ácido ribonucléico beta-hidroxilasa endógena de doble hebra, en lo siguiente también llamada beta-hidrox'ilasa-dsARN, o un casette de expresión o casettes de expresión que permita asegurar su expresión. Está ¦ incluidos aquellos procedimientos en los que la secuencia beta-hidroxilasa-dsARN está dirigida en contra de un gen beta-hidroxilasa (es decir, secuencias ADN genómicas como ser la secuencia del promotor) o un transcripto beta-hidroxilasa endógeno (es decir secuencias de ARN) . b) incorporación de por lo menos una secuencia de ácido ribonucléico antisentido beta-hidroxilasa, en lo siguiente también llamada ARN antisentido-beta-hidroxilasa endógeno, o un casette de expresión que permite asegurar su expresión. Están comprometidos aquellos procesamientos donde el ARN antisentido beta-hidroxidasa endógeno está dirigido en contra de un gen beta-hidroxilasa endógeno (es decir, secuencias ADN genómicas o una transcripción del gen beta-hidroxilasa (es decir, secuencias ARN) . También están comprendidas las secuencias de ácido nucléico alfa-anómeras , c) incorporación de por lo menos un ARN antisentido-beta-hidroxilasa endógena combinada con un ribozima o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, d) incorporación de por lo menos una secuencia ácido ribonucleico-sentido-beta-hidroxilasa, en lo siguiente también denominada ARN sentido-beta hidroxilas endógena, para la inducción de una compresión o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, e) incorporación de por lo menos en factor enlazador de ADN o proteina contra un gen-beta- hidroxilasa endógena, ARN o proteina-beta- hidroxilasa o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, f) incorporación de por lo menos una secuencia ácido nucleico viral productora en la degradación del ARN beta-hidroxilasa o un casette de expresión que permita asegurar su expresión, g) incorporación de por lo menos una construcción para producir una pérdida de función, como ser por ejemplo, la generación de codones de detención o un desplazamiento en el marcador de lectura, en un gen-beta-hidroxilasa endógeno, por ejemplo, para producir la inserción, supresión o deleción, inversión o mutación en un gen-beta-hidroxilasa endógeno. Preferentemente, se pueden generar mutantes "knockout" por medio de la inserción orientad en el mencionado gen- beta-hidroxilasa endógena con recombinación homologa o incorporación de nucleasas específicas de la secuencia en contra de secuencias de genes beta-hidroxilasa.
El técnico en el arte sabe que también es posible aplicar otros procedimientos en el marco de la presente invención para reducir una beta-hidroxilasa endógena o su actividad o función. Así por ejemplo, puede ser ventajoso la incorporación de una variante dominante negativa de una beta-hidroxilasa endógena o un casette de expresión que permite asegurar su expresión. Aquí cada uno de estos procedimientos individuales puede producir una reducción de la cantidad de proteína, la cantidad del mARN y/o la actividad de una beta-hidroxilasa endógena. También se puede pensar en una aplicación combinada. Otros métodos son conocidos por el técnico en el arte y ellos pueden comprender la inhibición o el impedimiento del procesamiento de la beta-hidroxilasa endógena, del transporte de la zeoxantina-epoxidasa y/o de la beta-hidroxilasa endógena o su mARN, inhibición de la fijación de los ribozomas, inhibición del desdoblamiento del ARN, inducción de una enzima degradadora del ARN-beta-hidroxilasa y/o la inhibición de la elongación de traducción o del término de traducción. A continuación se describen los procedimientos individuales preferidos a través de ejemplos de realización. a) incorporación de una secuencia de ácido ribonucleico beta-hidroxilasa endógena de doble hebra (beta-hidroxilasa-dsARN endógena) . El procedimiento de la regulación genética mediante un ARN de doble hebra se describió anteriormente para la reducción de la actividd epsilon-ciclasa, en forma detallada. Este procedimeiento se puede realizar análogamente para la reducción de la actividad beta-hidroxilasa endógena. Bajo una secuencia de ácido ribonucléico-beta-hidroxilasa endógena de doble hebra o también beta-hidroxilasa-dsARN se entiende preferentemente una molécula -ARN que tiene región con una estructura de doble hebra, conteniendo en dicha región una secuencia de ácido nucléico, que a) es idéntica con al menos una parte de la transcripción beta-hidroxilasa endógena propia de la planta y/o, b) es idéntica con al menos una parte de la secuencia promotor-beta-hidroxilasa endógena propia de la planta. En el procedimiento de acuerdo a la invención, con el objeto de reducir la actividd beta-hidroxilasa endógena se incorpora preferentemente en la planta un ARN el cual presenta una región con una estructura de doble hebra, conteniendo en esta región una secuencia de ácido nucléico, la que a) es idéntica con al menos una parte de la transcripción beta-hidroxilasa endógena propia de la planta y/o, b) es' idéntica con al menos una parte de la secuencia promotor-beta-hidroxilasa propia de la planta. Bajo el concepto "transcripción beta-hidroxilasa-endógeno" se entiende la parte transcrita de un gen beta-hidroxilasa endógeno, el cual además de la secuencia que codifica para una beta-hidroxilasa endógena también contiene, por ejemplo, secuencias que no codifican, tales como por ejemplo, UTRs . Bajo la expresión de un ARN "el cual es idéntico con al menos una parte de la secuencia promotor-beta-hidroxilasa endógena propia de la planta" se entiende preferentemente que la secuencia ARN es idéntica con al menos una parte de la transcripción teórica de la secuencia promotor-beta-hidroxilasa endógena, es decir, de la correspondiente secuencia ARN. Bajo la expresión "una parte" de la transcripción beta-hidroxilasa endógena propia de la planta o la secuencia promotor beta-hidroxilasa endógena propia de la planta se entiende secuencias parciales que pueden comprender desde unas pocas pares de bases hasta las secuencias completas de la transcripción o de la secuencia promotora. La longitud óptima de las mencionadas secuencias parciales las puede determinar el técnico a trvés de ensayos de rutina. Por lo general, la longitud de las secuencias parciales comprende por lo menos 10 bases y como máximo 2 kb, preferentemente por lo menos 25 bases y un máximo de 1,5 kb, de particular preferencia por lo menos 50 bases y un máximo de 600 bases, particularmente por lo menos 100 bases y un máximo de 500, de especial preferencia por lo menos 200 bases o por lo menos 300 bases y un máximo de 400 bases. Las secuencias parciales se eligen preferentemente de tal modo que se logra en lo posible una alta especificidad y que no sean reducidas las actividades de otras enzimas, cuya reducción no sea deseada. Por ello es conveniente seleccionar para las secuencias parciales de la beta-hidroxilasa-dsARN endógena partes de la transcripción beta-hidroxilasa endógena y/o secuencias parciales de las secuencias promotor beta-hidroxilasa endógeno, que no aparecen en otras actividades . Por ello, en una forma de realización especialmente preferida de beta-hidroxilasa-dsARN endógeno contiene una secuencia que es idéntica con una parte de la transcripción beta-hidroxilasa endógena propia de la planta, conteniendo el extremo -5' o el extremo -3' del ácido nucléico propio de la planta, que codifica para una beta-hidroxilasa endógena. En particular, son adecuadas las regiones no-traducidas en el 5' o 3' de la transcripción, para preparar estructuras de doble hebra selectivas. Otro objetivo de la invención se refiere a moléculas-ARN de doble hebra (moléculas-dsARN) , las cuales al ser incorporadas en un organismo de la plantas (o en una célula, tejido, órgano o material de reproducción de la misma) producen una reducción de una beta-hidroxilasa endógena . Además, la invención se refiere a una molécula-ARN de doble hebra para reducir la expresión de una beta-hidroxilasa endógena (beta-hidroxilasa-dsARN endógena) , comprendiendo preferentemente, a) una hebra-ARN-v sentido" que comprende al menos una secuencia ribonucleótida, substancialmente idéntica con por lo menos una parte de la transcripción beta-hidroxilasa endógena ARN- "sentido" y b) una hebra-ARN-"antisentido", la que es substancialmente, preferentemente totalmente complementaria con la mencionada hebra-ARN- "sentido" . Para la transformación de la planta con la beta-hidroxilasa-dsARN endógena se utiliza preferentemente una construcción de ácido nucléico, la cual se introduce en la planta y la cual se transcribe en la beta-hidroxilasa-dsARN endógena en la planta. Además, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucléico, susceptible para transcribir en a) una hebra ARN-"sentido", comprendiendo por lo menos una secuencia ribonucléotido, substancialmente, idéntica con por lo menos una parte de la transcripción beta-hidroxilasa endógena-ARN-"sentido", y b) una hebra ARN-"antisentido", la cual es substancialmente, preferentemente totalmente complementaria con la hebra-ARN-"sentido" del ítem (a) .
Estas construcciones de ciclos nucléicos también se denominan a continuación casettes de expresión o vectores de expresión . En relación a la molécula-dsARN se entiende preferentemente por una secuencia de ácido nucléico-beta-hidroxilasa, o de la correspondiente transcripción, la secuencia según SEQ. ID No. 139 o las partes de la misma. La expresión "substancialmente" idéntica significa que la secuencia de ARN también puede llevar inserciones, supresiones o deleciones, como también mutaciones individuales en comparación con la secuencia objetivo de la beta-hidroxilasa, produciendo a pesar de ello una reducción eficiente de la expresión. Preferentemente, la homología es de por lo menos un 75%, más preferentemente por lo menos un 80%, de particular preferencia por lo menos un 90%, en especial un 100% entre un dsARN inhibidor de la hebra "sentido" y al menos una parte de la transcripción ARN-"sentido" de un gen beta-hidroxilasa endógeno, o la hebra "sentido", la hebra complementaria de un gen beta-hidroxilasa endógeno . No es imprescindible tener un 100% de identidad de secuencia entre el dsARN y una transcripción del gen beta-hidroxilasa endógeno, para poder alcanzaruna reducción eficiente de la expresión beta-hidroxilasa endógena. En consecuencia, se tiene la ventaja xxx tolerante en relación a las desviaciones de secuencia, tales como las producidas plr las mutuaciones genéticas, las poli-morfinas o las divergencias por evolución. Asi, por ejemplo, es posible suprimir con el dsARN, generada a partir de la secuencia beta-hidroxilasa endógena de uno de los organismos, la expresión beta-hidroxilasa endógena en otro organismo. Con esta finalidad el dsARN comprende preferentemente regiones de secuencia de las transcripciones de los genes beta-hidroxilasa endógenos, los cuales corresponden a las regiones conservadas. Las mencionadas regiones conservadas se pueden derivar fácilmente a partir de comparaciones de secuencias. En una forma alternativa también es posible definir como secuencia de ácido nucléico una "substancialmente idéntica" del dsARN, la cual es capaz de hibridizar con una parte de una transcripción del gen beta-hidroxilasa endógeno (Ver ejemplo, en 400 mM NaCl , 40 mM PIPES pH 6,4 lmM EDTA a 50 °C a 70 °C durante 12 hasta 16 horas) . La expresión "substancialmente complementario" significa que la hebra ARN-"antisentido" también puede llevar inserciones, supresiones o deleciones, como también mutaciones presentadas en comparación con el complemento de la hebra ARN-"sentido" . La homología asciende a preferentemente por lo menos un 80%, más preferentemente por lo menos un 90%, de particular preferencia por lo menos un 95%, en especial por lo menos un 100% entre la hebra o codón ARN-"antisentido" y el complemento de la hebra o codón ARN-"sentido". En otra forma de realización, la secuencia beta-hidroxilasa-dsARN endógena comprende: a) una hebra o cordón ARN-"sentido", que comprende al menos una secuencia ribonucléotido, substancialmente idéntica al menos una parte de la transcripción ARN-"sentido" de la región promotor de un gen beta-hidroxilasa endógeno, y b) una hebra o cordón ARN-"antisentido", la cual es substancialmente de preferencia totalmente complementaria con la hebra-ARN-"sentido" del ítem (a) . La correspondiente construcción de ácido nucléico, utilizada para la transformación de las plantas, comprende: a) una hebra o cordón ARN-"sentido", substancialmente idéntica con al menos una parte de la región promotor de un gen beta-hidroxilasa endógeno, y b) una hebra o cordón ARN-"antisentido", la cual es substancialmente de preferencia totalmente complementaria con la hebra ADN-"sentido" del Item (a) .
Para preparar secuencias beta-hidroxilasa endógenas destinadas a reducir la actividad beta-hidroxilasa endógena, se utilizan preferentemente, en especial para Tagetes erecta, las siguientes secuencias parciales: SEQ ID No. 141: fragmento sentido de la región 5 -terminal de la beta-hidroxilasa endógena, SEQ. ID NO. 142: fragmento antisentido de la región 5'-terminal de la beta-hidroxilasa endógena.
La secuencia dsARN puede estar constituida de una o más hebras o cordones poliribonucleótidos . Evidentemente, con la misma finalidad, también es posible incorporar en la célula o en el organismo varias moléculas individuales de ds-ARN, cada una de las cuales comprende uno de los tramos de secuencias ribonucleótidas definidas anteriormente. La estructura dsARN de doble hebra o cordón se puede formar, partiendo de dos hebras o cordones ARN separados, complementarios o, preferentemente, partiendo de una sola hebra-ARN, individual, complementaria con si misma. En este caso la hebra ARN-"sentido" y la hebra ARN-"antisentido" son preferentemente covalentes, estando conectados entre si en forma de una "repetición" invertida. Tal como se describe, por ejemplo, en la patente WO 99/53050 la dsARN también puede comprender una estructura de horquilla, en la cual la hebra o el cordón "sentido" se une con el cordón o hebra "antisentido" mediante una secuencia de unión ("linkers", como ser por ejemplo, un intron) . Estas estructura dsARN complementarias con sí mismas, por cuanto ellas requieren solamente la expresión de una secuencia ARN, comprendiendo siempre las hebras o cordones ARN complementarias en una relación equimolar. La secuencia de unión consiste preferentemente en un intron (por ejemplo, un intron del gen ST-LS1 de la papa. Ver Vancanneyt GF y colaboradores (1990) Mol. Gen Genet . 220 (2) : 245-250) . La secuencia de ácido nucléico que codifica para una secuencia de ARN puede contener otros elementos, tales como por ejemplo, señales de término de la transcripción o señales de poliadenilacion. Otras formas de realización adecuadas para la reducción de la actividad beta-hidroxilasa endógena resultan análogamente a las formas de realización preferidas descritas anteriormente en relación a la reducción de la actividad epsilon-ciclasa, con intercambio de la epsilon-ciclasa por la beta-hidroxilasa endógena. En el procedimiento de acuerdo a la invención son especialmente preferidas las plantas modificadas genéticamente, con las siguientes combinaciones de modificaciones genéticas.
Las plantas modificadas genéticamente que presentan, en comparación con el tipo silvestre o natural, una actividad cetolasa aumentada o producida en los pétalos y una mayor actividad hidroxilasa, las plantas modificadas genéticamente, las que presentan en comparación con el tipo silvestre o natural una actividad cetolasa aumentada o producida en los pétalos y una actividad beta-ciclasa aumentada, las plantas modificadas genéticamente, las que presentan, en comparación con el tipo silvestre o natural, una actividad cetolasa aumentada o producida en los pétalos y una actividad epsilon-ciclasa reducida, las plantas modificadas genéticamente las que presentan, en comparación con el tipo silvestre o natural, una actividad cetolasa aumentada o producida en los pétalos y una mayor actividad hidroxilasa y una mayor actividad beta-ciclasa, las plantas modificadas genéticamente las que presenta, en comparación con el tipo silvestre o natural, una actividad cetolasa aumentadao producida en los pétalos y una actividad hidroxilasa aumentada y una actividad epsilon-ciclasa reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la producen en los pétalos de las flores y una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad epsilon-ciclasa reducida, como también las plantas modificadas genéticamente las que en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la presentan en los pétalos y una actividad hidroxilasa y una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad epsilon-ciclasa reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la producen en los pétalos, una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad beta-ciclasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre presentan una actividad cetolasa aumentada o la producen en los pétalos, una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la producen en los pétalos, una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad hidroxilasa- aumentada, plantas modificada genéticamente las que, en comparación con la de tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la producen en los pétalos, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad hidroxilasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan una actividad cetolasa aumentada o la generan en los pétalos, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con aquellas de tipo natural o silvestre, presentan la actividad cetolasa aumentada o la generan en dichos pétalos y una actividad beta-ciclasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con aquellas de tipo natural, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o producida, una actividad e-ciclasa reducida y por lo menos una actividad aumentada adicional, seleccionada del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-disfosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad feranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturasa, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre presentan en los pétalos una actividad-cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad hidroxilasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo silvestre o natural, presentan en los pétalos una actividad aumentada o la generan, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o la generan, una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad beta-ciclasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad hidroxilasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad epsilon-ciclasa reducida y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad hidroxilasa aumentada y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo silvestre o natural, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en las mismas, una actividad beta-ciclasa aumentada, una actividad hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o xxxxxxxx en los mismas, una actividad e-ciclasa reducida, una actividad b-ciclasa aumentada y por lo menos una actividad adicional aumentada, seleccionada del grupo de la actividad HMGA-CoA-reductasa, la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2~enil-difosfato-reductasa y la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reducto isomerasa, la actividd geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad zeta-carotin-desaturasa, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada, una actividad hidroxilasa aumentada y una actividad beta-hidroxilasa reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación co la de tipo silvestre o natural, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad hidroxilasa aumentada, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con las de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, una actividad e-ciclasa reducida, una actividad hidroxilasa aumentada y por lo menos una actividad adicional aumentada, seleccionada del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad e-ciclasa reducida, una actividad b-hidroxilasa endógena reducida y por lo menos una actividad adicional aumentada, seleccionada del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad b-ciclasa aumentada, una actividad hidroxilasa aumentada y por lo menos una actividad adicional aumentada, seleccionada del grupo de la actividad HMG-Coa-reductasa, una actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad b-ciclasa aumentada, una actividad b-hidroxilasa endógena reducida y por lo menos una actividad adicional aumentada seleccionada del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, la actividad (E) -4-hidroxi-3~ metilbut-2-enil-difosf to-reductasa, la actividad 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-difosfato- D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina- desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que en comparación con las plantas de tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad hidroxilasa aumentada y una actividad b-hidroxilasa reducida, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre de plantas, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad e-ciclasa reducida, una actividad b-ciclasa aumentada, una actividad hidroxilasa aumentada y por lo menos una actividad aumentada, -seleccionada del grupo de la actividad HMGA-CoA-reductasa, una actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato- reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, plantas modificadas genéticamente las que, en comparación con el tipo natural o silvestre, presentan en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada en los mismos, una actividad e-ciclasa reducida, una actividad b-ciclasa aumentada, una actividad b-hidroxilasa endógena reducida y por lo menos una actividad adicional aumentada, seleccionada del grupo de la actividad HMG-CoA-reductasa, una actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa, la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa, la actividad l-deoxi-D-xilasa-5-fosfato-reductoisomerasa, la actividad ¦ isopentenil-difosfato-D-isomerasa, la actividad geranil-difosfato-sintasa, la actividad farnesil-difosfato-sintasa, la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa, la actividad fitoen-sintasa, la actividad fitoen-desaturasa, la actividad zeta-carotina-desaturas, la actividad crtlSO, la actividad FtsZ y la actividad MinD, Las plantas modificadas genéticamente especialmente preferidas, presentan en comparación con el tipo silvestre o natural una actividad cetolasa aumentada o generada en los pétalos, una actividad beta-ciclasa aumentada y una actividad hidroxilasa aumentada donde la actividad cetolasa aumentada es producida mediante la incorporación de ácidos nucléicos, capaces de codificar para una proteína, conteniendo la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 2, o una secuencia derivad a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácidos con la mencionada secuencia SEQ. ID No. 2 y que tiene la propiedad enzimática de una cetolasa, la actividad beta-ciclasa aumentada se produce mediante la incorporación de un ácido nucléico, que codifica para una beta-ciclasa, portador de la secuencia aminoácido SEQ. ID No. 110, o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, con una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 110, y la actividd hidroxilasa aumentada se produce mediante la incorporación de ácidos nucléicos, que codifican para una hidroxilasa, portadores de la secuencia SEQ. ID No. 108, o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la sustitución, inserción o supresión (deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 108.
Las plantas modificadas genéticamente especialmente preferidas presentan, en comparación con las de tipo silvestre o natural en los pétalos una actividad cetolasa aumentada o generada, en los mismos, una actividad epsilon-ciclasa reducida, una actividad beta-ciclasa aumentada, una actividad hidroxilasa aumentada y una actividad beta-hidroxilasa endógena reducida, donde, la actividad cetolasa aumentada es producida mediante la incorporación de ácidos nucléicos, los cuales codifican para proteínas, portadores de las secuencia aminoácido SEQ. ID No. 2, o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o la supresión (o deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 2 , y que tiene la propiedad enzimática de una cetolasa, la actividad beta-ciclasa aumentada es producida, mediante la incorporación de ácidos nucléicos, que codifican para una beta-ciclasa, portadores de la secuencia aminoácidos SEQ. ID No. 110, o una secuencia derivada a partir de la misma por medio de la sustitución, inserción o supresión (o deleción) de aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácido con la secuencia SEQ. ID No. 100, la actividad hidroxilasa aumentada es producida, mediante la incorporación de ácidos nucléicos, que codifican para una hidroxilasa, portadores de la secuencia de aminoácidos SEQ. ID No. 108 o una secuencia derivada a partir de la misma mediante la sustitución, inserción o supresión (deleción) de los aminoácidos, la cual presenta una identidad de por lo menos un 20% a nivel de aminoácidos con la secuencia SEQ. ID No. 108 y que produce la actividad epsilón-ciclasa reducida y una actividad beta-hidroxilasa endóqena reducida de acuerdo a las formas de realización preferidas descritas anteriormente. Las plantas modificadas genéticamente pertenecientes a la especie Targetes, tal como se describe a continuación, se pueden fabricar, por ejemplo, mediante la incorporación de construcciones de ácidonucléicos individuales (casettes de expresión) o mediantea construcciones múltiples, que contienen dos, tres o cuatro de las actividades descritas. A continuación se describirá, a modo de ejemplo, la preparación de plantas modificadas genéticamente con una actividad cetolasa aumentada o generada en los pétalos. El aumento de otras actividades, tal como la actividad hidroxilasa y/o la actividad beta-ciclasa y/o la actividad HmG-CoA-reductasa y/o la actividad (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o la actividad 1-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-sintasa y/o la actividad l-deoxi-D-xilosa-5-fosfato-reductoisomerasa y/o la actividad isopentenil-difosfato-D-isomerasa y/o la actividad geranil-difosfato-sintasa y/o la actividad farnesil-difosfato-sintas y/o la actividad geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o la actividad fitoen-sintasa y/o la actividad fitoen-desaturasa y/o la actividad zeta-carotina-desaturasa y/o la actividad crtlSO y/o la actividad FtsZ y/o la actividad Mind-D se pueden efectuar análogamente utilizando secuencias de ácido nucléico que codifican para una hidroxilasa, o beta-ciclasa, ó ácidos nucléicos que codifica para una HmG-CoA-reductasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una (E) -4~hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato-reductasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una l-hidroxi-D-xilasa-5-fosfato-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una isopentenil-difosfato-D-isomerasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una geranil-difosfato-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una farnesil-difosfato-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una geranil-geranil-difosfato-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una fitoen-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una fitoen-sintasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una zeta-carotina-desaturasa y/o ácidos nucléicos que codifican para una proteina crtlSO y/o ácidos nucléicos que codifican para una proteina FtsZ y/o ácidos nucléicos que codifican para una proteina Min-D en lugar de las secuencias de ácido nucleico que codifican para una cetolasa. La reducción de otras actividades, como ser por ejemplo, la reducción de la actividad epsilón-ciclasa o la actividad b-hidroxilasa endógena puede realizarse análogamente utilizando secuencias ácido nucléico anti-epsilón-ciclasa o secuencias de ácido nucléico epsilon-ciclasa- invertida-repetida o mediante la aplicación de secuencias de ácido nucléico b-hidroxilasa anti-endógena o secuencias de ácido nucléico b-hidroxilasa-invertida-repetida en lugar de secuencias de ácido nucléico que codifican para una cetolasa. La transformación puede realizarse en las combinaciones de las modificaciones genéticas en forma individual o con ayuda de construcciones múltiples . La preparación de las plantas transgénicas pertenecientes a la especid Tagetes (o Tajetes) se realiza preferentemente por transformación de las plantas de partida, con una construcción de ácido nucléico, portador de los ácidos nucléicos descritos anteriormente, los cuales codifican para una cetolasa, estando enlazadas funcionalmente con una o varias señales reguladoras, las que permiten esperar la transcripción y traducción en plantas. Estas construcciones de ácido nucléico, donde la secuencia de ácido nucléico codificadora se encuentra enlazada funcionalmente con una o varias señales reguladoras, las que aseguran la transcripción y la traducción en las plantas, también se denominan casettes de expresión. Las señales de regulación contienen preferentemente uno o varios promotores, los cuales aseguran la transcripción y traducción en plantas . Los casettes de expresión contienen señales de regulación, es ' decir, secuencias de ácido nucléico reguladoras, las que controlan la expresión de la secuencia codificadora en la célula hospedante. De acuerdo a una forma de realización preferida, un casette de expresión comprende aguas arriba, es decir, en el extremo 5' de la secuencia codificadora, un promotor, y aguas abajo, es decir, en el extremo 3', una señal de poliadenilación y eventualmente otros elementos reguladores, los que están enlazados operativamente con la secuencia codificadora intermedia para al menos uno de los genes descritos anteriormente. Bajo la expresión "enlazado operativo" se entiende la disposición secuencial del promotor, la secuencia codificadora, terminal y eventualmene otros elementos reguladores, de una forma tal que cada elemento regulador pueda desarrollar su función durante la expresión de la secuencia codificadora, según su finalidad. ? continuación se describen, a modo de ejemplo, las construcciones de ácido nucléico, casettes de expresión 'y vectores preferidos para las plantas pertenecientes a la especie Targes y los procedimientos para producir plantas transgénicas de la especie Tagetes, como asimismo las plantas transgénicas de la especie Tagetes propiamente tales. Las secuencias preferidas en el enlazado operativo, pero sin estar limitadas a éstas, son secuencias objetivo que permiten asegurar la localización subcelular en el agroplasto, en la vacuola, en los plastidios, en la mitocondria, en el retículo endoplasmático (ER) , en el núcleo celular, en el cuerpo oleoso o en otros compartimientos y reforzadores de traducción como ser la secuenciologia 5' del virus de mosaico del tabaco (Galie y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15 (1987), páginas 8693-8711) . Como promotores del casette de expresión son adecuados básicamente cada promotor para ser capaz de controlar la expresión de los genes extraños en las plantas. Por promotor "constitutivo" se entiende aquel promotor que permita la expresión en secuencias, preferentemente en todos los tejidos durante un período prolongado del desarrollo de la planta, preferentemente en todo instante del desarrollo de la planta. Preferentemente se utiliza en particular un promotor de planta o un promotor proveniente de un virus de planta. Particularmente preferido es el promotor de la transcripción 35S del virus del mosaico del coliflor CaMV (Franck y colaboradores (1980) Cell 21:285-294; Odell y colaboradores (1985) Nature, 313: 810-812, Shewmaker y colaboradores (1985), Virology 140:281-288, Gardner y colaboradores (1986), Plant Mol. Biol. 6:221-228) o el promotor 19S CaMV (US 5.352.605; O 84/02913; Benfey y colaboradores (1989) EMBO J 8:2195-2202) . Otro promotor constitutivo adecuado es el promotor pds (Pecker y colaboradres (1992), Proc. Nati. Acad. Sci., USA 89: 4962-4966) o el llamado "Rubisco small subunit (SSU)"- promotor (US 4.962.028), el promotor LeguminB (GenBank No. de acceso X03677), el promotor de la nopalinsintasa del agrobacterium, el promotor doble-TR, del promotor OCS (octopin-sintasa) del agrobacterium, el promotor ubiquitina 1 (Holtorf S. y colaboradores (1995) Plant Mol. Biol. 29: 637-649), el promotor ubiquitina 1 (Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689; Bruce y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 9692-9696) , el promotor Sirias, el promotor alcohol cinámico-hidrogenasa (US 5.683.439), los promotoresde las subunidades vacuolares ATPase o el promotorde una proteina rica en proteina del tipo (WO 91/13991), el promotor Pnit (Y07648.L, Hillebrand y colaboradores (1998), Plant Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrand y colaboradores (1996), Gene, 170, 197-200), como también otros promotores de genes, cuya expresión en las plantas es conocida por el técnico en el arte.
Los casettes de expresión también pueden contener un promotor inducible químicamente (articulo de revisión general: Gatz y colaboradores (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108), mediante el cual se puede controlar la expresión del gen-cetolasa en la planta en un momento determinado. También se pueden utilizar tales promotores, como ser por ejemplo al promotor PRPl (Ward y colaboradres (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366), el promotor inducible mediante el acido salicílico (WO 95/19443) , un promotor inducible por medio de la bencensofulonamida (EP 0 388 186), un promotor inducible mediante tetraciclina (Gatz y colaboradores (1992) Plant J. 2:397-404), un promotor inducible por el ácido abicínico (EP 0 335 528) y un promotor inducible mediante etanol o ciclohexanona (WO 93/21334) . Además, se prefieren los promotores inducidos por medio de la tensión biótica o abiótica, como ser por ejemplo, el promotor inducible patógeno del gen-PRPl (Ward y colaboradres (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366), el promotor hsp70 o hsp80 inducible por calor del tomate (US 5.187.267), el promotor alfa-amilasa inducible mediante el frío de la papa (WO 96/12814), el promotor PRPl inducible por medio de la luz o el promotor pinll inducible por medio de heridas (EP 375091) . Los promotores inducibles patógenos comprenden aquellos inducidos por los genes, como resultado de un ataque patógeno, como ser, por ejemplo, los genes de las proteínas PR, las proteínas SAR, b-1, 3-glucanosa, quitinasa, etcétera (por ejemplo, Rudolfi y colaboradores (1983) Neth J. Plant Pathol. 89:245-254, Uknes y colaboradores (1992) The Plant Cell 4:645-656, Van Loon (1985) Plant Mol. Viral 4:111-116, Marineau y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342, Matton y colaboradores (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342, Somssich y colaboradores (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430, Somssich y colaboradores (1988), Mol. Gen. Genetics 2:93-98, Chen y colaboradores (1996), Plant J 10:955-966, Zhand and Sing (1994) Proc. Nati. Acad. Sci USA 91:2507-2511, Warner y colaboradores (1993) Plant J. 3:191-201, Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968 (1989) . También están comprendidos los promotores individuales por medio de xxxxxxx o interacciones, como ser el gen pinll (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath 28:425-449; Duan y colaboradores (1996) Nat . Biotech. 14:494-498), el gen winl y in2 (US 5.428.148), el gen winl y win2 (Stanford y colaboradores, (1989), Mol. Gen. Genet 215:200-208), de la sistemina (McGurl y colaboradores (1992) Science 225: 1570-1573, del gen winl (Rohmeier y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Ekelkamp y colaboradores (1993) FEBS Letters 323:73-76), del gen-MPI (Corderok y colaboradores (1994) The Plant J6 (2) : 141-150) y otros similares.
Otros promotores adeucados, por ejemplo, los promotores específicos para la maduración de la planta, como ser por ejemplo el promotor específico para la maduración de la planta del tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Los promotores dependientes del desarrollo incluyen, en parte, a los promotores específicos para el tejido, por cuanto la formación de los tejidos individuales por su naturaleza depende del desarrollo. Por otra parte, se prefieren en particular aquellos promotores que permiten asegurar la expresión en los tejidos o en las partes de las plantas, donde se produce por ejemplo la biosíntesis de las ceto-carotinoides o sus etapas previas. Por ejemplo, se prefieren los promotores con especificidad para las antenas, ovarios, pétalos, sépalos, flores, hojas tallas y raíces, y sus combinaciones. Los promotores específicos para los bulbos, las raíces acumuladoras y para las raíces son, por ejemplo, el promotor patatina de la clase I(B33) o el promotor del inhibidor catepsina D de la papa. Los promotores específicos para las hojas son, por ejemplo, el promotor de FBPase citocólico de la papa (WO 97/05900) , el promotor (pequeña subunidad) , el promotor rubisco (ribulosa-1, 5-bifosfatocarboxilasa) o el promotor ST-LSI de la papa (Stockhaus y colaboradores (1989), EMBO J. 8:2445-2451) .
Los promotores específicos para las flores son, por ejemplo, el promotor, fitoen-sintasa (WO 92/16635) o el promotor del gen P-rr (WO 98/22593) o el promotor AP3 de la Arabidopsis thaliana (ver E emplo 1) . Los promotores específicos para las antenas son, pore ejemplo, el promotor 5126 (US 5.689.049, US 5.689.051), el promotor glob-I o el promotor g-zeina. Otros promotores adecuados para la expresión en plantas se describen en las siguientes publicaciones, Rogers y colaboradores (1987), Meth.in Enzymol. 153:253-277, Schardl y colaboradores (1987), Gene 61:1-11 y en Berger y colaboradores (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8402-8406) . Todos los promotores descritos en la presente solicitud permiten generalmente la expresión de la cetolasa en los pétalos de las plantas de la invención. Especialmente preferidos en el procedimiento de la invención son los promotores constitutivos, específicos para las flores y en particular aquellos específicos para los pétalos . La fabricación de un casette de expresión se realiza preferentemente mediante la fusión de un promotor adecuado con un ácido nucléico descrito anteriormente que codifica para una cetolasa y preferentemente un ácido nucléico inserto entre el promotor y la secuencia del ácido nucléico, el cual codifica para un péptido en tránsito especifico para los plastidios, como también una señal de poliadenilación según las técnicas usadas recoxa inantes y de clonación, tales como las descritas en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y iley-Interscience (1987) . Los ácidos nucléicos insertados preferentemente, que codifican para un péptido en tránsito plastidiario aseguran la localización en los plastidios y en especial en las cromoplantas. También es posible utilizar casettes de expresión, cuya secuencia ácido nucléica para una proteina fusión-cetolasa, siendo una parte de la proteina de fusión un péptido en tránsito, el cual controla la translocación del polipéptido. De preferencia, los péptidos en tránsito específicos para las cromoplantas las cuales son escindidas enzimáticamente de la parte cetolasa después de la translocación de la cetolasa en las cromoplantas. Especialmente preferido es el péptido en tránsito derivado de la transcetolasa plastidiaria de la Nicotiana tabac m u otro péptido en tránsito (por ejemplo, el péptido en tránsito de la pequeña subunidad del rubisco (rbcS) o de la oxidoreductasa ferredoxina NADP, como también de la isopentenilpirofosfato isomerasa-2) o su equivalente f ncional . Particularmente preferidas son las secuencias ácido nucléico de tres casettes del péptido en tránsito plastidiario de la transcetolasa plastidiaria del tabanco con tres marcadores de lectura como fragmentos Knpl/BamHI con un codón ATG en el sitio de corte Ncol: pTP09 KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGG-GATCC_BamHI pTPIO KpnI__GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG-GATCC BamHI pTPll KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT- CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG- TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC- GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGG- GATCC BamHI Otros ejemplos del péptido en tránsito plastidiario son el péptido en tránsito de la isopentenil-pirosfosfato-isomerasa-2 (IPP-2) plastidiaria de la Arabisopsis thaliana y el péptido en tránsito de la pequeña subunidad de la ribulosabifosfato carboxilasa (rbcS) de la arveja (Guerinau, F., Woolston, S., Brooks, L., Mullineaux, P. (1988) An expression casette for targeting proteins into the chloroplasts . Nucí. Acids Res. 16:11380). Los ácidos nucléicos de acuerdo a la invención se pueden preparar mediante síntesis u obtenidas por vía natural o ellos pueden contener una mezcla de componentes ácido nucléico sintéticos y naturales, como también están constituidos de diferentes tramos de genes xxxxxxxxx de diferentes organismos. Tal como se describió anteriormente se prefieren las secuencias nucleótidas sintéticas con codones, que son preferidas por las plantas de la especie Tagetes (tajetes) . Estos codones preferidos por las plantas pueden ser determinados de los codones con la mayor presencia de proteínas, las cuales son expresadas en la mayoría de las especies de plantas interesantes. En la preparación de un casette de expresión se pueden manipular diferentes fragmentos -ADN, para obtener una secuencia nucleótida, la cual convenientemente tenga una lectura en la dirección correcta y la cual esté provista de un retículo de lectura correcto. Para la unión de los fragmentos -ADN entre sí se pueden colocar adaptadores o enlazadores ("linker") en los fragmentos. Convenientemente se pueden colocar en las regiones del promotor y terminal, en la dirección de transcripción, un enlazador o un polienlazador ("linker") el cual contiene uno o varios sitios de ventilación para la inserción de esta secuencia. Generalmente, el mencionado enlazador o "linker" tiene 1 hasta 10, generalmente 1 hasta 8, de preferencia 2 hasta 6 sitios de restricción. Generalmente el mencionado enlazador o "linker" tiene dentro de las regiones reguladoras un tamaño inferior a 100 bp, frecuentemente menos que 60 bp, xxxx como mínimo 5 bp. El promotor puede ser natural, es decir, homólogo, como también de tipo extraño o heterólogo con respecto de la planta hospedante. El casettede expresión contiene preferentemente en la dirección de transcripción 5'-3' el promotor, una secuencia codificadora de ácido nucléico o una construcción de ácido nucléico y una región para el término de transcripción. Con diferentes regiones de término se pueden intercambiar a voluntad. Ejemplos de término o terminales son el terminal -35S (Guerineau y colaboradores (1988) Nucí. Acids Res. 16:11380), der nos Terminator (Depicker A., Stachel S., Dhaese P. , Zambryski, P., Goodman HM., Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J. Mol. Appl. Genet. 1982; l(6):561-73) oder der oes Terminator (Gielen, J. de Beuckeleer, M. , Seurinck, J. , Debroek, H. , de Greve, H. , Lemmers, M. van Montagu, M. , Schell, J. (1984) The complete seguence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAchS. EBMO J. 3:835-846) . Además, mediante manipulaciones se pueden proporcionar los sitios de restricción adecuados y eliminar los ADN sobrantes o los sitios de restricción en exceso. En aquellos casos donde sean convenientes las inserciones, las supresiones o deleciones o sustituciones, como ser por ejemplo, las transciones y transversiones, se pueden usar la mutogenesis in vitro, reparación del cebador o partidor", restricción o ligazón. Con ayuda de manipulaciones adecuadas, tales como "una restricción", "chewing-back" o el rellenado de extremos que sobresalen para los llamados "bluntends", se pueden proporcionar extremos complementarios de los fragmentos para efectuar la ligazón. Las señales de poliadenilación preferidas son las señalesde poliadenilación de plantas, preferentemente aquellas que comprenden substancialmente a las señales de poliadenilación-T-ADN del Agrobacterium tumefaciens, en particular del gen 3 del ADN-T (octopin-sintasa) del plásmido-Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835 y siguientes) o los equivalentes funcionales. El traspaso de los genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. Para efectuar la transformación y la regeneración de las plantas a partir de tejidos de las plantas o de las células de las plantas para la transformación transitoria o estable se pueden aprovechar métodos conocidos. Los métodos adecuados para efectuar la transformación de las plantas son la transformación de los protoplastas por medio de la incorporación del ADN inducido por polietilenglicol, el procedimiento xxxxxx con el proyectil o "cañón" de genes, el llamado método de bombardeo en particular, la electroporación, la incubación de embriones xxxxx en una solución portadora de ADN, la microinyección y la transferencia de genes incluida por el agrobacterium, descrito anteriormente. Los mencionados métodos se han descrito, por ejemplo, en B. Jenes y colaboradores, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 y Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant olec. Biol. 42 (1991), 205-225). La construcción a ser expresada se clona preferentemente en un vector, el cual sea adecuado para transformar al Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo el pBinl9 (Bevan y colaboradores, Nucí. Acids Res. 12 (1984), 8711) o especialmente preferidos son los vectores pSUN2, pSUN3, pSUN4, o el pSUN5 (WO 02/00900) . Las agrobacterias transformadas con un plásmido de expresión se pueden emplear en la forma usual para la transformación de las plantas, por ejemplo sumergiendo las hojas dañadas o los trozos de hojas en una solución de agrobacterias y cultivando luego en medios adecuados . En la fabricación preferida de las plantas modificadas genéticamente, a continuación también llamadas plantas transgéncias , se procede a clonar el casette de expresión fusionado, el cual expresa para una cetolasa, en un vector, como ser por ejemplo el pBinl9 o especialmente el pSÜN2, y el cual es adecuado para ser transformado en el Agrobacterium tumefaciens. Las agrobacterias transformadas en tal vector se pueden utilizar entonces, en la forma usual, en la transformación de plantas, en la forma usual, en la transformación de plantas, preferentemente plantas de cultivo, bañando por ejemplo hojas heridas o los trozos de hojas en una solución de agrobacterias y luego cultivadas en medios adecuados. La transformación de las plantas mediante agrobacteriumse ha conocido, entre otras publicaciones, por F.F. hite, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants: in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and ütilization, editado por S.D.Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. A partir de las células transformadas de las hojas o de los trozos de hojas heridas es posible regenerar plantas transgénicas en la forma conocida, las cuales contienen un gen integrado en el casette de expresión para la expresión de un ácido nucléico que codifica una cetolasa. Para la transformación de una planta hospedante de la especie Tagetes con un ácido nucléico que codifica para una cetolasa, se incorpora un casette de expresión a modo de inserción en un vector recombinante, cuyo ADN-vector contiene señales reguladoras funcionales, adicionales, como ser por ejemplo, secuencias para la aplicación o integración. Aquellos vectores que son adecuados se describen, por ejemplo, en la producción ^Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press) , capítulos 6/7, páginas 71-119 (1993) . Mediante la aplicación de las técnicas recombinantesy de clonación citadas anteriormente es posible clonar los casettes de expresión en vectores adecuados, los cuales permiten su multiplicación, por ejemplo, en E. Coli. Los vectores de clonación adecuados son entre otros los siguientes: pJIT117 (Guerinau y colaboradores (1988) Nucí. Acids Res. 16:11380), pBR332, series-püC, series M13mp y pACYC184. Especialmente adecuados son los vectores binarios, los que son capaces de replicar tanto en E. Coli, como en las agrobacterias . Según la elección del promotor, la expresión en los pétalospuede ser constitutiva o preferentemente específica. Las plantas modificadas genéticamene de acuerdo a la invención pertenecientes ala especie Tagetes (o Tajetes) presenta, en comparación con el tipo silvestre o natural, un contenido de astaxantina, preferentemente en los pétalos. Tal como se mencionó anteriormente la invención se refiere al uso de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, o extractos portadores de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, para la administración oral a los animales.
En una forma de realización preferida se utilizan las plantas o sus partes portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos que contienen astaxantina de plantas a partir de las plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes, en la pigmentación de los animales y de los correspondientes productos de los animales. Bajo la expresión extractos portadores de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina se entiende preferentemente soluciones que contienen astaxantina, preparadas mediante la extracción a partir de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina con ayuda de por lo menos un solvente adecuado. Dependiendo del solvente usado y de los procesos de purificación químicas ' y físicas adicionales, se puede obtener la astaxantina con diferentes grados de pureza en el extracto. .Es conveniente prepara las plantas o las partes de las plantas, portadoras de astaxantina antes de la extracción, por ejemplo secar y moler las plantas o las partes de las plantas, donde el orden de dichos procesos puede ser cualquiera o ser indiferente. La astaxantina se puede extraer de las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina, eventualmente secados y/o molidos previamente, con ayuda de solventes orgánicos, como ser por ejemplo, acetona, hexano, cloruro de metileno, metil-butilo terciario-éter o mediante mezclasde solventes como ser etanol/hexano o acetona/hexano . Mediante diferentes relaciones de mezcla de los solventes, es posible variar el efecto de extracción basado en las diferentes polaridades de los solventes. En tal extracción es posible enriquecer la astaxantina hasta una alta concentración. A continuación es posible seguir aumentando la pureza de la astaxantina mediante la agitación de la astaxantina y su separación cromatográfica. Generalmente, la astaxantina se encuentra presente en formade una mezcla de mono- y diéstesis, generalmente como el éster del ácido palmitico. Por "pigmentación" se entiende preferentemente en el marco de la presente invención, la intensificación o la generación de un color al menos en una parte de un animal o en un producto de animal pigmentado en comparación con el animal sin pigmentar. Los colorantes de astaxantina producen una pigmentación o generan o intensifican por lo general una tonalidad rosada o rojo-rosada. Los animales preferidos que se pueden pigmentar mediante la administración oral se eligen del grupo formado por los peces, crustáceos o las aves, preferentemente los galiformes y Anatridae.
Los peces preferidos son los salmónidos, preferentemente el salmón o la trucha. Los crustáceos preferidos son los camarones o cangrejos . Los animales galiformes preferidos son los pollos, patos o gansos.' Los Anatridae preferidos son los flamencos. Dependiendo del animal pigmentado se entiende preferentemente bajo la expresión "productos animales pigmentados" preferentemente la carne de salmón y trucha, el cuero de gallina o pollo, pato o ganso, plumas de gallinas, o pollos, patos, gansos o flamencos y el huevo o la yema de huevo para la gallina, pato o ganso. La administración oral de las plantas o partes de las plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, o los extractos portadores de astaxantina provenientes de las plantas o partes de plantas que contienen astaxantina de la especie Tagetes a los animales puede realizarse en forma directa o a través de la administración oral de preparados de forraje o alimentos animales, con los cuales previamente se han mezclado las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes o los extractos de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes.
En una forma de realización preferida de la invención se mezclan las plantas o las partes de las plantas de la especie Tagetes, portadoras de astaxantina o los extractos de plantas o partes de plantas de la especie Tagetes portadores de astaxantina, con las composiciones de forraje o alimento animal y dichos forrajes o alimentos de administran a los animales por vía oral. Para ello es ventajoso procesar las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina de la especie Tagetes o los extractos portadores de astaxantina de las plantas o de las partes de las plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes antes de ser incorporadas a los preparados de forraje animal en una forma tal, que permite un mezclado con el correspondiente preparado de alimento animal y preferentemente una alta estabilidad y biodisponibilidad de la astaxantina en el respectivo campo de aplicación . Dependiendo del animal al cual se deberá administrar oralmene el alimento y con ello, según el preparado de forraje anima, pueden ser convenientes diferentes etapas de procesamiento. Para las plantas o las partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, en esta forma de realización es conveniente secar y/o moler las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina, preferentemente los pétalos y los botones de flores. De particular preferencia, las plantas o partes de las plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes, se encuentran en forma de polvo. Toda forma de realización de las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, ya sea procesada o sin procesar, se puede mezlcar en la forma usual con los preparados de alimentos o forraje para animales. Para los extractos de las plantas o de las partes de las plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, en esta forma de realización son ventajosas diferentes etapas de procesamiento. En la medida que los solventes residuales aún contenidos sean fisiológicamente aceptables para las respectivos animales, dichos extractos se pueden mezclar directamente con el forraje o alimento animal. Después de evaporar los solventes aún contenidos es posible aplicar los extractos en forma de un producto en polvo o de aceites portadores de astaxantina. Los productos en polvo o los aceties portadores de astaxantina se pueden incorporar, por ejemplo, en aceite de pescado, aplicar sobre materiales portadores o vehículos en polvo, por ejemplo harina de trigo o pétalos molidos de tagetes, o ser incorporados en alginatos, gelatina o en lípidos . Asi, los extractos directos o los extractos procesados se encuentran preferentemente en forma liquida o en polvo. Cualquiera sea la forma de realización del extracto portador de astaxantina de las plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, ya sea procesada o sin procesar, se le puede mezclar en la forma usual con los preparados de alimentos o forraje para los animales . Por lo tanto, la presente invención también se refiere a preparados de alimentos para los animales, que contienen plantas o partes de las plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o los extrctos de plantas o partes de las plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes. Además, , la invención se refiere a un procedimiento para fabricar preparados de alimentos para animales mediante la unión de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, pertenencientes a la especie Tagetes o extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes y los elementos o forrajes para animales usuales.
Una modalidad de realización preferida del procedimiento de la invención se caracteriza porque las plantas o las partes de dichas plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, o los extractos portadores de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, de la especie Tagetes, se procesan antes de su mezclado o incorporación a los alimentos animales, de tal modo de permitir ser reunidos con los preparados alimentos animales. Asi, por ejemplo, xxxx los peces los preparados de alimentos para los peces pueden contener otros componentes usuales de dichos alimentos para los peces, como ser por ejemplo, harina de pescado y / u otras proteínas, aceites, como ser por ejemplo, aceite de pescado, gramíneas, vitaminas, minerales, agentes preservantes y eventualmente medicamentos en las cantidades usuales. Una formulación típica de un alimento para peces destinado a la alimentación de truchas comprende los siguientes componentes: Componente % en peso Cantidad para 500 kg kg Harina de pescado 30,00 150, 00 Grasa poroto soya (total) 20,00 100,00 Almidón de tipo expandióle 18,00 50,00 Mezcla vitaminas 0,80 4,00 Cloruro de colina (50%) 0,20 1,00 Gluten del trigo 20,00 100,00 Sipernat 50S 3,00 15,00 Aceite de pescado 8,00 40,00 Una formulación tipica de un alimento para salmones comprende los siguientes componentes: Componentes % en peso Harina de pescado 75,00 Proteina vegetal 5,00 Gramíneas 7,80 Vitaminas / Minerales 1,00 Antioxidantes / Preservantes 0,20 Aceite de pescado 11,00 De acuerdo a una forma de realización se mezclan las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos provenientes de las plantas o partes de plantas de la especie Tagetes, en el caso de los alimentos para los peces se pueden paletizar en la forma conocida. En una modadlidad especialmente ventajosa, se extruyen. En una forma de realización preferida se incorporan los extractos portadores de astaxantina a los preparados o composiciones de alimentos para animalesen una forma liquida. Esto es especialmente ventajoso en la fabricación de los productos extruidos de alimentos para los peces . El proceso de la extrusión produce una solicitación por extrusión o un "tensionado" de las substancias sensibles, como ser por ejemplo la astaxantina, la cual puede ocasionar una pérdida de astaxantina. En la solicitación o la tensión de extrusión se trata principalmente a la acción de fuerzas mecánicas (amasado, corte, presión, etcétera) , pero también de una tensión hidrotécnica, producida por la incorporación de agua y vapor de agua, pero también se debe tomar en cuenta la tensión por oxidación. Para evitar las pérdidas de astaxantina producidas durante el proceso de extrusión descrito anteriormente, se pueden aplicar extractos líquidos portadores de astaxantina, mediante la llamada técnica PPA, según el proceso de extrusión y secado al vacío (aplicación posterior a la peletización) . En otra forma de realización preferida de la invención se administran oralmente las plantas o las partes de las plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, o los extractos de astaxantina de las plantas o de las partes de las plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, en una forma directa a los animales. En tal modalidad es ventajoso procesar las plantas o las partes de las plantas de la especie Tagetes, portadoras de astaxantina o los extractos de las plantas o de las partes de las plantas que contienen astaxantina, de la especie Tagetes, antes de su administración, a una forma que permita una administración directa a los animales y preferentemente a una alta estabilidad y biodisponibilidad de la astaxantina en el respectivo campo de aplicación. Dependiendo del animal, al cual se deberá administrar oralmente el preparado alimenticio y con ello según el tipo de preparado, pueden ser ventajosas diferentes etapas de procesamiento. Para las plantas o partes de plantas de la especie Tagetes, portadoras de astaxantina, es ventajoso en esta forma de realización secar y/o moler o sub-dividir las plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina, en especial los botones de flores y los pétalos. De especial preferencia, las plantas o partes de las plantas de la especie Tagetes, portadoras de astaxantina, se encuentran en forma de polvo o pulverizada.
Cualquiera que sea la forma de realización utilizada de la planta o partes de la planta de la especie Tagetes, portadoras de astaxantina, ya sea procesada o sin procesar, este se puede administrar oralmente a los animales en la forma conocida. Para los extractos portadores de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas de la especie Tagetes que contienen astaxantina, son ventajosos en esta forma de realización diferentes pasos de procesamiento. Los extractos que contienen astaxantina se pueden administrar directamente por vía oral a los animales, en la medida que los solventes residuales contenidos sean tolerables fisiológicamente para los animales correspondientes . Los extractos se pueden administrar en forma de productos en polvo o de aceites después de haber evaporado los solventes aún contenidos. Los polvos o aceites portadores de astaxantina obtenidos en el proceso se pueden incorporar, por ejemplo, al aceite de pescado, aplicar sobre materiales soportantes o vehículos en polvo o pulverizados, por ejemplo harina de trigo o pétalos de Tajetes molidos, o ser incorporados en alginatos, gelatina o lípidos.
De esta manera, los extractos portadores de astaxantina o los extractos procesados se encuentran preferentemente en forma liquida o pulverizada. Cualquiera que sea la forma de realización de los extractos con astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadores de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, ya sea procesada o sin procesar, estas se pueden administrar por vía oral en la forma conocida a los animales. La invención también se refiere a agentes o productos para pigmentación, portadoras de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina de la especie Tagetes o los extractos de astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes, donde las mencionadas plantas o partes de plantas que contienen astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos de astaxantina de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, se pueden procésar eventualmente tal como se describió anteriormente. En una forma de realización preferida los agentes de pigmentación están constituidos de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes o de extractos portadores de astaxantina de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes, donde las plantas o las partes de plantas que contienen astaxantina de la especie Tagetes o los extractos de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina a la especie Tagetes se pueden procesar opcionalmente tal como se describió anteriormente. En los agentes de segmentación especialmente preferidos se utilizan como partes de las plantas los botones o cabezas de flores o los pétalos. La invención se refiere además a un procedimiento para pigmentar animales o los productos de animales, mediante la administración oral de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientesa la especie Tagetes los extractos de astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes a los animales. La invención se refiere, además, al uso de plantas o partes de planttas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o de laos extractos de astaxantina de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes, como alimento para animales o suplemento de un alimento animal. Los productos para la pigmentación, que contienen plantas o partes de las plantas portadoras de astaxantina o los extractos de astaxantina provenientes de las plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes o los productos alimenticios que contienen estos pigmentos tienen, además, la ventaja de una alta capacidad de almacenamiento y una buena biodisponibilidad del pigmento astaxantina. A continuación se explica detalladamente la invención mediante ejemplos, sin estar limitada a los mismos.
Ejemplo I Preparación de plantas modificadas genéticamente portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes .
Condiciones Experimentales Generales: Análisis secuencial del ADN recombinante La secuenciación de las moléculas de ADN recombinantes se realizó con un secuenciador ADN de fluorescencia láser de la firma Licor (distribuido por MWG Biotech, Ebersbach, Alemania) de acuerdo al método de Sanger (Sanger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74(1977), 5463-5467) .
Ej emplo 1.1.
Amplificación de un cADN, el cual codifica para toda la secuencia primera de la cetolasa de Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille. El cADN que codifica para la cetolasa del Haematococcus pluvialis, se amplificó mediante una reacción PCR del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80 de la "Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Gottingen") en un cultivo en suspensión. Para la preparación del ARN-total a partir de un cultivo den suspensión del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) la cual habla crecido durante 2 semanas en presencia de luz diurna indirecta a temperatura ambiente en el medio de cultivo Haematococcus (1,2 g/1 acetato de sodio, 2 g/1 extracto de levadura, 0,2 g/1 MgC12 x 6 H20, 0,02 Ca Cl2 x 2 ¾0; pH 6,8; después de calentamiento en autoclave se incorporan 400 mg/1 L-asparagina, 10 mg/1 FeS04 x ¾0), se cosecharon las células, se congelaron en nitrógeno líquido y se pulverizaron en un mortero. A continuación se transfirieron 100 mg de las células del alga congeladas, pulverizadas, a un recipiente de reacción, siendo recibidas en 0,8 mi tampón-Trizol (Life Technologies) . La suspensión se extrajo con 0,2 mi de cloroformo. Después de centrifugar durante 15 minutos a 12.000 g se retiró la fracción superior acuosa y se traspasó a otro recipiente de reacción, siendo extraída con un volumen de etanol. El ARN se precipitó con un volumen de isopropanol, se lavó con etanol a 75% y el palet se disolvió en agua DEPC (incubación durante la noche en agua con 1/1.000 volumen de dietilpirocarbonato a temperatura ambiente, luego calentamiento en el autoclave) . La concentración del ARN se determinó por vía fotométrica. Para la síntesis cARN se procedió a desnaturalizar 2,5 mg del ADN-total durante 10 mintuos a 60°C, se enfrió durante 2 minutos sobre hielo y se re-xxxxx con ayuda de un kit cADN (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) de acuerdo a las indicaciones del fabricante aplicando un cebador o partidor antisentido específico en cADN (PRl SEQ. ID No. 29) . El ácido nucléico que codifica para una cetolasa del alga Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) se amplificó mediante una reacción en cadena polimerasa (PCR) a partir del Haematococcus pluvialis diferente, aplicando un cebador específico sentido (PR2 SEQ. ID No. 30) y un cebador específico antisentido (PRl SEQ. ID No. 29) . Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: La reacción PCR para la amplificación del cADN, el cual codifica para una proteína cetolasa formada por la totalidad de la secuencia primaria, se desarrolló en una mezcla de reacción de 50 mi, la cual contenía: 4 mi de un Haematococcus pluvialis cADN (preparado según se describió anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR1 (SEQ. ID No. 29), 0,2 mM PR2 (SEQ. ID No. 30), 5 mi 10X tampón-PCR (TAKARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA). 25,8 mi agua destilada.
La reacción ' PCR se desarrolló bajo las siguiente condiciones del ciclo: IX 2 minutos 35X 1 minuto 2 minutos 3 minutos IX 10 minutos La amplificación PCR con la SEQ. ID No. 29 y la SEQ. ID No. 30, resultó en un fragmento de 1155 Bp, el cual codifica para una proteina formada por la totalidad de la secuencia primaria (SEQ. ID No. 22) . Aplicando métodos estandarizados se procedió a clonar al amplificador en un vector de clonación PCR pGEM-Teasy (Promega) , obteniendo el clon pG ET02.
La secuenciación del clon pGKET02 con el cebador o partidor T7 y el portador SP6 permitió confirmar una secuencia la cual solamente se deferencia en los tres codones 73,114 y 119 en cada una de las bases de la secuencia publicada X86782. Estos intercambios de nucléotidos fueron reproducidos en una experiencia independiente de amplificación, representando asi la secuencia nucleótida en la cepa del alga Haematococcus pluvialis 192.80 utilizada (Figuras 1 y 2, comparaciones de las secuencias) . Por ello se utilizó este clon para la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerineau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380) . La clonación se realizó aislando el fragmento SpHI 1027 Bp del pGEM-Teasy y ligazón en el vector pJIT117 cortado SpHI . El clon que contiene la cetolasa del alga Haematococcus pluvialis es una orientación correcta como fusión traducida N-terminal con el péptido en tránsito rbcs, se denomima JKET02.
Ejemplo 1.2 Amplificación de un cADN, el cual codifica para cetolasa del Haematococcus pluvialis Flotow em.Willie con un N-terminal acortado en 14 aminoácidos. El cADN que codifica para la cetolasa del alga Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) con un N-terminal acortado en 14 aminoácidos, se amplificó mediante una PCR a partir de un cultivo en suspensión del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80 de la "Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Góttingen") . La preparación del ADN-total a partir del cultivo en suspensión del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) se realizó según el Ejemplo 1. La síntesis cADN se efectuó según la descripción del Ejemplo 1. Se amplificó un ácido nucleico que codifica para una cetolasa del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) con un N-terminal acortado en 14 aminoácidos, mediante la reacción en cadena polimerasa (PCR) a partir del Haematococcus pluvialis, utilizado en cebador o partidor sentido especifico (PR3 SEQ: ID No. 31) y un cebador antisentido especifico (PR1 SEQ. ID No. 29) .
Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 4 mi de un cADN del Haematococcus pluvialis (preparado según se describió anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR1 (SEQ. ID No. 29), 0,2 mM PR3 (SEQ. ID No. 30), 5 mi 10X tampón-PCR (TARARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA) , 25,8 mi agua destilada.
La PCR se desarrolló en las siguientes condiciones: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 53 °C 2 minutos 72 °C 3 minutos IX 72 °C 0 minutos La amplificación PCR con la secuencia SEQ. ID No. 29 y la SEQ. ID No. 31 entregó un fragmento de 1111 Bp, el cual codifica para una proteina cetolasa, donde los aminoácidos N-terminales de las posiciones 2-16 se han reemplazado por un solo aminoácido (leucina) . El amplificador se clonó en el vector de clonación PCR-pGEM Teasy (Promega) mediante la aplicación de métodos estandarizados. Los secuenciados con los cebadores o partidores T7 y SP6 confirman una secuencia idéntica con la secuencia SEQ. ID No. 22, en la cual la región -5' (posición 1-53) de la secuencia SEQ. ID No. 22 en el amplificado SEQ. ID No. 24 se reemplazó por una secuencia nonámera diferente a la secuencia. Por ello, se utilizó este clon en la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerineau y colaboradores, 1998, Nucí. Acids Res. 16: 11380). La clonación se efectuó aislando el fragmento 985 Bp SpHI del vector pGEM-Teasy y ligando con el vector pJITH7 cortado SpHI. El clon que contiene la cetolasa del Haematococcus pluvialis con un terminal N acortado en 14 aminoácidos, en una orientación correcta como fusión traducida, N-terminal con el péptido en tránsito rbsc, se denomina pJKET03.
Ejemplo 1.3 Amplificación de un cADN, el cual codifica para la cetolasa del Haematococcus pluvialis Flotow em. Willie (cepa 192.80 de la "Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Góttingen") constituido por toda la secuencia primaria y una señal fusionada C-terminal myc.
El cADN que codifica para la cetolasa del alga Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) formado por la totalidad de la secuencia primaria y la señal myc C-terminal fusionada, se preparó mediante una reacción PCR con aplicación del plásmido pGKET02 (descrito en el Ejemplo 1) y el cebador PR15 (SEQ. ID No. 32) . El cebador PR15 está formado por una región 3' -antisentido especifica (nucléotidos 40 hasta 59) y una región 5' codificador señal-myc (nucléotidos 1 hasta 39) . El desnaturalizado (5 minutos a 95 °C) y el enfriado lento a temperatura ambiente hasta 40 °C del plásmido pGKET02 y del cebador PR15 se realizó en un preparado de reacción de 11,5 mi, el cual contenia. - 1 mg ADN plásmido pGKET02 , 0,1 mg PR15 (SEQ. ID No. 32). El completado de los extremos 3' (30 minutos a 30 °C) se efectuó en un preparado de reacción de 20 mi, el cual contenia: - 11,5 mi pGKET02/PR15-reacción de anulación (preparado tal como se describe anteriormente) , 50 mM dNTPs, 2 mi IX tampón Klenow, - 2 ü enzima Klenow.
El ácido nucléico que codifica para una cetolasa del Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) constituida por toda la secuencia primaria y la señal-myc fusionada C-terminal se amplificó mediante la reacción en cadena polimerasa (PCR) a partir del Haematococcus pluvialis con aplicación de un cebador sentido especifico (PR2 SEQ. ID No. 30), de un cebador antisentido especifico (PR15 SEQ. ID No. 32) . Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes. La PCR para la amplificación del cADN, que codifica paa una proteina cetolasa con señal myc C-terminal fusionada, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia lo siguiente: 1 mi de una reacción de anelación (preparada acuerdo a la descripción anterior) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR15 (SEQ. ID No. 32), 0,2 mM PR2 (SEQ. ID No. 30), 5 mi 10X tampón-PCR (TAKARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA), 25,8 mi agua destilada.
La reacción PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 53°C 2 minutos 72 °C 3 minutos IX 72 °C 0 minutos La amplificación PCR con la SEQ. ID No. 32 y la SEQ. ID No. 30 resultó en un fragmento 1032 Bp, el cual codifica para una proteina, formada por toda la secuencia primaria de la cetolasa del Haematococcus pluvialis como fusión doblemente traducida con el péptido en tránsito-rbcS en el terminal-N y la señal-myc en el terminal C. El amplificado se clonó en el vector de clonación PCR pGE -Teasy (Promega) aplicando para ello métodos estandarizados. Los secuenciales con los cebadores o partidores T7 y SP6 confirmaron una secuencia idéntica con la secuencia SEQ. ID No. 22, donde la región-3' (posición 993 hasta 1155) de la SEQ. ID No. 22 en el amplificado SEQ. ID No. 26 se reemplazó por otra secuencia diferente de 39 Bp. Por ello se utilizó este clon en la clonación en el vector de expresión pJITH7 (Guernineau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380) . La clonación se efectuó aislando al fragmento 1038 Bp EcoRI-SpHl del pGEM-Teasy y ligando con el vector pJIT117 cortado EcoRI-SpHl. Mediante la ligazión se produce una fusión de traducción entre el terminal C de la secuencia del péptido en tránsito rbcS y el terminal N de la secuencia cetolasa. El clon, que contiene la cetolasa Haematococcus pluvialis con la señal-myc C-terminal fusionada en la orientación concreta como fusión de N-terminal traducida con el péptido en tránsito rbcS, se denomina pJKET04.
Ejemplo 1.4 Amplificación de un ADN que codifica para toda secuencia primaria de la cetolasa al Nostoc sp. PCC 7120.
El ADN, que codifica para la cetolasa de Nostoc PCC 1120, se amplificó mediante la reacción PCR a partir del Nostoc PCC 7120 (cepa de la "Colección de Cultivos Pasteur de Cianobacterias") . Para preparar el ADN genómico a partir de un cultivo en suspensión de Nostoc PCC 7120, el cual habla crecido durante una semana en presencia de iluminación permanente y agitación constante (150 rpm) a 25°C en el medio de cultivo BG 12-Medium (1,5 g/1 NaN03, 0, 04 g/1 K2P04 x 3 H20, 0,075 g/1 MgS04 x H20, 0,036 g/1 CaCl2 x 2 H20, 0,006 g/1 ácido cítrico, 0,006 g/1 citrato amonio férrico, 0,001 g/1 EDTA disódico magnesio, 0,04 g/1 a2C03, 1 mi mezcla de trozos metálicos A5+Co (2,86 g/1 H3B03, 1,81 g/1 nCl2 x H20, 0,222 g/1 ZnS04x 7 H20, 0,39 g/1 NaM04 x 2 H20, 0,079 g/1 CuS04 x 5 H20, 0, 0494 g/1 Co( 03)2 x 6 H2, se cosecharon las células mediante centrifugación, se congelaron en nitrógeno liquido y pulverizaron en el mortero.
Protocolo para aislar el ADN de Nostoc PCC7120: A partir de 10 mi de cultivo líquido se peletizaron las células bacterianas mediante centrifugado a 8.000 rpm durante 10 minutos. A continuación se subdividieron y molieron las células bacterianas en nitrógeno líquido en un mortero. El material celular se resuspendió en 1 mi Tris HC1 10 niM (pH 7,5)- y se transfirieron a un recipiente de reacción Eppendorf (volumen de 2 mi) . Después de agregar 100 µ? proteinasa K (concentración: 20 mg/ml) se procedió a incubar la suspensión celular durante 3 horas a 37 °C. A continuación se extrajo la suspensión con 500 µ? fenol. Después de centrifugar durante 5 minutos a 13.000 rpm se transfirió la fase acuosa superior a otro recipiente de reacción Eppendorf de 2 mi. Se repitió 3 veces la extracción con fenol. El ADN se precipitó con ayuda de 1/10 del volumen de acetato de sodio 3M (pH 5,2) y 0,60 volúmenes isopropanol, lavando luego con etanol de 70%. El pellet de ADN se secó a temperatura ambiente, se reactivó en 25 µ? agua y se disolvió calentando hasta 65°C. El ácido nucléico, que codifica para una cetolasa de Nostoc PCC 7120 se amplificó mediante una "reacción en cadena polimeraca" (PCR) a partir de Nostoc PCC 7120 con aplicación de un cebador específico para el sentido (NOSTF, SEQ. ID No. 87) y de un cebador específico antisentido (NOSTG, SEQ. ID No. 88) . Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: La PCR para la amplificación del ADN, el cual codifica para una proteína cetolasa, constituida por la secuencia primaria completa, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 µ?, el cual contenía: 1 mi de un ADN Nostoc PCC7120 (preparado tal como se describió anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM NOSTF (SEQ. ID No. 87), 0,2 mM NOSTG (SEQ. ID No. 88), 5 µ? 10X tampón-PCR (TARARA) , - 0,25 µ? R Taq polimerasa (TAKARA) , 25,8 µ? agua destilada.
La reacción PCR se desarrolló bajo las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 55 °C 1 minuto 72 °C 3 minutos IX 72 °C 10 minutos La amplificación PCR con la SEQ. ID No. 87 y la SEQ. ID No. 88 entregó un fragmento de 805 Bp, el cual codifica para una proteina consistente en toda la secuencia primaria (SEQ. ID No. 89) . Aplicando métodos estandarizados se procedió a clonar el amplificado en el vector de clonación PCR pGEM-T (Promega) obteniendo el clon pNOSTF-G. La secuenciación del clon pNOSTF-G con el cebabor 13F y el cebador o partidor M13R confirmó una secuencia, la cual es idéntica con la secuencia ADN del registro en el banco de datos AP003592. Esta secuencia nucléotida se reprodujo en una experiencia de amplificación independiente, representando asi la secuencia nucleótida en el Nostoc PCC 1120 empleado.
Así, este clon pNOSTF-G utilizó en la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerinau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16; 11380). La clonación se efecutó aislandoel fragmento 1027 Bp Sphldel pGEM-T y lignaod en el vector pJIT117 cortado Sphl . El clon que contiene la cetolasa de Nostoc en la oscilación correcta como fusión de traducción N-terminal con el péptido en tránsito rbcS, se llama pJNOST.
Ejemplo 1.5 Preparación de vectores de expresión para la expresión constitutiva de la cetolasa Haematococcus pluvialis en Tagetes erecta.
La expresión de la cetolasa del alga Haematococcus pluvialis en Tagetes erecta se efectuó bajo el control del promotor constitutivo d35S de Ca V (Franck y colaboradores, 1980, Cell 21: 285-294). La expesión se realizó con el péptido en tránstio rbcS de la arveja (Anderson y colaboradores, 1986, Biolchem J. 240: 709-715). El casette de expresión para la transformación de la cetolasa del Haematococcus pluvialis en Tagetes erecta mediada por el agrobacterium se fabricó con ayuda del vector binario pSUN5 (WO 02/00900) .
Para preparar el vector de expresión -Tagetes pS5KET02 se procedió a ligar el fragmento 2,8 Kb Sacl-Xhol del PJKET02 con el vector pSÜN5 cortado Sacl-Xhol (ver Figura 3, mapa o díagramade construcción) . En la Figura 3 el fragmento d35S (747 bp) , el fragmento rbcS el péptido en tránsito rbcS de la arveja (204 bp), el fragmento KET02 (1027 bp) la totalidad de la secuencia primaria que codifica para la cetolasa del Haematococcus pluvialis, el fragmento term (761 bp) contiene la señal de poliadenilación de CaMV.
Ejemplo 1.5 A Preparación de vectores de expresión para la expresión especifica de flores de la cetolasa del Haematococcus pluvialis en Tagetes erecta. La expresión de la cetolasa del Haematococcus pluvialis en Tagetes erecta se realizó mediante el péptido en tránsito rbcS de la arveja (Anderson y colaboradores, 1986, Biochem. J. 240: 709-715). La expresión se realizó bajo el control de una versión modificada ??3 del promotor AP3 especifico para la flor de Arabidopsis thaliana (AL132971: región nucleótida 9.298 hasta 10.200; Hill y colaboradores (1998) Development 125: 1711-1721) . fragmento de ADN, que contiene la región promotora AP3-902 hasta + 15 de Arabidopsis thaliana r se preparó mediante PCR con aplicación de ADN genómicas (aislado según métodos estandarizados desde Arabidopsis thaliana) y los cebadores PR7 (SEQ. ID No.33) y PR10 (SEQ. ID No. 36) . Las condiciones de la PCR fueron las siguientes : La reacción PCR para la amplificación del ADN, que contiene el fragmento promotor AP3 (-902 hasta + 15) , se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia lo siguiente: 100 ng de ADN genómico de ?. Thaliana, 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 (SEQ. ID No. 33), 0,2 mM PR10 (SEQ. ID No. 36), 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 mi Pfu polimerasa (Stratagene), 25,8 mi agua destilada. reacción PCR se realizó en las siguiente condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La amplificación de 922 Bp se clonó mediante métodos estandarizados en el vector de clonación PCR pCR 2.1 (Invitrogen) , obteniendo el plásmidio pTAP3. Mediante el secuenciado del clon pTAP3 se comprobó una secuencia la que solamente se diferencia en una inserción (un G en la posición 9765 de la secuencia AL132971) y en un intercambio de bases (un G en vez de un A en la posición 5726 de la secuencia AL132971) , de la secuencia publicada ??3 (AL 132971; región nucleótido 9.298 hatas 10.200) . Estas diferencias de nucleótidos se reprodujeron en una experiencia de amplificación independiente, representando asi efectivamente la secuencia nucleótido en las plantas usadas de Arabidopsis thaliana . La versión modificada AP3P se preparó con la ayuda de PCR-recombinante usando el plásmidio pTAP3. La región 10.200 hasta 9.771 se amplificó con los cebadores PR7 (SEQ. ID No. 33) y los cebadores PR9 (SEQ. ID No.35) (amplificado A7/9), la región 9.526 hasta 9.285 se amplificó con los cebadores PR8 (SEQ. ID No. 34) y PR10 (SEQ. ID No. 36) (amplificado A8/10) .
Las condiciones PCR fueron las siguientes: Las reacciones PCR para la amplificación de los fragmentos ADN, que contienen la región 10.200 - 9.771 y la región 9.526 hasta 9.285 del promotor AP3, se realizó en preparados de reacción de 50 al, los cuales contenían: - 100 ng amplificado AP3 (descrito anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 cebador sentido (PR7 SEQ. ID No. 33 ó PR8 - SEQ. ID No. 34) , 0,2 mM cebador antisentido (PR9 SEQ. ID No. 35 ó PR10 SEQ. ID No. 36) , 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , - 0,25 mi Pfu Taq polimerasa (Stratagene), 25,8 mi agua destilada.
La reacción PCR se desarrolló en las siguientes adiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La PCR recombinante comprende un anclado que comprende una secuencia de amplificados A7/9 y A8/10 que trasladan 25 nucleótidos, completado a una doble hebra y luego amplificación. Con ello se forma una versión modificada del promotor AP3, el ??3?, en el cual se han suprimido las posiciones 9.670 hasta 9.526. La desnaturalización (5 minutos a 95 °C) , y un anclado (enfriado lento a temperatura ambiente hasta 40 °C) de ambos amplificados A7/9 y A8/10 se realizó en 17,6 mi de preparado de reacción, el cual contenia: mg del amplificado A7/9 25 mg del amplificado A8/10 El completado de los extremos -3' (30 minutos a °C) se realizó en 20 mi de preparado de reacción, el cual contenia: 17,6 mg de la reacción de anulado gA7/9 y A8/10 (preparado según se describió anteriormente) , 50 mM dNTPs, 2 mi IX tampón Klenow, 2 ü enzima Klenow.
El ácido nucléico que codifica para la versión modificada del promotor AP3P se amplificó mediante un cebador especifico para el sentido (PR7 SEQ. ID No. 33) y el cebador especifico antisentido (PR10 SEQ. ID No. 36) . Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: La reacción PCR para la amplificación del fragmento ??3? se desarrolló en 50 mi del preparado de reacción, el cual contenia: - 1 mi reacción de anelado (preparado según se describió anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 (SEQ. ID No. 33), 0,2 mM PR10 (SEQ. ID No. 36), 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 mi Pfu Taq polimerasa (Stratagene), 25,8 mi agua destilada.
La PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo : 9 °C 2 minutos 9 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 72 °C 10 minutos La amplificación mediante PCR con las secuencias SEQ. ID No. 33 y la SEQ. ID No. 36 resultó en un fragmento de 778 Bp, el cual codifica para versión modificada del promotor AP3P. El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) . La secuenciación con los cebadores T7 y 13 confiró una secuencia idéntica con la secuencia AL132971, región 10.200 hasta 9.298, donde se suprimió la región interna 9.285 hasta 9.526. Por ello se utilizó este clon para la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guernineau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380) . La clonación de efectuó aislando el fragmento 77lBp SacI-HindIII del plásmido pTAP3P y ligando en el vector JIT117 cortado Sacl-HindIII . El clon que contiene el promotor AP3P en lugar del promotor d35S originario, se denomina pJAP3P. Para producir un cassete de expresión pJAP3PKET02 se procedió a clonar el fragmento 1.027 Bp SpHI KET02 en el vector pJAP3P cortado SpHI. El clon que contiene el fragmento KET02 en la orientación correcta como fusión N-terminal con el péptido en tránsito rbcS, se denomina pJAPKET02.
Para preparar un casette de expresión pJAP3PKET04 se procedió a clonar el fragmento 1.032 Bp SpHl EcoRI KET04 (descrito en el Ejemplo 3) en el vector pJAP3P cortado SpHI EcoRI. El clon que contiene el fragmento KET04 en la orientación correcta como fusión N-terminal con el péptido en tránsito rbcS, se denomina JAPKET0 . La preparación de un vector de expresión para la transformación de la cetolasa controlada por AP3P del Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta, mediada por el Agrobacterium, se realizó con ayuda del vector binario pSUNS (WO 02/00900) . Para preparar al vector de expresión pS5AP3 ET02 se procedió a ligar el fragmento 2,8 KB bp Sacl-Xhol del JAP3KET02 con el vector pSUN5 cortado Sacl-Xhol (ver Figura 4, mapa o diagrama de constitución) . En la Figura 4, el fragmento ??3? contiene el promotor modificado AP3P (771 bp) , el fragmento rbcS contiene el péptido en tránsito rbcS de la arveja (204 bp) , el fragmento KET02 (1.027 bp) contiene la totalidd de la secuencia primaria que codifica para la cetolasa del Haematococcus pluvialis, el fragmento term (761 Bp) contiene la señal depoliadenilación de CaMV.
Ejemplo 1.5 B: Preparación de vectores de expresión para la expresión constitutiva de la cetolasa Nostoc sp PCC 7120 en Tagetes erecta.
La epxresión de la cetolasa de Nostoc en Tagetes erecta se realizó bajo el control del promotor constitutivo FNR (Ferredoxin NADPH Oxidoreductasa) de Arabidopsis thalxana . La expresión se realizó con el péptido en tránsito rbcS de la arveja (Anderson y colaboradores, 1986, Biochem J. 240: 709-715) . El fragmento ADN que contiene la región promotor FNR-635 hasta 1 de Arabidopsis thalxana, se preparó mediante la PCR con cristalización del ADN genómico (aislado desde Arabidopsis thalxana según métodos estandarizados) y el cebador FNR-1 (SEQ. ID No. 90) y FNR-2 (SEQ. ID No.91).
Las condiciones de la reacción PCR fueron guientes : 100 ng del ADN genómico de A. Thalxana 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM FNR-1 (SEQ. ID No. 90), 0,2 mM FNR-2 (SEQ. ID No. 91), 5 µ? 10X tampón-PCR (Stratagene), 0,25 mi Pfu polimerasa (Stratagene), 25,8 ral agua destilada.
La reacción PCR se describió bajo las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La amplificación de 653 Bp se clonó mediante métodos estandarizados en el vector de clonación PCR pCR 2.1 (Invitrogen) , obteniendo el plásmidio pFNR. Mediante la secuenciación del clon pFNR se comprobó una secuencia, la cual coincide con un tramo de la secuencia en el cromosoma 5 de Arabidopsis thaliana (registro en el banco de datos AB011474) desde la posición 70.127 hasta la posición 69.493. El gen comienzas en el par de bases 69.492 y se ha anotado como ""Ferredoxina-NADPt Reductasa". Este clon se denomina pFNR y por ello se utilizó en la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerinau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380) . La clonación se efectuó aislando el fragmento 635 bp SacI-HindIII del clon pFNR y ligando en el vector pJITH7 cortado SacI-HindIII . El clon que contiene al promotor FNR en lugar del promotor d35S originario, se denomina pJITFNR. Para producir un casette de expresión Pjfnrnost se procedió a clonar el fragmento 805 bp spHI-NOSTF-G (descrito en el Ejemplo 1) en el vector pJITFNR cortado SpHI. El clon que contiene el fragmento NOSTF-G en la orientación correcta como fusión N-terminal con el péptido en tránsito rbcS, se denomina pJFNRNOST. La preparación de un casette de expresión para la transformación, mediada por el Agrobacterium, del vector de expresión con la cetolasa de Nostoc en Tagetes erecta se realizó con aplicación del vector binario pSÜN5 (WO 02/00900) . Para preparar el vector de expresión Tagetes pS5FNRNOST se procedió a ligar el fragmento 2,4 Kb Sacl-Xhol (hidrólisis parcial Sacl-Xhol) del pJFNRNOST con el vector pSUN5 cortado Sacl-Xhol (Figura 5, mapa o diagrama de construcción) . En la mencionada Figura 5, el fragmento FNR Promotor contiene el promotor FNR duplicado (655 bp) , el fragmento rbcS Transit Peptid contiene el péptido en tránsito rbcS de la arveja (204 bp) , el fragmento NostKetolase (799 bp) contiene toda la secuencia primaria, que codifica para la cetolasa Nostoc, el fragmento 35S Terminator (761 bp) contiene la señal de poliadenilación de CaMV.
Ej emplo 1.5 C Preparación de vectores de expresión para la expresión especifica en las flores de la cetolasa Nostoc sp. PCC 7120 en Tagetes erecta.
La epxresión de la cetolasa de Nostoc en Tagetes erecta se efectuó con ayuda del péptido en tránsito rbcS de la arveja (Anderson y colaboradores, 1986, Biochem. J. 240: 709-715) . La expresión se efectuó bajo el control de una versión modificada AP3P del promotor especifico para las flores AP3 de Arabidopsis thaliana (AL132971: región de nucleótidos 9258-10200; Hill y colaboradores (1998) Development 125: 1711-1721) . El fragmento de ADN que contiene la región promotor a AP3-902 hasta + 15 de Arabidopsis thaliana, se preparó mediante PCR y utilizando ADN genómicas (aisladas mediante métodos extandarizados a partir de Arabidopsis thaliana) como también los cebadores AP31 (SEQ. ID No. 93) y AP3-2 (SEQ. ID No. 94) . Las condiciones PCR fueron las siguientes: La PCR para la amplificación del ADN, el cual contiene el fragmento promotor AP3 (-902 hasta + 15) , se desarrolló en un preparado de reacción de 50 µ?, el cual contenia : 100 ng del ADN genómico de ?. Thaliana, - 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM AP3-1 (SEQ. ID No. 93), 0,2 mM AP3-2 (SEQ. ID No. 94), 5 µ? 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 µ? Pfu polimerasa (Stratagene), - 25,8 µ? agua destilada.
La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La amplificación de 929 Bp se clonó en el vector de clonación PCR pCR 2.1 (Invitrogen) , aplicando métodos estandarizados obteniendo el plásmidio pAP3.
Mediante la secuenciación del clon pAP3 se comprobó una secuencia, la cual solamente se diferencia en una inserción (una G en la posición 9765 de la secuencia AL132971) y un intercambio de bases (una G en vez de una A en la posición 9726 de la secuencia AL132971) de la secuencia AP3 publicada (AL132971, región nucleótido 9298-10200) . Estas diferencias de los nucleótidos fueron reproducidas en una experiencia de amplificación independiente, representando asi la secuencia de nucleótidos efectiva en las plantas utilizadas de Arabidopsis thaliana , La versión modificada AP3P se preparó mediante una PCR recombinante, utilizando el plásmido pAP3. La región 10200-9771 se amplificó con los cebadores AP3-1 (SEQ. ID No. 93) y los cebadores AP3-4 (SEQ. ID No. 96) (amplificado Al/4), la región 9526-9285 se amplificó con los cebadores AP3-3 (SEQ. ID No. 95) y los cebadores AP3-2 (SEQ. ID No. 94) (amplificado A2/3) .
Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: Las reacciones PCR para la amplificación de los fragmentos ADN, las que contienen las regiones 10200-9771 y 9526-9285 del promotor AP3, se desarrollaron en preparados de reacción de 50 µ?, los cuales contenían lo siguiente: 100 ng del amplificado ??3 (descrito anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM cebador antisentido (AP3-1 SEQ. ID No. 93 ó - el AP3-3 SEQ. ID No. 95), 0,2 mM cebador sentido (AP3-1 SEQ. ID No. 96 ó el 1 ??3-2 SEQ. ID No. 94) , 5 µ? 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 µ? Pfu Taq polimerasa (Stratagene), - 25,8 µ? agua destilada.
La reacción PCR se' desarrolloó bajo las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La reacción PCR recombinante comprende el anelado que cubre los amplificadores Al/4 y A2/3, aislados en una secuencia de 25 nucleótidos, completado a una doble hebra y luego amplificación. Con ello se forma una versión modificada del promotor AP3, donde se han suprimido las posiciones 9670-9526. La desnaturalización (5 minutos a 95 °C) y el anelado (enfriado lento a temperatura ambiente hasta 40 °C) de ambos amplificadores Al/4 y ?2/3 se realizó en 17,6 µ? de preparado de reacción, el cual contenia: 0,5 pg del amplificado Al/4 0,25 µg del amplificado A2/3 El completado de los extremos -3' (30 mintuos a °C) se realizó en 20 µ? del preparado de reacción, el cual contenia lo siguiente: 17,6 µ? de la reacción de anelado Al/4 y A2 (preparada de acuerdo a la descripción anterior) , 50 µ? dNTPs, 2 µ? 1 x tampón Klenow, 2 µ? enzima Klenow.
El ácido nucléico que codifica para la versión modificada del promotor AP3P se amplificó mediante la reacción PCR con aplicación de un cebador especifico para el sentido (AP3-1, SEQ. ID No. 93) y un cebador especifico anstisentido (AP3-2, SEQ. ID No. 94).
Las condiciones de la PCR fueron las siguientes : La PCR para la amplificación del fragmento AP3P se desarrolló en un preparado de reacción de 50 µ?, el cual contenia lo siguiente: - 1 mi reacción de anelado (preparado según se describe anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM AP3-1 (SEQ. ID No. 93), - 0,2 mM AP3-2 (SEQ. ID No. 94), 5 µ? 10X tampón-PCR (Stratagene), 0,25 µ? Pfu Taq polimerasa (Stratagene), 25,8 µ? agua destilada.
La reacción PCR se realizó bajo las siguientes condiciones del ciclo: IX 2 minutos 35X 1 minuto 1 minuto 1 minuto IX 10 minutos La amplificación PCR con la SEQ. ID No. 93 (cebador AP3-1) y la SEQ. ID No. 94 (cebador AP3-2) resultó en un fragmento 783 Bp, el cual codifica para la versión modificada del fragmento AP3P. El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) , obteniendo el- plásmido pAP3P. Mediante las secuenciales con los cebadores T7 y M13 se confirmó una secuencia idéntica conla secuencia AL132971, según 10200-9298, donde fue suprimida la región interna 9285-9526. Por ello, se utilizó este con en la clonación en el vector de expresión pJITH7 (Guerineau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380). La clonación se realizó, aislando el fragmento 783 Bp Sacl-HindIII del pAP3P y ligando en el vector pJIT117 cortado Sacl-HindIII . El clon, el cual contiene el promotor AP3P en vez del promotor original d35S, se denomina pJITAP3P. Para fabricar un casette de expresión pJAP3NOST se procedió a clonar el fragmento 805 Bp SpHI NOSTF-G (descrito en el Ejemplo 1) en el vector pJITAP3P cortado SpHI . El clon que contiene el fragmento NOSFT-G con la orientación correcta como fusión N-terminal con el péptido en tránsito rbcS, se denomina pJAP3PNOST. El vector de expresión para la transformación de la cetolasa de Nostoc controlada por el AP3P en Tagentes erecta, medida por el Agrobacteriou se preparó con ayuda del vector binario pSUN5 (WO 02/00900) .
Para preparar el vector de expresión pS5AP3PNOST se procedió a ligar el fragmento 2,6 KB bp Sacl-Xhol (hidrolización paracial Sacl) del vector pS5AP3PNOST, con el vector SÜN5 cortado Sacl-Xhol (Figura 6, mapa o diagrama de construcción) . En la mencionada Figura 6, el fragmento Ap3P contiene el promotor modificado AP3P (783 bp) , el fragmento rbcS contiene el péptido en tránsito rbcS de la arveja (207 bp) , el fragmento NOSTF-G (792 bp) contiene toda la secuencia primaria que codifica para la cetolasa Nostoc, el fragmento term (795 bp) la señal de poliadenilación de CaMV.
Ej emplo 1.6 Fabricación de plantas Targetes (Tajetes) transgénicas Se utilizaron semillas tajetes y se depositaron sobre un medio de cultivo (medio-MS; Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473-497) pH 5,8, 2% sacarosa) . La germinación se produjo condiciones de temperatura / luz / tiempo de 18 hasta 28 °C / 20-200 mE / 3 hasta 16 semanas, pero preferentemente a 21 °C, 20 hasta 70 mE, durante 4 hasta 8 semanas. Se cosecharon todas las hojas de las plantas desarrolladas in vitro hasta ese momento y se cortaron en la dirección transversal con respecto del nervio central. Los explantes de las hojas obtenidos con un término de 10 hasta 60 mm2 se conservaron durante la preparación en un medio MS liquido a la temperatura ambiente durante un máximode 2 horas. Se cultiva cualquier cepa de Agrobacterium tumefaciens, pero preferentemente una cepa extremadamente virulenta, por ejemplo la ???105 con el correspondiente plásmido binario, el cual puede llevar un gen marcador o varios genes "trait" o reporteros (por ejemplo, PS5KET02 y pS5AP3PKET02) , durante la noche y se utiliza para- el co-cultivo con el material de las hojas. El cultivo de la cepa bacteriana puede ser como sigue: Se inocula una colonia única de la correspondiente cepa en YEB (0,1% extracto de levadura, 0,5 % extracto de carne de vacuno, 0,5 % sacarosa, 0,5 % sulfato de magnesio x 7 ¾0) con 25 mg/1 kanamicina y se cultiva a 28 °C durante 16 hasta 10 horas. A continuación se cosecha la suspensión bacteriana mediante centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos y se resuspendió en el medio MS liquido, de tal modo de formar una OD6oo de alrededor de 0,1 hasta 0,8. Esta suspensión se utilizaen el Co cultivo con el material de hojas. Inmediatamente antes del Co cultivo se reemplasa el medio-MS, en el cual se habrán conservado las hojas, por la suspensión de bacterias. La incubación de las hojitas en la suspensión de las agrobacterias se efectuó durante 30 minutos con agitación suave y a temperatura ambiente. A continuación se depositan los explantes infectados sobre un medio-MSA solidificado con agar (por ejemplo 0,8% Plant Agar (Duchefa, NL) con reguladores del crecimiento, como por ejemplo 3 mg/1 benciaminopurina (BAP) y 1 mg/1 ácido indolilacético (IAA) . La orientación de las hojs sobre el medio no tiene importancia. Los explantes se cultivan durante 1 hasta 8 días, pero preferentemente durante 6 dias, donde se pueden aplicar las siguientes condiciones: intensidad luminosa: 30 hasta 80 mMol/m2 x seg, temperatura: 22 hasta 24 °C, cambio de claridad / obscuridad de 16/8 horas. A continuación se ' transfieren los explantes co-cultivados a un medio-MS fresco, preferentemente con los mismos reguladores de crecimiento, donse este segundo medio contiene adicionalmente un antibiótico para suprimir el crecimiento bacteriano. Para esta finalidad es adecuada la timentina en una concentración de 200 hasta 500 mg/1. Como segundo componente selectivo se empleoa uno para seleccionar el éxito de la transformación. La fosfinotricina en una concentración de 1 hasta 5 mg/ml selecciona de manera muy eficiente, pero también son posibles de aplicar otros componentes selectivos según el procedimiento aplicado. Después de una hasta tres semanas se transfirieron los explantes a un medio fresco hasta desarrollar botones de brotes (yemas) y pequeños brotes, los cuales se transfieren luego al mismo medio basal, incluyendo timentina y PPT o componentes alternativos con reguladores del crecimiento, en particular por ejemplo 0,5 mg/ml ácido indolilbutínico (IBA) y 0,5 mg/1 ácido giberilínico GA3, para producir el enraizado. Los brotes con raíz se pueden llevar al invernadero . Adicionalmente al método descrito son posibles las siguientes modificaciones ventajosas: a) antes de infectar los explantes con las bacterias, se les puede pre-cultivar durante 1 hasta 12 días, preferentemente 3 hasta 4 días, sobre el medio para el co-cultivo descrito anteriormente. A continuación se realiza la infección, el co-cultivo y la regeneración selectiva, tal como se describió anteriormente; b) el valor del pH para la regeneración (normalmente 5,8) se puede reducir a 5,2. Conello se mejora el control del crecimiento de las agrobacterias; c) la incorporación de AgN03 (3-10 mg/1) al medio de regeneración mejora al estado del cultivo, incluyendo la regeneración misma; d) aquellos componentes que reducen la formación de fenol, conocidos por el técnico en el arte, como ser por ejemplo, el ácido cítrico, ácido ascórbico, PVP y otros, tienen un efecto positivo sobre el cultivo; e) en todo el procedimiento también se puede emplear un medio de cultivo líquido. El cultivo también se puede incubar sobre vehículos comerciales, colocados sobre el medio líquido.
De acuerdo al método de transformación descrito anteriormente se obtuvieron con las siguientes construcciones de expesión las líneas que se indican: Con pS5KET02 se obtuvo, por ejemplo: csl8-l y csl8-2, con PS5AP3KET02 se obtuvo, por ejemplo: csl9-l, csl9-2 y csl9-3, con pS5FNRNOST se obtuvo, por ejemplo: ms 103-1, ms 103-2, msl03-3, con pS5AP3NOST se obtuvo, por ejemplo: ms 104-1, ms 104-2, msl04-3.
Ejemplo 1.8 Caracterización de las flores de plantas transgénicas Ej emplo 1.8.1 Separación de los ésteres carotinoides en los pétalos de plantas transgénicas Método general de trabajo Con pétalos de plantas transgénicas se pulverizan nitrógeno liquido en un mortero y el polvo de los pétalos (alrededor de 40 mg) se extrae con 100% acetona (tres veces), cada . una con 500 mi) . Se evapora el solvente y los carotinoides se re-suspenden en 100 hasta 200 mi éter de petróleo / acetona (5:1 v/v) .
Los carotinoides se sub-dividen en forma concentrada mediante cromatografía en capa fina (TLC) sobre placas sílica F254 (Merck) en un eluyente orgánico (éter de petróleo / acetona; 5:1) de acuerdo a su xxxxx . Sobre la TLC se rasparon bandas de color amarillo (éster xantofila) , roja (éster cetocarotinoide) y anaranjado (mezcla de ésteres xantofila y ceto-carotinoides) . Los carotinoides fijados sobre sílice se eluyeron tres veces con 500 mi acetona, evapora el solvente y se separan los carotinoides mediante HPLC y se identificaron con ayuda de una columna en fase inversa C3D es posible diferenciar entre los mono-y diésteres carotinodes.
Las condiciones de adhesión en la cromatografía HPLC fueron casi idénticas con un método publicado (Frazer y colaboradores (2000), Plant Journal 24(4): 551-558). Los carotinoides se pueden identificar basado en los espectros UV-V1S.
Ejemplo 1.9 Hidrólisis enzimática de los ásteres carotinoides e identificación de los carotinoides.
Método general de trabajo El material de pétalos molidos en un mortero (50 g hasta 100 mg peso fresco) , se extrae con acetona 100% (tres veces 500 mi; agitando cada vez aproximadamente durante 15 minutos) . Se evaporó el sobrante. A continuación se reciben los carotinoides en 400 mi de acetona (absorción a 475 mm entre 0,75 y 1,25) y se tratan durante 5 minutos en el baño de ultrasonido. El extracto carotinoide se mezcla con 300 mi de solución tampón Tris-HCl de 50 mM (pH 7,0) incubando 5 hasta 10 minutos a 37°C. Luego se agregó 100 hasta 200 mi esterasa-colesterol (solución 6,8 unidades/mi, una esterasa-colesterol de la especie Pseudo monas) . Después de 8 hasta 12 horas se agrega nuevamente 100 hasta 200 mi enzima; la hidrólisis de los ésteres ocurre dentro de 24 horas al incubar a 37 °C. Después de agregar 0,35 g Na2S04 x 10 H20 y 500 mi éter de petróleo se mezcla bien y centrifuga durante 3 minutos a 4.500 g. La fase de de éter de petróleo se extrae y se lava nuevamente con 0,35 g Na2S04 x 10 H20 (anhidro). Se centrifuga durante lminuto a 10.000 g. Se evapora el éter de petróleo y los carotinoides libres se reciben en 100 hasta 120 mi acetona. Los carotinoides libres se pueden identificar mediante cromatografía HPLC y una columna C30 en fase inversa basado en el tiempo de retención y en los espectros ÜV-VIS.
Ejemplo I.10 Preparación de un vector de clonación para fabricar casettes de expresión invertidas-repetidoras para la expresión específica en las flores de epsilon-ciclasa dsADN en Tagetes erecta. La expresión de las transcripciones invertidas-repetidoras constituidas de fragmentos de epsilon-ciclasa en Tagetes erecta se realizó bajo el control de una versión modificada AP3P del promotor específico para las flores AP3 de Arabidopsis thaliana (AL 132971: región de nucleótidos 9298 hasta 10200; Hill y colaboradores (1998, Development 125: 1711 hasta 1721) .
La transcripción invertida-repetidora contiene un fragmento en la orientación correcta (fragmento sentido) y un fragmento con secuencia idéntida con la orientación contraria (fragmento-antisentido) , las cuales están conectadas entre si mediante un intron funcional, el intron PIV2 del gen ST-LHl de la papa (Vancanneyt G. y colaboradores (1990), Mol. Gen. Genet . 220: 245-50) . Los cADN, que codifican para el promotor AP3 (-902 hasta +15) de Arabidopsis thaliana, se preparó mediante PCR con aplicación de ADN genómicas (aislados estandarizados) y los cebadores PR7 (SEQ. ID No. 49) y el cebador PR10 (SEQ. ID No. 52) . Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: La PCR para la amplificación del ADN que codifica para el fragmento promotor-AP3 (-902 hasta + 15) se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia : 1 mi ADN genómico de A. thaliana (diluido en la proporción 1:100, tal como se describió anteriormente) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 (SEQ. ID No. 49), 0,2 mM PR10 (SEQ. ID No. 52), - 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 mi Pfu Taq polimerasa (Stratagene) , 25,8 mi agua destilada.
La reacción PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94°C 1 minuto 50°C 1 minuto 72°C 1 minuto IX 72°C 10 minutos La amplificación de 922 Bp se clonó, mediante métodos estandarizados en el vector de clonación PCR pCR2.1 (Invitrogen) , obteniendo el .plásmido pTAP3. La secuencia del clon pTAP3 confirmó una secuencia la cual solamente se diferencia de la secuencia publicada AP3 (AL132971, región nucleótido 9298 hasta 10200) , en una inserción (una G en la posición 9765 de la secuencia AL132971) y en un intercambio de bases (una G e vez de una A en la posición 9726 en la secuencia AL132971) (En AP3, posición 33: T en vez de G; posición 55: T en vez de G) . Estas diferencias de nucleótidos fueron reproducidas en una experiencia de amplificación independiente, representando asi la secuencia nucleótida en la planta usada Arabidopsis thaliana .
La versión modificada AP3P se preparó mediante la secuencia PCR recom inante utilizando el plásmido pTAP3. La región 10200 hasta 9771 se amplificó con dos cebadores PR7 (SEQ. ID no. 49) y los cebadores PR9 (SEQ. ID no. 51) (Amplificado A7/9) , la región 9526 hasta 9285 se amplificó con el cebador PR8 (SEQ. ID No. 50) y PR10 (SEQ. ID No. 52) (amplificado A8/10) . Las condiciones PCR fueron las siguientes: Las reacciones PCR para la amplificación del fragmento ADN, el cual codifica para las regiones 10200 hasta 9771 y 9526 hasta 9285 del promotor AP3, se desarrollaron en preparados de reacción de 50 mi, las cuales contenían: 100 ng amplificado AP3 (descrito anteriormente) , - 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 (SEQ. ID No. 49) ó PR8 (SEQ. ID No. 50), 0,2 mM PR9 (SEQ. ID No. 51) ó PR10 (SEQ. ID No. 52) , 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , - 0,25 mi Pfu Taq polimerasa (Stratagene), 25,8 mi agua destilada.
La PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94°C 2 minutos 35X 94°C 1 minuto 50°C 1 minuto 72°C 1 minuto IX 72°C 10 minutos La reacción PCR recombinante comprende el anelado que se extiende sobre los amplificados A7/9 y A8/10 trasladados en 25 nucleótidos, completado en una hebra doble y luego amplificado. Con ello se forma una versión modificada del promotor AP3, denominado ??3?, en el cual se han suprimido las posiciones 9670 hasta 9526. La desnaturalización (5 minutos a 95 °C) y anelado (enfriado lento hasta 40°C a temperatura ambiente) de ambos amplificados A7/9 y A8/10 se realizó en un preparado de reacción de 17,6 mi, el cual contenia: 0,5 mg amplificado A7/9 - 0,25 mg amplificado A8/10 El reliando de los extremos-3' (30 minutos a 30°C) se realizó en 20 mi del preparado de reacción, el cual contenia : 17,6 mi reacción de anelado A7/9 y A8/10 (preparado de acuerdo a la descrición anterior) , 50 mM dNTPs, 2 mi IX tampón Kleno , - 2 ü enzima Klenow.
El ácido nucléico que codifica para la versión promotora modificada AP3P se amplificó mediante la PCR con amplificación de un cebador especifico sentido (PR7 SEQ. ID No. 49) y un cebador específico antisentido (PR10 SEQ. ID No. 52) . Las condiciones PCR fueron las siguientes: La PCR para la amplificación del fragmento AP3P se realizó en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenía: 1 mi reacción de anelado (preparada según la descripción anterior) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR7 (SEQ. ID No. 49), 0,2 mM PR10 (SEQ. ID No. 52), 5 mi 10X tampón-PCR (Stratagene) , 0,25 mi Pfu Taq polimerasa (Stratagene), 25,8 mi agua destilada.
La PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La amplificación PCR con el cebador PR7, SEQ. ID No. 49 y el PR10 SEQ. ID No. 52 resultó en un fragmento de 778 Bp, el cual codifica para la versión modificada del promotor AP3P. El amplificador se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) . La secuenciación con los cebadores T7 y Mi3 confirmó una secuencia idéntica con la secuencia AL132971, región 10200 hasta 9298, donde se suprimió la región interna 9285 hasta 9526. Por ello, se utilizó este clon para la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerineau y colaboradores, 1988, Nucí. Acids Res. 16: 11380). La clonación se efectuó aislando el fragmento 771 Bp Sacl-HindIII del pTAP3P y ligando en el vector pJIT117 cortado Sacl-HindIII . El clon, que contiene al promotor AP3P en vez del promotor original d35S, se denomina pJAP3P.
Se preparó un fragmento ADN, el cual contiene el intron-PIV2 del gen ST-LS1 mediante la reacción PCR utilizando el plásmido ADN p35SGUS INT (Vancanneyt G. y colaboradores (1990), Mol. Gen. Genet. 220: 245-50) como también el cebador PR40 (SEQ. ID No.54) y el cebador PR41 (SEQ. ID No. 55) . Las condiciones PCR fueron las siguientes: La PCR para la amplificación de la secuencia del intron PIV2 del gen ST-LS1, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia: lml p35SGUS INT, 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR40 (SEQ. ID No. 54), - 0,2 mM PR41 (SEQ. ID No. 55), 5 mi 10X tampón-PCR (TAKARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA), 25,8 mi agua destilada.
La PCR se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 72 °C 10 minutos La amplificación PCR con los cebadores PR 40 y PR 41 resultó en un fragmento 206 Bp. Mediante la aplicación de métodos estandarizados se clonó el amplificado en el vector de clonación PCR pBluntlI (Invitrogen) , obteniendo el clon pBluntII-40-41. La secuenciación de este clon con el cebador SP6 confirmó una secuencia, la cual es idéntica con la correspondiente secuencia del vector p35SGüS INT. Por ello se empleó este clon en la clonación en el vector pJAP3P (descrito anteriormente) . La clonación se realizó aislando el fragmento 206 Bp SalI-BamHI del pBluntII-40-41 y ligando con el vector pJAP3P cortado o mencionado SalI-BamHI . HI clon que contiene el nitron PIV2 del gen ST-LS1 con la orientación correcta a continuación del extremo-3' del péptido en tránciso rbcs, se denomina pJAIl, siendo adecuado para preparar casettes de expresión para la expresión especifica de la flor de transcripción invertidas repetidoras. En la Figura 7, el fragmento AP3P contiene el promotor modificado ??3? (771 bp) , el fragmento rbcS contiene el péptido en tránsito rbcS de la arveja (204 bp) , el fragmento nitron contiene el nitron PIV2 del gen de la papa ST-LS1 y el fragmento term (761 Bp) contiene la señal de poliadenilación de CaMV.
Ejemplo 1.11 Preparación de casettesde expresión invertidas repetidoras para la expresión especifica para las flores del epsilon-ciclasa dsARN en Tagetes erecta (dirigida en contra de la región-5' del cADN epsilon ciclasa) . El ácido nucléico que contiene la región 5' terminal 435bp del cADN epsilon-ciclasa (No. de acceso del banco de genes No. AF251016) se amplificó mediante reacción en cadena polimerasa (PCR) del cADN Tagetes erecta con aplicación de un cebador especifico para el sentido (PR42 SEQ. ID No. 56) y de un cebador específico para el antisentido (PR43 SEQ. ID No. 57). La región 5'-terminal 435 bp del cADN epsilon-ciclasa de Tagetes erecta está formada por la secuencia no traducida 5' 138 bp (5'UTR) y los 297 bp de la región codificante para el correspondiente terminal-N. Para la preparación del ARN-total a partir de las flores de Tagetes se colocaron 100 mg de las flores pulverizados, congelados en un recipiente de reacción y se recibieron en 0,8 mi de regulador de pH Trizol (Life Technologies). La suspensión se extrajo con 0,2 mi cloroformo. Después de centrifugar durante 15 minutos a 12.000 y se retiró la fracción acuosa sobrenadante y se transfirió a otro recipiente de reacción, extrayendo con un volumen de etanol. El ARN se precipitó con un volumen isopropenol, se lavó con 75% etanol y el pelet se disolvió en agua DEPC (incubación durante la noche en agua con 1/1.000 del volumen dietilpirocarbonato a temperatura ambiente, luego calentamiento en auto clave) . La concentración del ARN se determinó fotométricamente . Para la síntesis cADN se desnaturalizaron 2,5 mg del ARN-total durante 10 minutos a 60 °C, luego se enfriaron durante 2 minutos sobre hielo y se transcribieron en cADN con ayuda de un Bit-cADN (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y empleando un cebador especifico antisentido (PR17 SEQ. ID No. 53) . Las condiciones de las reacciones PCR siguientes fueron las siguientes: La PCR para la amplificación del fragmento -ADN PR42-PR43, portador de la región 435 bp 5 'terminal de la epsilon-ciclasa, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenía: 1 mi cADN (preparado de acuerdo a la descripción anterior) , 0,25 mM dNTPs, - 0,2 mM PR42 (SEQ. ID No. 56), 0,2 mM PR43 (SEQ. ID No. 57), 5 mi 10X tampón-PCR (TARARA) , .0,25 mi R Taq polimerasa (TARARA), 25,8 mi agua destilada.
La PCR para la amplificación del fragmento -ADN PR44-PR45, portador de la región 5' terminal 435 bp de la epsilon-ciclasa, se realizó en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia: 1 mi cADN (preparado de acuerdo a la descripción anterior) , 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR44 (SEQ. ID No. '58), 0,2 mM PR45 (SEQ. ID No. 59), 5 mi 10X tampón-PCR (TARARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TARARA), 25,8 mi agua destilada.
Las reacciones PCR se realizaron en las siguientes condiciones del ciclo: 94 °C 2 minutos 94 °C 1 minuto 58 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 72 °C 10 minutos La amplificación PCR con los cebadores PR42 y PR43 resultó en un fragmento de 443 Bp, la amplificación PCR con los cebadores PR44 y PR45 resultó en un fragmento de 444 Bp. Los dos amplificados, el fragmento PR42-PR43 (HindIII-Sall-sentido) y el fragmento PR44-PR45 (EcoRI-BamHI antisentido) se clonaron, mediante métodos estandarizados en el vector de clonación PCR pCR-BluntlI (Invitrogen) . La secuenciación con el cebador SP6 confirmó en cada caso una secuencia idéntica con la secuencia publicada AF251016 (SEQ. ID No. 38), a excepción de los sitios de restricción introducidas. Por ello se usaron estos clones en la preparación de una construcción invertida-repetidora en el vector de clonación pJAPl (Ver ejemplo 1.10) . La primera etapa de la clonación consistió en aislar el fragmento 444 Bp PR44-PR45 BamHI-EcoRI del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) y ligando en el vector pJAIl seccionado BamHI-EcoRI. El clon portador de la región 5' terminal de la epsilon-ciclasa en la orientación antisentido, se denomina pJAI2. Mediante la ligazón se forma una fusión transcripcional entre el fragmento antisentido de la región terminal 5' de la epsilon ciclasa y la señal de poliadenilación de CaMV. La segunda etapa de la clonación se realizó aislando el fragmento 443 Bp PR42-PR43 HindIII-SalI del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) y ligando con el vector pJAI2 secuenciado HindIII-SalI . El clon, portador de la región 435 Bp 5' terminal de la epsilon-ciclasa cADN con la orientación sentido se denomina JAI3. A través del ligado se forma una fusión transcripcional entre el AP3P y el fragmento sentido de la región 5' terminal de la epsilon-ciclasa. Para preparar un casette de expresión invertido-repetidor bajo el control del promotor -CHRC se procedió a amplificar un fragmento promotor -CHRC, empleando ADN genómicos de la petunia (preparado mediante métodos estandarizados) y los cebadores PRCHRC5 (SEQ. ID No. 76) y PRCHRC3 (SEQ. ID No. 77) . El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) . El secuenciado del clon resultante pCR2.1-CHCR con los cebadores M13 y T7 confirmó una secuencia idéntica con la secuencia AF099501. Este clon se usó por ello en la clonación en el vector de expesión pJAl3. La clonación se efectuó aislando el fragmento 1537 bp SacI-HindIII del clon pCR2.1-CHRC y ligando en el vector pJAI3 cortado o restringido SacI-HindIII . El clon portador del promotor CHRC en lugar del promotor original AP3P, se denomina pJCI3. La preparación de los vectores de expresión para la transformación mediada por el Agrobcterium de la transcripción invertida-repetida controlada por el CHRC o el AP3P, en Tagetes erecta se realizó utilizando el vector binario pSÜN5 (WO 02/00900) . Parar preparar el vector de expresión pS5AI3 se procedió a ligar el fragmento 2622 bp Sacl-Xhol del pJAl3 con el vector pSUN5 Sacl-Xhol (ver Figura 8, mapa o diagrama de construcción) . En la Figura 8, el fragmento AP3P contiene el promotor modificado AP3P (771 bp) , el fragmento 5sense contiene la región-5' de la espsilon-ciclasa de Tagetes erecta (435 bp) en la orientación sentido, el fragmento intron contiene el nitron PIV2 del gen de la papa ST-LSl, el fragmento 5anti contiene la región-5' de la epsilon-ciclasa de Tagetes erecta (435 bp) en la orientación antisentido, y el fragmento term (761 Bp) contiene la señal de poliadenilación de CaMV. Para preparar al vector de expresión pS5CI3 se procedió a ligar el fragmento 3394 bp Sacl-Xhol del pJCl3 con el vector pSÜN5 seleccionado Sacl-Xhol (Figura 9, diagrama constructivo) .
En la mencionada Figura 9 el fragmento CHRC cointiene el promotor (1537 bp) , el fragmento 5sense contiene la región-5' de la epsilon-ciclasa de Tagetes erecta (435 bp) en la orientación sentido, el fragmento interior contiene el intron PIV2 del gen de la papa ST-LS1, el fragmento 5anti contiene la región-5' de la epsilon ciclasa de Tagetes erecta (435 bp) en la orientación antisentido, el fragmento tena (761 Bp) contiene la señal de poliadenilacion de CaMV.
Ejemplo 1.12 Preparación de un casette de expresión invertido-repetidor para la expresión especifica para la flor del epsilon-ciclasa de ARNs en Tagetes erecta (dirigido en contra de la región 3' del cADN epsilon-cilcasa) . El ácido nucléico que contiene la región 3 'terminal (384 bp) del cADN epsilon-ciclasa (No. de acceso del banco de genes No. AP251016) se amplificó mediante una reacción en cadena polimerasa (PCR) del cADN de Tagetes erecta con aplicación de un cebador especifico para el sentido (PR46 SEQ. ID No. 60) y de un cebador especifico antisentido (PR47 SEQ. ID No. 61) . La región 3' terminal (384 bp) del cADN epsilon-ciclasa de Tagetes erecta está constituido por la secuencia 3'-no traducida ((3'UTR) y de 140 bp de la correspondiente región codificante C-terminal de 244 bp.
La preparación del ARN-total de las flores de Tagetes se realizó de acuerdo al Ejemplo 1.11. La síntesis del cADN se realizó según el Ejemplo 1.11, empleando un cebador especifico antisentido PR117 (SEQ. ID No. 53) . Las condiciones de las reacciones PCR siguientes fueron las siguientes: La PCR para la amplificación de fragmento-ADN PR46-PR47), que contiene la región 3'terminal 384 bp de la epsilon-ciclasa, se desarrolló en un preparado de 50 mi de reacción, el cual contenía lo siguiente: 1 mi cADN (preparado según la descripción anterior) , - 0,25 mM dNTPs, 0,2 mM PR46 (SEQ. ID No. 60), 0,2 mM PR47 (SEQ. ID No. 61), 5 mi 10X tampón-PCR (TARARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA) , - 25,8 mi agua destilada.
La PCR para la amplificación del fragmento ADN-PR48-PR49, portador de la región 5' terminal de 384 bp de la epsilon-ciclasa se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenía. 1 mi cADN (preparado según la descripción anterior) , 0,25 mM dNTPs, - 0,2 mM PR48 (SEQ. ID No. 62), 0,2 mM PR49 (SEQ. ID No. 63), 5 mi 10X tampón-PCR (TARARA) , 0,25 mi R Taq polimerasa (TARARA), 25,8 mi agua destilada.
Las reacciones PCR se desarrollaron en las siguientes condiciones del ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94 °C 1 minuto 58 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto IX 72 °C 10 minutos La amplificación con la SEQ. ID No. 60 y la SEQ. ID No. 61 resultó en un fragmento de 392 Bp y la amplificación con la SEQ. ID No. 62 y la SEQ. ID No. 63 resultó en un fragmento de 396 Bp. Se clonaron los dos amplificados, el fragmento PR46-PR47 y el fragmento PR48-PR49, mediante métodos estandarizados en el vector de clonación PCR pCR-BluntlI (Invitrogen) . La secuenciación con el cebador o partidor SP6 confirmó en todos los casos una secuencia idéntica con la secuencia publicada AF251016 (SEQ. ID No. 38), salvo los sitios de restricción introducidos. Por ello se emplean estos clones en la preparación de una construcción invertida-repetidora en el vector de clonación JAIl (Ver Ejemplo 1.10) . La primera etapa de clonación se efectuó aislando el fragmento 396 Bp PR48-PR49 BamHI-EcoRI del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) y ligando en el vector pJAIl seccionando BamHI-EcoRI . El clon que contiene la región 3 'terminal de la epsilon-ciclasa en la orientación antisentido, se denomina pJAl4. Mediante el ligado se produce una fusión transcripcional entre el fragmento antisentido d ela región 3 'terminal de la epsilon-ciclasa y la señal de poliadenilación de la CaMV. La segunda etapa de clonación se realizó aislando el fragmento 392 BpPR46-PR47 HindIII-SalI del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) y ligando con el vector pJAl4 seccionado HindIII-SalI . El clon que contiene la región 3 'terminal de 392 Bp del cADN epsilon ciclasa en la orientación sentido, se denomina pJAl5. Mediante la ligazón se forma una posición transcripcional entre el AP3P y el fragmento-sentido de la región 3 'terminal de la Epsilon-ciclasa . El vector de expresión para la transformación de la transcripción inversa-repetida controlada por el AP3P, mediada por el Agrobacterium, en Tapetes erecta, se preparó con ayuda del vector binario pSÜN5 (WO 02/00900) . Para preparar el vector de expresión pS5AI5 se procedió a ligar el fragmento 2523 bp Sacl-Xhol del pJAI5 con el vector pSUN5 cortado Sacl-Xhol (Figura 10, diagrama) . En la figura 10, el fragmento AP3P contiene el promotor modificado AP3P (771 bp) , el fragmento 3 sentido contiene la región-3' de la epsilon-ciclasa de Tapetes erecta (435 bp) en la orientación sentido, de fragmento intrón contiene el intrón IV2 del gen de la papa ST-LS1, el fragmento3 anti contiene la región -3' de la epsilon-ciclasa de Tapetes erecta (435 bp) en una orientación anti-sentido, y el fragmento terminal (761 Bp) contiene la señal de poliadenilación de CaMV.
Ejemplo I. 13 Clonación del promotor, epsilon-ciclasa. Se aisló un fragmento de 199 bp o el fragmento de 312 bp del promotor epsilon-ciclasa mediante dos estrategias de clonación independientes, PCR inversa (adaptada según Long y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 90: 10370) y TAIL-PCR (Liu Y-G y colaboradores (1995) Plant J. 8. 457-463) con aplicación de ADN genómico (aislado a partir de Tapetes erecta, linea orangenprinz, según métodos estandarizados) . Para el preparado de la PCR-inversa se digirieron 2 ug de ADN genómico en 25 ul de preparado de reacción con EcoRV y Rsal, diluyendo luego hasta 300 mi y volviendo a ligar durante la noche a 16°C con 3U ligasa. Con ayuda del cebador PR50 (SEQ ID No. 64) y PR51 (SEQ ID No. 65) se preparó mediante amplificación -PCR un fragmento, el cual contiene en la orientación sentido, 354 bp del CADN epsilón ciclasa (No. de acceso Genbank AF 251016), liquido con 300 bp del promotor epsilón-ciclasa, como también 70 bp de la región 5' terminal del CADN epsilón-ciclasa (Ver figura 11) . Las condiciones de la PCR fueron las siguientes; La PCR para la amplificación del fragmento ADN PR50-PR51, el cual entre otros contiene el fragmento promotor de 312 bp de la epsilón-ciclasa, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia: -1 mi preparado para ligar (preparado de acuerdo a la descripción anterior) . - 0,25 mM de dNTPs - 0,2 mM PR50 (SEQ FD No.64) - 0,2 mM PR51 (SEQ ID No. 65) - 5 mi 10 X tampón-PCR (TARARA) - 0,25 mi R Taq polimerasa (TAKARA) 28,8 mi agua destilada Las reacciones -PCR se desarrollaron en las siguientes condiciones del ciclo: I X 94°C 2 minutos 35 X 94°C 1 minuto 53 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 1 X 72 °C 10 minutos La amplificación -PCR con los cebadores PR50 y PR51 resultó en un fragmento de 734 Bp, el cual entre otros contiene el fragmento promotor 312 bp de la epsilon ciclasa (ver Figura 11) . El amplificado se clonó mediante métodos estadarizados en el vector de clonación -PCR pCR2.1 (Invitrogen) . La secuenciación con los cebadores M13 y T7 indicó la secuencia SEQ No. 45. Esta secuencia se reprodujo en una experiencia de amplificación independiente, representando asi la secuencia nucleótida en la linea Orangenprinz de Tapetes erecta usado. Para el preparado TAAIL-PCR se realizaron tres reacciones sucesivas -PCR cada una con diferentes cebadores específicos para el gen ("cebadoras clonadas") .
Para PCR TAIL-1 se realizó un preparado de reacción de 20 mi, el cual contenia lo siguiente: - 1 mg ADN genómico (preparado según la descripción anterior) , - 0,2 mM de cada dNTPs - 0,2 mM PR60 (SEQ ID No. 66) - 0,2 mM ADl (SEQ ID No. 69) - 2 mi 10 X tampón -PCR (TARARA) - 0, 5 UR Taq polimerasa (TARARA) - rellenado con agua destilada hasta 20 mi - el ADl representó en un comienzo una mezcla de cebadores de las secuencias (a/c/g/t) toga (g/c) t (a/t)t/g/c/g(a/t) gtt. La reacción PCR TAIL 1 se desarrolló bajo las siguientes 'Condiciones del ciclo: 1 X 90°C: 1 minuto, 95°C: 1 minuto 5 X 94°C: 30 segados, 62°C: lminuto, 72°C 2,5 minutos 1 X 94 °C: 30 segundos, 25°C: 3 minutos, incrementó hasta 72 aC en 3 minutos: 72°C: 2,5 minutos. 15 X 94°C: 10 segundos, 68°C 1 minuto, 72°C: 2,5 minutos 94°C: 10 segundos, 68°C 1 minuto, 72°C: 2,5 minutos 94°C: 10 segundos, 29°C 1 minuto, 72°C: 2,5 minutos 1 X 72 °C: 5 minutos.
La reacción PCR-TAII 2 se desarrolló en un preparado de reacción de 1 mi, el cual contenia: - 1 mi de una disolución 1:50 del preparado de reacción TAIL-1 (preparado según se describió anteriormente) . - 0,8 mM de NTP - 0,2 mM PR61 (SEQ ID No. 67) - 0,2 mM ADl (SEQ ID No. 69) - 2 mi 10 X Tampón PCR (TARARA) - 0,5 ÜR Tag polimerasa (TARARA) - completado con agua destilada hasta 21 mi.
La reacción -PCR TAIL2 se desarrolló en las siguientes condiciones del ciclo: 12 X 94°C: 10 segundos, 64°C; 1 minuto; 72°C: 2,5 minutos 94°C: 10 segundos, 64°C; 1 minuto; 72°C: 2,5 minutos 94°C: 10 segundos, 29°C; 1 minuto; 72°C: 2,5 minutos 1 X 72°C: 5 minutos La PCR-TAIL3 se desarrolló en un preparado de reacción de 100 mi, el cual contenia: - 1 mi de una disolución 1:10 del preparado de reacción TAIL-2 (preparado según se describió anteriormente) . - 0,8 mM dNTP - 0,2 mM PR63 (SEQ ID No. 68) - 0,2 mM AD1 (SEQ ID NO. 69) - 10 mi 10X tampón-PCR (TAKARA) - 0,5 UR Taq polimerasa (TAKARA) - completado con agua destilada hasta 100 mi La reacción PCR-TAIL3 se desarrolló bajo las siguientes condiciones del ciclo: 20 X 94°C. 15 segundos, 29°C: 30 segundos, 72°C: 2 minutos 1 X 72 °C: 5 minutos. La amplificación -PCR con el cebador PR63 y AD1 resultó en un fragmento de 280 Bp, el cual entre otras contiene el fragmento promotor 199 bp de la epsilon-ciclasa (ver Figura 12) . El amplificado se clonó en el vector de clonación -PCR pCR21 (Invitrogen) empleando métodos estandarizados. La secuencia con los cebadores M13 y T7 entregaron la secuencia SEQ No. 46. Esta secuencia es idéntica con la secuencia SEQ ID No. 45, la cual se aisló mediante la estrategia IPCR y representa asi, la secuencia nucleótido en la Linea Orangenprinz de Tapetes erecta usada. El clon pCR2.1; el cual contiene el fragmento 312 bp (SEQ ID No. 45) del promotor epsilón-ciclasa, aislado mediante la estrategia IPCR, se denomina pTA-ecycP, siendo usado en la preparación de las construcciones IR.
Ejemplo 1.14 Preparación de un casette de expresión -invertido -repetidor para la expresión especifica en las flores del de ARN epsilón-ciclasa en Tagetes erecta (dirigido en contra de la región promotora del cADN epsilón-ciclasa. La expresión de las transcripciones invertidas-repetidoras formadas por los fragmentos promotores de la epsilón-ciclasa en Tagetes erecta se efectuó bajo el control de una versión modificada AP3P del promotor especifico para las flores AP3 de Arabidopsis (ver ejemplo 1.10) o del promotor especifico para la flor CHRC (No. de acceso GenBank AF099501) . La transcripción invertida repetidora contiene en cada caso un fragmento promotor epsilón-ciclasa en la orientación correcta (fragmento sentido) y en fragmento promotor epsilón-ciclasa con la orientación opuesta (fragmento-antisentido) , las cuales están unidas entre si mediante un intrón funcional (ver ejemplo 1.10) . Los fragmentos promotores se prepararon mediante PCR con aplicación del ADN-plásmido (clon ???-ecycP, ver ejemplo 1.13) y de los cebadores PR 124 (SEQ ID No. 70) y PR126 (SEQ ID No. 72), o de los cebadores PR 125 (SEQ ID No. 71) y PR 127 (SEQ ID No. 73) . Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes : La PCR para la amplificación del fragmento ADN PR124-PR-126, que contiene el fragmento promotor de la epsilón-ciclasa, se 'efectuó en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia lo siguiente: - 1 mi GADN (preparado según la descripción anterior) - 0,25 mM dNTPs - 0,2 mM PR124 (SEQ ID No. 70) - 0,2 mM PR126 (SEQ ID No. 72) - 5 mi 10 X Tampón -PCR (TARARA) - 0,25 mi RT Taq polimerasa (TARARA) - 28,8 µp?? agua destilada. La reacción PCR para la amplificación del fragmento -ADN PR125-PR 127, el que contiene el fragmento promotor 312 bp de la epsilón-ciclasa, se desarrolló en un preparado de reacción de 50 mi, el cual contenia lo siguiente: - 1 mi CADN (preparado de acuerdo a la descripción anterior) - 0,25 mM dNTPs - 0,25 mM PR 125 (SEQ ID No. 71) - 0,2 mM PR 127 (SEQ ID No. 73) - 5 mi 10 X Tampón-PCR (TARARA) - 0,25 R Taq polimerasa (TARARA) - 28,8 mi agua destilada La reacción PCR se desarrollaron bajo las siguientes condiciones del ciclo. 1 X 94°C 2 minutos 35 X 94 °C 1 minuto 53 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto I X 72°C 10 minutos La amplificación PCR con el cebador PR 124 y PR 126 resultó en un fragmento de 358 BP, la amplificación -PCR con el cebador PR 125 y PR127 resultó en un fragmento de 361 Bp. Se clonaron las dos amplificados, el fragmento PR 124-PR126 (Hind III-SaII sentido) y el fragmento PR 125-PR127 (eco RI-BamHI-antisentido) , mediante la aplicación de métodos estandarizados en el vector de clonación -PCR pCR-Blunt II (Invitrogen) . La secuenciacion con el cebador o partidor SP6 confirmó en cada caso una secuencia la cual, fuera de los sitios de restricción introducidos, es idéntica con la SEQ ID No. 45. Por ello se utilizaron estos clones en la preparación de una construcción invertida repetidora en el vector de clonación JAIl (ver ejemplo I. 10) . La primera etapa de clonación se realizó aislando el fragmento 358 Bp PR124-PR126 Hind III-SaII del vector de clonación pCR-Blundt II (Invitrogen) y ligando con el vector pJAIl cortado BamH I-EcoRI. El clon portador del fragmento promotor epsilón-ciclasa- en la orientación sentido, se denomina cs43. Mediante el ligado se introduce el fragmento sentido del promotor epsilón-ciclasa entre el promotor AP3P y el intrón. La segunda etapa de clonación consistió en aislar el fragmento 361 Bp PR125-PR127 BamHI-EcoRI desde el vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) y ligando con el vector cs43, cortado BamHI-EcoRI . El clon que contiene el fragmento promotor epsilón-ciclasa en la orientación autosentido, se denomina es 44. Ligando se forma una fusión transcripcional entre el intrón y el fragmento antisentido del promotor epsilón-ciclasa. Para preparar un casette de expresión -invertida-repetidor a bajo el control del promotor -CHRC se procedió a amplificar un fragmento promotor -CHRC empleando el ADN genómico de la petunia (preparado mediante métodos estandarizados) y los cebadores PRCHRC3 ' (SEQ ID No. 77) y PRCHRc 5' (SEQ ID No.76) . El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) . La secuenciación del clon resultante pCR 2.1. -CHRC con los cebadores M13 y T7 confirmó una secuencia idéntica con la secuencia AF 099501. Asi se usó este clon para la clonación en el vector de expresión cs44. La clonación se realizó aislando el fragmento 1537 bp Sacll-Hind III del pCR2.1-CHRC y ligando en el vector es 44 cortado SAC I -Hind III. El clon que contiene el promotor CRC en vez del promotor originó AP3P se denomina es 45.
Para preparar un casette de expresión -invertido -repetidor bajo el control de dos promotores, el promotor -CRC y el promotor AP3P, se procedió a clonar el promotor AP3P en la orientación antisentido en el extremo -3' del fragmento antisentido epsilón-ciclasa en el clon es 45. El fragmento promotor -AP3P de pJAIl se amplificó usando los cebadores PRl28y PR 129. El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen) . La secuenciación con los cebadores M13 y T7 confirmó una secuencia idéntica con la secuencia a SEQ ID No. 28 (AL132971) . Este clon ó p CR2.1-AP3PSX se utilizó en la preparación de un casette de expresión -invertida-repetidor bajo el control de dos promotores . La clonación se realizó aislando el fragmento 771 bp Sall-Xhol del clon pCR2.1. -Ap3PSX y ligando en el vector es 45 cortado Xhol . El clon que contiene el promotor aP3P en orientación antisentido por el lado-3' del repetidor -invertido, se denomina es 46. Los casettes de expresión para la transformación de la transcripción -invertida-repetidora-AP3P, mediada por el Agrobacterium, en Tagetes erecta se prepararon con agua del vector binario pSUN5 (WO 02/00900) . Para preparar el vector de expresión pS5AI7 se procedió a ligar el fragmento 1685 bp Sacl-Xhol del clon es 44 con el vector pSUNS cortado SaCl-Xhol (figura 13) , diagrama de construcción) . En la Figura 13, el fragmento AP3P contiene el promotor modificado ???3? (77/bp), el fragmento P-sentido contiene el fragmento promotor 312 bp de la epsilón-ciclasa en la orientación sentido, el fragmento intrón contiene el intrón IV2 del gen de la papa ST-LS1) , y el fragmento P-anti contiene el fragmento promotor 312 bp de la epsilón-ciclasa en la orientación antisentido. Para preparar el vector de expresión pS5CI7 se procedió a ligar el fragmento 2445 bp Sacl-Xhol del es 45, con el vector pSUN5 cortado Sacl-Xhol (Figura 14, diagrama de construcción) . En la figura 14 el fragmento CHRH contiene el promotor CHRC (1537 bp) , el fragmento P-sentido contiene el fragmento promotor 312 de la epsilón-ciclasa en la orientación sentido, el fragmento intrón contiene el intrón IV2 del gen de la papa ST-LS1) , y el fragmento P-anti contiene el fragmento promotor de 312 bp de la epsilón-ciclasa en la orientación anti-sentido . Para preparar el vector de expresión pSCAI7 se procedió a ligar el fragmento 3219 bp Sacl-Xhol del clon es 46 con el vector pSUN5 cortado Sacl-Xhol (Figura 15, diagrama de construcción) . En la figura 15, el fragmento CHRC contiene el promotor -CHRC (1537 bp) , el fragmento P-sentido contiene el fragmento promotor de 312 bp de la epsilón-ciclasa en la orientación sentido, el fragmento intrón contiene el intrón IV2 del gen de la papa ST-1S1) , el fragmento P-anti contiene el fragmento promotor 312 bp de la epsilón-ciclasa en la orientación antisentido y el fragmento AP3P contiene el fragmento promotor -AP3P 771 bp en la orientación antisentido.
Ejemplo I. 15 Preparación de plantas Tagetes trangénicas con una actividad epsilón-ciclasa reducida. Se utilizan semillas de tegetes (Tagetes) y se depositan sobre el medio de germinación (medio-MS; Murashige y Skoog, Physiol. Pant. 15 (1962), 473-497) pH 5,8, 2% de sacarosa) . La germinación de las semillas se produce en condiciones de temperatura /luz/intervalo de tiempo de 18 hasta 28 °C/ 20 hasta 200 mE/3 hasta 16 semanas, pero preferentemente a 21°C, 20 hasta 70 mE, durante 4 hasta 8 semanas . Se cosechan todas las hojas de las plantas desarrolladas hasta ese momento in vitro y se cortaron en la dirección transversal con respecto del nervio central. Las explantas de hojas asi formadas con un tamaño de 10 hasta 60 rtim2 se conservaron durante la preparación en el medio-MS liquido a temperatura ambiente durante un máximo de 12 horas .
La cepa EHA105 del Agrobacterium turnefaciens se transformó con el plásmido birrasio pS5AI3. El cultivo inicial de la cepa A. tumefaciens EHA105 transformada se realizó durante la noche en las condiciones siguientes. Se incubó una colonia individual en el medio YEB (0,1% extracto de lavadura 0,5% extracto de carne de vacuno, 0,5% peptona, 0,5% sacarosa, 0,5% sulfato de magnesio ?7¾0 con 25mg/l canamicina, cultivando a 28°C durante 16 hasta 20 horas. A continuación se cosechó la suspensión bacteriana mediante centrifugado a 600 g durante 10 minutos y se volvió a suspender en el medio -MS liquido de tal modo de formar un OD600 de alrededor de 0,1 hasta 0,8. Esta suspensión se utilizó para el co-cultivo con el material de las hojas. Poco antes del co-cultivo se reemplaza el medio -MS, en el cual se habrán conservado las hojas, por la suspensión bacteriana. La incubación de las hojuelas en la suspensión de agrobacterias se realizó durante 30 minutos con agitación suave a temperatura ambiente. A continuación se depositaron las explantas infectadas sobre un medio -MS solidificado con agar (por ejemplo 0,8% Plan Agar (Duchafa, NL) , en presencia de reguladoras del crecimiento, como ser por ejemplo 3 mg/1 bencilaminopresina (BAP) y 1 mg/1 ácido indolilacético (IAA) . La orientación de las hojas sobre el medio no tiene influencia. Las explantas se cultivan durante 1 hasta 8 días, pero preferentemente durante 6 dias, donde se pueden aplicar las siguientes condiciones : intensidad de la luz: 30 hasta 80 mMol/m2 x seg, temperatura a: 22 hasta 24 °C, cambio claridad/oscuridad de 16/8 horas. A continuación se transfieren las explantas co-cultivadas sobre un medio-MS fresco, preferentemente con los mismos reguladores del crecimiento, donde este segundo medio contiene adicionalmente un antibiótico para suprimir el crecimiento bacteriano. Para ello es muy conveniente la timentina en una concentración de 200 hasta 500 mg/1. Como segundo componente selectivo se aplica uno adecuado para la selección del éxito de la transformación. La fosfinatricina enana concentración de 1 hasta 5 ml/1 selecciona de manera muy eficiente, pero también son posibles otros componentes selectivos, según el procedimiento utilizado. Después de tres semanas se transfirieron las explantas a un medio fresco hasta que se habrán desarrollado ya más brotes y pequeños brotes, los cuales se traspasan luego al mismo medio basal, incluyendo timustina y PPT o componentes alternativos con reguladores del crecimiento, en particular por ejemplo 0,5 mg/1 ácido isodolilbutinico (IBA) y 0,5 mg/1 ácido gibesilinico, GA3, para producir el enraizamiento . Las probetas que han desarrollado una raíz se pueden traspasar al invernadero . Adicionalmente al método descrito son posibles las siguientes modificaciones ventajosas: - antes de infectar las explantas con las bacterias se las puede preincubar durante 1 hasta 12 días, preferentemente 3 hasta 4 sobre el medio descrito anteriormente para fines delco-cultivo . A continuación se realiza la infección el co-cultivo y la regeneración selectiva, tal como se describió anteriormente . - el valor de pH para la regeneración (normalmente 5,8/ se puede reducir a pH 5,2. Con ello se mejora el control del crecimiento de las agrobacterias . - la incorporación de Ag 3 (3-10 mg/1) al medio de regeneración mejora el estado del cultivo, incluyendo la regeneración propiamente tal. - aquellos componentes que permiten reducir la formación de fenol, conocidas por el técnico en el arte, tales como por ejemplo ácido cítrico, ácido ascolico, PVP y otros actúan positivamente sobre el cultivo. - En todo el procedimiento también se puede emplear un medio de cultivo líquido. El cultivo también se puede cultivar sobre vehículos comerciales, los que se colocan sobre el medio líquido. De acuerdo al método de transformación descrito anteriormente con la construcción para la expresión pS5AI3 se obtuvieron las líneas siguientes: CS30-1, CS30-3 y CS30-4 E emplo I. 16. Caracterización de las plantas tagetes (Tagetes) transgénicas con una actividad epsilón-ciclasa reducida. El material de flores de las plantas transgénicas Tagetes erecta del Ejemplo 1.15 se pulverizó en presencia de nitrógeno liquido en un mortero, extrayendo el polvo (alrededor de 250 hasta 500 mg) con 100% acetona (tres veces con cada vez 500 mi) . Se incorpora el solvente y los contenidos se resuelven a suspender en 100 mi acetona. Mediante una columna de cromatografía en fase inversa C30 fue posible cuantificar las cromátidas individuales. Las condiciones de elusión en la HpCl fueron casi idénticas con aquéllas publicadas (Frozer y colaboradores (2000), Plant Journal 24 (4) : 551-558) . Las carotinoides fueron identificadas basadas en los espectros ÜV-VIS. En la tabla 2 se muestra el perfil carotinoide en los pétalos de Tagetes (tagetes) de acuerdo a las plantas de control Tagetes transgénicas . preparadas. Todas las cantidades de las carotinoides se indican en peso frasco (ug/g), indicando las variaciones porcentuales con respecto de la planta de control entre paréntesis. En comparación con la planta de control sin modificar genéticamente, las plantas modificadas genéticamente con una actividad epsilón-ciclasa reducida presenta un contenido claramente aumentado de carotinoides correspondientes a la vía be-carotina- tales como por ejemplo, beta-carotina y zeaxantina y un contenido claramente reducido de carotinoides correspondientes a la "vía -alfa- carotina") como ser por ejemplo. Luteina. Tabla 2 Ejemplo II Preparación de partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Vegetes. Se cortaron y secaron las cabezas de las flores o los pétalos de las plantas de la especie Tagetes portadora de astaxantina, preparadas de acuerdo al Ejemplo 1.6. A continuación se pulverizan las cabezas de las flores o los pétalos secos mediante una molienda.
Ejemplo II Preparación de los extractos de astaxantina y su purificación . Los pétalos secos o las cabezas de flores secas provenientes de las plantas Vegetes erecta, preparadas de acuerdo al ejemplo 1.6 se homogenizan con un exceso (aproximadamente 10 partes de solvente por una parte de planta En comparación con la planta de control sin modificar genéticamente, las plantas modificadas genéticamente con una actividad . epsilón-ciclasa reducida presenta un contenido claramente aumentado de carotinoides correspondientes a la via be-carotina- tales como por ejemplo, beta-carotina y zeaxantina y un contenido claramente reducido de carotinoides correspondientes a la "via -alfa-carotina") como ser por ejemplo. Luteina. Tabla 2 planta Luteina b-carotina Zeaxantina Violaxantina Total Carotinoides Control 260 4,8 2,7 36 304 CS 30-1 35 (- 13 (+170%) 4,4 (+62%) 59 (+63%) 111 (-63%) 86%) Control 456 6,4 6,9 58 527 CS 30-3 62 (- 13 (+103%) 8,9 (+29%) 75 (+29%) 159 (-70%) 86%) Ejemplo II Preparación de partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Vegetes. Se cortaron y secaron las cabezas de las flores o los pétalos de las plantas de la especie Tagetes portadora de astaxantina, preparadas de acuerdo al Ejemplo 1.6. A continuación se pulverizan las cabezas de las flores o los pétalos secos mediante una molienda.
Ejemplo III Preparación de los extractos de astaxantina y su purificación . Los pétalos secos o las cabezas de flores secas provenientes de las plantas Vegetes erecta, preparadas de acuerdo al ejemplo 1.6 se omogenizan con un exceso (aproximadamente 10 partes de solvente por una parte de planta (como por ejemplo, acetona, hexano, cloruro de metiendo, metil-butil terciario-éter , tetrahidrofurano, etanol, heptano, cicloheptano ó éter de petróleo, sin estar hidratado exclusivamente a estos o con una mezcla de solventes (como ser, por ejemplo, acetona, hexano, etanol/hexano (50:50, v/v) o acetona/metanol (7:3, v/v, ) extrayendo en un ambiente frió y oscuro, con agitación. El residuo se puede volver a extraer hasta 3 veces con el mismo solvente / mezcla de solventes. El solvente o la mezcla de solventes orgánicos recolectados se evapora en un evaporador hasta obtener un concentrado de evaporación. Adicionalmente se puede volver a extraer con hexano. El hexano usado se evapora nuevamente en la oscuridad y en ambiente frió. El concentrado asi preparado se disuelve en hexano y se somete a una cromatografía en columna de material de sílice. Para ello se mezcla una parte del material de sílice con 1 - 2 partes de solución carotinoide y se empaca en una columna. La columna se lava con hexano en la oscuridad y en un ambiente frío. El eluato se desecha. Los carotinoides, en especial la astaxantina, se eluye con una mezcla de hexano y etanol (2-5% etanol en hexano) , hasta que eluye una porción de color anaranjado-rojizo. Este eluato anaranjado-rojizo se recolecta, hasta que cambia el color. El eluato con una tonalidad anaranjada-rojizo contiene astaxantina como una mezca de mono- y di-ésteres.
EJEMPLO IV Fabricación de un alimento extruido para truchas, el cual contiene plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina de la especie Tagetes o extractos de astaxantina de plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes. En un extrusor de doble tornillo helicoidal se extruyen los siguientes componentes. Componentes Harina de pescado Grasa total de poroto soya Almidón expandido de trigo Mezcla vitamínica Cloruro de colina (50%) Gluten del trigo Aspirnat 50% Aceite de pescado Las plantas o partes de las plantas de la especie Tagetes portadoras de astaxantina procesadas, en polvo, o los extractos portadores de astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas de la especie Tagetes, preparados, por ejemplo, de acuerdo al Ejemplo II, se incorporan como componentes previamente a la extrusión. Los extractos o los extractos procesados, portadores de astaxantina, provenientes de plantas o partes de plantas pertenecientes a la especie Tagetes, preparados por ejemplo según el Ejemplo III, se pulverizan sobre el producto extruido, después de la extrusión de los mismos. (Aplicación mediante el método-PPA) .
La dosificación del principio activo astaxantina asciende a 10,20 y 40 mg astaxantina por cada kg de la dieta. Después de terminado el proceso de extrusión se procede a secar y enfriar al producto extruido.
EJEMPLO V Administración oral de las plantas o partes de plantas que contienen astaxantina, pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos de astaxantina provenientes de las plantas o partes de plantas de la especie Tagetes a las truchas en un alimento para truchas estandarizado-investigación de la biodisponibilidad. El alimento para truchas, que contiene los pigmentos de astaxantina de la invención, se prepara de acuerdo al Ejemplo IV y se administra oralmente a las truchas (masa viva promedio de 180 g) . Se ensayaron 3 concentraciones : 10, 20 y 40 mg astaxantina de la pigmentación de astaxantina de la invención por kg de dieta alimenticia. El mantenimiento de las truchas es el siguiente: -las truchas reciben en la forma estandarizada o usual una fase de adaptación de 14 días. -durante el ensayo de alimentación se mantienen 10 truchas por estanque de circulación de material plástico con una capacidad de 80 litros de agua. La temperatura del agua asciende a aproximadamente 15 °C. El agua se somete a una purificación biológica, reemplazando diariamente al menos un 10% del agua total por agua fresca. -el tiempo de iluminación es de 12 horas por día, para evitar una maduración sexual prematura de los animales, -el número de estanques de cada tratamiento es 3. Esto equivale a 30 truchas por cada etapa de dosificación. -las dietas alimenticias se conservan a -20 °C para evitar las pérdidas de astaxantina. El alimento se descongela por porciones (semanalmente) y se administra, -el período del ensayo es de 8 semanas La alimentación de las truchas se realiza como sigue: -en la administración de las dietas de ensayo se trata del alimento para truchas extruido fabricado de acuerdo al Ejemplo IV, el cual se recubre adicionalmente con aceite, -durante la fase de adaptación de los peces se administra un alimento estandarizado para truchas recubierto o revestido con aceite sin astaxantina. -como control negativo se administra, durante todo el período del ensayo, alimento estandarizado para truchas revestido con aceite libre de astaxantina de acuerdo al Ejemplo II, sin astaxantina. -la alimentación se efectúa 2 veces por día en forma normal hasta la saturación de los animales. Se investiga la influencia de la pigmentación con astaxantina de acuerdo a la invención sobre los parámetros de rendimiento de los peces, como también la aceptación de alimento, la asimilación del alimento y el aumento de peso vivo, además de biodiferencia de la pigmentación. Se evalúa estadísticamente el consumo promedio de alimento de cada pez, el alimento administrado y el aumento de masa corporal o viva. El grado de pigmentación de los peces se determina mediante mediciones espectrofotométricas (Valor-a- inolta = índice rojo en el corte de filete) y mediante la determinación del contenido de astaxantina (mg/kg) en el filete en comparación con el control negativo. Los valores o índices "a" de amialta, los cuales representan los componentes de color rojo del color, van aumentando en función de la dosis a medida que se va reduciendo la función. Los valores o índices b de amialta, los cuales reflejan el componente amarillo se ubica en la región negativa o se mueven en torno a cera. Esto significa que la tonalidad rojiza del filete de trucha presenta una dependencia con la cantidad de astaxantina recibida por el pescado .
Durante el ensayo no se observaron diferencias estadísticas para los parámetros de rendimiento observados, tanto entre como también durante los tratamientos (polvo portador de astaxantina, extracto líquido portador de astaxantina, astaxantina sintética, control negativo) . Se observa que las plantas o partes de plantas portadoras de astaxantina pertenecientes a la especie Tagetes o los extractos provenientes de plantas o partes de plantas de la especie Tagetes, portadores de astaxantina, presentaron una biodisponibilidad en la pigmentación de las truchas, como representantes de los salmones, y por otra parte no tienen efectos adversos sobre el rendimiento biológico de la trucha.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> SunGene GmbH Co. KgaA y Basf Aktiengesellschaft <120> Uso de plantas que contienen astaxantina o partes de plantas del género Tagetes como alimento para animales . <130> PF 5414Í <160> 142 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 1771 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (166) .. (1155) <223> <400> 1 ggcacgagct tgcacgcaag tcagcgcgcg caagtcaaca cctgccggtc cacagcctca 60 aataataaag agctcaagcg tttgtgcgcc tcgacgtggc cagtctgcac tgccttgaac 120 ccgcgagtct cccgccgcac tgactgccat agcacagcta gacga atg cag cta gca 177 Met Gln Leu Ala 1 gcg acá gta atg ttg gag cag ctt acc gga age gct gag gca etc aag 225 Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys 5 10 15 20 gag aag gag aag gag gtt gca ggc age tet gac gtg ttg cgt acá tgg 273 Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp 25 30 35 gcg acc cag tac teg ctt ceg tea gaa gag tea gac gcg gee cgc ceg 321 Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro 40 45 50 gga ctg aag aat gee tac aag cea cea ect tec gac acá aag ggc ate 369 Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly lie 55 60 65 acá atg gcg cta cgt gtc ate ggc tec tgg gee gca gtg ttc etc cae 417 Thr Met Ala Leu Arg Val lie Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His 70 75 80 gee att ttt caá ate aag ctt ceg acc tec ttg gac cag ctg cae tgg 465 Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp 85 90 95 100 ctg ecc gtg tea gat gee acá gct cag ctg gtt age ggc acg age age 513 Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser 105 110 115 ctg etc gac ate gtc gta gta ttc ttt gtc ctg gag ttc ctg tac acá 561 Leu Leu Asp lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr 120 125 130 ggc ctt ttt ate acc acg cat gat gct atg cat ggc acc ate gee atg 609 Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Met 135 140 145 aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga gta tgc ate tec ttg 657 Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys lie Ser Leu 150 155 160 tac gee tgg ttt gat tac aac atg ctg cae cgc aag cat tgg gag cae 705 Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His 165 170 175 180 cae aac cae act ggc gag gtg ggc aag gac ect gac ttc cae agg gga 753 His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly 185 190 195 aac ect ggc att gtg ecc tgg ttt gee age ttc atg tec age tac atg 801 Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met 200 205 210 teg atg tgg cag ttt gcg cgc etc gca tgg tgg acg gtg gtc atg cag 849 Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln 215 220 225 ctg ctg ggt gcg cea atg gcg aac ctg ctg gtg ttc atg gcg gee gcg 897 Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala 230 235 240 ecc ate ctg tec gee ttc cgc ttg ttc tac ttt ggc acg tac atg ecc 945 Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro 245 250 255 260 cae aag ect gag ect ggc gee gcg tea ggc tet tea cea gee gtc atg 993 His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met 265 270 275 aac tgg tgg aag teg cgc act age cag gcg tec gac ctg gtc age ttt 1041 Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe 280 285 290 ctg acc tgc tac cae ttc gac ctg cae tgg gag cae cae cgc tgg ecc 1089 Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro 295 300 305 ttc gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc cgc ctg tct ggc cga 1137 Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg 310 315 320 ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc cctgctgcca 1185 Gly Leu Val Pro Ala 325 gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa agctgcaggc gctgctgccg 1245 gacacgctgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta ggggaggggg tttgtagctg 1305 tcgagcttgc cccatggatg aagctgtgta gtggtgcagg gagtacaccc acaggccaac 1365 acccttgcag gagatgtctt gcgtcgggag gagtgttggg cagtgtagat gctatgattg 1425 tatcttaatg ctgaagcctt taggggagcg acacttagtg ctgggcaggc aacgccctgc 1485 aaggtgcagg cacaagctag gctggacgag gactcggtgg caggcaggtg aagaggtgcg 1545 ggagggtggt gccacaccca ctgggcaaga ccatgctgca atgctggcgg tgtggcagtg 1605 agagctgcgt gattaactgg gctatggatt gtttgagcag tctcacttat tctttgatat 1665 agatactggt caggcaggtc aggagagtga gtatgaacaa gttgagaggt ggtgcgctgc 1725 ccctgcgctt atgaagctgt aacaataaag tggttcaaaa aaaaaa 1771 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 2 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val 20 25 30 Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp 35 40 45 Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp 50 55 60 Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Arg Val lie Gly Ser Trp Ala Ala 65 70 75 80 Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp 85 90 95 Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser 100 105 110 Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu 115 120 125 Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly 130 135 140 Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val 145 150 155 160 Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys 165 170 175 His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp 180 185 190 Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met 195 200 205 Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr 210 215 220 Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe 225 230 235 240 Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly 245 250 255 Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His 290 295 300 His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 325 <210> 3 <211> 1662 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (168) .. (1130) <223> <400> 3 cggggcaact caagaaattc aacagctgca agcgcgcccc agcctcacag cgccaagtga 60 gctatcgacg tggttgtgag cgctcgacgt ggtccactga cgggcctgtg agcctctgcg 120 ctccgtcctc tgccaaatct cgcgtcgggg cctgcctaag tcgaaga atg cae gtc 176 Met His Val 1 gca tcg gca cta atg gtc gag cag aaa ggc agt gag gca gct gct tcc 224 Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gln Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser 5 10 15 age cea gac gtc ttg aga gcg tgg gcg acá cag tat cae atg cea tcc 272 Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gln Tyr His Met Pro Ser 20 25 30 35 gag tcg tea gac gca gct cgt ect gcg cta aag cae gee tac aaa ect 320 Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala Tyr Lys Pro 40 45 50 cea gca tet gac gee aag ggc ate acg atg gcg ctg acc ate att ggc 368 Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr lie lie Gly 55 60 65 acc tgg acc gca gtg ttt tta cae gca ata ttt caá ate agg cta ceg 416 Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Arg Leu Pro 70 75 80 acá tcc atg gac cag ctt cae tgg ttg ect gtg tcc gaa gee acá gee 464 Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Ala 85 90 95 cag ctt ttg ggc gga age age age cta ctg cae ate gct gca gtc ttc 512 Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala Ala Val Phe 100 105 110 115 att gta ctt gag ttc ctg tac act ggt cta ttc ate acc acá cat gac 560 lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp 120 125 130 gca atg cat ggc acc ata gct ttg agg cae agg cag etc aat gat etc 608 Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg His Arg Gln Leu Asn Asp Leu 135 140 145 ctt ggc aac ate tgc ata tea ctg tac gee tgg ttt gac tac age atg 656 Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met 150 155 160 ctg cat cgc aag c.ac tgg gag cae cae aac cat act ggc gaa gtg ggg 704 Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly 165 170 175 aaa gac ect gac ttc cae aag gga aat ecc ggc ctt gtc ecc tgg ttc 752 Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe 180 185 190 195 gee age ttc atg tcc age tac atg tcc ctg tgg cag ttt gee cgg ctg 800 Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu 200 205 210 gca tgg tgg gca gtg gtg atg caá atg ctg ggg gcg ecc atg gca aat 848 Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn 215 220 225 etc cta gtc ttc atg gct gca gee cea ate ttg tea gca ttc cgc etc 896 Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu 230 235 240 ttc tac ttc ggc act tac ctg cea cac aag ect gag cea ggc ect gca 944 Phe Tyr Phe Gly Thr Tyx Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala 245 250 255 gca ggc tct cag gtg atg gee tgg ttc agg gee aag acá agt gag gca 992 Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala 260 265 270 275 tct gat gtg atg agt ttc ctg acá tgc tac cac ttt gac ctg cac tgg 1040 Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp 280 285 290 gag cae cac agg tgg ccc ttt gee ccc tgg tgg cag ctg ccc cac tgc 1088 Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu Pro His Cys 295 300 305 cgc cgc ctg tcc ggg 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Lys His Ala 35 40 45 Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr 50 55 60 lie lie Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie 65 70 75 80 Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu 85 90 95 Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala 100 105 110 Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr 115 120 125 Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg His Arg Gln Leu 130 135 140 Asn Asp Leu Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp 145 150 155 160 Tyr Ser Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly 165 170 175 Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val 180 185 190 Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe 195 200 205 Ala Arg Leu Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro 210 215 220 Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala 225 230 235 240 Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro 245 250 255 Gly Pro Ala Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr 260 265 270 Ser Glu Ala Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp 275 280 285 Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu 290 295 300 Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Leu Ala 305 310 315 320 <210> 5 <211> 729 <212> ADN <213> Agrobacterium aurantiacum <220> <221> CDS <222> (1).. (729) <223> <400> 5 atg age gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc acc agc ctg 48 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 ate gtc teg ggc ggc ate ate gcc gct tgg ctg gcc ctg cat gtg cat 96 lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc ate ctg gcg ate gca 144 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala lie Ala 35 40 45 aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg teg gtc gga ttg ttc ate ate gcg 192 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 cat gac gcg atg cae ggg teg gtg gtg ceg ggg cgt ceg cgc gcc aat 240 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt teg tgg 288 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 cgc aag atg ate gtc aag cae atg gcc cat cae cgc cat gcc gga acc 336 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ceg gtc cgc tgg tac gcc 384 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 cgc ttc ate ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 gtc ate gtg acg gtc tat gcg ctg ate ctt ggg gat cgc tgg atg tac 480 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 gtg gtc ttc tgg ceg ctg ceg teg ate ctg gcg teg ate cag ctg ttc 528 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser lie Leu Ala Ser lie Gln Leu Phe 165 170 175 gtg ttc ggc acc tgg ctg ceg cae cgc ccc ggc cae gac gcg ttc ceg 576 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 gac cgc cae aat gcg cgg teg teg cgg ate age gac ccc gtg teg ctg 624 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg lie Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 ctg acc tgc ttt cae ttt ggc ggt tat cat cae gaa cae cae ctg cae 672 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac 720 Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 acc gca tga 729 Thr Ala <210> 6 <211> 242 <212> P T <213> Agrobacterium aurantiacum <400> 6 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala lie Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser lie Leu Ala Ser lie Gln Leu Phe 165 170 175 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg lie Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220. Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 Thr Ala <210> 7 <211> 1631 <212> ADN <213> Alcaligenes sp. <220> <221> CDS <222> (99) .. (827) <223> <400> 7 ctgcaggccg ggcccggtgg ccaatggtcg caaccggcag gactggaaca ggacggcggg 60 ccggtctagg ctgtcgccct acgcagcagg agtttcgg atg tcc gga cgg aag cct 116 Met Ser Gly Arg Lys Pro 1 " 5 ggc acá act ggc gac acg ate gtc aat etc ggt ctg acc gee gcg ate 164 Gly Thr Thr Gly Asp Thr lie Val Asn Leu Gly Leu Thr Ala Ala lie 10 15 20 ctg ctg tgc tgg ctg gtc ctg cae gee ttt acg cta tgg ttg cta gat 212 Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe Thr Leu Trp Leu Leu Asp 25 30 35 gcg gee gcg cat ceg ctg ctt gee gtg ctg tgc ctg gct ggg ctg acc 260 Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Ala Gly Leu Thr 40 45 50 tgg ctg teg gtc ggg ctg ttc ate ate gcg cat gac gca atg cae ggg Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala His Asp Ala Met His Gly 55 60 65 70 tcc gtg gtg ceg ggg cgg ceg cgc gee aat gcg gcg ate ggg caá ctg Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn Ala Ala lie Gly Gln Leu 75 80 85 gcg ctg tgg etc tat gcg ggg ttc teg tgg ecc aag ctg ate gee aag 404 Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp Pro Lys Leu lie Ala Lys 90 95 100 cae atg acg cat cae cgg cae gee ggc acc gac aac gat ecc gat ttc 452 His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr Asp Asn Asp Pro Asp Phe 105 110 115 ggt cae gga ggg ecc gtg cgc tgg tac ggc age ttc gtc tcc acc tat 500 Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly Ser Phe Val Ser Thr Tyr 120 125 130 ttc ggc tgg cga gag gga ctg ctg cta ceg gtg ate gtc acc acc tat 548 Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro Val lie Val Thr Thr Tyr 135 140 145 150 gcg ctg ate ctg ggc gat cgc tgg atg tat gtc atc ttc tgg ccg gtc 596 Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr Val lie Phe Trp Pro Val 155 160 165 ccg gee gtt ctg gcg teg atc cag att ttc gtc ttc gga act tgg ctg 644 Pro Ala Val Leu Ala Ser lie Gln lie Phe Val Phe Gly Thr Trp Leu 170 175 180 ecc cae cgc ccg gga cat gac gat ttt ecc gac cgg cae aac gcg agg 692 Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro Asp Arg His Asn Ala Arg 185 190 195 teg acc ggc atc ggc gac ccg ttg tea cta ctg acc tgc ttc cat ttc 740 Ser Thr Gly lie Gly Asp Pro Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe 200 205 210 ggc ggc tat cae cae gaa cat cae ctg cat ccg cat gtg ccg tgg tgg 788 Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His Pro His Val Pro Trp Trp 215 220 225 230 cgc ctg ect cgt acá cgc aag acc gga ggc cgc gca tga cgcaattcct 837 Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly Arg Ala 235 240 cattgtcgtg gcgacagtcc tcgtgatgga gctgaccgcc tattccgtcc accgctggat 897 tatgcacggc cccctaggct ggggctggca caagtcccat cacgaagagc acgaccacgc 957 gttggagaag aacgacctct acggcgtcgt cttcgcggtg ctggcgacga tcctcttcac 1017 cgtgggcgcc tattggtggc cggtgctgtg gtggatcgcc ctgggcatga cggtctatgg 1077 gttgatctat ttcatcctgc acgacgggct tgtgcatcaa cgctggccgt ttcggtatat 1137 tccgcggcgg ggctatttcc gcaggctcta ccaagctcat cgcctgcacc acgcggtcga 1197 ggggcgggac cactgcgtca gcttcggctt catctatgcc ccacccgtgg acaagctgaa 1257 gcaggatctg aagcggtcgg gtgtcctgcg cccccaggac gagcgtccgt cgtgatctct 1317 gatcccggcg tggccgcatg aaatccgacg tgctgctggc aggggccggc cttgccaacg 1377 gactgatcgc gctggcgatc cgcaaggcgc ggcccgacct tcgcgtgctg ctgctggacc 1437 gtgcggcggg cgcctcggac gggcatactt ggtcctgcca cgacaccgat ttggcgccgc 1497 actggctgga ccgcctgaag ccgatcaggc gtggcgactg gcccgatcag gaggtgcggt 1557 tcccagacca ttcgcgaagg ctccgggccg gatatggctc gatcgacggg cgggggctga 1617 tgcgtgcggt gacc 1631 <210> 8 <211> 242 <212> PRT <213> Alcaligenes <400> 8 Met Ser Gly Arg Lys Pro Gly Thr Thr Gly Asp Thr lie Val Asn Leu 1 5 10 15 Gly Leu Thr Ala Ala lie Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe 20 25 30 Thr Leu Trp Leu Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu 35 40 45 Cys Leu Ala Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala lie Gly Gln Leu Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Pro Lys Leu lie Ala Lys His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asn Asp Pro Asp Phe Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly 115 120 125 Ser Phe Val Ser Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 Val lie Val Thr Thr Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 Val lie Phe Trp Pro Val Pro Ala Val Leu Ala Ser lie Gln lie Phe 165 170 175 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro 180 185 190 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Thr Gly lie Gly Asp Pro Leu Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 Pro His Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly 225 230 235 240 Arg Ala <210> 9 <211> 729 <212> ADN <213> Paracoccus marcusii <220> <221> CDS <222> (1) .. (729) <223> <400> 9 atg age gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc aca agc ctg 48 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 ate gtc teg ggc ggc ate ate gcc gca tgg ctg gcc ctg cat gtg cat 96 lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 gcg ctg tgg ttt ctg gac gcg gcg gcc cat ccc ate ctg gcg gtc gcg 144 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala Val Ala 35 40 45 aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg teg gtc gga ttg ttc ate ate gcg 192 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 cat gac gcg atg cae ggg teg gtc gtg ceg ggg cgt ceg cgc gcc aat 240 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt teg tgg 288 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 cgc aag atg ate gtc aag cae atg gcc cat cae cgc cat gcc gga acc 336 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 gac gac gac cea gat ttc gac cat ggc ggc ceg gtc cgc tgg tac gcc 384 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 cgc ttc ate ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 gtc ate gtg acg gtc tat gcg ctg ate ctg ggg gat cgc tgg atg tac 480 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 gtg gtc ttc tgg ceg ttg ceg teg ate ctg gcg teg ate cag ctg ttc 528 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser lie Leu Ala Ser lie Gln Leu Phe 165 170 175 gtg ttc ggc act tgg ctg ceg cae cgc ccc ggc cae gac gcg ttc ceg 576 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 gac cgc cat aat gcg cgg teg teg cgg ate age gac ect gtg teg ctg 624 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg lie Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 ctg acc tgc ttt cat ttt ggc ggt tat cat cae gaa cae cae ctg cae 672 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac 720 Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 acc gca tga 729 Thr Ala <210> 10 <211> 242 <212> PRT <213> Paracoccus marcusii <400> 10 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 ' 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala Val Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 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Glu Leu Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asn Arg Cys Ala lie Asp His 50 . 55 60 gaa ttt ate ttt ctg ggg ccg gtg ttg cag gag cta aat tta gee cag 240 Glu Phe lie Phe Leu Gly Pro Val Leu Gln Glu Leu Asn Leu Ala Gln 65 70 75 80 tat ggt ttg gaa tat tta ttt tgt gac ccc agt gtt ttt tgt ccg ggg 288 Tyr Gly Leu Glu Tyr Leu Phe Cys Asp Pro Ser Val Phe Cys Pro Gly 85 90 95 ctg gat ggc caá get ttt atg age tac cgt tec cta gaa aaa acc tgt 336 Leu Asp Gly Gln Ala Phe Met Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Thr Cys 100 105 110 gee cae att gee acc tat age ccc cga gat gcg gaa aaa tat cgg caá 384 Ala His lie Ala Thr Tyr Ser Pro Arg Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Gln 115 120 125 ttt gtc aat tat tgg acg gat ttg etc aac gct gtc cag ect gct ttt 432 Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Leu Leu Asn Ala Val Gln Pro Ala Phe 130 135 140 aat gct ccg ccc cag gct tta cta gat tta gee ctg aac tat ggt tgg 480 Asn Ala Pro Pro Gln Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Trp 145 150 155 160 gaa aac tta aaa tec gtg ctg gcg ate gee ggg teg aaa acc aag gcg 528 Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ala lie Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ala 165 170 175 ttg gat ttt ate cgc act atg atc ggc tcc ccg gaa gat gtg ctc aat 576 Leu Asp Phe lie Arg Thr Met lie Gly Ser Pro Glu Asp Val Leu Asn 180 185 190 gaa tgg ttc gac age gaa cgg gtt aaa gct ect tta gct aga cta tgt 624 Glu Trp Phe Asp Ser Glu Arg Val Lys Ala Pro Leu Ala Arg Leu Cys 195 200 205 teg gaa att ggc gct ecc cea tcc caá aag ggt agt age tcc ggc atg 672 Ser Glu lie Gly Ala Pro Pro Ser Gln Lys Gly Ser Ser Ser Gly Met 210 215 220 atg atg gtg gee atg cgg cat ttg gag gga att gee aga cea aaa gga 720 Met Met Val Ala Met Arg His Leu Glu Gly lie Ala Arg Pro Lys Gly 225 230 235 240 ggc act gga gee ctc acá gaa gee ttg gtg aag tta gtg caá gee caá 768 Gly Thr Gly Ala Leu Thr Glu Ala Leu Val Lys Leu Val Gln Ala Gln 245 250 255 ggg gga aaa atc ctc act gac caá acc gtc aaa cgg gta ttg gtg gaa 816 Gly Gly Lys lie Leu Thr Asp Gln Thr Val Lys Arg Val Leu Val Glu 260 265 270 aac aac cag gcg atc ggg gtg gag gta gct aac gga gaa cag tac cgg 864 Asn Asn Gln Ala lie Gly Val Glu Val Ala Asn Gly Glu Gln Tyr Arg 275 280 285 gee aaa aaa ggc gtg att tet aac atc gat gee cgc cgt tta ttt ttg 912 Ala Lys Lys Gly Val lie Ser Asn lie Asp Ala Arg Arg Leu Phe Leu 290 295 300 caá ttg gtg gaa ccg ggg gee cta gee aag gtg aat caá aac cta ggg 960 Gln Leu Val Glu Pro Gly Ala Leu Ala Lys Val Asn Gln Asn Leu Gly 305 310 315 320 gaa cga ctg gaa cgg cgc act gtg aac aat aac gaa gee att tta aaa 1008 Glu Arg Leu Glu Arg Arg Thr Val Asn Asn Asn Glu Ala lie Leu Lys 325 330 335 atc gat tgt gee ctc tcc ggt tta ecc cae ttc act gee atg gee ggg 1056 lie Asp Cys Ala Leu Ser Gly Leu Pro His Phe Thr Ala Met Ala Gly 340 345 350 ccg gag gat cta acg gga act att ttg att gee gac teg gta cgc cat 1104 Pro Glu Asp Leu Thr Gly Thr lie Leu lie Ala Asp Ser Val Arg His 355 360 365 gtc gag gaa gee cae gee ctc att gee ttg ggg caá att ecc gat gct 1152 Val Glu Glu" Ala His Ala Leu lie Ala Leu Gly Gln lie Pro Asp Ala 370 375 380 aat ccg tet tta tat ttg gat att ecc act gta ttg gac ecc acc atg 1200 Asn Pro Ser Leu Tyr Leu Asp lie Pro Thr Val Leu Asp Pro Thr Met 385 390 395 400 gee ecc ect ggg cag cae acc ctc tgg atc gaa ttt ttt gee ecc tac 1248 Ala Pro Pro Gly Gln His Thr Leu Trp lie Glu Phe Phe Ala Pro Tyr 405 410 415 cgc ate gcc ggg ttg gaa ggg acá ggg tta atg ggc acá ggt tgg acc 1296 Arg lie Ala Gly Leu Glu Gly Thr Gly Leu Met Gly Thr Gly Trp Thr 420 425 430 gat gag tta aag gaa aaa gtg gcg gat cgg gtg att gat aaa tta acg 1344 Asp Glu Leu Lys Glu Lys Val Ala Asp Arg Val lie Asp Lys Leu Thr 435 440 445 gac tat gcc ect aac cta aaa tet ctg ate att ggt cgc cga gtg gaa 1392 Asp Tyr Ala Pro Asn Leu Lys Ser Leu lie lie Gly Arg Arg Val Glu 450 455 460 agt ecc gcc gaa ctg gcc caá cgg ctg gga agt tac aac ggc aat gtc 1440 Ser Pro Ala Glu Leu Ala Gln Arg Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Asn Val 465 470 475 480 tat cat ctg gat atg agt ttg gac caá atg atg ttc etc cgg ect cta 1488 Tyr His Leu Asp Met Ser Leu Asp Gln Met Met Phe Leu Arg Pro Leu 485 490 495 ceg gaa att 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lie Ala Thr Tyr Ser Pro Arg Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Gln 115 120 125 Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Leu Leu Asn Ala Val Gln Pro Ala Phe 130 135 140 Asn Ala Pro Pro Gln Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Trp 145 150 155 160 Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ala lie Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ala 165 170 175 Leu Asp Phe lie Arg Thr Met lie Gly Ser Pro Glu Asp Val Leu Asn 180 185 190 Glu Trp Phe Asp Ser Glu Arg Val Lys Ala Pro Leu Ala Arg Leu Cys 195 200 205 Ser Glu lie Gly Ala Pro Pro Ser Gln Lys Gly Ser Ser Ser Gly Met 210 215 220 Met Met Val Ala Met Arg His Leu Glu Gly lie Ala Arg Pro Lys Gly 225 230 235 240 Gly Thr Gly Ala Leu Thr Glu Ala Leu Val Lys Leu Val Gln Ala Gln 245 250 255 Gly Gly Lys lie Leu Thr Asp Gln Thr Val Lys Arg Val Leu Val Glu 260 265 270 Asn Asn Gln Ala lie Gly Val Glu Val Ala Asn Gly Glu Gln Tyr Arg 275 280 285 Ala Lys Lys Gly Val lie Ser Asn lie Asp Ala Arg Arg Leu Phe Leu 290 295 300 Gln Leu Val Glu Pro Gly Ala Leu Ala Lys Val Asn Gln Asn Leu Gly 305 310 315 320 Glu Arg Leu Glu Arg Arg Thr Val Asn Asn Asn Glu Ala lie Leu Lys 325 330 335 lie Asp Cys Ala Leu Ser Gly Leu Pro His Phe Thr Ala Met Ala Gly 340 345 350 Pro Glu Asp Leu Thr Gly Thr lie Leu lie Ala Asp Ser Val Arg His 355 360 365 Val Glu Glu Ala His Ala Leu lie Ala Leu Gly Gln lie Pro Asp Ala 370 375 380 Asn Pro Ser Leu Tyr Leu Asp lie Pro Thr Val Leu Asp Pro Thr Met 385 390 395 400 Ala Pro Pro Gly Gln His Thr Leu Trp lie Glu Phe Phe Ala Pro Tyr 405 410 415 Arg lie Ala Gly Leu Glu Gly Thr Gly Leu Met Gly Thr Gly Trp Thr 420 425 430 Asp Glu Leu Lys Glu Lys Val Ala Asp Arg Val lie Asp Lys Leu Thr 435 440 445 Asp Tyr Ala Pro Asn Leu Lys Ser Leu lie lie Gly Arg Arg Val Glu 450 455 460 Ser Pro Ala Glu Leu Ala Gln Arg Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Asn Val 465 470 475 480 Tyr His Leu Asp Met Ser Leu Asp Gln Met Met Phe Leu Arg Pro Leu 485 490 495 Pro Glu lie Ala Asn Tyr Gln Thr Pro lie Lys Asn Leu Tyr Leu Thr 500 505 510 Gly Ala Gly Thr His Pro Gly Gly Ser lie Ser Gly Met Pro Gly Arg 515 520 525 Asn Cys Ala Arg Val Phe Leu Lys Gln Gln Arg Arg Phe Trp 530 535 540 <210> 13 <211> 776 <212> ADN <213> Bradyrhizobium sp <220> <221> CDS <222> (1) .. (774) <223> <400> 13 atg cat gca gca acc gee aag gct act gag ttc ggg gee tet cgg cgc 48 Met His Ala Ala Thr Ala Lys Ala Thr Glu Phe Gly Ala Ser Arg Arg 1 5 10 15 gac gat gcg agg cag cgc cgc gtc ggt etc acg ctg gee gcg gtc ate 96 Asp Asp Ala Arg Gln Arg Arg Val Gly Leu Thr Leu Ala Ala Val lie 20 25 30 ate gee gee tgg ctg gtg ctg cat gtc ggt ctg atg ttc ttc tgg ceg 144 lie Ala Ala Trp Leu Val Leu His Val Gly Leu Met Phe Phe Trp Pro 35 40 45 ctg acc ctt cae age ctg ctg ceg gct ttg ect ctg gtg gtg ctg cag 192 Leu Thr Leu His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Gln 50 55 60 acc tgg etc tat gta ggc ctg ttc ate ate gcg cat gac tgc atg cae 240 Thr Trp Leu Tyr Val Gly Leu Phe lie lie Ala His Asp Cys Met His 65 70 75 80 ggc tcg ctg gtg ccg ttc aag ccg cag gtc aac cgc cgt atc gga cag 288 Gly Ser Leu Val Pro Phe Lys Pro Gln Val Asn Arg Arg lie Gly Gln 85 90 95 ctc tgc ctg ttc ctc tat gcc ggg ttc tcc ttc gac gct ctc aat gtc 336 Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val 100 105 110 gag cae cae aag cat cae cgc cat ecc ggc acg gcc gag gat ecc gat 384 Glu His His Lys His His Arg His Pro Gly Thr Ala Glu Asp Pro Asp 115 120 125 ttc gac gag gtg ccg ccg cae ggc ttc tgg cae tgg ttc gcc age ttt 432 Phe Asp Glu Val Pro Pro His Gly Phe Trp His Trp Phe Ala Ser Phe 130 135 140 ttc ctg cae tat ttc ggc tgg aag cag gtc gcg atc atc gca gcc gtc 480 Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala lie lie Ala Ala Val 145 150 155 160 tcg ctg gtt tat cag ctc gtc ttc gcc gtt ecc ttg cag aac atc ctg 528 Ser Leu Val Tyr Gln Leu Val Phe Ala Val Pro Leu Gln Asn lie Leu 165 170 175 ctg ttc tgg gcg ctg ecc ggg ctg ctg tcg gcg ctg cag ctg ttc acc 576 Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr 180 185 190 ttc ggc acc tat ctg ccg cae aag ccg gcc acg cag ecc ttc gcc gat 624 Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Ala Thr Gln Pro Phe Ala Asp 195 200 205 cgc cae aac gcg cgg acg age gaa ttt ecc gcg tgg ctg tcg ctg ctg 672 Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu, Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu 210 215 220 acc tgc ttc cae ttc ggc ttt cat cae gag cat cat ctg cat ecc gat 720 Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp 225 230 235 240 gcg ccg tgg tgg cgg ctg ccg gag atc aag cgg cgg gcc ctg gaa agg 768 Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu lie Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg 245 250 255 cgt gac ta 776 Arg Asp <210> 14 <211> 258 <212> P T <213> Bradyrhizobium sp. <400> 14 Met His Ala Ala Thr Ala Lys Ala Thr Glu Phe Gly Ala Ser Arg Arg 1 5 10 15 Asp Asp ALa Arg Gln Arg Arg Val Gly Leu Thr Leu Ala Ala Val lie 20 25 30 lie Ala Ala Trp Leu Val Leu His Val Gly Leu Met Phe Phe Trp Pro 35 40 45 Leu Thr Leu His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Gln 50 55 60 Thr Trp Leu Tyr Val Gly Leu Phe lie lie Ala His Asp Cys Met His 65 70 75 80 Gly Ser Leu Val Pro Phe Lys Pro Gln Val Asn Arg Arg lie Gly Gln 85 90 95 Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val 100 105 110 Glu His His Lys His His Arg His Pro Gly Thr Ala Glu Asp Pro Asp 115 120 125 Phe Asp Glu Val Pro Pro His Gly Phe Trp His Trp Phe Ala Ser Phe 130 135 140 Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala lie lie Ala Ala Val 145 150 155 160 Ser Leu Val Tyr Gln Leu Val Phe Ala Val Pro Leu Gln Asn lie Leu 165 170 175 Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr 180 185 190 Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Ala Thr Gln Pro Phe Ala Asp 195 200 205 Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu 210 215 220 Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp 225 230 235 240 Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu lie Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg 245 250 255 Arg Asp <210> 15 <211> 777 <212> ADN <213> Nostoc sp. <220> <221> CDS <222> (1) .. (777) <223> <400> 15 atg gtt cag tgt caá cea tea tct ctg cat tca gaa aaa ctg gtg tta 48 Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu 1 5 10 15 ttg tca tcg acá ate aga gat gat aaa aat att aat aag ggt ata ttt 96 Leu Ser Ser Thr lie Arg Asp Asp Lys Asn lie Asn Lys Gly lie Phe 20 25 30 att gee tgc ttt ate tta ttt tta tgg gca att agt tta ate tta tta 144 lie Ala Cys Phe lie Leu Phe Leu Trp Ala lie Ser Leu lie Leu Leu 35 40 45 etc tca ata gat acá tec ata att cat aag age tta tta ggt ata gee 192 Leu Ser lie Asp Thr Ser lie lie His Lys Ser Leu Leu Gly lie Ala 50 55 60 atg ctt tgg cag acc ttc tta tat acá ggt tta ttt att act gct cat 240 Met Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His 65 70 75 80 gat gee atg cae ggc gta gtt tat ecc aaa aat ecc aga ata aat aat 288 Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg lie Asn Asn 85 90 95 ttt ata ggt aag etc act cta ate ttg tat gga cta etc ect tat aaa 336 Phe lie Gly Lys Leu Thr Leu lie Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys 100 105 110 gat tta ttg aaa aaa cat tgg tta cae cae gga cat ect ggt act gat 384 Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp 115 120 125 tta gac ect gat tat tac aat ggt cat ecc caá aac ttc ttt ctt tgg 432 Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp 130 135 140 tat cta cat ttt atg aag tct tat tgg cga tgg acg caá att ttc gga 480 Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln lie Phe Gly 145 150 155 160 tta gtg atg att ttt cat gga ctt aaa aat ctg gtg cat ata cea gaa 528 Leu Val Met lie Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His lie Pro Glu 165 170 175 aat aat tta att ata ttt tgg atg ata ect tct att tta agt tca gta 576 Asn Asn Leu lie lie Phe Trp Met lie Pro Ser lie Leu Ser Ser Val 180 185 190 caá cta ttt tat ttt ggt acá ttt ttg ect cat aaa aag cta gaa ggt 624 Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly 195 200 205 ggt tat act aac ecc cat tgt gcg cgc agt ate cea tta ect ctt ttt 672 Gly Tyr Thr Asn Pro His Cys Ala Arg Ser lie Pro Leu Pro Leu Phe 210 215 220 tgg tct ttt gtt act tgt tat cac ttc ggc tac cac aag gaa cat cac Trp Ser Phe Val Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Lys Glu His His 225 230 235 240 gaa tac cct caá ctt cct tgg tgg aaa tta cct gaa gct cac aaa ata Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys lie 245 250 255 tct tta taa Ser Leu <210> 16 <211> 258 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 16 Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Thr lie Arg Asp Asp Lys Asn lie Asn Lys Gly lie Phe 20 25 30 lie Ala Cys Phe lie Leu Phe Leu Trp Ala lie Ser Leu lie Leu Leu 35 40 45 Leu Ser lie Asp Thr Ser lie lie His Lys Ser Leu Leu Gly lie Ala 50 55 60 Met Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His 65 70 75 80 Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg lie Asn Asn 85 90 95 Phe lie Gly Lys Leu Thr Leu lie Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp 115 120 125 Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp 130 135 140 Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln lie Phe Gly 145 150 155 160 Leu Val Met lie Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His lie Pro Glu 1S5 170 175 Asn Asn Leu lie lie Phe Trp Met lie Pro Ser lie Leu Ser Ser Val 180 185 190 Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly 195 200 205 Gly Tyr Thr Asn Pro His Cys Ala Arg Ser lie Pro Leu Pro Leu Phe 210 215 220 Trp Ser Phe Val Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Lys Glu His His 225 230 235 240 Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys lie 245 250 255 Ser Leu <210> 17 <211> 1608 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (3) .. (971) <223> <400> 17 ct acá ttt cae aag ecc gtg age ggt gca age gct ctg ecc cae ate 47 Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His lie 1 5 10 15 ggc cea ect ect cat etc cat cgg tea ttt gct gct acc acg atg ctg 95 Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu 20 25 30 teg aag ctg cag tea ate age gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc 143 Ser Lys Leu Gln Ser lie Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala 35 40 45 cgc gac ate acg cgg ecc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc teg 191 Arg Asp lie Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser 50 55 60 tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cea cag acá gag gag gcg ctg gga 239 Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly 65 70 75 acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cae age gcc gat gta gca 287 Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala 80 85 90 95 etc cag cag ctt gac cgg gct ate gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa 335 Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala lie Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys 100 105 110 cgg gag cag ctg tea tac cag gct gcc gcc att gca gca tea att ggc 383 Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala lie Ala Ala Ser lie Gly 115 120 125 gtg tea ggc att gcc ate ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cae 431 Val Ser Gly lie Ala lie Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His 130 135 140 atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc 479 Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu 145 150 155 ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat 527 Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr 160 165 170 175 gca cae aaa gcc ate tgg cat gag teg ect ctg ggc tgg ctg ctg cae 575 Ala His Lys Ala lie Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His 180 185 190 aag age cae cae acá ect cgc act gga ecc ttt gaa gcc aac gac ttg 623 Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu 195 200 205 ttt gca ate ate aat gga ctg ecc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc 671 Phe Ala lie lie Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly 210 215 220 ttc tgg ctg ecc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg 719 Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu 225 230 235 ggc ate acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cae gat ggc ctg 767 Gly lie Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu 240 245 250 255 gtg cae agg cgc ttt ecc acc ggg ecc ate gct ggc ctg ecc tac atg 815 Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro lie Ala Gly Leu Pro Tyr Met 260 265 270 aag cgc ctg acá gtg gcc cae cag cta cae cae age ggc aag tac ggt 863 Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly 275 280 285 ggc gcg ecc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cae att 911 Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His lie 290 295 300 cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959 Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp 305 310 315 tec aag cgg tag ggtgcggaac caggcacgct ggtttcacac ctcatgcctg 1011 Ser Lys Arg 320 tgataaggtg tggctagagc gatgcgtgtg agacgggtat gtcacggtcg actggtctga 1071 tggccaatgg catcggccat gtctggtcat cacgggctgg ttgcctgggt gaaggtgatg 1131 cacatcatca tgtgcggttg gaggggctgg cacagtgtgg gctgaactgg agcagttgtc 1191 caggctggcg ttgaatcagt gagggtttgt gattggcggt tgtgaagcaa tgactccgcc 1251 catattctat ttgtgggagc tgagatgatg gcatgcttgg gatgtgcatg gatcatggta 1311 gtgcagcaaa ctatattcac ctagggctgt tggtaggatc aggtgaggcc ttgcacattg 1371 catgatgtac tcgtcatggt gtgttggtga gaggatggat gtggatggat gtgtattctc 1431 agacgtagac cttgactgga ggcttgatcg agagagtggg ccgtattctt tgagagggga 1491 ggctcgtgcc agaaatggtg agtggatgac tgtgacgctg tacattgcag gcaggtgaga 1551 tgcactgtct cgattgtaaa atacattcag atgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1608 <210> 18 <211> 322 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 18 Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His lie Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser 20 25 30 Lys Leu Gln Ser lie Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg 35 40 45 Asp lie Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu 50 55 60 Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr 65 70 75 80 Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu 85 90 95 Gln Gln Leu Asp Arg Ala lie Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg 100 105 110 Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala lie Ala Ala Ser lie Gly Val 115 120 125 Ser Gly lie Ala lie Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met 130 135 140 Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu 145 150 155 160 Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala 165 170 175 His Lys Ala lie Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys 180 185 190 Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe 195 200 205 Ala lie lie Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe 210 215 220 Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly 225 230 235 240 lie Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val 245 250 255 His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro lie Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys 260 265 270 Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly 275 280 285 Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His lie Pro 290 295 300 Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser 305 310 315 320 Lys Arg <210> 19 <211> 1503 <212> ADN <213> tomate <220> <221> CDS <222> (1) .. (1503) <223> <400> 19 atg gat act ttg ttg aaa acc cea aat aac ctt gaa ttt ctg aac cea 48 Met Asp Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro 1 5 10 15 cat cat ggt ttt gct gtt aaa gct agt acc ttt aga tct gag aag cat 96 His His Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His 20 25 30 cat aat ttt ggt tct agg aag ttt tgt gaa act ttg ggt aga agt gtt 144 His Asn Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val 35 40 45 tgt gtt aag ggt agt agt agt gct ctt tta gag ctt gta ect gag acc 192 Cys Val Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu. Glu Leu Val Pro Glu Thr 50 55 60 aaa aag gag aat ctt gat ttt gag ctt ect atg tat gac ect tea aaa 240 Lys Lys Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys 65 70 75 80 ggg gtt gtt gtg gat ctt gct gtg gtt ggt ggt ggc ect gca gga ctt 288 Gly Val Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu 85 90 95 gct gtt gca cag caa gtt tct gaa gca gga ctc tct gtt tgt tca att 336 Ala Val Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser lie 100 105 110 gat ccg aat cct aaa ttg ata tgg cct aat aac tat ggt gtt tgg gtg 384 Asp Pro Asn Pro Lys Leu lie Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val 115 120 125 gat gaa ttt gag gct atg gac ttg tta gat tgt cta gat gct acc tgg 432 Asp Glu Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp 130 135 140 tct ggt gca gca gtg tac att gat gat aat acg gct aaa gat ctt cat 480 Ser Gly Ala Ala Val Tyr lie Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His 145 150 155 160 aga cct tat gga agg gtt aac cgg aaa cag ctg aaa tcg aaa atg atg 528 Arg Pro Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met 165 170 175 cag aaa tgt ata atg aat ggt gtt aaa ttc cae caa gee aaa gtt ata 576 Gln Lys Cys lie Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val lie 180 185 190 aag gtg att cat gag gaa tcg aaa tec atg ttg ata tgc aat gat ggt 624 Lys Val lie His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu lie Cys Asn Asp Gly 195 200 205 att act att cag gca acg gtg gtg ctc gat gca act ggc ttc tct aga 672 lie Thr lie Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg 210 215 220 tct ctt gtt cag tat gat aag cct tat aac ecc ggg tat caa gtt gct 720 Ser Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala 225 230 235 240 tat ggc att ttg gct gaa gtg gaa gag cae ecc ttt gat gta aac aag 768 Tyr Gly lie Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys 245 250 255 atg gtt ttc atg gat tgg cga gat tct cat ttg aag aac aat act gat 816 Met Val Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp 260 265 270 ctc aag gag aga aat agt aga ata cea act ttt ctt tat gca atg cea 864 Leu Lys Glu Arg Asn Ser Arg lie Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro 275 280 285 ttt tca tec aac agg ata ttt ctt gaa gaa acá tca ctc gta gct cgt 912 Phe Ser Ser Asn Arg lie Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg 290 295 300 cct ggc ttg cgt ata gat gat att caa gaa cga atg gtg gct cgt tta 960 Pro Gly Leu Arg lie Asp Asp lie Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu 305 310 315 320 aac cat ttg ggg ata aaa gtg aag age att gaa gaa gat gaa cat tgt 1008 Asn His Leu Gly lie Lys Val Lys Ser lie Glu Glu Asp Glu His Cys 325 330 335 cta ata cea atg ggt ggt cea ctt cea gta tta ect cag aga gtc gtt 1056 Leu lie Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val 340 345 350 gga ate ggt ggt acá gct ggc atg gtt cat cea tec acc ggt tat atg 1104 Gly lie Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met 355 360 365 gtg gca agg acá cta gct gcg gct ect gtt gtt gee aat gee ata att 1152 Val Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala lie lie 370 375 380 caá tac etc ggt tet gaa aga agt cat teg ggt aat gaa tta tec acá 1200 Gln Tyr Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr 385 390 395 400 gct gtt tgg aaa gat ttg tgg ect ata gag agg aga cgt caá aga gag 1248 Ala Val Trp Lys Asp Leu Trp Pro lie Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu 405 410 415 ttc ttc tgc ttc ggt atg gat att ctt ctg aag ctt gat tta ect gct 1296 Phe Phe Cys Phe Gly Met Asp lie Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala 420 425 430 acá aga agg ttc ttt gat gca ttc ttt gac tta gaa ect cgt tat tgg 1344 Thr Arg Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp 435 440 445 cat ggc ttc tta teg tet cga ttg ttt cta ect gaa etc ata gtt ttt 1392 His Gly Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu lie Val Phe 450 455 460 ggg ctg tet cta ttc tet cat gct tea aat act tet aga ttt gag ata 1440 Gly Leu Ser Leu Phe Ser His Ala Ser Asn Thr Ser Arg Phe Glu lie 465 470 475 480 atg acá aag gga act gtt cea tta gta aat atg ate aac aat ttg tta 1488 Met Thr Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met lie Asn Asn Leu Leu 485 490 495 cag gat aaa gaa tga 1503 Gln Asp Lys Glu 500 <210> 20 <211> 500 <212> PRT <213> tomate <400> 20 Met Asp Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro 1 5 10 15 His His Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His 20 25 30 His Asn Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val 35 40 45 Cys Val Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr 50 55 60 Lys Lys Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys 65 70 75 80 Gly Val Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu 85 90 95 Ala Val Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser lie 100 105 110 Asp Pro Asn Pro Lys Leu lie Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val 115 120 125 Asp Glu Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp 130 135 140 Ser Gly Ala Ala Val Tyr lie Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His 145 150 155 160 Arg Pro Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met 165 170 175 Gln Lys Cys lie Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val lie 180 185 190 Lys Val lie His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu lie Cys Asn Asp Gly 195 200 205 lie Thr lie Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg 210 215 220 Ser Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala 225 230 235 240 Tyr Gly lie Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys 245 250 255 Met Val Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp 260 265 270 Leu Lys Glu Arg Asn Ser Arg lie Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro 275 280 285 Phe Ser Ser Asn Arg lie Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg 290 295 300 Pro Gly Leu Arg lie Asp Asp lie Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn His Leu Gly lie Lys Val Lys Ser lie Glu Glu Asp Glu His Cys 325 330 335 Leu lie Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val 340 345 350 Gly lie Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met 355 360 365 Val Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala lie lie 370 375 380 Gln Tyr Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr 385 390 395 400 Ala Val Trp Lys Asp Leu Trp Pro lie Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu 405 410 415 Phe Phe Cys Phe Gly Met Asp lie Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala 420 425 430 Thr Arg Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp 435 440 445 His Gly Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu lie Val Phe 450 455 460 Gly Leu Ser Leu Phe Ser His Ala Ser A3n Thr Ser Arg Phe Glu lie 465 470 475 480 Met Thr Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met lie Asn Asn Leu Leu 485 490 495 Gln Asp Lys Glu 500 <210> 21 <211> 195 <212> ADN <213> papa/patata <220> <221> Intrón <222> (1) .. (195) <223> <400> 21 tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta 60 atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt 120 ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt 180 gttgatgtgc agctg 195 <210> 22 <211> 1155 <212> ADN <213> fíaematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (6) .. (995) <223> <400> 22 gaagc atg cag cta gca gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga age 50 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 gct gag gca etc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc age tet gac 98 Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp 20 25 30 gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag tac teg ctt ceg tea gag gag tea 146 Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser 35 40 45 gac gcg gee cgc ceg gga ctg aag aat gee tac aag cea cea ect tec 194 Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser 50 55 60 gac aca aag ggc ate aca atg gcg cta gct gtc ate ggc tec tgg gee 242 Asp Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala 65 70 75 gca gtg ttc etc cae gee att ttt caá ate aag ctt ceg acc tec ttg 290 Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu 80 85 90 95 gac cag ctg cae tgg ctg ecc gtg tea gat gee aca gct cag ctg gtt 338 Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val 100 105 110 age ggc age age age ctg ctg cae ate gtc gta gta ttc ttt gtc ctg 386 Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val Leu 115 120 125 gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt ate acc acg cat gat gct atg cat 434 Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His 130 135 140 ggc acc ate gee atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga 482 Gly Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg 145 150 155 gta tgc ate tec ttg tac gee tgg ttt gat tac aac atg ctg cae cgc 530 Val Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg 160 165 170 175 aag cat tgg gag cae cae aac cae act ggc gag gtg ggc aag gac ect 578 Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro 180 185 190 gac ttc cae agg gga aac ect ggc att gtg ecc tgg ttt gee age ttc 626 Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe 195 200 205 atg tec age tac atg teg atg tgg cag ttt gcg cgc etc gca tgg tgg 674 Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp 210 215 220 acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cea atg gcg aac ctg ctg gtg 722 Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro et Ala Asn Leu Leu Val 225 230 - 235 ttc atg gcg gcc gcg ccc ate ctg tec gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt 770 Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe 240 245 250 255 ggc acg tac atg ccc cae aag cct gag cct ggc gcc gcg tea ggc tct 818 Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser 260 265 270 tea cea gcc gtc atg aac tgg tgg aag teg cgc act age cag gcg tec 866 Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser 275 280 285 gac ctg gtc age ttt ctg acc tgc tac cae ttc gac ctg cae tgg gag 914 Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu 290 295 300 cae cae cgc tgg ccc ttt gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc 962 His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg 305 310 315 cgc ctg tct ggc cga ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc 1015 Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 320 325 cctgctgcca gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa agctgcaggc 1075 gctgctgccg gacacgctgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta ggggaggggg 1135 tttgtagctg tcgagcttgc 1155 <210> 23 <211> 329 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 23 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val 20 25 30 Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp 35 40 45 Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp 50 55 60 Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala Ala 65 70 75 80 Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp 85 90 95 Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu 115 120 125 Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly 130 135 140 Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val 145 150 155 160 Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys 165 170 175 His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp 180 185 190 Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met 195 200 205 Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr 210 215 220 Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe 225 230 235 240 Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly 245 250 255 Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His 290 295 300 His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 325 <210> 24 <211> 1111 <212> ADN <213> Haematococcus pluvxalis <220> <221> CDS <222> (4) .. (951) <223> <400> 24 tgc atg cta gag gca ctc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc age 48 Met Leu Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser 1 5 10 15 tct gac gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag tac teg ctt ceg tca gaa 96 Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu 20 25 30 gag tca gac gcg gcc cgc ceg gga ctg aag aat gcc tac aag cea cea 144 Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro 35 40 45 cct tcc gac aca aag ggc ate aca atg gcg cta gct gtc ate ggc tcc 192 Pro Ser Asp Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser 50 55 60 tgg gcc gca gtg ttc ctc cac gcc att ttt caá ate aag ctt ceg acc 240 Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr 65 70 75 tcc ttg gac cag ctg cac tgg ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag 288 Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln 80 85 90 95 ctg gtt age ggc age age age ctg ctg cac ate gtc gta gta ttc ttt 336 Leu Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe 100 105 110 gtc ctg gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt ate acc acg cat gat gct 384 Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala 115 120 125 atg cat ggc acc ate gcc atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg 432 Met His Gly Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu 130 135 140 ggc aga gta tgc ate tcc ttg tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg 480 Gly Arg Val Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu 145 150 155 cac cgc aag cat tgg gag cac cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag 528 His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys 160 155 170 175 gac cct gac ttc cac agg gga aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc 576 Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala 180 185 190 age ttc atg tcc age tac atg teg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca 624 Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala 195 200 205 tgg tgg acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cea atg gcg aac ctg 672 Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu 210 215 220 ctg gtg ttc atg gcg gcc gcg ccc atc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc 720 Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe 225 230 235 tac ttt ggc acg tac atg ccc cae aag ect gag ect ggc gcc gcg tea 768 Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser 240 245 250 255 ggc tet tea cea gcc gtc atg aac tgg tgg aag teg cgc act age cag 816 Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln 260 265 270 gcg tcc gac ctg gtc age ttt ctg acc tgc tac cae ttc gac ctg cae 864 Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His 275 280 285 tgg gag cae cae cgc tgg ccc ttc gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac 912 Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn 290 295 300 tgc cgc cgc ctg tet ggc cga ggt ctg gtt ect gcc tag ctggacacac 961 Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 305 310 315 tgcagtgggc cctgctgcca gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa 1021 agctgcaggc gctgctgccg gacacgttgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta 1081 ggggaggggg tttgtagctg tcgagcttgc 1111 <210> 25 <211> 315 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 25 Met Leu Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu 20 25 30 Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro 35 40 45 Ser Asp Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp 50 55 60 Ala Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser 65 70 75 80 Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu 85 90 95 Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val 100 105 110 Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met 115 120 125 His Gly Thr lie Ala Met Arg Asn. Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly 130 135 140 Arg Val Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His 145 150 155 160 Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp 165 170 175 Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser 180 185 190 Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp 195 200 205 Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu 210 215 220 Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr 225 230 235 240 Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly 245 250 255 Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala 260 265 270 Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp 275 280 285 Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys 290 295 300 Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 305 310 315 <210> 26 <211> 1031 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (6).. (1031) <223> <400> 26 gaagc atg cag cta gca gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga age 50 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 gct gag gca etc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc age tet gac 98 Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp 20 25 30 gtg ttg cgt acá tgg gcg acc cag tac tcg ctt ccg tea gag gag tea 146 Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser 35 40 45 gac gcg gcc cgc ccg gga ctg aag aat gcc tac aag cea cea ect tec 194 Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser 50 55 60 gac acá aag ggc ate acá atg gcg cta gct gtc ate ggc tec tgg gct 242 Asp Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala 65 70 75 gca gtg ttc etc cae gcc att ttt caá ate aag ctt ccg acc tec ttg 290 Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu 80 85 90 95 gac cag ctg cae tgg ctg ecc gtg tca gat gcc acá gct cag ctg gtt 338 Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val 100 105 110 age ggc age age -age ctg ctg cae ate gtc gta gta ttc ttt gtc ctg 386 Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val Leu 115 120 125 gag ttc ctg tac acá ggc ctt ttt ate acc acg cat gat gct atg cat 434 Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His 130 135 140 ggc acc ate gcc atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga 482 Gly Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg 145 150 155 gta tgc ate tec ttg tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg cae cgc 530 Val Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg 160 165 170 175 aag cat tgg gag cae cae aac cae act ggc gag gtg ggc aag gac ect 578 Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro 180 185 190 gac ttc cae agg gga aac ect ggc att gtg ecc tgg ttt gcc age ttc 626 Asp Phe His Arg .Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe 195 200 205 atg tec age tac atg tcg atg tgg cag ttt gcg cgc etc gca tgg tgg 674 Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp 210 215 220 acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cea atg gcg aac ctg ctg gtg 722 Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val 225 230 235 ttc atg gcg gcc gcg ecc ate ctg tec gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt 770 Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe 240 245 250 255 ggc acg tac atg ecc cae aag ect gag ect ggc gcc gcg tca ggc tet 818 Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser 260 265 270 tea cea gee gtc atg aac tgg tgg aag teg cgc act age cag gcg tec 866 Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser 275 280 285 gac ctg gtc age ttt ctg acc tgc tac cae ttc gac ctg cae tgg gag Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu 290 295 300 cae cae cgc tgg ecc ttt gee ecc tgg tgg gag ctg ecc aac tgc cgc His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg 305 310 315 cgc ctg tet ggc cga ggt ctg gtt ect gee gag caá aaa etc ate 1010 Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Glu Gln Lys Leu lie 320 325 330 gaa gag gat ctg aat age tag 1031 Glu Glu Asp Leu Asn Ser 340 <210> 27 <211> 341 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 27 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val 20 25 30 Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp 35 40 45 Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp 50 55 60 Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala Ala 65 70 75 80 Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp 85 90 95 Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu 115 120 125 Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly 130 135 140 Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val 145 150 155 160 Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys 165 170 175 His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp 180 185 190 Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met 195 200 205 Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr 210 215 220 Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe 225 230 235 240 Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly 245 250 255 Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His 290 295 300 His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu 325 330 335 Glu Asp Leu Asn Ser 340 <210> 28 <211> 777 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> promotor <222> (1) .. (777) <223> <400> 28 gagctcactc actgatttcc attgcttgaa aattgatgat gaactaagat caatccatgt 60 tagtttcaaa acaacagtaa ctgtggccaa cttagttttg aaacaacact aactggtcga 120 agcaaaaaga aaaaagagtt tcatcatata tctgatttga tggactgttt ggagttagga 180 ccaaacatta tctacaaaca aagacttttc tcctaacttg tgattccttc ttaaacccta 240 ggggtaatat tctattttcc aaggatcttt agttaaaggc aaatccggga aattattgta 300 atcatttggg gaaacatata aaagatttga gttagatgga agtgacgatt aatccaaaca 360 tatatatctc tttcttctta tttcccaaat taacagacaa aagtagaata ttggctttta 420 acaccaatat aaaaacttgc ttcacaccta aacacttttg tttactttag ggtaagtgca 480 aaaagccaac caaatccacc tgcactgatt tgacgtttac aaacgccgtt aagtcgatgt 540 ccgttgattt aaacagtgtc ttgtaattaa aaaaatcagt ttacataaat ggaaaattta 600 tcacttagtt ttcatcaact tctgaactta cctttcatgg attaggcaat actttccatt 660 tttagtaact caagtggacc ctttacttct tcaactccat ctctctcttt ctatttcact 720 tctttcttct cattatatct cttgtcctct ccaccaaatc tcttcaacaa aaagctt 777 <210> 29 <211> 22 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (22) <223> <400> 29 gcaagctcga cagctacaaa ce 22 <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (24) <223> <400> 30 gaageatgea gctagcagcg acag 24 <210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (30) <223> <400> 31 tgcatgctag aggcactcaa ggagaaggag 30 <210> 32 <211> 59 <212> ADN <213> artificial <220> <221> prxmer_umon <222> (1) ¦ · (59) <223> <400> 32 ctagctattc agatcctctt ctgagatgag tttttgctcg gcaggaacca gacctcggc 59 <210> 33 <211> 28 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_umon <222> (1) · · (28) <223> <400> 33 gagctcactc actgatttcc attgcttg 28 <210> 34 <211> 37 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (37) <223> <400> 34 cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37 <210> 35 <211> 34 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer unión <222> (1) .. (34) <223> <400> 35 atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34 <210> 36 <211> 25 <212> ADN <213> artificial <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (25) <223> <400> 36 taagcttttt gttgaagaga tttgg 25 <210> 37 <211> 212 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> Intrón <222> (1)..(212) <223> <400> 37 gtcgactacg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 60 gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 120 gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 180 aaatttgttg atgtgcaggt atcaccggat ce 212 <210> 38 <211> 1830 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> CDS <222> (141) .. (1691) <223> <400> 38 ggcacgaggc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttgttga gagacactcc aatccaaaca 60 gatacaaggc gtgactggat atttctctct cgttcctaac aacagcaacg aagaagaaaa 120 agaatcatta ctaacaatca atg agt atg aga gct gga cac atg acg gca aca 173 Met Ser et Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr 1 5 10 atg gcg gct ttt aca tgc cct agg ttt atg act age ate aga tac acg 221 Met Ala Ala Phe Thr Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser lie Arg Tyr Thr 15 20 25 aag caá att aag tgc aac gct gct aaa age cag cta gtc gtt aaa caá 269 Lys Gln lie Lys Cys Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln 30 35 40 gag att gag gag gaa gaa gat tat gtg aaa gee ggt gga teg gag ctg 317 Glu lie Glu Glu Glu Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu 45 50 55 ctt ttt gtt caá atg caá cag aat aag tec atg gat gca cag tet age 365 Leu Phe Val Gln Met Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser 60 65 70 75 cta tec caá aag etc cea agg gta cea ata gga gga gga gga gac agt 413 Leu Ser Gln Lys Leu Pro Arg Val Pro lie Gly Gly Gly Gly Asp Ser 80 85 90 aac tgt ata ctg gat ttg gtt gta att ggt tgt ggt cct gct ggc ctt 461 Asn Cys lie Leu Asp Leu Val Val lie Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu 95 100 105 gct ctt gct gga gaa tea gee aag cta ggc ttg aat gtc gca ctt ate 509 Ala Leu Ala Gly Glu Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu lie 110 115 120 ggc cct gat ctt cct ttt aca aat aac tat ggt gtt tgg gag gat gaa 557 Gly Pro Asp Leu Pro Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu 125 130 135 ttt ata ggt ctt gga ctt gag ggc tgt att gaa cat gtt tgg cga gat 605 Phe lie Gly Leu Gly Leu Glu Gly Cys lie Glu His Val Trp Arg Asp 140 145 150 155 act gta gta tat ctt gat gac aac gat ecc att etc ata ggt cgt gee 653 Thr Val Val Tyr Leu Asp Asp Asn Asp Pro lie Leu lie Gly Arg Ala 160 165 170 tat gga cga gtt agt cgt gat tta ctt cac gag gag ttg ttg act agg 701 Tyr Gly Arg Val Ser Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg 175 180 185 tgc atg gag tea ggc gtt tea tat ctg age tec aaa gtg gaa cgg att 749 Cys Met Glu Ser Gly Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg lie 190 195 200 act gaa gct cea aat ggc cta agt etc ata gag tgt gaa ggc aat at Thr Glu Ala Pro Asn Gly Leu Ser Leu lie Glu Cys Glu Gly Asn II 205 210 215 acá att cea tgc agg ctt gct act gtc gct tet gga gca gct tet gga 845 Thr lie Pro Cys Arg Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly 220 225 230 235 aaa ctt ttg cag tat gaa ctt ggc ggt ecc cgt gtt tgc gtt caá acá 893 Lys Leu Leu Gln Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr 240 245 250 gct tat ggt ata gag gtt gag gtt gaa age ata ecc tat gat cea age 941 Ala Tyr Gly lie Glu Val Glu Val Glu Ser lie Pro Tyr Asp Pro Ser 255 260 265 cta atg gtt ttc atg gat tat aga gac tac acc aaa cat aaa tet caá 989 Leu Met Val Phe Met Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln 270 275 280 tea cta gaa gca caá tat cea acá ttt ttg tat gtc atg cea atg tet 1037 Ser Leu Glu Ala Gln Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser 285 290 295 cea act aaa gta ttc ttt gag gaa act tgt ttg gct tea aaa gag gee 1085 Pro Thr Lys Val Phe Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala 300 305 310 315 atg ect ttt gag tta ttg aag acá aaa etc atg tea aga tta aag act 1133 Met Pro Phe Glu Leu Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr 320 325 330 atg ggg ate cga ata acc aaa act tat gaa gag gaa tgg tea tat att 1181 Met Gly lie Arg lie Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr lie 335 340 345 cea gta ggt gga tec tta cea aat acc gag caá aag aac ctt gca ttt 1229 Pro Val Gly Gly Ser Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe 350 355 360 ggt gct gct gct age atg gtg cat cea gee acá gga tat teg gtt gta 1277 Gly Ala Ala Ala Ser Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val 365 370 375 aga tea ctg tea gaa gct ect aat tat gca gca gta att gca aag att 1325 Arg Ser Leu Ser Glu Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val lie Ala Lys lie 380 385 390 395 tta ggg aaa gga aat tea aaa cag atg ctt gat cat gga aga tac acá 1373 Leu Gly Lys Gly Asn Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr 400 405 410 acc aac ate tea aag caá gct tgg gaa acá ctt tgg ecc ctt gaa agg 1421 Thr Asn lie Ser Lys Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg 415 420 425 aaa aga cag aga gca ttc ttt etc ttt gga tta gca ctg att gtc cag 1469 Lys Arg Gln Arg Ala Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu lie Val Gln 430 435 440 atg gat att gag ggg acc cgc acá ttc ttc cgg act ttc ttc cgc ttg 1517 Met Asp lie Glu Gly Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu 445 450 455 ccc acá tgg atg tgg tgg ggg ttt ctt gga tct tcg tta tea tca act 1565 Pro Thr Trp et Trp Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr 460 465 470 475 gac ttg ata ata ttt gcg ttt tac atg ttt ate ata gca ceg cat age 1613 Asp Leu lie lie Phe Ala Phe Tyr Met Phe lie lie Ala Pro His Ser 480 485 490 ctg aga atg ggt ctg gtt aga cat ttg ctt tct gac ceg acá gga gga 1661 Leu Arg Met Gly Leu Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly 495 500 505 acá atg tta aaa gcg tat etc acg ata taa ataactetag tcgcgatcag 1711 Thr Met Leu Lys Ala Tyr Leu Thr lie 510 515 tttagattat aggcacatct tgcatatata tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct tggggtaatg ctgatgaagt attttctgg <210> 39 <211> 516 <212> PRT <213> Tagetes erecta <400> 39 Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr Met Ala Ala Phe Thr 1 5 10 15 Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser lie Arg Tyr Thr Lys Gln lie Lys Cys 20 25 30 Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln Glu lie Glu Glu Glu 35 40 45 Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu Leu Phe Val Gln Met 50 55 60 Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser Leu Ser Gln Lys Leu 65 70 75 80 Pro Arg Val Pro lie Gly Gly Gly Gly Asp Ser Asn Cys lie Leu Asp 85 90 95 Leu Val Val lie Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Glu 100 105 110 Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu lie Gly Pro Asp Leu Pro 115 120 125 Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu Phe lie Gly Leu Gly 130 135 140 Leu Glu Gly Cys lie Glu His Val Trp Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu 145 150 155 160 Asp Asp Asn Asp Pro lie Leu lie Gly Arg Ala Tyr Gly Arg Val Ser 165 170 175 Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg Cys Met Glu Ser Gly 180 185 190 Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg lie Thr Glu Ala Pro Asn 195 200 205 Gly Leu Ser Leu lie Glu Cys Glu Gly Asn lie Thr lie Pro Cys Arg 210 215 220 Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Lys Leu Leu Gln Tyr 225 230 235 240 Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr Ala Tyr Gly lie Glu 245 250 255 Val Glu Val Glu Ser lie Pro Tyr Asp Pro Ser Leu Met Val Phe Met 260 265 270 Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln Ser Leu Glu Ala Gln 275 280 285 Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser Pro Thr Lys Val Phe 290 295 300 Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala Met Pro Phe Glu Leu 305 310 315 320 Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr Met Gly lie Arg lie 325 330 335 Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr lie Pro Val Gly Gly Ser 340 345 350 Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe Gly Ala Ala Ala Ser 355 360 365 Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val Arg Ser Leu Ser Glu 370 375 380 Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val lie Ala Lys lie Leu Gly Lys Gly Asn 385 390 395 400 Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr Thr Asn lie Ser Lys 405 -410 415 Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro' Leu Glu Arg Lys Arg Gln Arg Ala 420 425 430 Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu lie Val Gln Met Asp lie Glu Gly 435 440 445 Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu Pro Thr Trp Met Trp 450 455 460 Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asp Leu lie lie Phe 465 470 475 480 Ala Phe Tyr Met Phe lie lie Ala Pro His Ser Leu Arg Met Gly Leu 485 490 495 Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly Thr Met Leu Lys Ala 500 505 510 Tyr Leu Thr lie 515 <210> 40 <211> 445 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> fragmento sentido <222> (1) .. (445) <223> <400> 40 aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60 aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120 gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180 ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240 caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300 gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360 acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420 ctgtatactg gatttggttg tcgac 445 <210> 41 <211> 446 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> fragmento antisentido <222> (1) .. (446) <223> <400> 41 gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60 aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120 gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180 ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240 caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300 gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360 acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420 ctgtatactg gatttggttg gatcct 446 <210> 42 <211> 393 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> fragmento sentido <222> (1) .. (393) <223> <400> 42 aagctttgga ttagcactga ttgtccagat ggatattgag gggacccgca cattcttccg 60 gactttcttc cgcttgccca catggatgtg gtgggggttt cttggatctt cgttatcatc 120 aactgacttg ataatatttg cgttttacat gtttatcata gcaccgcata gcctgagaat 180 gggtctggtt agacatttgc tttctgaccc gacaggagga acaatgttaa aagcgtatct 240 cacgatataa ataactctag tcgcgatcag tttagattat aggcacatct tgcatatata 300 tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct 360 tggggtaatg ctgatgaagt attttctgtc gac 393 <210> 43 <211> 397 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> fragmento antisentido <222> (1) .. (397) <223> <400> 43 gaattctctt tggattagca ctgattgtcc agatggatat tgaggggacc cgcacattct 60 tccggacttt cttccgcttg cccacatgga tgtggtgggg gtttcttgga tcttcgttat 120 catcaactga cttgataata tttgcgtttt acatgtttat catagcaccg catagcctga 180 gaatgggtct ggttagacat ttgctttctg acccgacagg aggaacaatg ttaaaagcgt 240 atctcacgat ataaataact ctagtcgcga tcagtttaga ttataggcac atcttgcata 300 tatatatgta taaaccttat gtgtgctgta tccttacatc aacacagtca ttaattgtat 360 ttcttggggt aatgctgatg aagtattttc tggatcc 397 <210> 44 <211> 1537 <212> ADN <213> - <220> <221> promotor <222> (1) .. (1537) <223> <400> 44 gagctctaca aattagggtt actttattca ttttcatcca ttctctttat tgttaaattt 60 tgtacattta ttcaataata ttatatgttt attacaaatt ctcactttct tattcatacc 120 tattcactca agcctttacc atcttccttt tctatttcaa tactatttct acttcatttt 180 tcacgttttt aacatctttc tttatttctt gtccacttcg tttagggatg cctaatgtcc 240 caaatttcat ctctcgtagt aacacaaaac caatgtaatg ctacttctct ctacattttt 300 aatacaaata aagtgaaaca aaatatctat aaataaacaa atatatatat tttgttagac 360 gctgtctcaa cccatcaatt aaaaaatttt gttatatttc tactttacct actaaatttg 420 tttctcatat ttacctttta acccccacaa aaaaaaatta taaaaaagaa agaaaaaagc 480 taaaccctat ttaaatagct aactataaga tcttaaaatt atcctcatca gtgtatagtt 540 taattggtta ttaacttata acattatata tctatgacat atactctctc ctagctattt 600 ctcacatttt ttaacttaag aaaatagtca taacatagtc taaaattcaa acatccacat 660 gctctaattt gattaacaaa aagttagaaa tatttattta aataaaaaag actaataaat 720 atataaaatg aatgttcata cgcagaccca tttagagatg agtatgcttt cacatgctga 780 gattattttc aaaactaagg ttgtagcaat attaaatcaa taaaattatt ataaataaca 840 aaattaacct gctcgtgttt gctgtatatg ggaggctaca aaataaatta aactaaagat 900 gattatgttt tagacatttt ttctatctgt attagtttat acatattaat tcaggagctg 960 cacaacccaa ttctattttc gttccttggt ggctgggttt ctcacaaggt tcaatagtca 1020 atattaggtt ttattggact tttaatagta tcaaacaaat ctatgtgtga acttaaaaat 1080 tgtattaaat atttagggta acctgttgcc gtttttagaa taatgtttct tcttaataca 1140 cgaaagcgta ttgtgtattc attcatttgg cgcctcacat gcttcggttg gctcgcttta 1200 gtctctgcct tctttgtata ttgtactccc cctcttccta tgccacgtgt tctgagctta 1260 acaagccacg ttgcgtgcca ttgccaaaca agtcatttta acttcacaag gtccgatttg 1320 acctccaaaa caacgacaag tttccgaaca gtcgcgaaga tcaagggtat aatcgtcttt 1380 ttgaattcta tttctcttta tttaatagtc cctctcgtgt gatagttttt aaaagatttt 1440 taaaacgtag ctgctgttta agtaaatccc agtccttcag tttgtgcttt tgtgtgtttt 1500 gtttctctga tttacggaat ttggaaataa taagctt 1537 <210> 45 <211> 734 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> variación <222> (1)..(734) <223> <400> 45 ctaacaatca atgagtagag agctggacac atgacggcaa caatggcggc ttttacatgc 60 cctaggttta tgactagcat cagatacacg aagcaaatta agtgcaacgc tgctaaaagc 120 cagctagtcg ttaaacaaga gattgaggag gaagaagatt atgtgaaagc cggtggatcg 180 gagctgcttt ttgttcaaat gcaacagaat aagtccatgg atgcacagtc tagcctatcc 240 caaaaggtca ctccagactt aattgcttat aaataaataa atatgttttt taggaataat 300 gatatttaga tagattagct atcacctgtg ctgtggtgtg cagctcccaa gggtcttacc 360 gatagtaaaa tcgttagtta tgattaatac ttgggaggtg ggggattata ggctttgttg 420 tgagaatgtt gagaaagagg tttgacaaat cggtgtttga atgaggttaa atggagttta 480 attaaaataa agagaagaga aagattaaga gggtgatggg gatattaaag acggscaata 540 tagtgatgcc acgtagaaaa aggtaagtga aaacatacaa cgtggcttta aaagatggct 600 tggctgctaa tcaactcaac tcaactcata tcctatccat tcaaattcaa ttcaattcta 660 ttgaatgcaa agcaaagcaa aggttgtttg ttgttgttgt tgagagacac tccaatccaa 720 acagatacaa ggcg 734 <210> 46 <211> 280 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> variación <222> (1) .. (280) <223> <400> 46 gtcgagtatg gagttcaatt aaaataaaga gaagaraaag attaagaggg tgatggggat 60 attaaagacg gccaatrtag tgatgccacg taagaaaaag gtaagtgaaa acatacaacg 120 tggctttaaa agatggcttg gctgctaatc aactcaactc aactcatatc ctatccattc 180 aaattcaatt caattctatt gaatgcaaag caaagcaaag caaaggttgt ttgttgttgt 240 tgttgagaga cactccaatc caaacagata caaggcgtga 280 <210> 47 <211> 358 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> promotor sentido <222> (1)..(358) <223> <400> 47 aagcttaccg atagtaaaat cgttagttat gattaatact tgggaggtgg gggattatag 60 gctttgttgt gagaatgttg agaaagaggt ttgacaaatc ggtgtttgaa tgaggttaaa 120 tggagtttaa ttaaaataaa gagaagagaa agattaagag ggtgatgggg atattaaaga 180 cggccaatat agtgatgcca cgtagaaaaa ggtaagtgaa aacatacaac gtggctttaa 240 aagatggctt ggctgctaat caactcaact caactcatat cctatccatt caaattcaat 300 tcaattctat tgaatgcaaa gcaaagcaaa gcaaaggttg tttgttgttg ttgtcgac 358 <210> 48 <211> 361 <212> ADN ' <213> Tagetes erecta <220> <221> promotor antisentido <222> (1) .. (361) <223> <400> 48 ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt tatgattaat acttgggagg tgggggatta 60 taggctttgt tgtgagaatg ttgagaaaga ggtttgacaa atcggtgttt gaatgaggtt 120 aaatggagtt taattaaaat aaagagaaga gaaagattaa gagggtgatg gggatattaa 180 agacggccaa tatagtgatg ccacgtagaa aaaggtaagt gaaaacatac aacgtggctt 240 taaaagatgg cttggctgct aatcaactca actcaactca tatcctatcc attcaaattc 300 aattcaattc tattgaatgc aaagcaaagc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttggatc 360 c 361 <210> 49 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1)..(28) <223> <400> 49 gagctcactc actgatttcc attgcttg <210> 50 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1)..(37) <223> <400> 50 cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37 <210> 51 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (34) <223> <400> 51 atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34 <210> 52 <211> 25 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (25) <223> <400> 52 taagcttttt gttgaagaga tttgg 25 <210> 53 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (23) <223> <400> 53 gaaaatactt catcagcatt acc <210> 54 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 54 gtcgactacg taagtttctg cttctacc <210> 55 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (26) <223> <400> 55 ggatccggtg atacctgcac atcaac <210> 56 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 56 aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttg 28 <210> 57 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (29) <223> <400> 57 gtcgacaacc aaatccagta tacagttac 29 <210> 58 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) . · (30) <223> <400> 58 aggatccaac caaatccagt atacagttac 30 <210> 59 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 59 gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttg 28 <210> 60 <211> 25 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (25) <223> <400> 60 aagctttgga ttagcactga ttgtc <210> 61 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (29) <223> <400> 61 gtcgacagaa aatacttcat cagcattac <210> 62 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) · · (29) <223> <400> 62 ggatccagaa aatacttcat cagcattac 29 <210> 63 <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) · · (27) <223> <400> 63 gaattctctt tggattagca ctgattg 27 <210> 64 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (23) <223> <400> 64 cgccttgtat ctgtttggat tgg <210> 65 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) - · (24) <223> <400> 65 ctaacaatca atgagtatga gagc 24 <210> 66 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1)..(26) <223> <400> 66 agagcaaggc cagcaggacc acaacc <210> 67 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (26) <223> <400> 67 ccttgggagc ttttgggata ggctag 26 <210> 68 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) '.. (26) <223> <400> 68 tcacgccttg tatctgtttg gattgg <210> 69 <211> 15 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) - - (15) <223> <400> 69 gtcgagtatg gagtt 15 <210> 70 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 70 aagcttaccg atagtaaaat cgttagtt 28 <210> 71 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) - · (31) <223> <400> 71 ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt t 31 <210> 72 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <400> 72 gtcgacaaca acaacaaaca acctttgc <210> 73 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) ¦ · (28) <223> <400> 73 ggatccaaca acaacaaaca acctttgc 28 <210> 74 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 74 gtcgactttt tgttgaagag atttggtg <210> 75 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (28) <223> <400> 75 ctcgagactc actgatttcc attgi <210> 76 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (22) <223> <400> 76 gagctctaca aattagggtt ac <210> 77 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (23) <223> <400> 77 aagcttatta tttccaaatt ccg <210> 78 <211> 50 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> primer o cebador <222> (1) .. (50) <223> <400> 78 aagctttgca attcatacag aagtgagaaa aatgcagcta gcagcgacag <210> 79 <211> 1062 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> (32) .. (1021) <223> <400> 79 aagctttgca attcatacag aagtgagaaa a atg cag cta gca gcg aca gta 52 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val 1 5 atg ttg gag cag ctt acc gga age gct gag gca ctc aag gag aag gag 100 Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu 10 15 20 aag gag gtt gca ggc age tet gac gtg ttg cgt acá tgg gcg acc cag 148 Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln 25 30 35 tac teg ctt ceg tea gag gag tea gac gcg gee cgc ceg gga ctg aag 196 Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys 40 45 50 55 aat gee tac aag cea cea ect tec gac acá aag ggc ate acá atg gcg 244 Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly lie Thr Met Ala 60 65 70 cta gct gtc ate ggc tec tgg gee gca gtg ttc ctc cae gee att ttt 292 Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe 75 80 85 caá ate aag ctt ceg acc tec ttg gac cag ctg cae tgg ctg ecc gtg 340 Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val 90 95 100 tea gat gee acá gct cag ctg gtt age ggc age age age ctg ctg cae 388 Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His 105 110 115 ate gtc gta gta ttc ttt gtc ctg gag ttc ctg tac acá ggc ctt ttt 436 lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe 120 125 130 135 ate acc acg cat gat gct atg cat ggc acc ate gee atg aga aac agg 484 lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Met Arg Asn Arg 140 145 150 cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga gta tgc ate tec ttg tac gee tgg 532 Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp 155 160 165 ttt gat tac aac atg ctg cae cgc aag cat tgg gag cae cae aac cae 580 Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His 170 175 180 act ggc gag gtg ggc aag gac ect gac ttc cae agg gga aac ect ggc 628 Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly 185 190 195 att gtg ecc tgg ttt gee age ttc atg tec age tac atg teg atg tgg 676 lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp 200 205 210 215 cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt 724 Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly 220 225 230 gcg cea atg gcg aac ctg ctg gtg ttc atg gcg gee gcg ecc ate ctg 772 Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu 235 240 245 tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt ggc acg tac atg ccc cac aag cct 820 Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro 250 255 260 gag cct ggc gcc gcg tea ggc tet tea cea gcc gtc atg aac tgg tgg 868 Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp 265 270 275 aag teg cgc act age cag gcg tcc gac ctg gtc age ttt ctg acc tgc 916 Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys 280 285 290 295 tac cac ttc gac ctg cac tgg gag cac cac cgc tgg ccc ttt gcc ccc 964 Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro 300 305 310 tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc cgc ctg tet ggc cga ggt ctg gtt 1012 Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val 315 320 325 cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc cctgctgcca gctgggcatg c 1062 Pro Ala <210> 80 <211> 329 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 80 Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val 20 25 30 Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp 35 40 45 Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp 50 55 60 Thr Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Ala Val lie Gly Ser Trp Ala Ala 65 70 75 80 Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp 85 90 95 Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp. Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu 115 120 125 Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly 130 135 140 Thr lie Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val 145 150 155 160 Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys 165 170 175 His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp 180 185 190 Phe His Arg Gly Asn Pro Gly lie Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met 195 200 205 Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr 210 215 220 Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe 225 230 235 240 Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly 245 250 255 Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His 290 295 300 His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 325 <210> 81 <21l> 789 <212> ADN <213> Nostoc punctiforme <220> <221> CDS <222> (1) .. (789) <223> <400> 81 ttg aat ttt tgt gat aaa cea gtt age tat tat gtt gca ata gag caá Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala lie Glu Gln 1 5 10 15 tta agt gct aaa gaa gat act gtt tgg ggg ctg gtg att gtc ata gta Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val lie Val lie Val 20 25 30 att att agt ctt tgg gta gct agt ttg gct ttt tta cta gct att aat 144 lie lie Ser Leu Trp Val Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Ala lie Asn 35 40 45 tat gcc aaa gtc cea att tgg ttg ata cct att gca ata gtt tgg caá 192 Tyr Ala Lys Val Pro lie Trp Leu lie Pro lie Ala lie Val Trp Gln 50 55 60 atg ttc ctt tat acá ggg cta ttt att act gca cat gat gct atg cat 240 Met Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His Asp Ala Met His 65 70 75 80 ggg tca gtt tat cgt aaa aat ccc aaa att aat aat ttt ate ggt tca 288 Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys lie Asn Asn Phe lie Gly Ser 85 90 95 cta gct gta gcg ctt tac gct gtg ttt cea tat caá cag atg tta aag 336 Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys 100 105 110 aat cat tgc tta cat cat cgt cat cct gct age gaa gtt gac cea gat 384 Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp 115 120 125 ttt cat gat ggt aag aga acá aac gct att ttc tgg tat etc cat ttc 432 Phe His Asp Gly Lys Arg Thr Asn Ala lie Phe Trp Tyr Leu His Phe 130 135 140 atg ata gaa tac tec agt tgg caá cag tta ata gta cta act ate cta 480 Met lie Glu Tyr Ser Ser Trp Gln Gln Leu lie Val Leu Thr lie Leu 145 150 155 160 ttt aat tta gct aaa tac gtt ttg cae ate cat caá ata aat etc ate 528 Phe Asn Leu Ala Lys Tyr Val Leu His lie His Gln lie Asn Leu lie 165 170 175 tta ttt tgg agt att cct cea att tta agt tec att caá ctg ttt tat 576 Leu Phe Trp Ser lie Pro Pro lie Leu Ser Ser lie Gln Leu Phe Tyr 180 185 190 ttc gga acá ttt ttg cct cat cga gaa ccc aag aaa gga tat gtt tat 624 Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Arg Glu Pro Lys Lys Gly Tyr Val Tyr 195 200 205 ccc cat tgc age caá acá ata aaa ttg cea act ttt ttg tca ttt ate 672 Pro His Cys Ser Gln Thr lie Lys Leu Pro Thr Phe Leu Ser Phe lie 210 215 220 gct tgc tac cae ttt ggt tat cat gaa gaa cat cat gag tat ccc cat 720 Ala Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His 225 230 235 240 gta cct tgg tgg caá ctt cea tet gta tat aag cag aga gta ttc aac 768 Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Ser Val Tyr Lys Gln Arg Val Phe Asn 245 250 255 aat tca gta acc aat teg taa 789 Asn Ser Val Thr Asn Ser 260 <210> 82 <211> 262 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 82 Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala lie Glu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val lie Val lie Val 20 25 30 lie lie Ser Leu Trp Val Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Ala lie Asn 35 . 40 45 Tyr Ala Lys Val Pro lie Trp Leu lie Pro lie Ala lie Val Trp Gln 50 55 - 60 et Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His Asp Ala et His 65 70 75 80 Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys lie Asn Asn Phe lie Gly Ser 85 90 95 Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys 100 105 110 Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp 115 120 125 Phe His Asp Gly Lys Arg Thr Asn Ala lie Phe Trp Tyr Leu His Phe 130 135 140 Met lie Glu Tyr Ser 'Ser Trp Gln Gln Leu lie Val Leu Thr lie Leu 145 150 155 160 Phe Asn Leu Ala Lys Tyr Val Leu His lie His Gln lie Asn Leu lie 165 170 175 Leu Phe Trp Ser lie Pro Pro lie Leu Ser Ser lie Gln Leu Phe Tyr 180 185 190 Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Arg Glu Pro Lys Lys Gly Tyr Val Tyr 195 200 205 Pro His Cys Ser Gln Thr lie Lys Leu Pro Thr Phe Leu Ser Phe lie 210 215 220 Ala Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His 225 230 235 240 Val Pro Tr Trp Gln Leu Pro Ser Val Tyr Lys Gln Arg Val Phe Asn 245,' - 250 255 Asn Ser Val Thr Asn Ser 260 <210> 83 <211> 762 <212> ADN <213> Nostoc punctiforme <220> <221> CDS <222> (1)..(762) <223> <400> 83 gtg ate cag tta gaa caá cea ctc agt cat caá gca aaa ctg act cca 48 Val lie Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro 1 5 10 15 gta ctg aga agt aaa tct cag ttt aag ggg ctt ttc att gct att gtc 96 Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe lie Ala lie Val 20 25 30 att gtt age gca tgg gtc att age ctg agt tta tta ctt tec ctt gac 144 lie Val Ser Ala Trp Val lie Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp 35 40 45 ate tea aag cta aaa ttt tgg atg tta ttg cct gtt ata cta tgg caá 192 lie Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val lie Leu Trp Gln 50 55 60 acá ttt tta tat acg gga tta ttt att acá tct cat gat gee atg cat 240 Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ser His Asp Ala Met His 65 70 75 80 ggc gta gta ttt ecc caá aac acc aag att aat cat ttg att gga acá 288 Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys. lie Asn His Leu lie Gly Thr 85 90 95 ttg acc cta tec ctt tat ggt ctt tta cca tat caá aaa cta ttg aaa 336 Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys 100 105 110 aaa cat tgg tta cae cae cae aat cca gca age tea ata gac ceg gat 384 Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser lie Asp Pro Asp 115 120 125 ttt cae aat ggt aaa cae caá agt ttc ttt gct tgg tat ttt cat ttt 432 Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe 130 135 140 atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caá ata att gcg ttg act att att 480 Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln lie lie Ala Leu Thr lie lie 145 150 155 160 tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat ate cca agt gat aat cta act 528 Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr lie Leu His lie Pro Ser Asp Asn Leu Thr 165 170 175 tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tea tta caá tta ttc tat 576 Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr 180 185 190 ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cea ata ggg ggt tat gtt cag 624 Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro lie Gly Gly Tyr Val Gln 195 200 205 cct cat tgt gcc caá acá att age cgt cct att tgg tgg tea ttt ate 672 Pro His Cys Ala Gln Thr lie Ser Arg Pro lie Trp Trp Ser Phe lie 210 215 220 acg tgc tat cat ttt ggc tac cae gag gaa cat cae gaa tat cct cat 720 Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His 225 230 235 240 att tct tgg tgg cag tta cea gaa att tac aaa gca aaa tag 762 lie Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu lie Tyr Lys Ala Lya 245 250 <210> 84 <211> 253 <212> P T <213> Nostoc punctiforme <400> 84 Val lie Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro 1 5 10 15 Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe lie Ala lie Val 20 25 30 lie Val Ser Ala Trp Val lie Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp 35 40 45 lie Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val lie Leu Trp Gln 50 55 60 Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ser His Asp Ala Met His 65 70 75 80 Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys lie Asn His Leu lie Gly Thr 85 90 95 Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys 100 105 110 Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser lie Asp Pro Asp 115 120 125 Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe 130 135 140 Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln lie lie Ala Leu Thr lie lie 145 150 155 160 Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr lie Leu His lie Pro Ser Asp Asn Leu Thr 165 170 175 Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr 180 185 190 Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro lie Gly Gly Tyr Val Gln 195 200 205 Pro His Cys Ala Gln Thr lie Ser Arg Pro lie Trp Trp Ser Phe lie 210 215 220 Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His 225 230 235 240 lie Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu lie Tyr Lys Ala Lys 245 250 <210> 85 <211> 804 <212> ADN <213> Synechococcus WH8102 <220> <221> CDS <222> (1) .. (804) <223> <400> 85 atg aaa acg acá aga tct att tcg tgg cea teg act tgc tgg cat cae 48 Met Lys Thr Thr Arg Ser lie Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His 1 5 10 15 cag ceg agt tgc tea age tgg gtg gca aat gag ttc age cct cag gee 96 Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala 20 25 30 etc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tea gee tgg ctg etc 144 Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu lie Gly Ser Ala Trp Leu Leu 35 40 45 tcc ctg ggc ctg age tac acc ctg cea ctt gat cag acg cct ggg ctg 192 Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu 50 55 60 ttg att ggc age ttg att ctg etc aga gca ttt ctg cae acc ggg ctg 240 Leu lie Gly Ser Leu lie Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu 65 70 75 80 ttc ate gtt gee cae gat tcc atg cae gee agt ctg gtt ceg ggt cat 288 Phe lie Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His 85 90 95 ecc gga ttg aac cgc tgg ate ggc aaa gtg tat ttg ttg gtg tat gca 336 Pro Gly Leu Asn Arg Trp lie Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala 100 105 110 ggc ttg tct tat gag cgt tgt tcc cgc aac cae aga cgt cat cac ctg 384 Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu 115 120 125 gca ccg gag acg ttc cag gat cct gac tac caá cgt tgc acc aat aac 432 Ala Pro Glü Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn 130 135 140 aac ate cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg 480 Asn lie Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met 145 150 155 ' 160 cgg caá ctg tta aat cta age tgt ctt tgg ctg gcg cta ate att etc 528 Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu lie lie Leu 165 170 175 aac ggt tct gat etc cct gct cag ate atg cat ctg ctg ttg ttc age 576 Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln lie Met His Leu Leu Leu Phe Ser 180 185 190 gtt ctg ccg ttg ate ate agt tcc tgt caá ttg ttt cta gtg gga acc 624 Val Leu Pro Leu lie lie Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr 195 200 205 tgg tta ecc cac cga cgt ggg gee acg acá cga ccg ggc gtg acá acg 672 Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr 210 215 220 cgc age ctg gct ttg cat cea gee etc tct ttc gca gct tgt tac aac 720 Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn 225 230 235 240 ttt ggc tat cat cgt gaa cat cat gaa teg cct tcc acá ecc tgg ttt 768 Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe 245 250 255 cag ctg cea caá ctt cga aat gaa tea ttc act tga 804 Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr 260 265 <210> 86 <211> 267 <212> PRT <213> Synechococcus WH8102 <400> 86 Met Lys Thr Thr Arg Ser lie Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His 1 5 10 15 Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala 20 25 30 Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu lie Gly Ser Ala Trp Leu Leu 35 40 45 Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu 50 55 60 Leu lie Gly Ser Leu lie Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu 65 70 75 80 Phe lie Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His 85 90 95 Pro Gly Leu Asn Arg Trp lie Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala 100 105 110 Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu 115 120 125 Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn 130 135 140 Asn lie Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met 145 150 155 160 Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu lie lie Leu 165 170 175 Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln lie Met His Leu Leu Leu Phe Ser 180 185 190 Val Leu Pro Leu lie lie Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr 195 200 205 Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr 210 215 220 Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn 225 230 235 240 Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe 245 250 255 Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr 260 265 <210> 87 <211> 33 <212> 7ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1)..(33) <223> <400> 87 gcatgctcta gaccttataa agatattttg tga 33 <210> 88 <211> 33 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (33) <223> <400> 88 gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac cat <210> 89 <211> 805 <212> ADN <213> Nostoc sp. variedad PCC7120 <220> <221> variación <222> (1) .. (805) <223> <400> 89 gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac catcatctct gcattcagaa aaactggtgt 60 tattgtcatc gacaatcaga gatgataaaa atattaataa gggtatattt attgcctgct 120 ttatcttatt tttatgggca attagtttaa tcttattact ctcaatagat acatccataa 180 ttcataagag cttattaggt atagccatgc tttggcagac cttcttatat acaggtttat 240 ttattactgc tcatgatgcc atgcacggcg tagtttatcc caaaaatccc agaataaata 300 attttatagg taagctcact ctaatcttgt atggactact cccttataaa gatttattga 360 aaaaacattg gttacaccac ggacatcctg gtactgattt agaccctgat tattacaatg 420 gtcatcccca aaacttcttt ctttggtatc tacattttat gaagtcttat tggcgatgga 480 cgcaaatttt cggattagtg atgatttttc atggacttaa aaatctggtg catataccag 540 aaaataattt aattatattt tggatgatac cttctatttt aagttcagta caactatttt 600 attttggtac atttttgcct cataaaaagc tagaaggtgg ttatactaac ccccattgtg 660 cgcgcagtat cccattacct cttttttggt cttttgttac ttgttatcac ttcggctacc 720 acaaggaaca tcacgaatac cctcaacttc cttggtggaa attacctgaa gctcacaaaa 780 tatctttata aggtctagag catgc 805 <210> 90 <211> 35 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (35) <223> <400> 90 gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgacc <210> 91 <211> 44 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (44) <223> <400> 91 aagcttgagc tcggttgatc agaagaagaa gaagaagatg <210> 92 <211> 653 <212> ADN <213> Arabidopsis thal <220> <221> promotor <222> (1) .. (653) <223> <400> 92 gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgaccagcga acgcagaata ccttgttgtg 60 taatacttta cccgtgtaaa tcaaaaacaa aaaggctttt gagctttttg tagttgaatt 120 tctctggctg atcttttctg tacagattca tatatctgca gagacgatat cattgattat 180 ttgagcttct tttgaactat ttcgtgtaat ttgggatgag agctctatgt atgtgtgtaa 240 actttgaaga caacaagaaa ggtaacaagt gagggaggga tgactccatg tcaaaataga 300 tgtcataaga ggcccatcaa taagtgcttg agcccattag ctagcccagt aactaccaga 360 ttgtgagatg gatgtgtgaa cagttttttt tttgatgtag gactgaaatg tgaacaacag 420 gcgcatgaaa ggctaaatta ggacaatgat aagcagaaat aacttatcct ctctaacact 480 tggcctcaca ttgcccttca cacaatccac acacatccaa tcacaacctc atcatatatc 540 tcccgctaat ctttttttct ttgatctttt tttttttgct tattattttt ttgactttga 600 tctcccatca gttcatcttc ttcttcttct tctgatcaac cgagctcaag ctt 653 <210> 93 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1)..(28) <223> <400> 93 gagctcactc actgatttcc attgcttg <210> 94 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1) .. (30) <223> <400> 94 aagcttgagc tctttgttga agagatttgg <210> 95 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_union <222> (1) ¦ · (37) <223> <400> 95 cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37 <210> 96 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <221> primer_unión <222> (1)..(34) <223> <400> 96 atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34 <210> 97 <211> 831 <212> ADN <213> Haematococcus pluvialis <220> <221> CDS <222> ( 1 ) . . ( 831 ) <223> <400> 97 atg cea tcc gag tcg tea gac gca gct cgt cct gtg ttg aag cac gcc 48 Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Val Leu Lys His Ala 1 5 10 15 tat aaa cct cea gca tet gac gcc aag ggc ate act atg gcg ctg acc 96 Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr 20 25 30 ate att ggc acc tgg acc gca gtg ttt tta cac gca ata ttc caá ate 144 lie lie Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie 35 40 45 agg cta ceg acá tcc atg gac cag ctt cac tgg ttg cct gtg tcc gaa 192 Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu 50 55 60 gcc acá gcc cag ctg ttg ggc gga age age age cta ttg cac ate gcc 240 Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala 65 70 75 80 gca gtc ttc att gta ctt gag ttt ctg tac act ggt cta ttc ate acc 288 Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr 85 90 95 acg cat gat gca atg cat ggc acc ata gct ttg agg aae agg cag etc 336 Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg Asn Arg Gln Leu 100 105 110 aat gat etc ctt ggc aae ate tgc ata tea ctg tac gcc tgg ttt gac 384 Asn Asp Leu Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp 115 120 125 tac age atg cac tgg gag cac cac aae cat act ggc gaa gtg ggg aaa 432 Tyr Ser Met His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys 130 135 140 gac cct gac ttc cac aaa gga aat cct ggc ctt gtc ecc tgg ttc gcc 480 Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe Ala 145 150 155 160 age ttc atg tec age tac atg tec ctg tgg cag ttt gee cgg ctg gca 528 Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala 165 170 175 tgg tgg gca gtg gtg atg caá acg ttg ggg gee ecc atg gcg aat etc 576 Trp Trp Ala Val Val Met Gln Thr Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu 180 185 190 cta gtc ttc atg gct gca gee cea ate ttg tea gca ttc cgc etc ttc 624 Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe 195 200 205 tac ttc ggc act tac ctg cea cae aag ect gag cea ggc ect gca gca 672 Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala Ala 210 215 220 ggc tet cag gtc atg tet tgg ttc agg gee aag acá agt gag gca tet " 720 Gly Ser Gln Val Met Ser Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala Ser 225 230 235 240 gat gtg atg age ttc ctg acá tgc tac cae ttt gac ctg ttt gee ecc 768 Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu Phe Ala Pro 245 250 255 tgg tgg cag ctg ecc cae tgc cgc cgc ctg tet ggg cgt ggc ctg gtg 816 Trp Trp Gln Leu Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val 260 265 270 ect gee ttg gca tga 831 Pro Ala Leu Ala 275 <210> 98 <211> 276 <212> PRT <213> Haematococcus pluvialis <400> 98 Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Val Leu Lys His Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr 20 25 30 lie lie Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gln lie 35 40 45 Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu 50 55 60 Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala 65 70 75 80 Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr 85 90 95 Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg Asn Arg Gln Leu 100 105 110 Asn Asp Leu Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp 115 120 125 Tyr Ser Met His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys 130 135 140 Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe Ala 145 150 155 160 Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala 165 170 175 Trp Trp Ala Val Val Met Gln Thr Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu 180 185 190 Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe 195 200 205 Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala Ala 210 215 220 Gly Ser Gln Val Met Ser Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala Ser 225 230 235 240 Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu Phe Ala Pro 245 250 255 Trp Trp Gln Leu Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val 260 265 270 Pro Ala Leu Ala 275 <210> 99 <211> 729 <212> ADN <213> Paracoccus sp. BIC1143 <220> <221> CDS <222> (1)..(729) <223> <400> 99 atg age gca cat gee ctg ecc aag gca gat ctg acc gee acc age ctg Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 ate gtc teg ggc ggc ate ate gee gct tgg ctg gee ctg cat gtg cat lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc ate ctg gcg atc gca 144 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala lie Ala 35 40 45 aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg 192 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 cat gac gcg atg cae ggg tcg gtg gtg ceg ggg cgt ceg cgc gee aat 240 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gee gga ttt tcg tgg 288 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 cgc aag atg atc gtc aag cae atg gee cat cae cgc cat gee gga acc 336 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ceg gtc cgc tgg tac gee 384 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctt ggg gat cgc tgg atg tac 480 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 gtg gtc ttc tgg ceg ctg ceg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser lie Leu Ala Ser lie Gln Leu Phe 165 170 175 gtg ttc ggc acc tgg ctg ceg cae cgc ccc ggc cae gac gcg ttc ceg 576 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 gac cgc cae aat gcg cgg tcg tcg cgg atc age gac ccc gtg tcg ctg 624 Asp Arg -His Asn Ala Arg Ser Ser Arg lie Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 ctg acc tgc ttt cae ttt ggc ggt tat cat cae gaa cae cae ctg cae 672 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 ceg acg gtg ceg tgg tgg cgc ctg ccc age acc cgc acc aag ggg gac 720 Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 acc gca tga 729 Thr Ala <210> 100 <211> 242 <212> PRT <213> Paracoccus sp. MBIC1143 <400> 100 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 lie Val Ser Gly Gly lie lie Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro lie Leu Ala lie Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe lie lie Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met lie Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 " 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 Arg Phe lie Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 " 135 140 Val lie Val Thr Val Tyr Ala Leu lie Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser lie Leu Ala Ser lie Gln Leu Phe 165 170 175 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg lie Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 Thr Ala <210> 101 <211> 735 <212> ADN <213> Brevundimonas aurantiaca <220> <221> CDS <222> (1) .. (735) <223> <400> 101 atg acc gcc gcc gtc gcc gag cca cgc acc gtc ccg cgc cag acc tgg 48 Met Thr Ala Ala Val Ala Glu Pro Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Trp 1 5 10 15 ate ggt ctg acc ctg gcg gga atg ate gtg gcg gga tgg gcg gtt ctg 96 lie Gly Leu Thr Leu Ala Gly Met lie Val Ala Gly Trp Ala Val Leu 20 25 30 cat gtc tac ggc gtc tat ttt cae cga tgg ggg ccg ttg acc ctg gtg 144 His Val Tyr Gly Val Tyr Phe His Arg Trp Gly Pro Leu Thr Leu Val 35 40 45 ate gcc ccg gcg ate gtg gcg gtc cag acc tgg ttg teg gtc ggc ctt 192 lie Ala Pro Ala lie Val Ala Val Gln Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu 50 55 60 ttc ate gtc gcc cat gac gcc atg tac ggc tec ctg gcg ccg gga cgg 240 Phe lie Val Ala His Asp Ala Met Tyr Gly Ser Leu Ala Pro Gly Arg 65 70 75 80 ccg cgg ctg aac gcc gca gtc ggc cgg ctg acc ctg ggg etc tat gcg 288 Pro Arg Leu Asn Ala Ala Val Gly Arg Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Ala 85 90 95 ggc ttc cgc ttc gat cgg ctg aag acg gcg cae cae gcc cae cae gcc 336 Gly Phe Arg Phe Asp Arg Leu Lys Thr Ala His His Ala His His Ala 100 105 110 gcg ecc ggc acg gcc gac gac ccg gat ttt cae gcc ccg gcg ecc cgc 384 Ala Pro Gly Thr Ala Asp Asp Pro Asp Phe His Ala Pro Ala Pro Arg 115 120 125 gcc ttc ctt ecc tgg ttc ctg aac ttc ttt cgc acc tat ttc ggc tgg 432 Ala Phe Leu Pro Trp Phe Leu Asn Phe Phe Arg Thr Tyr Phe Gly Trp 130 135 140 cgc gag atg gcg gtc ctg acc gcc ctg gtc ctg ate gcc etc ttc ggc 480 Arg Glu Met Ala Val Leu Thr Ala Leu Val Leu lie Ala Leu Phe Gly 145 150 155 160 ctg ggg gcg cgg ccg gcc aat etc ctg acc ttc tgg gcc gcg ccg gcc 528 Leu Gly Ala Arg Pro Ala Asn Leu Leu Thr Phe Trp Ala Ala Pro Ala 165 170 175 ctg ctt tea gcg ctt cag etc ttc acc ttc ggc acc tgg ctg ccg cae 576 Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr Phe Gly Thr Trp Leu Pro His 180 185 190 cgc cae acc gac cag ccg ttc gcc gac gcg cae cae gcc cgc age age 624 Arg His Thr Asp Gln Pro Phe Ala Asp Ala His His Ala Arg Ser Ser 195 200 205 ggc tac ggc ccc gtg ctt tcc ctg ctc acc tgt ttc cac ttc ggc cgc 672 Gly Tyr Gly Pro Val Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Arg 210 215 220 cae cac gaa cac cat ctg age ccc tgg cgg ccc tgg tgg cgt ctg tgg 720 His His Glu His His Leu Ser Pro Trp Arg Pro Trp Trp Arg Leu Trp 225 230 235 240 cgc ggc gag tet tga 735 Arg Gly Glu Ser <210> 102 <211> 244 <212> PRT <213> Brevundimonas aurantiaca <400> 102 Met Thr Ala Ala Val Ala Glu Pro Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Trp 1 5 10 15 lie Gly Leu Thr Leu Ala Gly Met lie Val Ala Gly Trp Ala Val Leu 20 25 30 His Val Tyr Gly Val Tyr Phe His Arg Trp Gly Pro Leu Thr Leu Val 35 40 45 lie Ala Pro Ala lie Val Ala Val Gln Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu 50 55 60 Phe lie Val Ala His Asp Ala Met Tyr Gly Ser Leu Ala Pro Gly Arg 65 70 75 80 Pro Arg Leu Asn Ala Ala Val Gly Arg Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Ala 85 90 95 Gly Phe Arg Phe Asp Arg Leu Lys Thr Ala His His Ala His His Ala 100 105 110 Ala Pro Gly Thr Ala Asp Asp Pro Asp Phe His Ala Pro Ala Pro Arg 115 120 125 Ala Phe Leu Pro Trp Phe Leu Asn Phe Phe Arg Thr Tyr Phe Gly Trp 130 135 140 Arg Glu Met Ala Val Leu Thr Ala Leu Val Leu lie Ala Leu Phe Gly 145 150 155 160 Leu Gly Ala Arg Pro Ala Asn Leu Leu Thr Phe Trp Ala Ala Pro Ala 165 170 175 Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr Phe Gly Thr Trp Leu Pro His 180 185 190 Arg His Thr Asp Gln Pro Phe Ala Asp Ala His His Ala Arg Ser Ser 195 200 205 Gly Tyr Gly Pro Val Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Arg 210 215 220 His His Glu His His Leu Ser Pro Trp Arg Pro Trp Trp Arg Leu Trp 225 230 235 240 Arg Gly Glu Ser <210> 103 <211> 690 <212> ADN <213> Nodularia spumigena NSOR10 <220> <221> CDS <222> (I).. (690) <223> <400> 103 atg gcg atc gcc att att agt ata tgg gct atc age cta ggt ttg tta 48 Met Ala lie Ala lie lie Ser lie Trp Ala lie Ser Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 ctt tat att gat ata tec caá ttc aag ttt tgg atg ttg tta ceg etc . 96 Leu Tyr lie Asp lie Ser Gln Phe Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Leu 20 25 30 ata ttt tgg caá acá ttt tta tat acg gga tta ttt att acá gct cat 144 lie Phe Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His 35 40 45 gat gcc atg cat ggg gta gtt ttt ccc aaa aat ccc aaa atc aac cat 192 Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Lys Asn Pro Lys lie Asn His 50 55 60 ttc att ggc tea ttg tgc ctg ttt ctt tat ggt ctt tta ect tat caá 240 Phe lie Gly Ser Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln 65 70 75 80 aaa ctt tta aaa aag cat tgg cta cat cae cat aat cea gcc agt gaa 288 Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Glu 85 90 95 acá gat cea gat ttt cae aac ggg aag cag aaa aac ttt ttt gct tgg 336 Thr Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys Gln Lys Asn Phe Phe Ala Trp 100 105 110 tat tta tat ttt atg aag cgt tac tgg agt tgg tta caá att atc acá 384 Tyr Leu Tyr Phe Met Lys Arg Tyr Trp Ser Trp Leu Gln lie lie Thr 115 120 125 tta atg att att tat aac tta cta aaa tat ata tgg cat ttt cea gag 432 Leu Met lie lie Tyr Asn Leu Leu Lys Tyr lie Trp His Phe Pro Glu 130 135 140 gat aat atg act tat ttt tgg gta gtt ccc tca att tta agt tct tta 480 Asp Asn Met Thr Tyr Phe Trp Val Val Pro Ser lie Leu Ser Ser Leu 145 150 155 160 caá tta ttt tat ttt gga act ttt cta ccc cae agt gag cct gta gaa 528 Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Val Glu 165 170 175 ggt tat aaa gag cct cat cgt tcc caá act att age cgt ccc att tgg 576 Gly Tyr Lys Glu Pro His Arg Ser Gln Thr lie Ser Arg Pro lie Trp 180 185 190 tgg tca ttt ata act tgt tac cat ttt ggt tat cat tac gaa cat cat 624 Trp Ser Phe lie Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Tyr Glu His His 195 200 205 gaa tac ccc cat gtt cct tgg tgg caá tta cea gaa att tat aaa atg 672 Glu Tyr Pro His Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Glu lie Tyr Lys Met 210 215 220 tct aaa tca aat ttg tga 690 Ser Lys Ser Asn Leu 225 <210> 104 <211> 229 <212> PRT <213> Nodularia spumigena NSOR10 <400> 104 Met Ala lie Ala lie lie Ser lie Trp Ala lie Ser Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Tyr lie Asp lie Ser Gln Phe Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Leu 20 25 30 lie Phe Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Ala His 35 40 5 Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Lys Asn Pro Lys lie Asn His 50 55 60 Phe lie Gly Ser Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln 65 70 75 80 Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Glu 85 90 95 Thr Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys Gln Lys Asn Phe Phe Ala Trp 100 105 110 Tyr Leu Tyr Phe Met Lys Arg Tyr Trp Ser Trp Leu Gln lie lie Thr 115 120 125 Leu Met lie lie Tyr Asn Leu Leu Lys Tyr lie Trp His Phe Pro Glu 130 135 140 Asp Asn Met Thr Tyr Phe Trp Val Val Pro Ser lie Leu Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Val Glu 165 170 175 Gly Tyr Lys Glu Pro His Arg Ser Gln Thr lie Ser Arg Pro lie Trp 180 185 190 Trp Ser Phe lie Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Tyr Glu His His 195 200 205 Glu Tyr Pro His Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Glu lie Tyr Lys Met 210 215 220 Ser Lys Ser Asn Leu 225 <210> 105 <211> 1536 <212> ADN <213> Deinococcus radiodurans Rl <220> <221> CDS <222> (1) .. (1536) <223> <400> 105 atg ccg gat tac gac ctg ate gtc atg ggc gcg ggc cae aac gcg ctg 48 Met Pro Asp Tyr Asp Leu lie Val Met Gly Ala Gly His Asn Ala Leu 1 5 10 15 gtg act gct gee tac gee gee cgg gcg ggc ctg aaa gtc ggc gtg ttc 96 Val Thr Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Ala Gly Leu Lys Val Gly Val Phe 20 25 30 gag cgg cgg cae etc gtc ggc ggg gcg gtc age acc gag gag gtc gtg 144 Glu Arg Arg His Leu Val Gly Gly Ala Val Ser Thr Glu Glu Val Val 35 40 45 ecc ggt tac cgc ttc gac tac ggc ggc age gee cae ate ctg att cgg 192 Pro Gly Tyr Arg Phe Asp Tyr Gly Gly Ser Ala His lie Leu lie Arg 50 55 60 atg acg ecc ate gtg cgc gaa etc gaa etc acg cgg cae ggg ctg cat 240 Met Thr Pro lie Val Arg Glu Leu Glu Leu Thr Arg His Gly Leu His 65 70 75 80 tac etc gaa gtg gac ect atg ttt cae gct tec gac ggt gaa acg ecc 288 Tyr Leu Glu Val Asp Pro Met Phe His Ala Ser Asp Gly Glu Thr Pro 85 90 95 tgg ttc att cae cgc gac gee ggg cgg acc ate cgc gaa etg gac gaa 336 Trp Phe lie His Arg Asp Ala Gly Arg Thr lie Arg Glu Leu Asp Glu 100 105 110 aag ttt ccc ggg cag ggc gac gcc tac ggg cgc ttt ctc gac gat tgg 384 Lys Phe Pro Gly Gln Gly Asp Ala Tyr Gly Arg Phe Leu Asp Asp Trp 115 120 125 acá ccc ttc gcg cgc gcc gtg gcc gac ctg ttc aac tcg gcg ccg ggg 432 Thr Pro Phe Ala Arg Ala Val Ala Asp Leu Phe Asn Ser Ala Pro Gly 130 135 140 ccg ctc gac ctg ggc aaa atg gtg atg cgc age ggc cag ggc aag gac 480 Pro Leu Asp Leu Gly Lys Met Val Met Arg Ser Gly Gln Gly Lys Asp 145 150 155 160 tgg aac gag cag ctc ccg cgc ate ctg cgg ccc tac ggc gac gtg gcg 528 Trp Asn Glu Gln Leu Pro Arg lie Leu Arg Pro Tyr Gly Asp Val Ala 165 170 175 cgc gag tac ttc age gag gag cgc gtg cgg gct ccc ctg acc tgg atg 576 Arg Glu Tyr Phe Ser Glu Glu Arg Val Arg Ala Pro Leu Thr Trp Met 180 185 190 gcg gcc cag age ggc ccc cea ccc tcg gac ccg ctg age gcg ccc ttt 624 Ala Ala Gln Ser Gly Pro Pro Pro Ser Asp Pro Leu Ser Ala Pro Phe 195 200 205 ttg ctg tgg cae ccg ctc tac cae gaa ggc ggc gtg gcg cgg ccc aaa 672 Leu Leu Trp His Pro Leu Tyr His Glu Gly Gly Val Ala Arg Pro Lys 210 215 220 ggc ggc age ggc ggc ctg acc aaa gcc ctg cgc cgg gcc acc gag gcc 720 Gly Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Ala Leu Arg Arg Ala Thr Glu Ala 225 230 235 240 gaa ggc ggc gag gtc ttc acc gac gcg ccg gtc aag gaa att ctg gtc 768 Glu Gly Gly Glu Val Phe Thr Asp Ala Pro Val Lys Glu lie Leu Val 245 250 255 aag gac ggc aag gcg cag ggc ate cgg ctg gaa age ggc gag acg tac 816 Lys Asp Gly Lys Ala Gln Gly lie Arg Leu Glu Ser Gly Glu Thr Tyr 260 265 270 acc gcc cgc gcc gtc gtg tcg ggc gtc cae ate ctg acc act gcg aat 864 Thr Ala Arg Ala Val Val Ser Gly Val His lie Leu Thr Thr Ala Asn 275 280 285 gcc ctg ccc gcc gaa tat gtc ect age gcc gcc agg aat gtg cgc gtg 912 Ala Leu Pro Ala Glu Tyr Val Pro Ser Ala Ala Arg Asn Val Arg Val 290 295 300 ggc aac ggc ttc ggc atg att ttg cgc ctc gcc ctc agt gaa aaa gtc 960 Gly Asn Gly Phe Gly Met lie Leu Arg Leu Ala Leu Ser Glu Lys Val 305 310 315 320 aaa tac cgt cae cae acc gag ccc gac tea cgc ate ggc ctg gga ttg 1008 Lys Tyr Arg His His Thr Glu Pro Asp Ser Arg lie Gly Leu Gly Leu 325 330 335 ctg ate aaa aac gag cgg caá ate atg cag ggc tac ggc gaa tac ctc 1056 Leu lie Lys Asn Glu Arg Gln lie Met Gln Gly Tyr Gly Glu Tyr Leu 340 345 350 gcc ggg cag ccc acc acc gac ccg ccc ctc gtc gcc atg age ttc agc 1104 Ala Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Pro Leu Val Ala Met Ser Phe Ser 355 360 365 gcg gtg gac gac tcg ctc gcc cea ccg aac ggc gac gtg ttg tgg ctg 1152 Ala Val Asp Asp Ser Leu Ala Pro Pro Asn Gly Asp Val Leu Trp Leu 370 375 380 tgg gcg cag tac tac ccc ttc gag ctc gcc acc ggg age tgg gaa acg 1200 Trp Ala Gln Tyr Tyr Pro Phe Glu Leu Ala Thr Gly Ser Trp Glu Thr 385 390 395 400 cgc acc gcc gaa gcg cgg gag aac ate ctg cgg gcc ttt gag cae tac 1248 Arg Thr Ala Glu Ala Arg Glu Asn lie Leu Arg Ala Phe Glu His Tyr 405 410 415 gcg ccg ggc acc cgc gac acg att gtg ggc gaa ctc gtg cag acg ccg 1296 Ala Pro Gly Thr Arg Asp Thr lie Val Gly Glu Leu Val Gln Thr Pro 420 425 430 cag tgg ctg gaa acc aac ctc ggc ctg cae cgg ggc aac gtg atg cae 1344 Gln Trp Leu Glu Thr Asn Leu Gly Leu His Arg Gly Asn Val Met His 435 440 445 ctg gaa atg tec ttc gac cag atg ttc tec ttc cgc ccc tgg ctg aaa 1392 Leu Glu Met Ser Phe Asp Gln Met Phe Ser Phe Arg Pro Trp Leu Lys 450 455 460 gcg age cag tac cgc tgg ccg ggc gtg cag ggg ctg tac ctc acc ggc 1440 Ala Ser Gln Tyr Arg Trp Pro Gly Val Gln Gly Leu Tyr Leu Thr Gly 465 470 475 480 gcc age acc cae ccc ggc gga ggc ate atg ggc gcc tcg gga cgc aac 1488 Ala Ser Thr His Pro Gly Gly Gly lie Met Gly Ala Ser Gly Arg Asn 485 490 495 gcg gcg cgg gtc ate gtg aag gac ctg acg cgg agg cgc tgg aaa tga 1536 Ala Ala Arg Val lie Val Lys Asp Leu Thr Arg Arg Arg Trp Lys 500 505 510 <210> 106 <211> 511 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans Rl <400> 106 Met Pro Asp Tyr Asp Leu lie Val Met Gly Ala Gly His Asn Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Ala Gly Leu Lys Val Gly Val Phe 20 25 30 Glu Arg Arg His Leu Val Gly Gly Ala Val Ser Thr Glu Glu Val Val 35 40 45 Pro Gly Tyr Arg Phe Asp Tyr Gly Gly Ser Ala His lie Leu lie Arg 50 55 60 Met Thr Pro lie Val Arg Glu Leu Glu Leu Thr Arg His Gly Leu His 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Val Asp Pro Met Phe His Ala Ser Asp Gly Glu Thr Pro 85 90 95 Trp Phe lie His Arg Asp Ala Gly Arg Thr lie Arg Glu Leu Asp Glu 100 105 110 Lys Phe Pro Gly Gln Gly Asp Ala Tyr Gly Arg Phe Leu Asp Asp Trp 115 120 125 Thr Pro Phe Ala Arg Ala Val Ala Asp Leu Phe Asn Ser Ala Pro Gly 130 135 140 Pro Leu Asp Leu Gly Lys Met Val Met Arg Ser Gly Gln Gly Lys Asp 145 150 155 160 Trp Asn Glu Gln Leu Pro Arg lie Leu Arg Pro Tyr Gly Asp Val Ala 165 170 175 Arg Glu Tyr Phe Ser Glu Glu Arg Val Arg Ala Pro Leu Thr Trp Met 180 185 190 Ala Ala Gln Ser Gly Pro Pro Pro Ser Asp Pro Leu Ser Ala Pro Phe 195 200 205 Leu Leu Trp His Pro Leu Tyr His Glu Gly Gly Val Ala Arg Pro Lys 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Ala Leu Arg Arg Ala Thr Glu Ala 225 230 235 240 Glu Gly Gly Glu Val Phe Thr Asp Ala Pro Val Lys Glu lie Leu Val 245 250 255 Lys Asp Gly Lys Ala Gln Gly lie Arg Leu Glu Ser Gly Glu Thr Tyr 260 265 270 Thr Ala Arg Ala Val Val Ser Gly Val His lie Leu Thr Thr Ala Asn 275 280 285 Ala Leu Pro Ala Glu Tyr Val Pro Ser Ala Ala Arg Asn Val Arg Val 290 295 300 Gly Asn Gly Phe Gly Met lie Leu Arg Leu Ala Leu Ser Glu Lys Val 305 310 315 320 Lys Tyr Arg His His Thr Glu Pro Asp Ser Arg lie Gly Leu Gly Leu 325 330 335 Leu lie Lys Asn Glu Arg Gln lie Met Gln Gly Tyr Gly Glu Tyr Leu 340 345 350 Ala Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Pro Leu Val Ala Met Ser Phe Ser 355 360 365 Ala Val Asp Asp Ser Leu Ala Pro Pro Asn Gly Asp Val Leu Trp Leu 370 375 380 Trp Ala Gln Tyr Tyr Pro Phe Glu Leu Ala Thr Gly Ser Trp Glu Thr 385 390 395 400 Arg Thr Ala Glu Ala Arg Glu Asn lie Leu Arg Ala Phe Glu His Tyr 405 410 415 Ala Pro Gly Thr Arg Asp Thr lie Val Gly Glu Leu Val Gln Thr Pro 420 425 430 Gln Trp Leu Glu Thr Asn Leu Gly Leu His Arg Gly Asn Val Met His 435 440 445 Leu Glu Met Ser Phe Asp Gln Met Phe Ser Phe Arg Pro Trp Leu Lys 450 455 460 Ala Ser Gln Tyr Arg Trp Pro Gly Val Gln Gly Leu Tyr Leu Thr Gly 465 470 475 480 Ala Ser Thr His Pro Gly Gly Gly lie Met Gly Ala Ser Gly Arg Asn 485 490 495 Ala Ala Arg Val lie Val Lys Asp Leu Thr Arg Arg Arg Trp Lys 500 505 510 <210> 107 <211> 1666 <212> ADN <213> Lycopersicon esculentúm <220> <221> CDS <222> (1)..(1494) <223> <400> 107 atg gaa gct ctt ctc aag cct ttt cea tet ctt tta ctt tec tet ect 48 Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro 1 5 10 15 acá ecc cat agg tet att ttc caá caá aat ecc tet ttt cta agt ecc 96 Thr Pro His Arg Ser lie Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro 20 25 30 acc acc aaa aaa aaa tea aga aaa tgt ctt ctt aga aac aaa agt agt 144 Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser 35 40 45 aaa ctt ttt tgt age ttt ctt gat tta gca ecc acá tea aag cea gag 192 Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu 50 55 60 tet tta gat gtt aac ate tea tgg gtt gat cct aat teg aat cgg gct 240 Ser Leu Asp Val Asn lie Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 caá ttc gac gtg ate att ate gga gct ggc ect gct ggg ctc agg cta 288 Gln Phe Asp Val lie lie lie Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu 85 90 95 gct gaa caá gtt tet aaa tat ggt att aag gta tgt tgt gtt gac ect 336 Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly lie Lys Val Cys Cys Val Asp Pro 100 105 110 tea cea ctc tcc atg tgg cea aat aat tat ggt gtt tgg gtt gat gag 384 Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu 115 120 125 ttt gag aat tta gga ctg gaa aat tgt tta gat cat aaa tgg ect atg 432 Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met 130 135 140 act tgt gtg cat ata aat gat aac aaa act aag tat ttg gga aga cea 480 Thr Cys Val His lie Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro 145 150 155 160 tat ggt aga gtt agt aga aag aag ctg aag ttg aaa ttg ttg aat agt 528 Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser 165 170 175 tgt gtt gag aac aga gtg aag ttt tat aaa gct aag gtt tgg aaa gtg 576 Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val 180 185 190 gaa cat gaa gaa ttt gag tet tea att gtt tgt gat gat ggt aag aag 624 Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser lie Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys 195 200 205 ata aga ggt agt ttg gtt gtg gat gca agt ggt ttt gct agt gat ttt 672 lie Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe 210 215 220 ata gag tat gac agg cea aga aac cat ggt tat caá att gct cat ggg 720 lie Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln lie Ala His Gly 225 230 235 240 gtt tta gta gaa gtt gat aat cat cea ttt gat ttg gat aaa atg gtg 768 Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val 245 250 255 ctt atg gat tgg agg gat tet cat ttg ggt aat gag cea tat tta agg 816 Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg 260 265 270 gtg aat aat gct aaa gaa cea acá ttc ttg tat gca atg cea ttt gat 864 Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp 275 280 285 aga gat ttg gtt ttc ttg gaa gag act tet ttg gtg agt cgt ect gtt 912 Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val 290 295 300 tta teg tat atg gaa gta aaa aga agg atg gtg gca aga tta agg cat 960 Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His 305 310 315 320 ttg ggg ate aaa gtg aaa agt gtt att gag gaa gag aaa tgt gtg atc 1008 Leu Gly lie Lys Val Lys Ser Val lie Glu Glu Glu Lys Cys Val lie 325 330 335 ect atg gga gga cea ctt ceg cgg att ect caá aat gtt atg gct att 1056 Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg lie Pro Gln Asn Val Met Ala lie 340 345 350 ggt ggg aat tea ggg ata gtt cat cea tea acá ggg tac atg gtg gct 1104 Gly Gly Asn Ser Gly lie Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala 355 360 365 agg age atg gct tta gca cea gta cta gct gaa gee atc gtc gag ggg 1152 Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala lie Val Glu Gly 370 375 380 ctt ggc tea acá aga atg ata aga ggg tet caá ctt tac cat aga gtt 1200 Leu Gly Ser Thr Arg Met lie Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val 385 390 395 400 tgg aat ggt ttg tgg ect ttg gat aga aga tgt gtt aga gaa tgt tat 1248 Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr 405 410 415 tea ttt ggg atg gag acá ttg ttg aag ctt gat ttg aaa ggg act agg 1296 Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg 420 425 430 aga ttg ttt gac gct ttc ttt gat ctt gat ect aaa tac tgg caá ggg 1344 Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly 435 440 445 ttc ctt tet tea aga ttg tet gtc aaa gaa ctt ggt tta etc age ttg 1392 Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu 450 455 460 tgt ctt ttc gga cat ggc tea aac atg act agg ttg gat att gtt acá 1440 Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp lie Val Thr 465 470 475 480 aaa tgt ect ctt ect ttg gtt aga ctg att ggc aat cta gca ata gag 1488 Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu lie Gly As Leu Ala lie Glu 485 490 495 age ctt tgaatgtgaa aagtttgaat cattttcttc attttaattt ctttgattat 1544 Ser Leu tttcatattt tctcaattgc aaaagtgaga taagagctac atactgtcaa caaataaact 1604 actattggaa agttaaaata tgtgtttgtt gtatgttatt ctaatggaat ggattttgta 1664 aa 1666 <210> 108 <211> 498 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 108 Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro 1 5 10 15 Thr Pro His Arg Ser lie Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro 20 25 30 Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser 35 40 45 Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu 50 55 60 Ser Leu Asp Val Asn lie Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 Gln Phe Asp Val lie lie lie Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu 85 90 95 Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly lie Lys Val Cys Cys Val Asp Pro 100 105 110 Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu 115 120 125 Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met 130 135 140 Thr Cys Val His lie Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser 165 170 175 Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val 180 185 190 Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser lie Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys 195 200 205 lie Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe 210 215 220 He Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln lie Ala His Gly 225 230 235 240 Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val 245 250 255 Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg 260 265 270 Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp 275 280 285 Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val 290 295 300 Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His 305 310 315 320 Leu Gly lie Lys Val Lys Ser Val lie Glu Glu Glu Lys Cys Val lie 325 330 335 Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg lie Pro Gln Asn Val Met Ala lie 340 345 350 Gly Gly Asn Ser Gly lie Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala 355 360 365 Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala lie Val Glu Gly 370 375 380 Leu Gly Ser Thr Arg Met lie Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val 385 390 395 400 Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr 405 410 415- Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg 420 425 430 Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly 435 440 445 Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu 450 455 460 Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp lie Val Thr 465 470 475 480 Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu lie Gly Asn Leu Ala lie Glu 485 490 495 Ser Leu <210> 109 <211> 1125 <212> ADN <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (20).. (946) <223> <400> 109 ttggtcatct ccacaatca atg gct gcc gcc gcc aga atc tcc gcc tcc tct 52 Met Ala Ala Ala Ala Arg lie Ser Ala Ser Ser 1 5 10 acc tea cga act ttt tat ttc cgt cat tea ccg ttt ctt ggc cca aaa 100 Thr Ser Arg Thr Phe Tyr Phe Arg His Ser Pro Phe Leu Gly Pro Lys 15 20 25 cct act teg acá acc tea cat gtt tet cca ate tet cct ttt tet ctt 148 Pro Thr Ser Thr Thr Ser His Val Ser Pro lie Ser Pro Phe Ser Leu 30 35 40 aat cta ggc cca att ttg agg tet aga aga aaa ecc agt ttc act gtt 196 Asn Leu Gly Pro lie Leu Arg Ser Arg Arg Lys Pro Ser Phe Thr Val 45 50 55 tgc ttt gtt ctc gag gat gag aag ctg aaa cct caa ttt gac gat gag 244 Cys Phe Val Leu Glu Asp Glu Lys Leu Lys Pro Gln Phe Asp Asp Glu 60 65 70 75 gct gag gat ttt gaa aag aag att gag gaa cag ate tta gct act cgc 292 Ala Glu Asp Phe Glu Lys Lys lie Glu Glu Gln lie Leu Ala Thr Arg 80 85 90 ttg gcg gag aaa ctg gct agg aag aaa teg gag agg ttt act tat ctt 340 Leu Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu 95 100 105 gtg gct gct ata atg tet agt ttt ggg att act tet atg gct gtt atg 388 Val Ala Ala lie Met Ser Ser Phe Gly lie Thr Ser Met Ala Val Met 110 . 115 120 gct gtt tat tac aga ttt teg tgg caa atg gag gga gga gaa gtt cct 436 Ala Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro 125 130 135 gta acc gaa atg ttg ggt acá ttt gct ctc tet gtt ggt gct gct gta 484 Val Thr Glu Met Leu Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala Ala Val 140 145 150 155 gga atg gag ttt tgg gcg aga tgg gca cae aaa gca ctg tgg cat gct 532 Gly Met Glu Phe Trp Ala Arg Trp Ala His Lys Ala Leu Trp His Ala 160 165 170 tea cta tgg cae atg cat gag tea cae cae aaa cca aga gaa gga cct 580 Ser Leu Trp His Met His Glu Ser His His Lys Pro Arg Glu Gly Pro 175 180 185 ttt gag ctg aac gac gtt ttc gee ata acá aac gct gtt cca gca ata 628 Phe Glu Leu Asn Asp Val Phe Ala lie Thr Asn Ala Val Pro Ala lie 190 195 200 gee ctc ctc aac tat ggt ttc ttc cat aaa ggc ctc att gee gga cta 676 Ala Leu Leu Asn Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Leu lie Ala Gly Leu 205 210 215 tgc ttc ggt gct ggg cta ggg ate acá gta ttt gga atg gca tac atg 724 Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly lie Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met 220 225 230 235 ttt gtt cae gat ggt ttg gtt cae aag aga ttc cca gtt gga cct gta 772 Phe Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Val 240 245 250 gcc aat gta cct tat ctt agg aag gtg gct gct gct cat tcg ctt cat 820 Ala Asn Val Pro Tyr Leu Arg Lys Val Ala Ala Ala His Ser Leu His 255 260 265 cae tea gag aag ttc aat ggt gtc cea tat ggc ttg ttc ttc gga cct 868 His Ser Glu Lys Phe Asn Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Phe Gly Pro 270 275 280 aag gaa ctg gaa gaa gta gga ggg acg gaa gag ttg gaa aag gaa gtg 916 Lys Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Thr Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val 285 290 295 ata cga agg acg aga ctt tcg aaa gga tea tgaacgattg ttcataaaca 966 lie Arg Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Ser 300 305 tagaatgtca ttttacactt cttatcaatg aggaagggtg atttttgatg tatttgatag 1026 tagagaaaaa tgtagctctc ttgatgaaat gaatttgtat ttatgtaggc tcttcttatt 1086 cagtaagatt ttttcttttt tttgatctcg tgccgaatt 1125 <210> 110 <211> 309 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 110 et Ala Ala Ala Ala Arg lie Ser Ala Ser Ser Thr Ser Arg Thr Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Arg His Ser Pro Phe Leu Gly Pro Lys Pro Thr Ser Thr Thr 20 25 30 Ser His Val Ser Pro lie Ser Pro Phe Ser Leu Asn Leu Gly Pro lie 35 40 · 45 Leu Arg Ser Arg Arg Lys Pro Ser Phe Thr Val Cys Phe Val Leu Glu 50 55 60 Asp Glu Lys Leu Lys Pro Gln Phe Asp Asp Glu Ala Glu Asp Phe Glu 65 70 75 80 Lys Lys lie Glu Glu Gln lie Leu Ala Thr Arg Leu Ala Glu Lys Leu 85 90 95 Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val Ala Ala lie Met 100 105 110 Ser Ser Phe Gly lie Thr Ser Met Ala Val Met Ala Val Tyr Tyr Arg 115 120 125 Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Val Thr Glu Met Leu 130 135 140 Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala Ala Val Gly Met Glu Phe Trp 145 150 155 160 Ala Arg Trp Ala His Lys Ala Leu Trp His Ala Ser Leu Trp His Met 165 170 175 His Glu Ser His His Lys Pro Arg Glu Gly Pro Phe Glu Leu Asn Asp 180 185 190 Val Phe Ala lie Thr Asn Ala Val Pro Ala lie Ala Leu Leu Asn Tyr 195 200 205 Gly Phe Phe His Lys Gly Leu lie Ala Gly Leu Cys Phe Gly Ala Gly 210 215 220 Leu Gly lie Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly 225 230 235 240 Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Val Ala Asn Val Pro Tyr 245 250 255 Leu Arg Lys Val Ala Ala Ala His Ser Leu His His Ser Glu Lys Phe 260 265 . 270 Asn Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Phe Gly Pro Lys Glu Leu Glu Glu 275 280 285 Val Gly Gly Thr Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val lie Arg Arg Thr Arg 290 295 300 Leu Ser Lys Gly Ser 305 <210> 111 <211> 1779 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1779) <223> <400> 111 atg gat ctc cgt cgg agg cct cct aaa cea ceg gtt acc aac aac aac 48 Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn 1 5 10 15 aac tec aac gga tet ttc cgt tet tat cag cct cgc act tec gat gac 96 Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp 20 25 30 gat cat cgt cgc cgg gct acá acá att gct cct cea ceg aaa gca tec 144 Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr lle Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser 35 40 45 gac gcg ctt cct ctt ceg tta tat ctc acá aac gee gtt ttc ttc acg 192 Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr 50 55 . 60 ctc ttc ttc tcc gtc gcg tat tac ctc ctc cac cgg tgg cgt gac aag 240 Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys 65 70 75 80 ate cgt tac aat acg cct ctt cac gtc gtc act ate acá gaa ctc ggc 288 lie Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr lie Thr Glu Leu Gly 85 90 95 gee att att gct ctc ate gct teg ttt ate tat ctc cta ggg ttt ttt 336 Ala lie lie Ala Leu lie Ala Ser Phe lie Tyr Leu Leu Gly Phe Phe 100 · 105 110 ggt att gac ttt gtt cag tea ttt ate tea cgt gee tet ggt gat gct 384 Gly lie Asp Phe Val Gln Ser Phe lie Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala 115 120 125 tgg gat ctc gee gat acg ate gat gat gat gac cac cgc ctt gtc acg 432 Trp Asp Leu Ala Asp Thr lie Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr 130 135 140 tgc tet cea ceg act ceg ate gtt tcc gtt gct aaa tta cct aat ceg 480 Cys Ser Pro Pro Thr Pro lie Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Pro 145 150 155 160 gaa cct att gtt acc gaa teg ctt cct gag gaa gac gag gag att gtg 528 Glu Pro lie Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu lie Val 165 170 175 aaa teg gtt ate gac gga gtt att cea teg tac teg ctt gaa tet cgt 576 Lys Ser Val lie Asp Gly Val lie Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg 180 185 190 ctc ggt gat tgc aaa aga gcg gcg teg att cgt cgt gag gcg ttg cag 624 Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser lie Arg Arg Glu Ala Leu Gln 195 ' 200 205 aga gtc acc ggg aga teg att gaa ggg tta ceg ttg gat gga ttt gat 672 Arg Val Thr Gly Arg Ser lie Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp 210 215 220 tat gaa teg att ttg ggg caá tgc tgt gag atg cct gtt gga tac att 720 Tyr Glu Ser lie Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr lie 225 230 235 240 cag att cct gtt ggg att gct ggt cea ttg ttg ctt gat ggt tat gag 768 Gln lie Pro Val Gly lie Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu 245 250 255 tac tet gtt cct atg gct acá acc gaa ggt tgt ttg gtt gct age act 816 Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr 260 265 270 aac aga ggc tgc aag gct atg ttt ate tet ggt ggc gee acc agt acc 864 Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe lie Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr 275 280 285 gtt ctt aag gac ggt atg acc cga gca cct gtt gtt cgg ttc gct teg 912 Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser 290 295 300 gcg aga cga gct tcg gag ctt aag ttt ttc ttg gag aat cca gag aac 960 Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn 305 310 315 320 ttt gat act ttg gca gta gtc ttc aac agg tcg agt aga ttt gca aga 1008 Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg 325 330 335 ctg caá agt gtt aaa tgc acá ate gcg ggg aag aat gct tat gta agg 1056 Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr lie Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg 340 345 350 ttc tgt tgt agt act ggt gat gct atg ggg atg aat atg gtt tet aaa 1104 Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys 355 360 365 ggt gtg cag aat gtt ctt gag tat ctt acc gat gat ttc ect gac atg 1152 Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Thr Asp Asp Phe Pro Asp Met 370 375 380 gat gtg att gga ate tet ggt aac ttc tgt tcg gac aag aaa ect gct 1200 Asp Val lie Gly lie Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala 385 390 395 400 gct gtg aac tgg att gag gga cgt ggt aaa tea gtt gtt tgc gag gct 1248 Ala Val Asn Trp lie Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala 405 410 415 gta ate aga gga gag ate gtg aac aag gtc ttg aaa acg age gtg gct 1296 Val lie Arg Gly Glu lie Val Asn Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala 420 425 430 gct tta gtc gag etc aac atg etc aag aac cta gct ggc tet gct gtt 1344 Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val 435 440 445 gca ggc tet cta ggt gga ttc aac gct cat gee agt aac ata gtg tet 1392 Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala Hls Ala Ser Asn lie Val Ser 450 455 460 gct gta ttc ata gct act ggc caá gat cca gct caá aac gtg gag agt 1440 Ala Val Phe lie Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser 465 470 475 480 tet caá tgc ate acc atg atg gaa gct att aat gac ggc aaa gat ate 1488 Ser Gln Cys lie Thr Met Met Glu Ala lie Asn Asp Gly Lys Asp lie 485 490 495 cat ate tea gtc act atg cca tet ate gag gtg ggg acá gtg gga gga 1536 His lie Ser Val Thr Met Pro Ser lie Glu val Gly Thr val Gly Gly 500 505 510 gga acá cag ctt gca tet caá tea gcg tgt tta aac ctg etc gga gtt 1584 Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val 515 520 525 aaa gga gca age acá gag tcg ceg gga atg aac gca agg agg cta gcg 1632 Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala 530 535 540 acg ate gta gcc gga gca gtt tta gct gga gag tta tct tta atg tca 1680 Thr lie Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser 545 550 555 560 gca att gca gct gga cag ctt gtg aga agt cae atg aaa tac aat aga 1728 Ala lie Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg 565 570 575 tec age cga gac ate tct gga gca acg acá acg acá acá acá acá acá 1776 Ser Ser Arg Asp lie Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 580 585 590 tga 1779 <210> 112 <211> 592 <212> PRT <213> Arabidopsis thal <400> 112 M Meett AAsspp LLeeuu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn 1 Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp 20 25 30 Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr lie Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr 50 55 60 Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys 65 70 75 80 lie Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr lie Thr Glu Leu Gly 85 90 95 Ala lie lie Ala Leu lie Ala Ser Phe lie Tyr Leu Leu Gly Phe Phe 100 105 110 Gly lie Asp Phe Val Gln Ser Phe lie Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala 115 120 125 Trp Asp Leu Ala Asp Thr lie Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr 130 135 140 Cys Ser Pro Pro Thr Pro lie Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Pro 145 150 155 160 Glu Pro lie Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu lie Val 165 170 175 Lys Ser Val lie Asp Gly Val lie Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg 180 185 190 Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser lie Arg Arg Glu Ala Leu Gln 195 200 205 Arg Val Thr Gly Arg Ser lie Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp 210 215 220 Tyr Glu Ser lie Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr lie 225 230 235 240 Gln lie Pro Val Gly lie Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu 245 250 255 Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr 260 265 270 Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe lie Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr 275 280 285 Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser 290 295 300 Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn 305 310 315 320 Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg 325 330 335 Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr lie Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg 340 345 350 Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys 355 360 365 Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Thr Asp Asp Phe Pro Asp Met 370 375 380 Asp Val lie Gly lie Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala 385 390 395 400 Ala Val Asn Trp lie Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala 405 410 415 Val lie Arg Gly Glu lie Val Asn Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala 420 425 430 Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val 435 440 445 Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn lie Val Ser 450 455 460 Ala Val Phe lie Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser 465 470 475 480 Ser Gln Cys lie Thr Met Met Glu Ala lie Asn Asp Gly Lys Asp lie 485 490 495 His lie Ser Val Thr Met Pro Ser lie Glu Val Gly Thr Val Gly Gly 500 505 510 Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val 515 520 525 Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala 530 535 540 Thr lie Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser 545 550 555 560 Ala lie Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg 565 570 575 Ser Ser Arg Asp lie Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 580 585 590 <210> 113 <211> 1401 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana ISPH <220> <221> CDS <222> (1) .. (1401) <223> <400> 113 atg gct gtt gcg ctc caá ttc age cga tta tgc gtt cga ceg gat act 48 Met Ala Val Ala Leu Gln Phe Ser Arg Leu Cys Val Arg Pro Asp Thr 1 5 10 15 ttc gtg cgg gag aat cat ctc tet gga tec gga tet ctc cgc cgc cgg 96 Phe Val Arg Glu Asn His Leu Ser Gly Ser Gly Ser Leu Arg Arg Arg 20 25 30 aaa gct tta tea gtc cgg tgc teg tet ggc gat gag aac gct ect teg 144 Lys Ala Leu Ser Val Arg Cys Ser Ser Gly Asp Glu Asn Ala Pro Ser 35 40 45 cea teg gtg gtg atg gac tec gat ttc gac gee aag gtg ttc cgt aag 192 Pro Ser Val Val Met Asp Ser Asp Phe Asp Ala Lys Val Phe Arg Lys 50 55 60 aac ttg acg aga age gat aat tac aat cgt aaa ggg ttc ggt cat aag 240 Asn Leu Thr Arg Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gly His Lys 65 70 75 80 gag gag aca ctc aag ctc atg aat cga gag tac acc agt gat ata ttg 288 Glu Glu Thr Leu Lys Leu Met Asn Arg Glu Tyr Thr Ser Asp lie Leu 85 90 95 gag aca ctg aaa aca aat ggg tat act tat tet tgg gga gat gtt act 336 Glu Thr Leu Lys Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Trp Gly Asp Val 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Asn Thr Val Glu 210 215 220 aag cae aag aag ggg gaa tac acá tea gta ate cat ggt aaa tat aat 720 Lys His Lys Lys Gly Glu Tyr Thr Ser Val lie His Gly Lys Tyr Asn 225 230 235 240 cat gaa gag acg att gca act gcg tet ttt gca gga aag tac ate att 768 His Glu Glu Thr lie Ala Thr Ala Ser Phe Ala Gly Lys Tyr lie lie 245 250 255 gta aag aac atg aaa gag gca aat tac gtt tgt gat tac att etc ggt 816 Val Lys Asn Met Lys Glu Ala Asn Tyr Val Cys Asp Tyr lie Leu Gly 260 265 270 ggc caá tac gat gga tet age tec acá aaa gag gag ttc atg gag aaa 864 Gly Gln Tyr Asp Gly Ser Ser Ser Thr Lys Glu Glu Phe Met Glu Lys 275 280 285 ttc aaa tac gca att teg aag ggt ttc gat ecc gac aat gac ctt gtc 912 Phe Lys Tyr Ala lie Ser Lys Gly Phe Asp Pro Asp Asn Asp Leu Val 290 295 300 aaa gtt ggt att gca aac caá acá acg atg cta aag gga gaa acá gag 960 Lys Val Gly lie Ala Asn Gln Thr Thr Met Leu Lys Gly Glu Thr Glu 305 310 315 320 gag ata gga aga tta etc gag acá acá atg atg cgc aag tat gga gtg 1008 Glu lie Gly Arg Leu Leu Glu Thr Thr Met Met Arg Lys Tyr Gly Val 325 330 335 gaa aat gta age gga cat ttc ate age ttc aac acá ata tgc gac gct 1056 Glu Asn Val Ser Gly His Phe lie Ser Phe Asn Thr lie Cys Asp Ala 340 345 350 act caá gag cga caá gac gca ate tat gag cta gtg gaa gag aag att 1104 Thr Gln Glu Arg Gln Asp Ala lie Tyr Glu Leu Val Glu Glu Lys lie 355 360 365 gac ctc atg cta gtg gtt ggc gga tgg aat tea agt aac acc tct cac 1152 Asp Leu Met Leu Val Val Gly Gly Trp Asn Ser Ser Asn Thr Ser His 370 375 380 ctt cag gaa ate tea gag gca cgg gga ate cea tct tac tgg ate gat 1200 Leu Gln Glu lie Ser Glu Ala Arg Gly lie Pro Ser Tyr Trp lie Asp 385 390 395 400 agt gag aaa cgg ata gga ect ggg aat aaa ata gee tat aag ctc cac 1248 Ser Glu Lys Arg lie Gly Pro Gly Asn Lys lie Ala Tyr Lys Leu His 405 410 415 tat gga gaa ctg gtc gag aag gaa aac ttt ctc cea aag gga cea ata 1296 Tyr Gly Glu Leu Val Glu Lys Glu Asn Phe Leu Pro Lys Gly Pro lie 420 425 430 acá ate ggt gtg acá tea ggt gca tea acc ceg gat aag gtc gtg gaa 1344 Thr lie Gly Val Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro Asp Lys Val Val Glu 435 440 445 gat gct ttg gtg aag gtg ttc gac att aaa cgt gaa gag tta ttg cag 1392 Asp Ala Leu Val Lys Val Phe Asp lie Lys Arg Glu Glu Leu Leu Gln 450 455 460 ctg gct tga 1401 Leu Ala 465 <210> 114 <211> 466 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana ISPH <400> 114 Met Ala Val Ala Leu Gln Phe Ser Arg Leu Cys Val Arg Pro Asp Thr 1 5 10 15 Phe Val Arg Glu Asn His Leu Ser Gly Ser Gly Ser Leu Arg Arg Arg 20 25 30 Lys Ala Leu Ser Val Arg Cys Ser Ser Gly Asp Glu Asn Ala Pro Ser 35 40 45 Pro Ser Val Val Met Asp Ser Asp Phe Asp Ala Lys Val Phe Arg Lys 50 55 60 Asn Leu Thr Arg Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gly His Lys 65 70 75 80 Glu Glu Thr Leu Lys Leu Met Asn Arg Glu Tyr Thr Ser Asp lie Leu 85 90 95 Glu Thr Leu Lys Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Trp Gly Asp Val Thr 100 105 110 Val Lys Leu Ala Lys Ala Tyr Gly Phe Cys Trp Gly Val Glu Arg Ala 115 120 125 Val Gln lie Ala Tyr Glu Ala Arg Lys Gln Phe Pro Glu Glu Arg Leu 130 135 140 Trp lie Thr Asn Glu lie lie His Asn Pro Thr Val Asn Lys Arg Leu 145 150 155 160 Glu Asp Met Asp Val Lys lie lie Pro Val Glu Asp Ser Lys Lys Gln 165 170 175 Phe Asp Val Val Glu Lys Asp Asp Val Val lie Leu Pro Ala Phe Gly 180 185 190 Ala Gly Val Asp Glu Met Tyr Val Leu Asn Asp Lys Lys Val Gln lie 195 200 205 Val Asp Thr Thr Cys Pro Trp Val Thr Lys Val Trp Asn Thr Val Glu 210 215 220 Lys His Lys Lys Gly Glu Tyr Thr Ser Val lie His Gly Lys Tyr Asn 225 230 235 240 His Glu Glu Thr lie Ala Thr Ala Ser Phe Ala Gly Lys Tyr lie lie 245 250 255 Val Lys Asn Met Lys Glu Ala Asn Tyr Val Cys Asp Tyr lie Leu Gly 260 ¦ 265 270 Gly Gln Tyr Asp Gly Ser Ser Ser Thr Lys Glu Glu Phe Met Glu Lys 275 280 285 Phe Lys Tyr Ala lie Ser Lys Gly Phe Asp Pro Asp Asn Asp Leu Val 290 295 300 Lys Val Gly lie Ala Asn Gln Thr Thr Met Leu Lys Gly Glu Thr Glu 305 310 315 320 Glu lie Gly Arg Leu Leu Glu Thr Thr Met Met Arg Lys Tyr Gly Val 325 330 335 Glu Asn Val Ser Gly His Phe lie Ser Phe Asn Thr lie Cys Asp Ala 340 345 350 Thr Gln Glu Arg Gln Asp Ala lie Tyr Glu Leu Val Glu Glu Lys lie 355 360 365 Asp Leu Met Leu Val Val Gly Gly Trp Asn Ser Ser Asn Thr Ser His 370 375 380 Leu Gln Glu lie Ser Glu Ala Arg Gly lie Pro Ser Tyr Trp lie Asp 385 390 395 400 Ser Glu Lys Arg lie Gly Pro Gly Asn Lys lie Ala Tyr Lys Leu His 405 410 415 Tyr Gly Glu Leu Val Glu Lys Glu Asn Phe Leu Pro Lys Gly Pro lie 420 425 430 Thr lie Gly Val Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro Asp Lys Val Val Glu 435 440 445 Asp Ala Leu Val Lys Val Phe Asp lie Lys Arg Glu Glu Leu Leu Gln 450 455 460 Leu Ala 465 <210> 115 <211> 2160 <212> ADN <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (1) .. (2160) <223> <400> 115 atg gct ttg tgt gct tat gca ttt cct ggg att ttg aac agg act ggt 48 Met Ala Leu Cys Ala Tyr Ala Phe Pro Gly lie Leu Asn Arg Thr Gly 1 5 10 15 gtg gtt tca gat tct tct aag gca acc cct ttg ttc tct gga tgg att 96 Val Val Ser Asp Ser Ser Lys Ala Thr Pro Leu Phe Ser Gly Trp lie 20 25 30 cat gga acá gat ctg cag ttt ttg ttc caá cae aag ctt act cat gag 144 His Gly Thr Asp Leu Gln Phe Leu Phe Gln His Lys Leu Thr His Glu 35 40 45 gtc aag aaa agg tca cgt gtg gtt cag gct tcc tta tca gaa tct gga 192 Val Lys Lys Arg Ser Arg Val Val Gln Ala Ser Leu Ser Glu Ser Gly 50 55 60 gaa tac tac acá cag aga ceg cea acg cct att ttg gac act gtg aac 240 Glu Tyr Tyr Thr Gln Arg Pro Pro Thr Pro lie Leu Asp Thr Val Asn 65 70 75 80 tat ecc att cat atg aaa aat ctg tct ctg aag gaa ctt aaa caá cta 288 Tyr Pro lie His Met Lys Asn Leu Ser Leu Lys Glu Leu Lys Gln Leu 85 90 95 gca gat gaa cta agg tca gat acá att ttc aat gta tca aag act ggg 336 Ala Asp Glu Leu Arg Ser Asp Thr lie Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly 100 105 110 ggt cae ctt ggc tca agt ctt ggt gtt gtt gag ctg act gtt gct ctt 384 Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu 115 120 125 cat tat gtc ttc aat gca ceg caá gat agg att etc tgg gat gtt ggt 432 His Tyr Val Phe Asn Ala Pro Gln Asp Arg lie Leu Trp Asp Val Gly 130 135 ' 140 cat cag tct tat cct cae aaa ate ttg act ggt aga agg gac aag atg 480 His Gln Ser Tyr Pro His Lys lie Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Met 145 150 155 160 tcg acá tta agg cag acá gat ggt ctt gca gga ttt act aag cga tcg 528 Ser Thr Leu Arg Gln Thr Asp Gly Leu Ala Gly Phe Thr Lys Arg Ser 165 170 175 gag agt gaa tat gat tgc ttt ggc acc ggc cae agt tec acc acc ate 576 Glu Ser Glu Tyr Asp Cys Phe Gly Thr Gly His Ser Ser Thr Thr lie 180 185 190 tea gca ggc cta ggg atg gct gtt ggt aga gat cta aaa gga aga aac 624 Ser Ala Gly Leu Gly Met Ala Val Gly Arg Asp Leu Lys Gly Arg Asn 195 200 205 aac aat gtt att gee gta ata ggt gat ggt gee atg acá gca ggt caá 672 Asn Asn Val lie Ala Val lie Gly Asp Gly Ala Met Thr Ala Gly Gln 210 215 220 gct tat gaa gee atg aat aat gct ggt tac ctg gac tet gac atg att 720 Ala Tyr Glu Ala Met Asn Asn Ala Gly Tyr Leu Asp Ser Asp Met lie 225 230 235 240 gtt ate tta aac gac aat aga caá gtt tet tta ect act gct act ctg 768 Val lie Leu Asn Asp Asn Arg Gln Val Ser Leu Pro Thr Ala Thr Leu 245 250 255 gat ggg cea gtt gct ect gtt gga gct cta agt agt gct ttg age agg 816 Asp Gly Pro Val Ala Pro Val Gly Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ser Arg 260 265 270 tta cag tet aat agg ect etc aga gaa cta aga gaa gtc gca aag gga 864 Leu Gln Ser Asn Arg Pro Leu Arg Glu Leu Arg Glu Val Ala Lys Gly 275 280 285 gtt act aag cag att ggt ggt ect atg cat gag ctt gct gca aaa gtt 912 Val Thr Lys Gln lie Gly Gly Pro Met His Glu Leu Ala Ala Lys Val 290 295 300 gat gaa tat gct cgt ggc atg att agt ggt tet gga tea acá ttg ttt 960 Asp Glu Tyr Ala Arg Gly Met lie Ser Gly Ser Gly Ser Thr Leu Phe 305 310 315 320 gaa gaa ctt gga ctt tac tat att ggt ect gtg gat ggt cae aac att 1008 Glu Glu Leu Gly Leu Tyr Tyr lie Gly Pro Val Asp Gly His Asn lie 325 " 330 335 gat gat cta att gcg att etc aaa gag gtt aga agt act aaa acá acá 1056 Asp Asp Leu lie Ala lie Leu Lys Glu Val Arg Ser Thr Lys Thr Thr 340 345 350 ggt cea gta ctg ate cat gtt gtc act gag aaa ggc aga ggt tat cea 1104 Gly Pro Val Leu lie His Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro 355 360 365 tat gct gag aga gct gca gat aag tat cat gga gtt gee aag ttt gat 1152 Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Ala Lys Phe Asp 370 37"5 380 cea gca acá gga aag caá ttc aaa gee agt gee aag acá cag tec tat 1200 Pro Ala Thr Gly Lys Gln Phe Lys Ala Ser Ala Lys Thr Gln Ser Tyr 385 390 395 400 acá acá tat ttt gcc gag gct tta att gca gaa gca gaa gca gat aaa 1248 Thr Thr Tyr Phe Ala Glu Ala Leu lie Ala Glu Ala Glu Ala Asp Lys 405 410 415 gac att gtt gca ate cat gct gcc atg ggg ggt ggg acc gga atg aac 1296 Asp lie Val Ala lie His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Met Asn 420 425 430 ctt ttc cat cgt cgc ttc cea acá agg tgt ttt gat gtt gga ata gca 1344 Leu Phe His Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly lie Ala 435 440 445 gaa caá cat gca gta acc ttt gct gct gga ttg gct tgt gaa ggc att 1392 Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly lie 450 455 460 aaa ect ttc tgt gca ate tat teg tet ttc atg cag agg gct tat gac 1440 Lys Pro Phe Cys Ala lie Tyr Ser Ser Phe Met Gln Arg Ala Tyr Asp 465 470 475 480 cag gta gtg cat gac gtt gat ttg caá aag ctg ecc gtg agg ttt gca 1488 Gln Val Val His Asp Val Asp Leu Gln Lys Leu Pro Val Arg Phe Ala 485 490 495 atg gac aga gca ggt ctt gtt gga gca gat ggt cea acá cat tgt ggt 1536 Met Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly 500 505 510 gca ttt gat gtt act tac atg gca tgt ctt ect aac atg gtt gta atg 1584 Ala Phe Asp Val Thr Tyr Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met 515 520 525 gct ect tet gat gaa gcg gag cta ttt cae atg gta gca act gct gcc 1632 Ala Pro Ser Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala 530 535 540 gcc att gat gac aga cea agt tgt ttt aga tac cea aga gga aat ggg 1680 Ala lie Asp Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly 545 550 555 560 ate ggt gta gag ctt ceg gct gga aac aaa gga att ect ctt gag gtt 1728 lie Gly Val Glu Leu Pro Ala Gly Asn Lys Gly lie Pro Leu Glu Val 565 570 575 ggt aaa ggt agg ata ttg att gag ggg gag aga gtg gct cta ttg gga 1776 Gly Lys Gly Arg lie Leu lie Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly 580 585 590 tat ggc tea gca gtg cag aac tgt ttg gat gct gct att gtg cta gaa 1824 Tyr Gly Ser Ala Val Gln Asn Cys Leu Asp Ala Ala lie Val Leu Glu 595 600 605 tec cgc ggc tta caá gta acá gtt gca gat gca cgt ttc tgc aaa cea 1872 Ser Arg Gly Leu Gln Val Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro 610 615 620 ctg gac cat gcc etc ata agg age ctt gca aaa tea cat gaa gtg cta 1920 Leu Asp His Ala Leu lie Arg Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu 625 630 635 640 ate act gtc gaa gaa gga tea att gga ggt ttt gga tet cat gtt gtt He Thr Val Glu Glu Gly Ser He Gly Gly Phe Gly Ser His Val Val 645 650 655 cag ttc atg gee tta gat ggg ctt ctt gat ggc aag ttg aag tgg aga 2016 Gln Phe Met Ala Leu Asp Gly Leu Leu Asp Gly Lys Leu Lys Trp Arg 660 665 670 cea ata gtt ctt ect gat cga tac att gac cat gga tet ect gtt gat Pro He Val Leu Pro Asp Arg Tyr He Asp His Gly Ser Pro Val Asp 675 680 685 cag ttg gcg gaa gct ggc cta acá cea tet cae att gca gca acá gta 2112 Gln Leu Ala Glu Ala Gly Leu Thr Pro Ser His He Ala Ala Thr Val 690 695 700 ttt aac ata ctt gga caá acc aga gag gct cta gag gtc atg acá taa 2160 Phe Asn He Leu Gly Gln Thr Arg Glu Ala Leu Glu Val Met Thr 705 710 715 <210> 116 <211> 719 <212> P T <213> Lycopersicon esculentum <400> 116 Met Ala Leu Cys Ala Tyr Ala Phe Pro Gly He Leu Asn Arg Thr Gly 1 5 10 15 Val Val Ser Asp Ser Ser Lys Ala Thr Pro Leu Phe Ser Gly Trp He 20 25 30 His Gly Thr Asp Leu Gln Phe Leu Phe Gln His Lys Leu Thr His Glu 35 40 45 Val Lys Lys Arg Ser Arg Val Val Gln Ala Ser Leu Ser Glu Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Tyr Thr Gln Arg Pro Pro Thr Pro He Leu Asp Thr Val Asn 65 70 75 80 Tyr Pro lie His Met Lys Asn Leu Ser Leu Lys Glu Leu Lys Gln Leu 85 90 95 Ala Asp Glu Leu Arg Ser Asp Thr He Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly 100 105 110 Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu 115 120 125 His Tyr Val Phe Asn Ala Pro Gln Asp Arg He Leu Trp Asp Val Gly 130 135 140 His Gln Ser Tyr Pro His Lys He Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Met 145 150 155 160 Ser Thr Leu Arg Gln Thr Asp Gly Leu Ala Gly Phe Thr Lys Arg Ser 165 170 175 Glu Ser Glu Tyr Asp Cys Phe Gly Thr Gly His Ser Ser Thr Thr lie 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Gly Met Ala Val Gly Arg Asp Leu Lys Gly Arg Asn 195 200 205 Asn Asn Val lie Ala Val lie Gly Asp Gly Ala Met Thr Ala Gly Gln 210 215 220 Ala Tyr Glu Ala Met Asn Asn Ala Gly Tyr Leu Asp Ser Asp Met lie 225 230 235 240 Val lie Leu Asn Asp Asn Arg Gln Val Ser Leu Pro Thr Ala Thr Leu 245 250 255 Asp Gly Pro Val Ala Pro Val Gly Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ser Arg 260 265 270 Leu Gln Ser Asn Arg Pro Leu Arg Glu Leu Arg Glu Val Ala Lys Gly 275 280 285 Val Thr Lys Gln lie Gly Gly Pro Met His Glu Leu Ala Ala Lys Val 290 295 300 Asp Glu Tyr Ala Arg Gly Met lie Ser Gly Ser Gly Ser Thr Leu Phe 305 310 315 320 Glu Glu Leu Gly Leu Tyr Tyr lie Gly Pro Val Asp Gly His Asn lie 325 330 335 Asp Asp Leu lie Ala lie Leu Lys Glu Val Arg Ser Thr Lys Thr Thr 340 345 350 Gly Pro Val Leu lie His Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro 355 360 365 Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Ala Lys Phe Asp 370 375 380 Pro Ala Thr Gly Lys Gln Phe Lys Ala Ser Ala Lys Thr Gln Ser Tyr 385 390 395 400 Thr Thr Tyr Phe Ala Glu Ala Leu lie Ala Glu Ala Glu Ala Asp Lys 405 410 415 Asp lie Val Ala lie His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Met Asn 420 425 430 Leu Phe His Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly lie Ala 435 440 445 Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly lie 450 455 460 Lys Pro Phe Cys Ala lie Tyr Ser Ser Phe Met Gln Arg Ala Tyr Asp 465 470 475 480 Gln Val Val His Asp Val Asp Leu G n Lys Leu Pro Val Arg Phe Ala 485 490 495 Met Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly 500 505 510 Ala Phe Asp Val Thr Tyr Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met 515 520 525 Ala Pro Ser Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala 530 535 540 Ala lie Asp Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly 545 550 555 560 lie Gly Val Glu Leu Pro Ala Gly Asn Lys Gly lie Pro Leu Glu Val 565 570 575 Gly Lys Gly Arg lie Leu lie Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly 580 585 590 Tyr Gly Ser Ala Val Gln Asn Cys Leu Asp Ala Ala lie Val Leu Glu 595 600 605 Ser Arg Gly Leu Gln Val Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro 610 615 620 Leu Asp His Ala Leu lie Arg Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu 625 630 635 640 lie Thr Val Glu Glu Gly Ser lie Gly Gly Phe Gly Ser His Val Val 645 650 655 Gln Phe Met Ala Leu Asp Gly Leu Leu Asp Gly Lys Leu Lys Trp Arg 660 665 670 Pro lie Val Leu Pro Asp Arg Tyr lie Asp His Gly Ser Pro Val Asp 675 680 585 Gln Leu Ala Glu Ala Gly Leu Thr Pro Ser His lie Ala Ala Thr Val 690 695 700 Phe Asn lie Leu Gly Gln Thr Arg Glu Ala Leu Glu Val Met Thr 705 710 715 <210> 117 <211> 1434 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1) .. (1434) <223> <400> 117 atg atg acá tta aac tea cta tct cca gct gaa tcc aaa gct att tct 48 Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala lie Ser 1 5 10 15 ttc ttg gat acc tcc agg ttc aat cca ate ect aaa etc tea ggt ggg 96 Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro lie Pro Lys Leu Ser Gly Gly 20 25 30 ttt agt ttg agg agg agg aat caá ggg aga ggt ttt gga aaa ggt gtt 144 Phe Ser Leu Arg' Arg Arg Asn Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val 35 40 45 aag tgt tea gtg aaa gtg cag cag caá caá caá ect ect cca gca tgg 192 Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp 50 55 60 ect ggg aga gct gtc ect gag gcg ect cgt caá tct tgg gat gga cca 240 Pro Gly Arg Ala Val Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro 65 70 75 80 aaa ecc ate tct ate gtt gga tct act ggt tct att ggc act cag acá 288 Lys Pro lie Ser lie Val Gly Ser Thr Gly Ser lie Gly Thr Gln Thr 85 90 95 ttg gat att gtg gct gag aat ect gac aaa ttc aga gtt gtg gct cta 336 Leu Asp lie Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu 100 105 110 gct gct ggt teg aat gtt act cta ctt gct gat cag gta agg aga ttt 384 Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe 115 120 125 aag ect gca ttg gtt gct gtt aga aac gag tea ctg att aat gag ctt 432 Lys Pro Ala Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu lie Asn Glu Leu 130 135 140 aaa gag gct tta gct gat ttg gac tat aaa etc gag att att cca gga 480 Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Leu Glu lie lie Pro Gly 145 150 155 160 gag caá gga gtg att gag gtt gee cga cat ect gaa gct gta acc gtt 528 Glu Gln Gly Val lie Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val 165 170 175 gtt acc gga ata gta ggt tgt gcg gga cta aag ect acg gtt gct gca 576 Val Thr Gly lie Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala 180 185 190 att gaa gca gga aag gac att gct ctt gca aac aaa gag acá tta ate 624 lie Glu Ala Gly Lys Asp lie Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu lie 195 200 205 gca ggt ggt ect ttc gtg ctt ceg ctt gee aac aaa cat aat gta aag 672 Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys Hls Asn Val Lys 210 215 220 att ctt ccg gca gat tca gaa cat tct gee ata ttt cag tgt att caá 720 lie Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala lie Phe Gln Cys lie Gln 225 230 235 240 ggt ttg cct gaa ggc gct ctg cgc aag ata ate ttg act gca tct ggt 768 Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys lie lie Leu Thr Ala Ser Gly 245 250 255 gga gct ttt agg gat tgg cct gtc gaa aag cta aag gaa gtt aaa gta 816 Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val 260 265 270 gcg gat gcg ttg aag cat cea aac tgg aac atg gga aag aaa ate act 864 Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys lie Thr 275 280 285 gtg gac tct gct acg ctt ttc aac aag ggt ctt gag gtc att gaa gcg 912 Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val lie Glu Ala 290 295 300 cat tat ttg ttt gga gct gag tat gac gat ata gag att gtc att cat 960 His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp lie Glu lie Val lie His 305 310 315 320 ccg caá agt ate ata cat tec atg att gaa acá cag gat tca tct gtg 1008 Pro Gln Ser lie lie His Ser Met lie Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val 325 330 335 ctt gct caá ttg ggt tgg cct gat atg cgt tta ccg att etc tac acc 1056 Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro lie Leu Tyr Thr 340 345 350 atg tca tgg ecc gat aga gtt cct tgt tct gaa gta act tgg cea aga 1104 Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg 355 360 365 ctt gac ctt tgc aaa etc ggt tca ttg act ttc aag aaa cea gac aat 1152 Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn 370 375 380 gtg aaa tac cea tec atg gat ctt gct tat gct gct gga cga gct gga 1200 Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly 385 390 395 400 ggc acá atg act gga gtt etc age gee gee aat gag aaa gct gtt gaa 1248 Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu 405 410 415 atg ttc att gat gaa aag ata age tat ttg gat ate ttc aag gtt gtg 1296 Met Phe lie Asp Glu Lys lie Ser Tyr Leu Asp lie Phe Lys Val Val 420 425 430 gaa tta acá tgc gat aaa cat cga aac gag ttg gta acá tca ccg tct 1344 Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser 435 440 445 ctt gaa gag att gtt cae tat gac ttg tgg gca cgt gaa tat gee gcg 1392 Leu Glu Glu lie Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala 450 455 460 aat gtg cag ctt tct tct ggt gct agg cea gtt cat gca tga 1434 Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala 465 470 475 <210> 118 <211> 477 <212> PRT <213> Arabidopsis thal <400> 118 Met et Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala lie Ser 1 5 10 15 Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro lie Pro Lys Leu Ser Gly Gly 20 25 30 Phe Ser Leu Arg Arg Arg Asn Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val 35 40 45 Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp 50 55 60 Pro Gly Arg Ala Val Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro 65 70 75 80 Lys Pro lie Ser lie Val Gly Ser Thr Gly Ser lie Gly Thr Gln Thr 85 90 95 Leu Asp lie Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe 115 120 125 Lys Pro Ala Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu lie Asn Glu Leu 130 135 140 Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Leu Glu lie lie Pro Gly 145 150 155 160 Glu Gln Gly Val lie Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val 165 170 175 Val Thr Gly lie Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala 180 185 190 lie Glu Ala Gly Lys Asp lie Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu lie 195 200 205 Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Asn Val Lys 210 215 220 lie Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala lie Phe Gln Cys lie Gln 225 230 235 240 Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys lie lie Leu Thr Ala Ser Gly 245 250 255 Gly Ala P e Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val 260 265 270 Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys lie Thr 275 280 285 Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val lie Glu Ala 290 295 300 His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp lie Glu lie Val lie His 305 310 315 320 Pro Gln Ser lie lie His Ser Met lie Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val 325 330 335 Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro lie Leu Tyr Thr 340 345 350 Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg 355 360 365 Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn 370 375 380 Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly 385 390 395 400 Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu 405 410 415 Met Phe lie Asp Glu Lys lie Ser Tyr Leu Asp lie Phe Lys Val Val 420 425 430 Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser 435 440 445 Leu Glu Glu lie Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala 450 455 460 Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala 465 470 475 <210> 119 <211> 884 <212> ADN <213> clon ApIPI28 de Adonis palaestina <220> <221> CDS <222> (180) .. (884) <223> <400> 119 cgtcgatcag gattaatcct ttatatagta tcttctccac caccactaaa acattatcag 60 cttcgtgttc ttctcccgct gttcatcttc agcagcgttg tcgtactctt tctatttctt 120 cttccatcac taacagtcct cgccgagggt tgaatcggct gttcgcctca acgtcgact 179 atg ggt gaa gtc gct gat gct ggt atg gat gcc gtc cag aag cgg ctt 227 Met Gly Glu Val Ala Asp Ala Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu 1 5 10 15 atg ttc gac gat gaa tgt att ttg gtg gat gag aat gac aag gtc gtc 275 Met Phe Asp Asp Glu Cys lie Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val 20 25 30 gga cat gat tcc aaa tac aac tgt cat ttg atg gaa aag ata gag gca 323 Gly Hls Asp Ser Lys Tyr Asn Cys Hls Leu Met Glu Lys lie Glu Ala 35 40 45 gaa aac ttg ctt cae aga gcc ttc agt gtt ttc tta ttc aac tea aaa 371 Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys 50 55 60 tac gag ttg ctt ctt cag caá cga tct gca acg aag gta acá ttc ccg 419 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro 65 70 75 80 etc gta tgg acá aac acc tgt tgc age cat ecc etc ttc cgt gat tcc 467 Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser 85 90 95 gaa etc ata gaa gaa aat ttt etc ggg gta cga aac gct gca caá agg 515 Glu Leu lie Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg 100 105 110 aag ctt tta gac gag cta ggc att cea gct gaa gac gta cea gtt gat 563 Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly lie Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp 115 120 125 gaa ttc act ect ctt ggt cgc att ctt tac aaa gct cea tct gac gga 611 Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg lie Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly 130 135 140 aaa tgg gga gag cae gaa ctg gac tat ctt ctg ttt att gtc cga gat 659 Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe lie Val Arg Asp 145 150 155 160 gtg aaa tac gat cea aac cea gat gaa gtt gct gac gct aag tac gtt 707 Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val 165 170 175 aat cgc gag gag ttg aaa gag ata ctg aga aaa gct gat gca ggt gaa 755 Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu lie Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu 180 185 190 gag gga ata aag ttg tct ect tgg ttt aga ttg gtt gtg gat aac ttt 803 Glu Gly lie Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe 195 200 205 ttg ttc aag tgg tgg gat cat gta gag gag ggg aag att aag gac gtc 851 Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys lie Lys Asp Val 210 215 220 gcc gac atg aaa act ate cac aag ttg act taa 884 Ala Asp Met Lys Thr lie His Lys Leu Thr 225 230 <210> 120 <211> 234 <212> PRT <213> clon ApIPI28 de Adonis palaestina <400> 120 Met Gly Glu Val Ala Asp Ala Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu 1 5 10 15 Met Phe Asp Asp Glu Cys lie Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val 20 25 30 Gly His Asp Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Met Glu Lys lie Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys 50 55 60 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro 65 70 75 80 Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser 85 90 95 Glu Leu lie Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg 100 105 110 Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly lie Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp 115 120 125 Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg lie Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly 130 135 140 Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe lie Val Arg Asp 145 150 155 160 Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val 165 170 175 Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu lie Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu 180 185 190 Glu Gly lie Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe 195 200 205 Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys lie Lys Asp Val 210 215 220 Ala Asp Met Lys Thr lie His Lys Leu Thr 225 . 230 <210> 121 <211> 1402 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (52) . (1317) <223> <400> 121 aagtctttgc ctctttggtt tactttcctc tgttttcgat ccatttagaa a atg tta 57 Met Leu 1 ttc acg agg agt gtt gct cgg att tct tct aag ttt ctg aga aac cgt 105 Phe Thr Arg Ser Val Ala Arg lie Ser Ser Lys Phe Leu Arg Asn Arg 5 10 15 age ttc tat ggc tec tct caá tct etc gee tct cat cgg ttc gca ate 153 Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe Ala lie 20 25 30 att ecc gat cag ggt cae tct tgt tct gac tct cea cae aag ggt tac 201 lie Pro Asp Gln Gly His Ser Cys Ser Asp Ser Pro His Lys Gly Tyr 35 40 45 50 gtt tgc aga acá act tat tea ttg aaa tct ceg gtt ttt ggt gga ttt 249 Val Cys Arg Thr Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Gly Gly Phe 55 60 65 agt cat caá etc tat cae cag agt age tec ttg gtt gag gag gag ctt 297 Ser His Gln Leu Tyr His Gln Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu Glu Leu 70 75 80 gac cea ttt teg ctt gtt gee gat gag ctg tea ctt ctt agt aat aag 345 Asp Pro Phe Ser Leu Val Ala Asp Glu Leu Ser Leu Leu Ser Asn Lys 85 90 95 ttg aga gag atg gta ctt gee gag gtt cea aag ctt gee tct gct gct 393 Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser Ala Ala 100 105 110 gag tac ttc ttc aaa agg ggt gtg caá gga aaa cag ttt cgt tea act 441 Glu Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg Ser Thr 115 120 125 130 att ttg ctg ctg atg gcg acá gct ctg gat gta cga gtt cea gaa gca 489 lie Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro Glu Ala 135 140 145 ttg att ggg gaa tea acá gat ata gtc acá tea gaa tta cgc gta agg 537 Leu lie Gly Glu Ser Thr Asp lie Val Thr Ser Glu Leu Arg Val Arg 150 155 160 caá cgg ggt att gct gaa ate act gaa atg ata cae gtc gca agt cta 585 Gln Arg Gly lie Ala Glu lie Thr Glu Met lie His Val Ala Ser Leu 165 170 175 ctg cae gat gat gtc ttg gat gat gee gat acá agg cgt ggt gtt ggt 633 Leu His Asp Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg Arg Gly Val Gly 180 185 190 tcc tta aat gtt gta atg ggt aac aag atg tcg gta tta gca gga gac 681 Ser Leu Asn Val Val Met Gly Asn Lys Met Ser Val Leu Ala Gly Asp 195 200 205 210 ttc ttg etc tcc cgg gct tgt ggg gct etc gct gct tta aag aac acá 729 Phe Leu Leu Ser Arg Ala Cys Gly Ala Leu Ala Ala Leu Lys Asn Thr 215 220 225 gag gtt gta gca tta ctt gca act gct gta gaa cat ctt gtt acc ggt 777 Glu Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val Glu His Leu Val Thr Gly 230 235 240 gaa acc atg gag ata act agt tea acc gag cag cgt tat agt atg gac 825 Glu Thr Met Glu lie Thr Ser Ser Thr Glu Gln Arg Tyr Ser Met Asp 245 250 255 tac tac atg cag aag acá tat tat aag acá gca tcg cta ate tet aac 873 Tyr Tyr Met Gln Lys Thr Tyr Tyr Lys Thr Ala Ser Leu lie Ser Asn 260 265 270 age tgc aaa gct gtt gee gtt etc act gga caá acá gca gaa gtt gee 921 Ser Cys Lys Ala Val Ala Val Leu Thr Gly Gln Thr Ala Glu Val Ala 275 280 285 290 gtg tta gct ttt gag tat ggg agg aat ctg ggt tta gca ttc caá tta 969 Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu 295 300 305 ata gac gac att ctt gat ttc acg ggc acá tet gee tet etc gga aag 1017 lie Asp Asp lie Leu Asp Phe Thr Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Lys 310 315 320 gga tcg ttg tea gat att cgc cat gga gtc ata acá gee cea ate etc 1065 Gly Ser Leu Ser Asp lie Arg His Gly Val lie Thr Ala Pro lie Leu 325 330 335 ttt gee atg gaa gag ttt ect caá cta cgc gaa gtt gtt gat caá gtt 1113 Phe Ala Met Glu Glu Phe Pro Gln Leu Arg Glu Val Val Asp Gln Val 340 345 350 gaa aaa gat ect agg aat gtt gac att gct tta gag tat ctt ggg aag 1161 Glu Lys Asp Pro Arg Asn Val Asp lie Ala Leu Glu Tyr Leu Gly Lys 355 360 365 370 age aag gga ata cag agg gca aga gaa tta gee atg gaa cat gcg aat 1209 Ser Lys Gly lie Gln Arg Ala Arg Glu Leu Ala Met Glu His Ala Asn 375 380 385 cta gca gca gct gca ate ggg tet cta ect gaa acá gac aat gaa gat 1257 Leu Ala Ala Ala Ala lie Gly Ser Leu Pro Glu Thr Asp Asn Glu Asp 390 395 400 gtc aaa aga tcg agg cgg gca ctt att gac ttg acc cat aga gtc atc 1305 Val Lys Arg Ser Arg Arg Ala Leu lie Asp Leu Thr His Arg Val lie 405 410 415 acc aga aac aag tgagattaag taatgtttct ctctatacac caaaacattc 1357 Thr Arg Asn Lys 420 ctcatttcat ttgtaggatt ttgttggtcc aattcgtttc acgaa 1402 <210> 122 <211> 422 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 122 Met Leu Phe Thr Arg Ser Val Ala Arg lie Ser Ser Lys Phe Leu Arg 1 5 10 15 Asn Arg Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe 20 25 30 Ala lie lie Pro Asp Gln Gly His Ser Cys Ser Asp Ser Pro His Lys 35 40 45 Gly Tyr Val Cys Arg Thr Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Gly 50 55 60 Gly Phe Ser His Gln Leu Tyr His Gln Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu 65 70 75 80 Glu Leu Asp Pro Phe Ser Leu Val Ala Asp Glu Leu Ser Leu Leu Ser 85 90 95 Asn Lys Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser 100 105 110 Ala Ala Glu Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg 115 120 125 Ser Thr lie Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro 130 135 140 Glu Ala Leu lie Gly Glu Ser Thr Asp lie Val Thr Ser Glu Leu Arg 145 150 155 160 Val Arg Gln Arg Gly lie Ala Glu lie Thr Glu Met lie His Val Ala 165 170 175 Ser Leu Leu His Asp Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg Arg Gly 180 185 190 Val Gly Ser Leu Asn Val Val Met Gly Asn Lys Met Ser Val Leu Ala 195 200 · 205 Gly Asp Phe Leu Leu Ser Arg Ala Cys Gly Ala Leu Ala Ala Leu Lys 210 215 220 Asn Thr Glu Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val Glu His Leu Val 225 230 235 240 Thr Gly Glu Thr Met Glu lie Thr Ser Ser Thr Glu Gln Arg Tyr Ser 245 250 255 Met Asp Tyr Tyr Met Gln Lys Thr Tyr Tyr Lys Thr Ala Ser Leu lie 260 265 270 Ser Asn Ser Cys Lys Ala Val Ala Val Leu Thr Gly Gln Thr Ala Glu 275 280 285 Val Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Leu Ala Phe 290 295 300 Gln Leu lie Asp Asp lie Leu Asp Phe Thr Gly Thr Ser Ala Ser Leu 305 310 315 320 Gly Lys Gly Ser Leu Ser Asp lie Arg His Gly Val lie Thr Ala Pro 325 330 335 lie Leu Phe Ala Met Glu Glu Phe Pro Gln Leu Arg Glu Val Val Asp 340 345 350 Gln Val Glu Lys Asp Pro Arg Asn Val Asp lie Ala Leu Glu Tyr Leu 355 360 365 Gly Lys Ser Lys Gly lie Gln Arg Ala Arg Glu Leu Ala Met Glu His 370 375 380 Ala Asn Leu Ala Ala Ala Ala lie Gly Ser Leu Pro Glu Thr Asp Asn 385 390 395 400 Glu Asp Val Lys Arg Ser Arg Arg Ala Leu lie Asp Leu Thr His Arg 405 410 415 Val lie Thr Arg Asn Lys 420 <210> 123 <211> 1155 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1) .. (1155) <223> <400> 123 atg agt gtg agt tgt tgt tgt agg aat ctg ggc aag acá ata aaa aag 48 Met Ser Val Ser Cys Cys Cys Arg Asn Leu Gly Lys Thr lie Lys Lys 1 5 10 15 gca ata cct- tca cat cat ttg cat ctg aga agt ctt ggt ggg agt ctc 96 Ala lie Pro Ser His His Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Gly Ser Leu 20 25 30 tat cgt cgt cgt atc caa age tct tca atg gag acc gat ctc aag tca 144 Tyr Arg Arg Arg lie Gln Ser Ser Ser Met Glu Thr Asp Leu Lys Ser 35 40 45 acc ttt ctc aac gtt tat tct gtt ctc aag tct gac ctt ctt cat gac 192 Thr Phe Leu Asn Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Asp Leu Leu His Asp 50 55 60 cct tec ttc gaa ttc acc aat gaa tct cgt ctc tgg gtt gat cgg atg 240 Pro Ser Phe Glu Phe Thr Asn Glu Ser Arg Leu Trp Val Asp Arg Met 65 70 75 80 ctg gac tac aat gta cgt gga ggg aaa ctc aat cgg ggt ctc tct gtt 288 Leu Asp Tyr Asn Val Arg Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val 85 90 95 gtt gac agt ttc aaa ctt ttg aag caa ggc aat gat ttg act gag caa 336 Val Asp Ser Phe Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Asp Leu Thr Glu 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Ser Leu Ser lie 210 215 220 cae cgt cgt att gtc cag tac aaa acg gct tat tac tca ttt tat ctc 720 His Arg Arg lie Val Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu 225 230 235 240 cct gtt gct tgt gcg ttg ctt atg gcg ggc gaa aat ttg gaa aac cat 768 Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Ala Gly Glu Asn Leu Glu Asn His 245 250 255 att gac gtg aaa aat gtt ctt gtt gac atg gga ate tac ttc caá gtg 816 lie Asp Val Lys Asn Val Leu Val Asp Met Gly lie Tyr Phe Gln Val 260 265 ' 270 cag gat gat tat ctg gat tgt ttt gct gat ccc gag acg ctt ggc aag 864 Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Gly Lys 275 280 285 ata gga acá gat ata gaa gat ttc aaa tgc tcg tgg ttg gtg gtt aag 912 lie Gly Thr Asp lie Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys 290 295 300 gca tta gag cgc tgc age gaa gaa caá act aag ata tta tat gag aac 960 Ala Leu Glu Arg Cys Ser Glu Glu Gln Thr Lys lie Leu Tyr Glu Asn 305 310 315 320 tat ggt aaa ccc gac cea tcg aac gtt gct aaa gtg aag gat ctc tac 1008 Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Ser Asn Val Ala Lys Val Lys Asp Leu Tyr 325 330 335 aaa gag ctg gat ctt gag gga gtt ttc atg gag tat gag age aaa age 1056 Lys Glu Leu Asp Leu Glu Gly Val Phe Met Glu Tyr Glu Ser Lys Ser 340 345 350 tac gag aag ctg act gga gcg att gag gga cae caá agt aaa gca ate 1104 Tyr Glu Lys Leu Thr Gly Ala lie Glu Gly His Gln Ser Lys Ala lie 355 360 365 caá gca gtg cta aaa tec ttc ttg gct aag ate tac aag agg cag aag 1152 Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Ala Lys lie Tyr Lys Arg Gln Lys 370 375 380 tag 1155 <210> 124 <211> 384 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 124 Met Ser Val Ser Cys Cys Cys Arg Asn Leu Gly Lys Thr lie Lys Lys 1 5 10 15 Ala lie Pro Ser His His Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Gly Ser Leu 20 25 ' 30 Tyr Arg Arg Arg lie Gln Ser Ser Ser Met Glu Thr Asp Leu Lys Ser 35 40 45 Thr Phe Leu Asn Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Asp Leu Leu His Asp 50 55 60 Pro Ser Phe Glu Phe Thr Asn Glu Ser Arg Leu Trp Val Asp Arg Met 65 70 75 80 Leu Asp Tyr Asn Val Arg Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val 85 90 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Leu Val Ala Gly 210 215 220 caá gtg gtg gat ata age agt gaa ggg ttg gac tta aac aac gtc gga 720 Gln Val Val Asp lie Ser Ser Glu Gly Leu Asp Leu Asn Asn Val Gly 225 230 235 240 ttg gag cat ttg aag ttt ata cat ttg cat aaa acg gcg gcg ttg ctt 768 Leu Glu His Leu Lys Phe lie His Leu His Lys Thr Ala Ala Leu Leu 245 250 255 gaa gct tea gcg gtt ttg ggt ggg ate ate ggt gga ggg agt gat gaa 816 Glu Ala Ser Ala Val Leu Gly Gly lie lie Gly Gly Gly Ser Asp Glu 260 265 270 gag ate gag agg ctg agg aag ttc gcg agg tgt att ggg ttg ttg ttt 864 Glu lie Glu Arg Leu Arg Lys Phe Ala Arg Cys lie Gly Leu Leu Phe 275 280 285 cag gtg gtt gat gat ate ttg gac gtg acg aaa tcg tct caá gaa ctg 912 Gln Val Val Asp Asp lie Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Gln Glu Leu 290 295 300 ggg aaa acc gct ggg aaa gat ttg att gct gat aag ttg act tat ccg 960 Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu lie Ala Asp Lys Leu Thr Tyr Pro 305 310 315 320 aag etc atg ggt ttg gag aaa tcg aga gag ttc gct gag aag ttg aat 1008 Lys Leu Met Gly Leu Glu Lys Ser 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Gly Ala Leu Val 210 215 220 cag ggg atg ata aag ctg ttt cag gat ctg ggt ggc gaa gtc gtg tta 720 Gln Gly Met lie Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly Glu Val Val Leu 225 230 235 240 aac gcc aga gtc age cat atg gaa acg acá gga aac aag att gaa gee 768 Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn Lys lie Glu Ala 245 250 255 gtg cat tta gag gac ggt cgc agg ttc ctg acg caá gcc gtc gcg tea 816 Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln Ala Val Ala Ser 260 265 270 aat gca gat gtg gtt cat acc tat cgc gac ctg tta age cag cae ect 864 Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Ser Gln His Pro 275 280 285 gcc gcg gtt aag cag tec aac aaa ctg cag act aag cgc atg agt aac 912 Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys Arg Met Ser Asn 290 295 300 tet ctg ttt gtg etc tat ttt ggt ttg aat cae cat cat gat cag etc 960 Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Asn His His His Asp Gln Leu 305 310 315 320 gcg cat cae acg gtt tgt ttc ggc ceg cgt tac cgc gag ctg att gac 1008 Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg Glu Leu lie Asp 325 330 335 gaa att ttt aat cat gat ggc etc gca gag gac ttc tea ctt tat ctg 1056 Glu lie Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Leu 340 345 350 cae gcg ecc tgt gtc acg gat teg tea ctg gcg ect gaa ggt tgc ggc 1104 His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly Cys Gly 355 360 365 agt tac tat gtg ttg gcg ceg gtg ceg cat tta ggc acc gcg aac etc 1152 Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly Thr Ala Asn Leu 370 375 380 gac tgg acg gtt gag ggg cea aaa cta cgc gac cgt att ttt gcg tac 1200 Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg lie Phe Ala Tyr 385 390 395 400 ctt gag cag cat tac atg ect ggc tta cgg agt cag ctg gtc acg cae 1248 Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln Leu Val Thr His 405 410 415 cgg atg ttt acg ceg ttt gat ttt cgc gac cag ctt aat gcc tat cat 1296 Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu Asn Ala Tyr His 420 425 430 ggc tea gcc ttt tet gtg gag ecc gtt ctt acc cag age gcc tgg ttt 1344 Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ala Trp Phe 435 440 445 cgg ceg cat aac cgc gat aaa acc att act aat etc tac ctg gtc ggc 1392 Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr lie Thr Asn Leu Tyr Leu Val Gly 450 455 460 gca ggc acg cat ccc ggc gca ggc att cct ggc gtc atc ggc tcg gca 1440 Ala Gly Thr His Pro Gly Ala Gly lie Pro Gly Val lie Gly Ser Ala 465 470 475 480 aaa gcg acá gca ggt ttg atg ctg gag gat ctg ata tga 1479 Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu lie 485 490 <210> 130 <211> 492 <212> PRT <213> Erwinia uredovora <400> 130 Met Lys Pro Thr Thr Val lie Gly Ala Gly Phe Gly Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala lie Arg Leu Gln Ala Ala Gly lie Pro Val Leu Leu Leu Glu Gln 20 25 30 Arg Asp Lys Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Val Tyr Glu Asp Gln Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val lie Thr Asp Pro Ser Ala lie Glu 50 55 60 Glu Leu Phe Ala Leu Ala Gly Lys Gln Leu Lys Glu Tyr Val Glu Leu 65 70 75 80 Leu Pro Val Thr Pro Phe Tyr Arg Leu Cys Trp Glu Ser Gly Lys Val 85 90 95 Phe Asn Tyr Asp Asn Asp Gln Thr Arg Leu Glu Ala Gln lie Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Pro Arg Asp Val Glu Gly Tyr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Ser 115 120 125 Arg Ala Val Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Val Pro Phe 130 135 140 Leu Ser Phe Arg Asp Met Leu Arg Ala Ala Pro Gln Leu Ala Lys Leu 145 150 155 160 Gln Ala Trp Arg Ser Val Tyr Ser Lys Val Ala Ser Tyr lie Glu Asp 165 170 175 Glu His Leu Arg Gln Ala Phe Ser Phe His Ser Leu Leu Val Gly Gly 180 185 190 Asn Pro Phe Ala Thr Ser Ser lie Tyr Thr Leu lie His Ala Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Trp Gly Val Trp Phe Pro Arg Gly Gly Thr Gly Ala Leu Val 210 215 220 Gln Gly Met lie Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly Glu Val Val Leu 225 230 235 240 Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn Lys lie Glu Ala 245 250 255 Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln Ala Val Ala Ser 260 265 270 Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Ser Gln His Pro 275 280 285 Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys Arg Met Ser Asn 290 295 300 Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Asn His His His Asp Gln Leu 305 310 315 320 Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg Glu Leu lie Asp 325 330 335 Glu lie Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Leu 340 345 350 His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly Cys Gly 355 360 365 Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly Thr Ala Asn Leu 370 375 380 Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg lie Phe Ala Tyr 385 390 395 400 Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln Leu Val Thr His 405 410 415 Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu Asn Ala Tyr His 420 425 430 Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ala Trp Phe 435 440 445 Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr lie Thr Asn Leu Tyr Leu Val Gly 450 455 460 Ala Gly Thr His Pro Gly Ala Gly lie Pro Gly Val lie Gly Ser Ala 465 470 475 480 Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu lie 485 490 <210> 131 <211> 1725 <212> ADN <213> Narcissus pseudonarcissus <220> <221> CDS <222> (1) .. (1725) <223> <400> 131 atg gct tct tcc act tgt tta att cat tct tcc tct ttt ggg gtt gga Met Ala Ser Ser Thr Cys Leu lie His Ser Ser Ser Phe Gly Val Gly 1 5 10 15 gga aag aaa gtg aag atg aac acg atg att cga tcg aag ttg ttt tea Gly Lys Lys Val Lys Met Asn Thr Met lie Arg Ser Lys Leu Phe Ser 20 25 30 att cgg tcg gct ttg gac act aag gtg tct gat atg age gtc aat gct lie Arg Ser Ala Leu Asp Thr Lys Val Ser Asp Met Ser Val Asn Ala 35 40 45 cea aaa gga ttg ttt cea cea gag cct gag cae tac a99 999 cca aa9 Pro Lys Gly Leu Phe Pro Pro Glu Pro Glu His Tyr Arg ,Gly Pro Lys 55 60 ctt aaa gtg gct ate att gga gct ggg etc gct ggc atg tea act gca 240 Leu Lys al Ala lie He Gly Ala Gly Leu Ala Gly Met Ser Thr Ala 65 70 75 80 gtg gag ctt ttg gat caá ggg cat gag gtt gac ata tat gaa tcc aga 288 Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His Glu Val Asp lie Tyr Glu Ser Arg 85 90 95 caá ttt att ggt ggt aaa gtc ggt tct ttt gta gat aag cgt gga aac 336 Gln Phe lie Gly Gly Lys Val Gly Ser Phe- Val Asp Lys Arg Gly Asn 100 105 110 cat att gaa atg gga etc cat gtg ttt ttt ggt tgc tat aac aat ctt 384 His lie Glu Met Gly Leu His Val Phe Phe Gly Cys Tyr Asn Asn Leu 115 120 125 ttc aga ctt atg aaa aag gta ggt gca gat gaa aat tta ctg gtg aag 432 Phe Arg Leu Met Lys Lys Val Gly Ala Asp Glu Asn Leu Leu Val Lys 130 135 140 gat cat act cat acc ttt gta aac cga ggt gga gaa att ggt gaa ctt 480 Asp His Thr His Thr Phe Val Asn Arg Gly Gly Glu lie Gly Glu Leu 145 150 155 ¦ 160 gat ttc cga ctt ceg atg ggt gca cca tta cat ggt att cgt gca ttt 528 Asp Phe Arg Leu Pro Met Gly Ala Pro Leu His Gly lie Arg Ala Phe 165 170 175 cta acá act aat caá ctg aag cct tat gat aaa gca agg aat gct gtg 576 Leu Thr Thr Asn Gln Leu Lys Pro Tyr Asp Lys Ala Arg Asn Ala Val 180 185 190 gct ctt gee ctt age cca gtt gta cgt gct ctt att gat cca aat ggt 624 Ala Leu Ala Leu Ser Pro Val Val Arg Ala Leu lie Asp Pro Asn Gly 195 200 205 gca atg cag gat ata agg aac tta gat aat att agc ttt tct gat tgg 672 Ala Met Gln Asp lie Arg Asn Leu Asp Asn lie Ser Phe Ser Asp 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Asn Lys Lys Leu Val 325 330 335 aaa gct gac gtg tat gtt gca gca tgt gat gtt ect gga ata aaa agg 1056 Lys Ala Asp Val Tyr Val Ala Ala Cys Asp Val Pro Gly lie Lys Arg 340 345 350 ttg ate cea teg gag tgg aga gaa tgg gat cta ttt gac aat ate tat 1104 Leu lie Pro Ser Glu Trp Arg Glu Trp Asp Leu Phe Asp Asn lie Tyr 355 360 365 aaa cta gtt gga gtt cea gtt gtc act gtt cag ctt agg tac aat ggt 1152 Lys Leu Val Gly Val Pro Val Val Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn Gly 370 375 380 tgg gtg acá gag atg caá gat ctg gaa aaa tea agg cag ttg aga gct 1200 Trp Val Thr Glu Met Gln Asp Leu Glu Lys Ser Arg Gln Leu Arg Ala 385 390 395 400 gca gta gga ttg gat aat ctt ctt tat act cea gat gca gac ttt tct 1248 Ala Val Gly Leu Asp Asn Leu Leu Tyr Thr Pro Asp Ala Asp Phe Ser 405 410 415 tgt ttt tct gat ctt gca etc teg teg ect gaa gat tat tat att gaa 1296 Cys Phe Ser Asp Leu Ala Leu Ser Ser Pro Glu Asp Tyr Tyr lie Glu 420 425 430 gga caá ggg tcc cta ata cag gct gtt etc acg cea ggg gat cea tac 1344 Gly Gln Gly Ser Leu lie Gln Ala Val Leu Thr Pro Gly Asp Pro Tyr 435 440 445 atg ccc cta ect aat gat gca att ata gaa aga gtt cgg aaa cag gtt Met Pro Leu Pro Asn Asp Ala lie lie Glu Arg Val Arg Lys Gln Val 450 455 460 ttg gat tta ttc cea tec tet caá ggc ctg gaa gtt cta tgg tet teg 1440 Leu Asp Leu Phe Pro Ser Ser Gln Gly Leu Glu Val Leu Trp Ser Ser 465 470 475 480 gtg gtt aaa ate gga caá tec cta tat cgg gag ggg ect gga aag gac 1488 Val Val Lys lie Gly Gln Ser Leu Tyr Arg Glu Gly Pro Gly Lys Asp 485 490 495 cea ttc aga ect gat cag aag acá cea gta aaa aat ttc ttc ctt gca 1536 Pro Phe Arg Pro Asp Gln -Lys Thr Pro Val Lys Asn Phe Phe Leu Ala 500 505 510 ggt tea tac acc aaa cag gat tac att gac agt atg gaa gga gcg acc Gly Ser Tyr Thr Lys Gln Asp Tyr lie Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr 515 520 525 cta teg ggg aga caá gca gct gca tat ate tgc age gee ggt gaa gat 1632 Leu Ser Gly Arg Gln Ala Ala Ala Tyr lie Cys Ser Ala Gly Glu Asp 530 535 540 ctg gca gca ctt cgc aag aag ate gct gct gat cat cea gag caá ctg 1680 Leu Ala Ala Leu Arg Lys Lys lie Ala Ala Asp His Pro Glu Gln Leu 545 550 555 560 ate aac aaa gat tet aac gtg teg gat gaa ctg agt etc gta taa 1725 lie Asn Lys Asp Ser Asn Val Ser Asp Glu Leu Ser Leu Val 565 570 <210> 132 <211> 574 <212> PRT <213> Narcissus pse donarcissus <400> 132 Met Ala Ser Ser Thr Cys Leu lie His Ser Ser Ser Phe Gly Val Gly 1 5 10 15 Gly Lys Lys Val Lys Met Asn Thr Met lie Arg Ser Lys Leu Phe Ser 20 25 30 lie Arg Ser Ala Leu Asp Thr Lys Val Ser Asp Met Ser Val Asn Ala 35 40 45 Pro Lys Gly Leu Phe Pro Pro Glu Pro Glu His Tyr Arg Gly Pro Lys 50 55 60 Leu Lys Val Ala lie lie Gly Ala Gly Leu Ala Gly Met Ser Thr Ala 65 70 75 80 Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His Glu Val Asp lie Tyr Glu Ser Arg 85 90 95 Gln Phe lie Gly Gly Lys Val Gly Ser Phe Val Asp Lys Arg Gly Asn 100 105 110 His lie Glu Met Gly Leu His Val Phe Phe Gly Cys Tyr Asn Asn Leu 115 120 125 Phe Arg Leu Met Lys Lys Val Gly Ala Asp Glu Asn Leu Leu Val Lys 130 135 140 Asp His Thr His Thr Phe Val Asn Arg Gly Gly Glu lie Gly Glu Leu 145 150 155 160 Asp Phe Arg Leu Pro Met Gly Ala Pro Leu His Gly lie Arg Ala Phe 165 170 175 Leu Thr Thr Asn Gln Leu Lys Pro Tyr Asp Lys Ala Arg Asn Ala Val 180 185 190 Ala Leu Ala Leu Ser Pro Val Val Arg Ala Leu lie Asp Pro Asn Gly 195 200 205 Ala Met Gln Asp lie Arg Asn Leu Asp Asn lie Ser Phe Ser Asp Trp 210 215 220 Phe Leu Ser Lys Gly Gly Thr Arg Met Ser lie Gln Arg Met Trp Asp 225 230 235 240 Pro Val Ala Tyr Ala Leu Gly Phe lie Asp Cys Asp Asn lie Ser Ala 245 250 " 255 Arg Cys Met Leu Thr lie Phe Ser Leu Phe Ala Thr Lys Thr Glu Ala 260 265 270 Ser Leu Leu Arg Met Leu Lys Gly Ser Pro Asp Val Tyr Leu Ser Gly 275 280 285 Pro lie Arg Lys Tyr lie Thr Asp Lys Gly Gly Arg Phe His Leu Arg 290 295 300 Trp Gly Cys Arg Glu lie Leu Tyr Asp Glu Leu Ser Asn Gly Asp Thr 305 31.0 315 320 Tyr lie Thr Gly lie Ala Met Ser Lys Ala Thr Asn Lys Lys Leu Val 325 330 335 Lys Ala Asp Val Tyr Val Ala Ala Cys Asp Val Pro Gly lie Lys Arg 340 345 350 Leu lie Pro Ser Glu Trp Arg Glu Trp Asp Leu Phe Asp Asn 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tea gga ata ggt gga ttg gtg gca 336 Ser Tyr Asp Ala lie Val lie Gly Ser Gly lie Gly Gly Leu Val Ala 100 105 110 gcg acg cag ctg gcg gtt aag gga gct aag gtt tta gtt ctg gag aag 384 Ala Thr Gln Leu Ala Val Lys Gly Ala Lys Val Leu Val Leu Glu Lys 115 120 125 tat gtt att ect ggt gga age tet ggc ttt tac gag agg gat ggt tat 432 Tyr Val lie Pro Gly Gly Ser Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Asp Gly Tyr 130 135 140 aag ttt gat gtt ggt tea tea gtg atg ttt gga ttc agt gat aag gga 480 Lys Phe Asp Val Gly Ser Ser Val Met Phe Gly Phe Ser Asp Lys Gly 145 150 155 160 aac etc aat tta att act caá gca ttg gca gca gta gga cgt aaa tta 528 Asn Leu Asn Leu lie Thr Gln Ala Leu Ala Ala Val Gly Arg Lys Leu 165 170 175 gaa gtt ata ect gac cea acá act gta cat ttc cae ctg cea aat gac 576 Glu Val lie Pro Asp Pro Thr Thr Val His Phe His Leu Pro Asn Asp 180 185 190 ctt tet gtt cgt ata cae cga gag tat gat gac ttc att gaa gag ctt 624 Leu Ser Val Arg lie His Arg Glu Tyr Asp Asp Phe lie Glu Glu Leu 195 200 205 gtg agt aaa ttt cea cat gaa aag gaa ggg att ate aaa ttt tac agt 672 Val Ser Lys Phe Pro His Glu Lys Glu Gly lie lie Lys Phe Tyr Ser 210 215 220 gaa tgc tgg aag ate ttt aat tet ctg aat tea ttg gaa ctg aag tet 720 Glu Cys Trp Lys lie Phe Asn Ser Leu Asn Ser Leu Glu Leu Lys Ser 225 230 235 240 ttg gag gaa ecc ate tac ctt ttt ggc cag ttc ttt aag aag ecc ctt 768 Leu Glu Glu Pro lie Tyr Leu Phe Gly Gln Phe Phe Lys Lys Pro Leu 245 250 255 gaa tgc ttg act ctt gee tac tat ttg ecc cag aat gct ggt age ate 816 Glu Cys Leu Thr Leu Ala Tyr Tyr Leu Pro Gln Asn Ala Gly Ser lie 260 265 270 gct cgg aag tat ata aga gat ect ggg ttg ctg tet ttt ata gat gca 864 Ala Arg Lys Tyr lie Arg Asp Pro Gly Leu Leu Ser Phe lie Asp Ala 275 280 285 gag tgc ttt ate gtg agt acá gtt aat gca tta caá acá cea atg ate 912 Glu Cys Phe lie Val Ser Thr Val Asn Ala Leu Gln Thr Pro Met lie 290 295 300 aat gca age atg gtt cta tgt gac aga cat ttt ggc gga ate aac tac 960 Asn Ala Ser Met Val Leu Cys Asp Arg His Phe Gly Gly lie Asn Tyr 305 310 315 320 ecc gtt ggt gga gtt ggc gag ate gee aaa tec tta gca aaa ggc ttg 1008 Pro Val Gly Gly Val Gly Glu lie Ala Lys Ser Leu Ala Lys Gly Leu 325 330 335 gat gat cae gga agt cag ata ctt tat agg gca aat gtt acá agt ate 1056 Asp Asp His Gly Ser Gln lie Leu Tyr Arg Ala Asn Val Thr Ser lie 340 345 350 att ttg gac aat ggc aaa gct gtg gga gtg aag ctt tet gac ggg agg 1104 lie Leu Asp Asn Gly Lys Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg 355 360 365 aag ttt tat gct aaa acc ata gta teg aat gct acc aga tgg gat act 1152 Lys Phe Tyr Ala Lys Thr lie Val Ser Asn Ala Thr Arg Trp Asp Thr 370 375 380 ttt gga aag ctt tta aaa gct gag aat ctg cea aaa gaa gaa gaa aat 1200 Phe Gly Lys Leu Leu Lys Ala Glu Asn Leu Pro Lys Glu Glu Glu Asn 385 390 395 400 ttc cag aaa gct tat gta aaa gca ect tet ttt ctt tet att cat atg 1248 Phe Gln Lys Ala Tyr Val Lys Ala Pro Ser Phe Leu Ser lie His Met 405 410 415 gga gtt aaa gca gat gta etc cea cea gac acá gat tgt cae cat ttt 1296 Gly Val Lys Ala Asp Val Leu Pro Pro Asp Thr Asp Cys His His Phe 420 425 430 gtc etc gag gat gat tgg acá aat ttg gag aaa cea tat gga agt ata 1344 Val Leu Glu Asp Asp Trp Thr Asn Leu Glu Lys Pro Tyr Gly Ser lie 435 440 445 ttc ttg agt att cea acá gtt ctt gat tec tea ttg gee cea gaa gga 1392 Phe Leu Ser lie Pro Thr Val Leu Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly 450 455 460 cae cat att ctt cae att ttt acá acá teg age att gaa gat tgg gag 1440 His His lie Leu His lie Phe Thr Thr Ser Ser lie Glu Asp Trp Glu 465 470 475 480 gga etc tet ecg aaa gac tat gaa gcg aag aaa gag gtt gtt gct gaa 1488 Gly Leu Ser Pro Lys Asp Tyr Glu Ala Lys Lys Glu Val Val Ala Glu 485 490 495 agg att ata age aga ctt gaa aaa acá etc ttc cea ggg ctt aag tea 1536 Arg lie lie Ser Arg Leu Glu Lys Thr Leu Phe Pro Gly Leu Lys Ser 500 505 510 tet att etc ttt aag gag gtg gga act cea aag acc cae aga cga tac 1584 Ser lie Leu Phe Lys Glu Val Gly Thr Pro Lys Thr His Arg Arg Tyr 515 520 525 ctt gct cgt gat agt ggt acc tat gga cea atg cea cgc gga acá ect 1632 Leu Ala Arg Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Pro Met Pro Arg Gly Thr Pro 530 535 540 aag gga ctc ctg gga atg cct ttc aat acc act gct ata gat ggt cta 1680 Lys Gly Leu Leu Gly Met Pro Phe Asn Thr Thr Ala lie Asp Gly Leu 545 550 555 560 tat tgt gtt ggc gat agt tgc ttc cea gga caá ggt gtt ata gct gta 1728 Tyr Cys Val Gly Asp Ser Cys Phe Pro Gly Gln Gly Val lie Ala Val 565 570 575 gcc ttt tca gga gta atg tgc gct cat cgt gtt gca gct gac tta ggg 1776 Ala Phe Ser Gly Val Met Cys Ala His Arg Val Ala Ala Asp Leu Gly 580 585 590 ttt gaa aaa aaa tca gat gtg ctg gac agt gct ctt ctt aga cta ctt 1824 Phe Glu Lys Lys Ser Asp Val Leu Asp Ser Ala Leu Leu Arg Leu Leu 595 600 605 ggt tgg tta agg aca cta gca tga 1848 Gly Trp Leu Arg Thr Leu Ala 610 615 <210> 134 <211> 615 <212> P T <213> Lycopersicon esculentum <400> 134 Met Cys Thr Leu Ser Phe Met Tyr Pro Asn Ser Leu Leu Asp Gly Thr 1 5 10 15 Cys Lys Thr Val Ala Leu Gly Asp Ser Lys Pro Arg Tyr Asn Lys Gln 20 25 30 Arg Ser Ser Cys Phe Asp Pro Leu lie lie Gly Asn Cys Thr Asp Gln 35 40 45 Gln Gln Leu Cys Gly Leu Ser Trp Gly Val Asp Lys Ala Lys Gly Arg 50 55 60 Arg Gly Gly Thr Val Ser Asn Leu Lys Ala Val Val Asp Val Asp Lys 65 70 75 80 Arg Val Glu Ser Tyr Gly Ser Ser Asp Val Glu Gly Asn Glu Ser Gly 85 ' 90 95 Ser Tyr Asp Ala lie Val lie Gly Ser Gly lie Gly Gly Leu Val Ala 100 105 110 Ala Thr Gln Leu Ala Val Lys Gly Ala Lys Val Leu Val Leu Glu Lys 115 120 125 Tyr Val lie Pro Gly Gly Ser Ser Gly Phe Tyr Glu Arg Asp Gly Tyr 130 135 140 Lys Phe Asp Val Gly Ser Ser Val Met Phe Gly Phe Ser Asp Lys Gly 145 150 155 160 Asn Leu Asn Leu lie Thr Gln Ala Leu Ala Ala Val Gly Arg Lys Leu 165 170 175 Glu Val lie Pro Asp Pro Thr Thr Val His Phe His Leu Pro Asn Asp 180 185 190 Leu Ser Val Arg lie His Arg Glu Tyr Asp Asp Phe lie Glu Glu Leu 195 200 205 Val Ser Lys Phe Pro His Glu Lys Glu Gly lie lie Lys Phe Tyr Ser 210 215 220 Glu Cys Trp Lys lie Phe Asn Ser Leu Asn Ser Leu Glu Leu Lys Ser 225 230 235 240 Leu Glu Glu Pro lie Tyr Leu Phe Gly Gln Phe Phe Lys Lys Pro Leu 245 250 255 Glu Cys Leu Thr Leu Ala Tyr Tyr Leu Pro Gln Asn Ala Gly Ser lie 260 265 270 Ala Arg Lys Tyr lie Arg Asp Pro Gly Leu Leu Ser Phe lie Asp Ala 275 280 285 Glu Cys Phe lie Val Ser Thr Val Asn Ala Leu Gln Thr Pro Met lie 290 295 300 Asn Ala Ser Met Val Leu Cys Asp Arg His Phe Gly Gly lie Asn Tyr 305 310 315 320 Pro Val Gly Gly Val Gly Glu lie Ala Lys Ser Leu Ala Lys Gly Leu 325 330 335 Asp Asp His Gly Ser Gln lie Leu Tyr Arg Ala Asn Val Thr Ser lie 340 345 350 lie Leu Asp Asn Gly Lys Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg 355 360 365 Lys Phe Tyr Ala Lys Thr lie Val Ser Asn Ala Thr Arg Trp Asp Thr 370 375 380 Phe Gly Lys Leu Leu Lys Ala Glu Asn Leu Pro Lys Glu Glu Glu Asn 385 390 395 400 Phe Gln Lys Ala Tyr Val Lys Ala Pro Ser Phe Leu Ser lie His Met 405 410 415 Gly Val Lys Ala Asp Val Leu Pro Pro Asp Thr Asp Cys His His Phe 420 425 430 Val Leu Glu Asp Asp Trp Thr Asn Leu Glu Lys Pro Tyr Gly Ser lie 435 440 445 Phe Leu Ser lie Pro Thr Val Leu Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly 450 455 460 His His lie Leu His lie Phe Thr Thr Ser Ser lie Glu Asp Trp Glu 465 470 475 480 Gly Leu Ser Pro Lys Asp Tyr Glu Ala Lys Lys Glu Val Val Ala Glu 485 490 495 Arg lie lie Ser Arg Leu Glu Lys Thr Leu Phe Pro Gly Leu Lys Ser 500 505 510 Ser lie Leu Phe Lys Glu Val Gly Thr Pro Lys Thr His Arg Arg Tyr 515 520 525 Leu Ala Arg Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Pro Met Pro Arg Gly Thr Pro 530 535 540 Lys Gly Leu Leu Gly Met Pro Phe Asn Thr Thr Ala lie Asp Gly Leu 545 550 555 560 Tyr Cys Val Gly Asp Ser Cys Phe Pro Gly Gln Gly Val lie Ala Val 565 570 575 Ala Phe Ser Gly Val Met Cys Ala His Arg Val Ala Ala Asp Leu Gly 580 585 590 Phe Glu Lys Lys Ser Asp Val Leu Asp Ser Ala Leu Leu Arg Leu Leu 595 600 605 Gly Trp Leu Arg Thr Leu Ala 610 615 <210> 135 <211> 1233 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> CDS <222> (1) .. (1233) <223> <400> 135 atg gcc acá cae aaa etc ctt caá ttc acc acc aat etc cea cea tet 48 Met Ala Thr His Lys Leu Leu Gln Phe Thr Thr Asn Leu Pro Pro Ser 1 5 10 15 tet tet tea ate tet act ggc tgt tea etc tec ecc ttc ttc etc aaa 96 Ser Ser Ser lie Ser Thr Gly Cys Ser Leu Ser Pro Phe Phe Leu Lys 20 25 30 tea tet tet cat tec ect aac ect cgc cga cae cgc cgc tec gcc gta 144 Ser Ser Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Arg His Arg Arg Ser Ala Val 35 40 45 tgc tgc tet ttc gcc tea etc gac tet gca aaa ate aaa gtc gtt ggc 192 Cys Cys Ser Phe Ala Ser Leu Asp Ser Ala Lys lie Lys Val Val Gly 50 55 60 gtc ggt ggt ggt ggc aac aat gcc gtt aac cgc atg att ggt age ggc 240 ' Val Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ala Val Asn Arg Met lie Gly Ser Gly 65 70 75 80 tta cag ggt gtt gat ttt tac gcc att aac acg gac tca caa gcg ctt 288 Leu Gln Gly Val Asp Phe Tyr Ala lie Asn Thr Asp Ser Gln Ala Leu 85 90 95 ctg caa tct gtt gca cat aac cct att caa att ggg gag ctt ttg act 336 Leu Gln Ser Val Ala His Asn Pro lie Gln lie Gly Glu Leu Leu Thr 100 105 110 cgt gga tta ggt act ggt ggg aac ccg ctt ttg gga gaa cag gct gcg 384 Arg Gly Leu Gly Thr Gly Gly Asn Pro Leu Leu Gly Glu Gln Ala Ala 115 120 125 gag gag tcg aag gaa gcg att ggg aat gcg ctt aaa ggg tcg gat ctt 432 Glu Glu Ser Lys Glu Ala lie Gly Asn Ala Leu Lys Gly Ser Asp Leu 130 135 140 gtg ttt ata acá gca ggt atg ggt ggt ggg acg ggt tcg ggt gct gct 480 Val Phe lie Thr Ala Gly Met Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ala Ala 145 150 155 160 cea gtt gta gcg cag ata gcg aaa gaa gca ggg tat tta act gtt ggt 528 Pro Val Val Ala Gln lie Ala Lys Glu Ala Gly Tyr Leu Thr Val Gly 165 170 175 gtt gta acg tac cea ttc age ttt gaa ggc cgt aaa aga tca gta cag 576 Val Val' Thr Tyr Pro Phe Ser Phe Glu Gly Arg Lys Arg Ser Val Gln 180 185 190 gcg tta gag gct att gag aag ctg caa aag aac gtt gac acá ctt ata 624 Ala Leu Glu Ala lie Glu Lys Leu Gln Lys Asn Val Asp Thr Leu lie 195 200 205 gtg att cea aat gac cgt ttg ctg gat att gct gat gaa aac acg cct 672 Val lie Pro Asn Asp Arg Leu Leu Asp lie Ala Asp Glu Asn Thr Pro 210 215 220 ctt cag gat gct ttt ctt ctt gct gat gat gta etc cgc caa gga gtt 720 Leu Gln Asp Ala Phe Leu Leu Ala Asp Asp Val Leu Arg Gln Gly Val 225 230 235 240 caa gga ate tca gat ata att ac ata cct ggg ctg gta aat gtg gac 768 Gln Gly lie Ser Asp lie lie Thr lie Pro Gly Leu Val Asn Val Asp 245 250 255 ttt gca gac gtt aaa gca gtc atg aaa gat tct gga act gca atg ctt 816 Phe Ala Asp Val Lys Ala Val Met Lys Asp Ser Gly Thr Ala Met Leu 260 265 270 ggt gtc ggt gtt tec tca agt aaa aac cga gct gaa gaa gca gct gaa 864 Gly Val Gly Val Ser Ser Ser Lys Asn Arg Ala Glu Glu Ala Ala Glu 275 280 285 caa gca act ctt gct cct ttg att gga tca tca att caa tct gct acá 912 Gln Ala Thr Leu Ala Pro Leu lie Gly Ser Ser lie Gln Ser Ala Thr 290 295 300 ggt gtt gtt tat aat att acc gga ggg aag gac ata act cta caa gaa 960 Gly Val Val Tyr Asn lie Thr Gly Gly Lys Asp lie Thr Leu Gln Glu 305 310 315 320 gtc aac agg gtt tct cag gtg gta acá agt ttg gca gat cea tea gca 1008 Val Asn Arg Val Ser Gln Val Val Thr Ser Leu Ala Asp Pro Ser Ala 325 330 335 aac att ata ttc ggg gca gtg gta gat gag aga tac aac ggg gag att 1056 Asn lie lie Phe Gly Ala Val Val Asp Glu Arg Tyr Asn Gly Glu lie 340 345 350 cat gtg acc att gtt gct act ggc ttt gcc cag tcg ttt cag aaa tct 1104 His Val Thr lie Val Ala Thr Gly Phe Ala Gln Ser Phe Gln Lys Ser 355 360 365 ctt ctt gct gac ccg aaa gga gca aaa ctt gtt gat aga aat caá gaa Leu Leu Ala Asp Pro Lys Gly Ala Lys Leu Val Asp Arg Asn Gln Glu 370 375 380 cct acá caá cct ttg act tcc gcg aga tct ttg acá acá cct tct cct 1200 Pro Thr Gln Pro Leu Thr Ser Ala Arg Ser Leu Thr Thr Pro Ser Pro 385 390 395 400 gct ccg tct cgg tct agg aaa ctc ttc ttt taa 1233 Ala Pro Ser Arg Ser Arg Lys Leu Phe Phe 405 410 <210> 136 <211> 410 <212> PRT <213> Tagetes erecta <400> 136 Met Ala Thr His Lys Leu Leu Gln Phe Thr Thr Asn Leu Pro Pro Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser lie Ser Thr Gly Cys Ser Leu Ser Pro Phe Phe Leu Lys 20 25 30 Ser Ser Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Arg His Arg Arg Ser Ala Val 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ala Ser Leu Asp Ser Ala Lys lie Lys Val Val Gly 50 55 60 Val Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ala Val Asn Arg Met lie Gly Ser Gly 65 70 75 80 Leu Gln Gly Val Asp Phe Tyr Ala lie Asn Thr Asp Ser Gln Ala Leu 85 90 95 Leu Gln Ser Val Ala His Asn Pro lie Gln lie Gly Glu Leu Leu Thr 100 105 110 Arg Gly Leu Gly Thr Gly Gly Asn Pro Leu Leu Gly Glu Gln Ala Ala 115 120 125 Glu Glu Ser lys Glu Ala lie Gly Asn Ala Leu Lys Gly Ser Asp Leu 130 135 140 Val Phe lie Thr Ala Gly Met Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ala Ala 145 150 155 160 Pro Val Val Ala Gln lie Ala Lys Glu Ala Gly Tyr Leu Thr Val Gly 165 170 175 Val Val Thr Tyr Pro Phe Ser Phe Glu Gly Arg Lys Arg Ser Val Gln 180 185 190 Ala Leu Glu Ala lie Glu Lys Leu Gln Lys Asn Val Asp Thr Leu lie 195 200 205 Val lie Pro Asn Asp Arg Leu Leu Asp lie Ala Asp Glu Asn Thr Pro 210 215 220 Leu Gln Asp Ala Phe Leu Leu Ala Asp Asp Val Leu Arg Gln Gly Val 225 230 235 240 Gln Gly lie Ser Asp lie lie Thr lie Pro Gly Leu Val Asn Val Asp 245 250 255 Phe Ala Asp Val Lys Ala Val Met Lys Asp Ser Gly Thr Ala Met Leu 260 265 270 Gly Val Gly Val Ser Ser Ser Lys Asn Arg Ala Glu Glu Ala Ala Glu 275 280 285 Gln Ala Thr Leu Ala Pro Leu lie Gly Ser Ser lie Gln Ser Ala Thr 290 295 300 Gly Val Val Tyr Asn lie Thr Gly Gly Lys Asp lie Thr Leu Gln Glu 305 310 315 320 Val Asn Arg Val Ser Gln Val Val Thr Ser Leu Ala Asp Pro Ser Ala 325 330 335 Asn lie lie Phe Gly Ala Val Val Asp Glu Arg Tyr Asn Gly Glu lie 340 345 350 His Val Thr lie Val Ala Thr Gly Phe Ala Gln Ser Phe Gln Lys Ser 355 360 365 Leu Leu Ala Asp Pro Lys Gly Ala Lys Leu Val Asp Arg Asn Gln Glu 370 375 380 Pro Thr Gln Pro Leu Thr Ser Ala Arg Ser Leu Thr Thr Pro Ser Pro 385 390 395 400 Ala Pro Ser Arg Ser Arg Lys Leu Phe Phe 405 410 <210> 137 <211> 891 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> CDS <222> (1) .. (891) <223> <400> 137 atg acá tcc ctg agg ttt cta acá gaa ccc tea ctt gta tgc tca tcc 48 Met Thr Ser Leu Arg Phe Leu Thr Glu Pro Ser Leu Val Cys Ser Ser 1 5 10 15 act ttc ccc acá ttc aat ccc cta cae aaa acc cta act aaa cea acá 96 Thr Phe Pro Thr Phe Asn Pro Leu His Lys Thr Leu Thr Lys Pro Thr 20 25 30 cea aaa ccc tac cea aag cea cea cea att cgc tcc gtc ctt caá tac 144 Pro Lys Pro Tyr Pro Lys Pro Pro Pro lie Arg Ser Val Leu Gln Tyr 35 40 45 aat cgc aaa cea gag etc gee gga gac act cea cga gtc gtc gca ate 192 Asn Arg Lys Pro Glu Leu Ala Gly Asp Thr Pro Arg Val Val Ala lie 50 55 60 gac gee gac gtt ggt cta cgt aac etc gat ctt ctt etc ggt etc gaa 240 Asp Ala Asp Val Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Leu Leu Gly Leu Glu 65 70 75 80 aac cgc gtc aat tac acc gtc gtt gaa gtt etc aac ggc gat tgc aga 288 Asn Arg Val Asn Tyr Thr Val Val Glu Val Leu Asn Gly Asp Cys Arg 85 90 95 etc gac caá gee cta gtt cgt gat aaa cgc tgg tca aat ttc gaa ttg 336 Leu Asp Gln Ala Leu Val Arg Asp Lys Arg Trp Ser Asn Phe Glu Leu 100 105 110 ctt tgt att tca aaa cct agg tca aaa ttg cct tta gga ttt ggg gga 384 Leu Cys lie Ser Lys Pro Arg Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Gly Gly 115 120 125 aaa gct tta gtt tgg ctt gat gca tta aaa gat agg caá gaa ggt tgc 432 Lys Ala Leu Val Trp Leu Asp Ala Leu Lys Asp Arg Gln Glu Gly Cys 130 135 140 ceg gat ttt ata ctt ata gat tgt cct gca ggt att gat gee ggg ttc 480 Pro Asp Phe lie Leu lie Asp Cys Pro Ala Gly lie Asp Ala Gly Phe 145 150 155 160 ata acc gee att acá ceg gct aac gaa gee gta tta gtt acá acá cct 528 lie Thr Ala lie Thr Pro Ala Asn Glu Ala Val Leu Val Thr Thr Pro 165 170 175 gat att act gca ttg aga gat gca gat aga gtt acá ggc ttg ctt gaa 576 Asp lie Thr Ala Leu Arg Asp Ala Asp Arg Val Thr Gly Leu Leu Glu 180 185 190 tgt gat gga att agg gat att aaa atg att gtg aac aga gtt aga act 624 Cys Asp Gly lie Arg Asp lie Lys Met lie Val Asn Arg Val Arg Thr 195 200 205 gat ttg ata agg ggt gaa gat atg atg tca gtt ctt gat gtt caa gag 672 Asp Leu lie Arg Gly Glu Asp Met Met Ser Val Leu Asp Val Gln Glu 210 215 220 atg ttg gga ttg tca ttg ttg agt gat acc cga gga ttc gaa gtg att 720 Met Leu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Asp Thr Arg Gly Phe Glu Val lie 225 230 235 240 cgg agt acg aat aga ggg ttt ccg ctt gtg ttg aac aag cct ccg act 768 Arg Ser Thr Asn Arg Gly Phe Pro Leu Val Leu Asn Lys Pro Pro Thr 245 250 255 tta gca gga ttg gca ttt gag cag gct gct tgg aga ttg gtt gag caa 816 Leu Ala Gly Leu Ala Phe Glu Gln Ala Ala Trp Arg Leu Val Glu Gln 260 265 270 gat age atg aag gct gtg atg gtg gag gaa gaa cct aaa aag agg gga 864 Asp Ser Met Lys Ala Val Met Val Glu Glu Glu Pro Lys Lys Arg Gly 275 280 285 ttt ttc teg ttt ttt gga ggt tag tga 891 Phe Phe Ser Phe Phe Gly Gly 290 295 <210> 138 <211> 295 <212> PRT <213> Tagetes erecta <400> 138 Met Thr Ser Leu Arg Phe Leu Thr Glu Pro Ser Leu Val Cys Ser Ser 1 5 10 15 Thr Phe Pro Thr Phe Asn Pro Leu His Lys Thr Leu Thr Lys Pro Thr 20 25 30 Pro Lys Pro Tyr Pro Lys Pro Pro Pro lie Arg Ser Val Leu Gln Tyr 35 40 45 Asn Arg Lys Pro Glu Leu Ala Gly Asp Thr Pro Arg Val Val Ala lie 50 55 60 Asp Ala Asp Val Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Leu Leu Gly Leu Glu 65 70 75 80 Asn Arg Val Asn Tyr Thr Val Val Glu Val Leu Asn Gly Asp Cys Arg 85 90 95 Leu Asp Gln Ala Leu Val Arg Asp Lys Arg Trp Ser Asn Phe Glu Leu 100 105 110 Leu Cys lie Ser Lys Pro Arg Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Gly Gly 115 120 125 Lys Ala Leu Val Trp Leu Asp Ala Leu Lys Asp Arg Gln Glu Gly Cys 130 135 140 Pro Asp Phe lie Leu lie Asp Cys Pro Ala Gly lie Asp Ala Gly Phe 145 150 155 160 lie Thr Ala lie Thr Pro Ala Asn Glu Ala Val Leu Val Thr Thr Pro 165 170 175 Asp lie Thr Ala Leu Arg Asp Ala Asp Arg Val Thr Gly Leu Leu Glu 180 185 190 Cys Asp Gly lie Arg Asp lie Lys Met lie Val Asn Arg Val Arg Thr 195 200 205 Asp Leu lie Arg Gly Glu Asp Met Met Ser Val Leu Asp Val Gln Glu 210 215 220 Met Leu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Asp Thr Arg Gly Phe Glu Val lie 225 230 235 240 Arg Ser Thr Asn Arg Gly Phe Pro Leu Val Leu Asn Lys Pro Pro Thr 245 250 255 Leu Ala Gly Leu Ala Phe Glu Gln Ala Ala Trp Arg Leu Val Glu Gln 260 265 270 Asp Ser Met Lys Ala Val Met Val Glu Glu Glu Pro Lys Lys Arg Gly 275 280 285 Phe Phe Ser Phe Phe Gly Gly 290 295 <210> 139 <211> 332 <212> ADN <213> Tagetes erect <220> <221> CDS <222> (1) .. (330) <223> <400> 139 aag ctt gca cga gcc tct ctc tat ttt tac act tea atg gcg gca gca 48 Lys Leu Ala Arg Ala Ser Leu Tyr Phe Tyr Thr Ser Met Ala Ala Ala 1 5 10 15 att gct gtc ect tgt age tea aga cea ttt ggc tta ggt cga atg cgg 96 lie Ala Val Pro Cys Ser Ser Arg Pro Phe Gly Leu Gly Arg Met Arg 20 25 30 tta ctt ggt cat aaa ecc acá acc ata act tgt cae ttc ecc ttt tct 144 Leu Leu Gly His Lys Pro Thr Thr lie Thr Cys His Phe Pro Phe Ser 35 40 45 ttt tct ate aaa toa ttt acc cea att gtt agg ggc aga aga tgt act 192 Phe Ser lie Lys Ser Phe Thr Pro lie Val Arg Gly Arg Arg Cys Thr 50 55 60 gtt tgt ttt gtt gcc ggt ggc gac agt aat agt aac agt aat aat aat 240 Val Cys Phe Val Ala Gly Gly Asp Ser Asn Ser Asn Ser Asn Asn Asn 65 70 75 80 agt gac agt aat agt aat aat ccg ggt ctg gat tta aac ccg gcg gtt Ser Asp Ser Asn Ser Asn Asn Pro Gly Leu Asp Leu Asn Pro Ala Val 85 90 95 atg aac cgt aac cgt ttg gtt gaa gaa aaa atg gag agg tcg ac Met Asn Arg Asn Arg Leu Val Glu Glu Lys Met Glu Arg Ser 100 105 110 <210> 140 <211> 110 <212> PRT <213> Tagetes erecta <400> 140 Lys Leu Ala Arg Ala Ser Leu Tyr Phe Tyr Thr Ser Met Ala Ala Ala 1 5 10 15 lie Ala Val Pro Cys Ser Ser Arg Pro Phe Gly Leu Gly Arg Met Arg 20 25 30 Leu Leu Gly His Lys Pro Thr Thr lie Thr Cys His Phe Pro Phe Ser 35 40 45 Phe Ser lie Lys Ser Phe Thr Pro lie Val Arg Gly Arg Arg Cys Thr 50 55 60 Val Cys Phe Val Ala Gly Gly Asp Ser Asn Ser Asn Ser Asn Asn Asn 65 70 75 80 Ser Asp Ser Asn Ser Asn Asn Pro Gly Leu Asp Leu Asn Pro Ala Val 85 90 95 Met Asn Arg Asn Arg Leu Val Glu Glu Lys Met Glu Arg Ser 100 105 110 <210> 141 <211> 332 <212> ADN <213> Tagetes erceta <220> <221> misc_feature <222> (1)..(332) <223> fragmento sentido de b-hidroxilasa <400> 141 aagcttgcac gagcctctct ctatttttac acttcaatgg cggcagcaat tgctgtccct 60 tgtagctcaa gaccatttgg cttaggtcga atgcggttac ttggtcataa acccacaacc 120 ataacttgtc acttcccctt ttctttttct atcaaatcat ttaccccaat tgttaggggc 180 agaagatgta ctgtttgttt tgttgccggt ggcgacagta atagtaacag taataataat 240 agtgacagta , atagtaataa tccgggtctg gatttaaacc cggcggttat gaaccgtaac 300 cgtttggttg aagaaaaaat ggagaggtcg ac 332 <210> 142 <211> 332 <212> ADN <213> Tagetes erecta <220> <221> misc_feature <222> (1)..(332) <223> fragmento antisentido de b-hidroxilasa <400> 142 gaattcggca cgagcctctc tctattttta cacttcaatg gcggcagcaa ttgctgtccc 60 ttgtagctca agaccatttg gcttaggtcg aatgcggtta cttggtcata aacccacaac 120 cataacttgt cacttcccct tttctttttc tatcaaatca tttaccccaa ttgttagggg 180 cagaagatgt actgtttgtt ttgttgccgg tggcgacagt aatagtaaca gtaataataa 240 tagtgacagt aatagtaata atccgggtct ggatttaaac ccggcggtta tgaaccgtaa 300 ccgtttggtt gaagaaaaaa tggagaggat ce 332

Claims (29)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Uso de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes, CARACTERIZADO porque es en la administración oral a los animales.
  2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina de las plantas o partes de las plantas que contienen de astaxantina pertenecientes al género Tagetes se utilizan en la pigmentación de los animales y de los correspondientes productos de los animales.
  3. 3. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes . se mezclan con las preparaciones de alimentos para los animales y la preparación de alimento para los animales se administra por vía oral a los animales.
  4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de las plantas o de las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes se procesan antes de ser mezcladas con los preparaciones de alimentos para los animales de tal modo de facilitar el mezclado con las preparaciones de alimentos para los animales.
  5. 5. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de las plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes se administran directamente por via oral a los animales.
  6. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del qénero Tagetes se procesan antes de su administración, en una forma tal que facilita una administración oral directa a los animales .
  7. 7. El uso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes son capaces de producir astaxantina mediante una modificación genética .
  8. 8. El uso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque los animales se eligen del grupo que consiste de peces, crustáceos, Galiformes y Anatridae.
  9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque los animales se eligen del grupo que consiste de los salmónidos, camarones, cangrejos, gallinas o pollos, patos, gansos y flamencos.
  10. 10. El uso de conformidad con una de las reivindicaciones 2 a 9, CARACTERIZADO porque los productos de los animales se eligen del grupo que consiste de la carne, pellejo, plumas y yemas de huevo.
  11. 11. El uso de conformidad con una, de las reivindicaciones 1 a 10, CARACTERIZADO porque las partes de las plantas utilizadas son las cabezas de flores o los pétalos .
  12. 12. Un procedimiento para producir preparaciones alimenticias para los animales, CARACTERIZADO porque comprende combinar las plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes con los componentes usuales de los alimentos para los animales.
  13. 13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, CARACTERZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes se procesan antes de la combinación con los alimentos para los animales, de tal modo de permitir la combinación con los alimentos para los animales.
  14. 14. Un procedimiento para pigmentar animales o los productos de los animales, CARACTERIZADO porque es mediante la administración oral de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes, a los animales.
  15. 15. Un procedimiento para producir animales pigmentados o los productos de los animales, CARACTERIZADO porque es mediante la administración oral de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o extracto's que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes, a los animales.
  16. 16. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes se mezclan con las preparaciones de alimentos para los animales y la preparación de alimento para los animales se administra por via oral a los animales .
  17. 17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de las plantas o de las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes se procesan antes de ser mezcladas con los preparaciones de alimentos para los animales de tal modo de facilitar el mezclado con las preparaciones de alimentos para los animales.
  18. 18. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de las plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes se administran directamente por via oral a los animales.
  19. 19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, CARACTERIZADO porque las plantas o las partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al qénero Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes se procesan antes de su administración, en una forma tal que facilita una administración oral directa a los animales.
  20. 20. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 14 a 19, CARACTERIZADO porque las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes son capaces de producir astaxantina mediante una modificación genética .
  21. 21. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 14 a 20, CARACTERIZADO porque los animales se eligen del grupo que consiste de peces, crustáceos, galiformes y anatridae.
  22. 22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, CARACTERIZADO porque los animales se eligen del grupo que consiste de salmónidos, crustáceos, cangrejos, pollos, patos, gansos y flamencos.
  23. 23. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicación 14 a 22, CARACTERIZADO porque los productos de los animales se eligen del grupo que consiste de la carne, cuero, plumas y huevo.
  24. 24. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 14 a 23, CARACTERIZADO porque las partes de las plantas utilizadas son las cabezas de las flores o los pétalos .
  25. 25. El uso de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes o extractos que contienen astaxantina de plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes, CARACTERIZADO porque es como alimento para los animal o suplemento de alimento para los animal.
  26. 26. Una preparación de alimento para animales, CARACTERIZADO porque comprende plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes o extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes.
  27. 27. Un agente de pigmentación, CARACTERIZADO porque comprende plantas o partes de plantas que contienen astaxantina del género Tagetes o los extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes.
  28. 28. El agente de pigmentación de conformidad con la reivindicación 27, CARACTERIZADO porque consiste de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina del género Tagetes o extractos que contienen astaxantina provenientes de plantas o partes de las plantas que contienen astaxantina pertenecientes al género Tagetes.
  29. 29. El agentes de pigmentación de conformidad con las reivindicaciones 27 o 28, CARACTERIZADO porque las partes de las plantas utilizadas son cabezas de flores o los pétalos .
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