MXPA06001620A - Metodo para producir cetocarotenoides en organismos no humanos geneticamente modificados. - Google Patents

Metodo para producir cetocarotenoides en organismos no humanos geneticamente modificados.

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Abstract

La invencion se relaciona a un metodo para producir cetocarotinoides mediante el cultivo de organismos geneticamente modificados que tiene una actividad cetolasa modificada y actividad ??-ciclasa modificada cuando se compara en el organismo de tipo silvestre. La invencion tambien se relaciona a organismos geneticamente modificados, a su uso como pasta alimenticia y a su uso para producir extractos de cetocarotinoides.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR CETOCAROTENOIDES EN ORGANISMOS NO -HUMANOS, GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Descripción La presente invención se relaciona a un proceso para la preparación de cetocarotenoides cultivando organismos genéticamente modificados, los cuales en comparación con el tipo silvestre tienen una actividad de cetolasa modificada y una actividad de ß-ciclasa modificada, a los organismos genéticamente modificados, y a su uso como productos alimenticios y forraje para la producción de extractos de cetocarotenoides . Los carotenoides se sintetizan de nuevo en bacterias, algas, hongos y plantas. Los cetocarotenoides, es decir carotenoides los cuales comprenden al menos un grupo ceto, tal como por ejemplo, astaxantina, cantaxantina, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3' -hidroxi-equinenona, adonirubina y adonixantina son antioxidantes y pigmentos naturales los cuales se producen por algunas algas y microorganismos como metabolitos secundarios. ? cuenta de sus propiedades que imparten color, los cetocarotenoides y en particular la astaxantina se utilizan como auxiliares de pigmentación en la nutrición de animales, en particular en el cultivo de truchas, salmones y camarones. La preparación de astaxantina se lleva a cabo hoy dia principalmente por medio de procesos de síntesis química. Los cetocarotenoides naturales, tales como por ejemplo, astaxantina natural, se obtienen actualmente en pequeñas cantidades en procesos biotecnológicos cultivando algas, por ejemplo, Haematococcus pluvialis o por la fermentación de microorganismos optimizados por ingeniería genética, y aislamiento subsecuente. Un proceso biotecnológico económico para la preparación de cetocarotenoides naturales es por lo tanto de mayor importancia. Los ácidos nucleicos que codifican una cetolasa y las secuencias de proteína correspondientes . se han aislado a partir de varios organismos y explicado tal como por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una cetolasa a partir de ñgrobacterium aurantiacum (EP 735 137, No. de Acceso: D58420), de Alcaligenes sp. PC-1 (EP 735137, No. de Acceso: D58422), Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille y Haematoccus pluvialis, NIES-144 (EP 725137, WO 98/18910 y Lotan et al, FEBS Letters 1995, 364, 125-128, No. de Acceso: X86782 y D45881) , Paracoccus marcussi (No. de Acceso: Y15112), Synechocystis sp. Strain PC6803 (No. de Acceso: NP_442491), Bradyrhizobium sp. (No. de Acceso: AF218415) y Nostoc sp. PCC 7120 (Kaneko et al, DNA Res. 2001, 8(5), 205-213; No. de Acceso: AP003592, BAB74888) . EP 735 137 describe la preparación de xantofilas en microorganismos tales como por ejemplo, E. coli por la inserción de genes cetolasa (crtW) a partir de Agrobacterium aurantiacum o Alcaligenes sp. PC-1 en microorganismos. Se sabe a partir de la EP 725 137, WO 98/18910, Kajiwara · et al. (Plant Mol. Biol. 1995, 29, 343-352) y Hirschberg et al. (FEBS Letters 1995, 364, 125-128) para preparar astaxantina por la inserción de genes cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis (crtW, crtO o bkt) en E. coli . Hirschberg et al. (FEBS Letters 1997, 404, 129-134) describe la preparación de astaxantina en Synechococcus por la inserción de genes vetolasa (crtO) a partir de Hematococcus pluvialis. Sandmann et al. ( Photochemistry and Photobiology 2001, 73(5), 551-55) describe un proceso análogo el cual sin embargo, conduce a la preparación de cantaxantina y produce sólo trazas de astaxantina. WO 98/18910 y Hirschberg et al. (Nature Biotechnology 2000, 18(8), 888-892) describe la síntesis de cetocarotenoides en néctar de las flores del tabaco por la inserción del gen cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis (crtO) en tabaco. WO 01/20011 describe una construcción de ADN para la producción de cetocarotenoides, en particular astaxantina, en semillas de plantas oleaginosas tal como colza, girasol, soya y cáñamo utilizando un promotor específico de semilla y una cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis . Todos los procesos para la preparación de cetocarotenoides descritos en la técnica anterior y en particular los procesos descritos para la preparación · de astaxantina tienen la desventaja que en un lado el rendimiento no es aún satisfactorio y por el otro lado los organismos transgénicos producen una gran cantidad de subproductos hidroxilados tales como por ejemplo, zeaxantina y adonixantina . La invención se basa por lo tanto en el objeto para poner a disposición un proceso para la preparación de cetocarotenoides cultivando organismos no humanos genéticamente modificados, o para hacer además organismos no humanos genéticamente modificados disponibles, los cuales producen cetocarotenoides, a los cuales en un grado menor o ya no tienen las desventajas de la técnica previa descrita anteriormente o producen los cetocarotenoides deseados en rendimientos más elevados. Por consiguiente, se ha encontrado un proceso para la preparación de cetocarotenoides cultivando organismos no humanos genéticamente modificados, los cuales en comparación con el tipo silvestre tienen una actividad de cetolasa modificada y una actividad de ß-ciclasa modificada, y se provocó la actividad de ß-ciclasa modificada por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. Una "actividad de cetolasa modificada en comparación con el tipo silvestre" se entiende como significando para el caso en donde el organismo de activación en el tipo silvestre no tiene la actividad de cetolasa, de preferencia una "actividad de cetolasa provocada en comparación con el tipo silvestre". Una "actividad de cetolasa modificada en comparación con el tipo silvestre" se entiende como significando para el caso en donde el organismo de activación o .el tipo silvestre tiene una actividad de cetolasa, de preferencia una "actividad de cetolasa incrementada en comparación con el tipo silvestre". Una "actividad de ß-ciclasa modificada en comparación con el tipo silvestre" se entiende como significando para el caso en donde el organismo de activación o el tipo silvestre no tiene actividad de ß-ciclasa, de preferencia una "actividad de ß-ciclasa provocada en comparación con el tipo silvestre". Los organismos no humanos de acuerdo con la invención tales como por ejemplo, microorganismos o plantas son de preferencia organismos de activación, naturalmente en la posición para producir carotenoides tales como por ejemplo, ß-caroteno o zeaxantina, o pueden colocarse por modificación genética, tal como por ejemplo, re-regulación o trayectorias metabólicas o complementación, en la posición para producir carotenoides tales como por ejemplo, ß-caroteno o zeaxantina. Algunos organismos están, como organismos de activación o del tipo silvestre, ya en la posición para producir cetocarotenoides tales como por ejemplo, astaxantina o cantaxantina . Estos organismos, tales como por ejemplo, Haematococcus pluvialisr Paracoccus marcussi r Xanthophyllomyces dendrorhous r Bacillus circulans, Chlorococcum Phaffia rhodozyma , pheasanf s-eye, Neochloris wimmeri , Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis, Scenedes us vacuolatus, Chlorela zofingiensis, Ankistrodesmus braunii , Euglena sanguínea y Bacillus atrophaeus ya tienen como un organismos de activación o de tipo silvestre, una actividad de cetolasa y una actividad de ß-ciclasa. El término "tipo silvestre" se entiende de acuerdo con la invención como significando el organismo de activación correspondiente . Dependiendo del contexto, el término "organismo" puede entenderse como significando el organismo de activación no humano (tipo silvestre) o un organismo no humano genéticamente modificado, de acuerdo con la invención o ambos. De preferencia, y en particular en casos en donde la planta o el tipo silvestre no puede asignarse claramente, "tipo silvestre" se entiende en cada caso como significando un organismo de referencia para el incremento o la producción de la actividad de cetolasa, para el incremento o la producción de la actividad de hidroxilasa descrita posteriormente, para el incremento o la producción de la actividad de ß-ciclasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de HMG-CoA reductasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enildifosfato reductasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de 1-desoxi-D-xilosa 5-fosfato sintasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de 1-desoxi-D-xiü osa-5-fosfato reductoisomerasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de la isopentenil difosfato ?-isomerasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad' de geranil difosfato sintasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de la farnesil difosfato sintasa descrita posteriormente, para el incremento de la geranilgeranil difosfato sintasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de fitoeno sintasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de fitoeno desaturasa descrita posteriormente , para el incremento de la actividad de zeta-caroteno desaturasa descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de crtISO descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de FtsZ descrita posteriormente, para el incremento de la actividad de MinD descrita posteriormente, para la reducción de la actividad de e-ciclasa descrita posteriormente y para la reducción de la actividad de ß-hidroxilasa endógena descrita posteriormente y para el incremento del contenido de cetocarotenoides . Este organismo de referencia es para microorganismos que tienen ya como el tipo silvestre, una actividad de cetolasa, de preferencia Haematococcus pluvialis . Este organismo de referencia es para microorganismos que no tienen ya, como el tipo silvestre, actividad de cetolasa, de preferencia Blakeslea. Este organismo de referencia es para plantas que tienen ya como el tipo silvestre, una actividad de cetolasa, de preferencia, Adonis aestivalis, Adonis flammeus o Adonis annuus, particularmente de preferencia Adonis aestivalis . Este organismo de referencia es para plantas que no tienen ya actividad de cetolasa en pétalos, de preferencia Tagetes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei , Tagetes palmeri, Tagetes minuta o Tagetes campanulata, particularmente de preferencia Tagetes erecta. La actividad de cetolasa se entiende como significando la actividad enzimática de una cetolasa. Una cetolasa se entiende como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para introducir un grupo ceto en el anillo ß-ionona opcionalmente sustituido de carctenoides . En particular, una cetolasa se entiende como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir ß-caroteno a cantaxantina . Por consiguiente, la actividad de cetolasa se entiende como significando la cantidad ce ß-caroteno reactiva en un cierto tiempo por la cetolasa de proteína o una cantidad de la cantaxantina formada. En una modalidad del proceso de acuerdo con la invención, los organismos de activación utilizados son organismos no humanos que tienen ya como un tipo silvestre o un organismo de activación, una actividad de cetolasa, tal como por ejemplo, Haematococcus pluvialis, Paracoccus marcusii r Xanthophyllomyces dendrorhous, Bacillus circulans , Chlorococcum , Phaffia rhodozyma r pheasant' s eye, Neochloris wimmeri, Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis , Scendesmus vacuolatusr Chlorela zofingiensis , Ankistrodesmus braunii, Euglena sanguínea o Bacillus atrophaeus . En esta modalidad, la modificación genética provoca un incremento de la actividad de cetolasa en comparación con el tipo silvestre o el organismo de activación. Con una actividad de cetolasa incrementada comparada al tipo silvestre, la cantidad de ß-caroteno reactiva o la cantidad de cantaxantina formada por la cetolasa de proteina en un cierto tiempo se incrementa en comparación con el tipo silvestre. De preferencia, este incremento de la actividad de cetolasa es al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de cetolasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de cetolasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con , la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : La determinación de la actividad de cetolasa en material de plantas o microorganismos se lleva a cabo siguiendo el método de Fraser et al. (J. Biol. Chem. 272 (10) : 6128-6135, 1997). La actividad de cetolasa en extractos de plantas y microorganismos se determina utilizando los sustratos ß-caroneto y catanxantina en la presencia del lipido (lecitina de soya) y de detergente (colato ¦ de sodio) . Las relaciones del sustrato/producto a partir de los ensayos de cetolasa se determinan por medio de HPLC. El incremento de la actividad de cetolasa puede llevarse a cabo por varias rutas, por ejemplo, desconectando los mecanismos de regulación inhibidora en la traducción y el nivel de proteínas o incrementando la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa comparada al tipo silvestre, por ejemplo, por la inducción del gen cetolasa por medio de los activadores o por la inserción de ácidos nucleicos que codifican una cetolasa dentro del organismo. Incrementando la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa se entiende de acuerdo con la invención en esta modalidad como significando la manipulación de la expresión de las cetolasas endógenas propias del organismo. Esto puede lograrse, por ejemplo, modificando la secuencia de ADN promotora para los genes que codifican la cetolasa. Tal modificación, la cual resulta en una velocidad de expresión modificada o de preferencia incrementada, al menos de un gen cetolasa endógeno, puede llevarse a cabo por la eliminación o la inserción de las secuencias de ADN. Es posible como se describe anteriormente, modificar la expresión de al menos una cetolasa endógena por la aplicación de estímulo exógeno. Esto puede llevarse a cabo por medio de condiciones fisiológicas especiales, es decir, por la aplicación de sustancias extrañas. Además, la expresión incrementada de al menos un gen cetolasa endógeno puede lograrse por una proteina reguladora la cual no ocurre o se modifica en el organismo de tipo silvestre interactuando con el promotor de estos genes. Tal regulador puede ser una proteina quimérica la cual consiste de un dominio de unión de ADN y un dominio activador de transcripción, tal como se describe por ejemplo, en WO 96/06166. En una modalidad preferida, el incremento de la actividad de cetolasa comparado al tipo silvestre se lleva a cabo incrementando la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa. En una modalidad preferida adicional, el incremento de la expresión qenética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa se lleva a cabo por la introducción de ácidos nucleicos los cuales codifican cetolasas ' dentro del organismo . En los organismos transgénicos de acuerdo con la invención, al menos un gen cetolasa adicional se presenta por lo tanto en esta modalidad comparada al tipo silvestre. En esta modalidad, el organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención tiene de preferencia al menos un ácido nucleico exógeno (=heterólogo) , que codifica una cetolasa, o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una cetolasa. En otra modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención, los organismos de activación utilizados son organismos no humanos los cuales, como el tipo silvestre, no tienen actividad de cetolasa, tal como por ejemplo, Blakeslea , Marigold, Tagetes erecta, Tagetes lucida, Tagetes minuta, Tagetes pringlei , Tagetes palmeri y Tagetes campanulata . En esta modalidad preferida, la modificación genética provoca la actividad de cetolasa en los organismos. El organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención en esta modalidad preferida, en comparación con el tipo silvestre genéticamente no modificado, de este modo tiene una actividad de cetolasa y de este está de preferencia en la posición que expresa una cetolasa transgénicamente . En esta modalidad preferida, la producción de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa análogamente al incremento de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa descrita anteriormente se lleva a cabo de preferencia por la inserción de ácidos nucleicos los cuales codifican cetolasas en el organismo de activación. Para este fin, en ambas modalidades en principio, cada gen cetolasa, es decir, puede utilizarse cada ácido nucleico el cual codifica una cetolasa. Todos los ácidos nucleicos mencionados en la descripción pueden ser por ejemplo, una secuencia de ARN, ADN o ADNc. En las secuencias de cetolasa genómica a partir de fuentes eucarióticas las cuales comprenden intrones, en el caso en donde el organismo huésped no está en la posición o no puede colocarse en la posición para expresar la cetolasa correspondiente, van a utilizarse de preferencia secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tal como los ADNc correspondientes . Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican una cetolasa y las cetolasas correspondientes las cuales pueden utilizarse en el proceso de acuerdo con la invención son por ejemplo, secuencias de Haematoccus pluvialis, en particular de Haematoccus pluvialis Floto em. Wille (No. de Acceso: X86782; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 3, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 4) . Haematoccus pluvialis, NIES-144 (No. de Acceso: D45881; ácido nucleico: SEC . DE IDENT. NO.: 35, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 36) , Agrobacterium aurantiacum (No. de Acceso: D58420; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 37, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 38) , Alicaligenes spec. (No. de Acceso: D58422; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 39, proteina SEC. DE IDENT. NO.: 40), Paracoccus marcusii (No. de Acceso: Y15112 ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 41, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 42) . Synechocystis sp. Strain PC6803 (No. de Acceso: NP442491; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 43, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 44) . Bradyrhizobium sp. (No. de Acceso: AF218415; ácido nucleico; SEC. DE IDENT. NO. : 45, proteina SEC. DE IDENT. NO. : 46) . Nostoc sp. Strain PC7120 (No. de Acceso: AP003592, BAB74888; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 47, proteina SEC. DE IDENT. NO.: 48). Haematococcus pluvialis (No. de Acceso: AF534876, ???03484; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 49, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 50) . Paracoccus sp. MBIC1143 (No. de Acceso: D58420, P54972; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 51, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 52) Brevundimonas aurantiaca (No. de Acceso: AY166610, AAN86030; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 53, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 54) Nodularia spumigena NSOR10 (No. de Acceso: AY210783, AA064399; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 55, proteina : SEC. DE IDENT. NO. : 56) Nostoc punctiforme ATCC 29133 (No. de Acceso: NZ_AABC01000195, ZP_00111258; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 57, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 58) Nostoc punctiforme ATCC 29133 (No. de Acceso: NZ_AABC01000196; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 59, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 60) Deinococcus radiodurans' Rl (No. de Acceso: E75561, AE001872; ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 61, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 62), Synechococcus sp. WH8102, ácido nucleico: No. de Acceso: NZ_AABD01000001 , par de base 1,354,725-1,355,528 (SEC. DE IDENT. NO. : 75), proteina: No. de Acceso ZP_00115639 (SEC. DE IDENT. NO. : 76) (anotada como una proteina putativa) , o secuencias derivadas a partir de estas secuencias, tales como por ejemplo, las cetolasas de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 64 ó 66 y las secuencias de ácido nucleico de codificación correspondientes SEC. DE IDENT. NO. : 63 o la SEC. DE IDENT.
NO. : 65, las cuales se originan por ejemplo, por variación/mutación de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 58 ó la SEC. DE IDENT. NO. : 57, las cetolasas de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 68 ó 70 y las secuencias de ácido nucleico de codificación correspondiente' SEC. DE IDENT. NO. : 67 ó la SEC. DE IDENT. NO. : 69, las cuales se originan por ejemplo, por variación/mutación de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 60 ó la SEC. DE IDENT. NO. : 59, o las cetolasas de las secuencias SEC. DE IDENT. NO.: 72 ó 74 y las secuencias de ácido nucleico de codificación correspondientes SEC. DE IDENT. NO.: 71 o SEC. DE IDENT. NO.: 73, las cuales se originan, por ejemplo por variación o mutación de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 76 o la SEC. DE IDENT. NO. : 75. Ejemplos naturales adicionales de cetolasas y genes cetolasa los cuales pueden utilizarse en el proceso de acuerdo con la invención pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, por medio de comparaciones de identidad de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que comprenden las secuencias descritas anteriormente y en particular teniendo las secuencias SEC. DE IDENT. NO.: 4 y/o 48 y/o 58 y/o 60. Ejemplos naturales adicionales de cetolasas y genes cetolasa pueden encontrarse además fácilmente a partir de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, en particular empezando a partir de las secuencias SEC. DE IDENT. NO. : 3 y/o 47 y/o 57 y/o 59 a partir de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, por técnicas de hibridización en una manera conocida per se. La hibridización puede llevarse a cabo bajo condiciones moderadas (baja severidad) o de preferencia bajo condiciones rigurosas (alta severidad) . Tales condiciones de hibridización, las cuales aplican para todos los ácidos nucleicos de la descripción se describen por ejemplo, en Sambrook, J. Fritsch, E.F., Maniatis, T. , en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual) 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, las condiciones durante la etapa de lavado pueden seleccionarse a partir del rango de condiciones restringidas por aquellos con baja severidad (con 2X de SSC a 50°C) y aquellos con alta severidad (con 0.2X de SSC a 50°C, de preferencia a 65°C) (20X de SSC: 0.3M de citrato de sodio, 3M de cloruro de sodio, pH 7.0) . Además, la temperatura durante la etapa de lavado puede elevarse a partir de condiciones moderadas a temperatura ambiente, 22 °C hasta condiciones severas a 65 °C. Los dos parámetros, la concentración salina y la temperatura, pueden variarse de manera simultánea, uno de los dos parámetros puede también mantenerse constante y sólo el otro variarse. Durante la hibridización, los agentes de desnaturalización tales como por ejemplo, formamida o SDS pueden · emplearse también. En la presencia del 50% de formamida, la hibridización se lleva a cabo de preferencia a 42°C. Algunas condiciones ejemplares para la hibridización y la etapa de lavado se dan como un resultado de : (1) condiciones de hibridización con, por ejemplo, (i) 4X de SSC a 65°C, o (ii) 6X de SSC a 45°C, o (iii) 6X de SSC a 68°C, 100 mg/ml de ADN de esperma pescado desnaturalizado, o (iv) 6X de SSC, 0.5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado a 68 °C, o (v) 6XSSC, 0.5% de SDS , 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 50% de formamida a 42°C, o (vi) 50% de formamida, 4X de SSC a 42°C, o (vii) 50% (vol/vol) de formamida, 0.1% de albúmina de suero de bovino, 0.1% de Ficoll, 0.1% de polivinilpirrolidona, 50 mM de tampón de fosfato de sodio pH 6.5, 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sodio, a 42°C, o (viii) 2X ó 4X de SSC a 50°C (condiciones moderadas) , o (ix) 30 a 40% de formamida, 2X ó 4X de SSC a 42_ (condiciones moderadas) . (2) etapas de lavado en cada caso 10 minutos con por ejemplo, (i) 0.015 M de NaCl/0.0015 M de citrato de sodio/0.1% de SDS a 50°C, o (ii) 0.1X de SSC a 65°C, o (iii) 0.1X de SSC, 0.5% de SDS a 68°C, o (iv) 0.1X de SSC, 0.5% de SDS, 50% de formamida a 42°C, o (v) 0.2X de SSC, 0.1% de SDS a 42°C o (vi) 2X de SSC a 65°C (condiciones moderadas) . En una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención, se introducen ácidos nucleicos, los cuales codifican una proteina que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 4 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, particularmente de preferencia al menos 99% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 4 y las propiedades enzimáticas de una cetolasa. Al mismo tiempo, puede ser una secuencia de cetolasa natural, la cual puede encontrarse como se describe anteriormente, por comparación de identidad de las secuencias a partir de otros organismos, o una secuencia de cetolasa sintética la cual, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 4, se ,ha modificado por variación sintética, por ejemplo por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos. En una modalidad preferida adicional del proceso de acuerdo con la invención, se emplean ácidos nucleicos los cuales codifican una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 48 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, particularmente de preferencia al menos 99% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 48 y las propiedades enzimáticas de una cetolasa. Al mismo tiempo, puede ser una secuencia de cetolasa natural la cual, como se' describe anteriormente, puede encontrarse por comparación de identidad de las secuencias a partir de otros organismos, o una secuencia de cetolasa sintética la cual, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 48, se ha modificado por variaciones sintéticas, por ejemplo por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos . En una modalidad preferida adicional del proceso de acuerdo con la invención, se introducen ácidos nucleicos los cuales codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 58 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, particularmente de preferencia al menos 99% en el nivel de aminoácidos con la secuencia de SEC. DE IDENT. NO.: 58 y las propiedades enzimáticas de una cetolasa. Al mismo tiempo, puede ser una secuencia de cetolasa natural la cual, como se describe anteriormente, puede encontrarse por comparación de identidad de las secuencias a partir de otros organismos, o una secuencia de cetolasa sintética la cual, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 58, se ha modificado por variación sintética, por ejemplo por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos .
En una modalidad preferida adicional del proceso de acuerdo con la invención, se introducen ácidos nucleicos los cuales codifican una proteina que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 60 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, particularmente de preferencia al menos 99% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 60 y las propiedades enzimáticas de una cetolasa. Al mismo tiempo, puede ser una secuencia de cetolasa natural la cual, como se describe anteriormente, puede encontrarse por comparación de identidad de las secuencias a partir de otros organismos, o una secuencia de cetolasa sintética que, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 60, se ha modificado por variaciones sintéticas, por ejemplo por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos . El término "sustitución" se entenderá en la descripción para todas las proteínas como significando el reemplazo de uno o más aminoácidos por uno o más aminoácidos. De preferencia, se llevan a cabo "reemplazos moderados", en donde el aminoácido reemplazado tiene propiedades similares a aquellas del aminoácido original, por ejemplo el reemplazo de Glu por Asp, Gln por Asn, Val por lie, Leu por lie, Ser por Thr. La eliminación es el reemplazo de un aminoácido por una unión directa. Las posiciones preferidas para eliminaciones son el término del polipéptido y las conexiones entre los dominios de proteina individual. Las inserciones son inserciones de aminoácidos dentro de la cadena polipeptidica, una unión directa que se reemplaza formalmente por uno o más aminoácidos. La identidad entre dos proteínas se entiende como significando la identidad de los aminoácidos sobre la longitud de proteínas total en cada caso, en particular la identidad la cual se calcula en comparación con la ayuda del Vector ?G?.? Suite 7.1 Software of Informax (USA) utilizando el método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive múltiple sequence alignments on a microcomputer . Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1) con ajuste de los siguientes parámetros: Parámetro de alineamiento múltiple: Penalidad de abertura Gap 10 Penalidad de extensión Gap 10 Rango de penalidad de separación Gap 8 Penalidad de separación Gap desactivada % de identidad para retraso de alineación 40 Aberturas especificas de residuos desactivadas Abertura de residuo hidrofilico desactivada Peso de transición 0 Parámetro de alineamiento en pares: Algoritmo FAST activado Tamaño de K-tuple 1 Penalidad Gap 3 Tamaño de ventana 5 Número de diagonales adecuadas 5 Una proteina, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos se entiende por consiguiente como significando una proteina la cual, en comparación de su secuencia con la secuencia determinada, en particular tiene una identidad de al menos 70% con el parámetro anterior establecido de acuerdo al logaritmo del programa anterior. Una proteina la cual tiene, por ejemplo, una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 4 ó 48 ó 58 ó 60, se entiende por consiguiente como significando una proteina, la cual en comparación de su secuencia con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 4 ó 48 ó 58 ó 60, en particular de acuerdo al logaritmo del programa anterior tiene una identidad de al menos 70% del conjunto de parámetros anteriores.
Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para ésta, los cuales de acuerdo al uso del codón especifico de organismos se utilizan con frecuencia. El .uso del codón puede determinarse fácilmente con la ayuda del análisis de computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 3 se inserta dentro de la planta. En una modalidad particularmente preferida adicional, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 48 se inserta dentro de la planta. En una modalidad particularmente preferida adicional, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 58 se inserta dentro de la planta. En una modalidad particularmente preferida adicional, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 60 se inserta dentro de la planta. Todos los genes de cetolasa anteriormente mencionados pueden prepararse además en una manera conocida per se por' sintesis química a partir de las unidades estructurales del nucleótido, tales como por ejemplo por condensación de fragmentos del traslape individual de unidades estructurales de ácido nucleico complementarias de doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos puede llevarse a cabo por ejemplo en una manera conocida per se de acuerdo al método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, pp . 896-897). La adición de los oligonucleótidos sintéticos y el llenado de aberturas con la ayuda del fragmento Klenow de la polimerasa de ADN y las reacciones de ligación y los procesos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Como se menciona anteriormente, los organismos no humanos utilizados en el proceso de acuerdo con la invención tienen una actividad de cetolasa modificada y una actividad de ß-ciclasa modificada en comparación con el tipo silvestre de la actividad de ß-ciclasa modificada que se provoca por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 2. En una modalidad del proceso de acuerdo con la invención, los organismos de activación utilizados son organismos no humanos los cuales tienen ya como el organismo de tipo silvestre o de activación una actividad de ß-ciclasa. En esta modalidad, la modificación genética produce un incremento de la actividad de ß-ciclasa en comparación con el organismo de tipo silvestre o de activación, la actividad de ß-ciclasa incrementada se provoca por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 2 o una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 2. Se entiende la actividad de ß-ciclasa como significando una actividad enzimática de una ß-ciclasa. Se entiende una ß-ciclasa como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir un residuo terminal, lineal de licopeno dentro de un anillo ß-ionona . En particular, se entiende una ß-ciclasa como significando una proteina, la cual tiene la actividad enzimática para convertir ?-caroteno dentro de ß-caroteno. Por consiguiente, se entiende la actividad de ß-ciclasa como significando la cantidad de ?-caroteno reactiva o una cantidad de ß-caroteno formada en un cierto tiempo por la ß-ciclasa de proteina. Con una actividad de ß-ciclasa incrementada comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre de la cantidad de licopeno o ?-caroteno reactivo en un cierto tiempo por la ß-ciclasa de proteina o la cantidad de ?-caroteno formada a partir del licopeno o la cantidad de ß-caroteno formada a partir de ?-caroteno se incrementa de este modo. De preferencia, este incremento de la actividad de ß-ciclasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente 500%, en particular al menos 600% de la actividad de ß-ciclasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de ß-ciclasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : La actividad de la ß-ciclasa se determina in vitro de acuerdo con Fraser and Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992)9-15). El fosfato de potasio como un tampón (pH 7.6), licopeno como un sustrato, proteina de estroma a partir de paprika, NADP+, NADPH y ATP se agregan a una cantidad especifica del extracto de organismo. Particularmente de preferencia, la determinación de la actividad de ß-ciclasa se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones de acuerdo a Bouvier, d' Harlingue and Cámara (Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition Arch. Biochem. Biophys . 346(1) (1997) 53-64): El ensayo in-vitro se lleva a cabo en un volumen de 250 µ? de volumen. El baño comprende 50 mM de fosfato de potasio (pH 7.6), difiriendo cantidades de extracto de organismo, 20 nM de licopeno, 250 g de proteina de dextroma cromoplastidico a partir de paprika, 0.2 mM de NADP+, 0.2 mM de NADPH y 1 mM de ATP. Se disolvieron NADP/NADPH y ATP en 10 mi de etanol con 1 mg de Tween 80 inmediatamente antes de la adición del medio de incubación. Después de un tiempo de reacción de 60 minutos a 30°C, la reacción se finalizó por la adición de cloroformo/metanol (2:1). Los productos de reacción extraídos dentro del cloroformo se analizan por medio de HPLC. Un ensayo alternativo que utiliza un sustrato radioactivo se describe en Fraser and Sandmann (Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992)9-15). El incremento en la actividad de ß-ciclasa puede llevarse a cabo en varias formas, por ejemplo desconectando los mecanismos de regulación inhibidores en el nivel de expresión y de proteínas o incrementando la expresión genética comparada al tipo silvestre de ácidos nucleicos, codificando una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 2 o una secuencia derivada a partir de su secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 2. El incremento en la expresión genética de 'los ácidos nucleicos que codifican una ß-ciclasa, comparada al tipo silvestre puede llevarse a cabo asi mismo en varias formas, por ejemplo por inducción del gen ß-ciclasa por activadores o por inserción de una o más copias genéticas de ß-ciclasa, es decir insertando al menos un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos co la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, en el organismo. Incrementar la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa, se entiende de acuerdo con la invención también como significando la manipulación de la expresión de la ß-ciclasa endógena propia del organismo, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. IDENT. NO. 2. Esto puede lograrse, por ejemplo por modificación de la secuencia de ADN promotora para genes de codificación ß-ciclasa. Tal modificación, la cual resulta en una velocidad de expresión incrementada del genr puede llevarse a cabo, por ejemplo por eliminación o inserción de secuencias de ADN. Es posible, como se describe anteriormente, modificar la expresión de la ß-ciclasa endógena por LA aplicación del estimulo exógeno. Esto puede llevarse a cabo por medio de condiciones fisiológicas particulares, es decir por la administración de sustancias extrañas. Además, una expresión modificada o incrementada de un gen ß-ciclasa endógeno puede lograrse por una proteina reguladora que no ocurre en el organismo no transformado que interactúa con el promotor de este gen. Tal regulador puede ser una proteina quimérica la cual consiste de un dominio de unión de ADN y un dominio activador de transcripción, tal como se describe por ejemplo, en WO 96/06166. En una modalidad preferida, el incremento de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa se lleva a cabo por inserción dentro del organismo de al menos un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la SEC. IDENT. NO. 2. En los organismos transgénicos de acuerdo con la invención, al menos un gen ß-ciclasa adicional se presenta de este modo en esta modalidad comparado al tipo silvestre. En esta modalidad, el organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención tiene de preferencia al menos un ácido nucleico exógeno (= heterólogo) que codifica una ß-ciclasa, o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una ß-ciclasa . En otra modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención, los organismos de activación utilizados son organismos no humanos, los cuales como el tipo silvestre no tienen actividad de ß-ciclasa. En esta modalidad menos preferida, la modificación genética provoca la actividad de ß-ciclasa en los organismos. El organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención tiene de este modo en esta modalidad en comparación con el tipo silvestre genéticamente no modificado una actividad ß-ciclasa y es de preferencia de este modo capaz de expresar transgénicamente una ß-ciclasa. En esta modalidad preferida la producción de la expresión genética del ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa análogamente al incremento descrito anteriormente de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa se lleva a cabo de preferencia insertando ácidos nucleicos los cuales codifican la ß-ciclasa dentro del organismo de activación. Para este fin, en ambas modalidades en principio cualquier gen ß-ciclasa, es decir cualquier ácido nucleico, el cual codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2 puede utilizarse. Con las secuencias de ácido nucleico de ß-ciclasa a partir de fuentes eucarióticas , las cuales comprenden intrones para el caso en donde el organismo huésped no está en la posición o no puede colocarse en la posición para expresar la ß-ciclasa correspondiente, de preferencia secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tales como los ADNc correspondientes, se van a utilizar. Una ß-ciclasa particularmente preferida es la ß-ciclasa especifica de cromoplastos a partir del tomate (AAG21 133) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. 1; proteina: SEC. DE IDENT. NO. 2) . Los genes de ß-ciclasa los cuales pueden utilizarse de acuerdo con la invención son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas, que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. : 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, que tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 2 y las propiedades enzimáticas de una ß-ciclasa. Ejemplos adicionales de ß-ciclasa y genes de ß-ciclasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas a partir de bases de datos con la SEC. DE IDENT. NO. : 2. Ejemplos adicionales de ß-ciclasa y genes de ß-ciclasa pueden encontrarse además fácilmente en una manera conocida per se, por ejemplo a partir de las secuencias SEC. DE IDENT. NO. : 1 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, por hibridización y técnicas de PCR. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de ß-ciclasa, los ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la ß-ciclasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 2 se introducen dentro de los organismos . Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. De preferencia, para ésta, se utilizan aquellos codones los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 1 se introduce dentro del organismo. Todos los genes de ß-ciclasa anteriormente mencionados pueden prepararse además en una manera conocida per se, por síntesis química a partir de las unidades estructurales de nucleótido, tal como por ejemplo, por condensación de fragmentos del traslape individual de las unidades estructurales de ácidos nucleicos complementarias de doble hélice. La síntesis química de los oligoneucleótidos puede llevarse a cabo por ejemplo en una manera conocida de acuerdo al método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligoneucleótidos sintéticos y el llenado de aberturas con la ayuda del fragmento Klenow de la ADN-polimerasa y las reacciones de ligación y los procesos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En una modalidad preferida, se cultivan organismos no humanos los cuales, comparados al tipo silvestre además de la actividad de cetolasa modificada y la actividad de ß-ciclasa modificada tienen una actividad de hidroxilasa modificada . Una "actividad de hidroxilasa modificada en comparación con el tipo silvestre" se entiende para el caso en donde el organismo de activación o el tipo silvestre no tiene actividad de hidroxilasa ya que de preferencia significa una "actividad de hidroxilasa producida en comparación con el tipo silvestre". Una "actividad de hidroxilasa . modificada en comparación con el tipo silvestre" se entiende para el caso en donde el organismo de activación o de tipo silvestre tiene una actividad de hidroxilasa ya que significa de preferencia una "actividad de hidroxilasa incrementada en comparación con el tipo silvestre". Por consiguiente, en una modalidad preferida, se cultivan organismos no humanos los cuales, comparados al tipo silvestre, además de la actividad de cetolasa modificada y la actividad de ß-ciclasa modificada tienen o provocan una actividad de hidroxilasa incrementada.
Se entiende la actividad de hidroxilasa como significando la actividad enzimática de una hidroxilasa. Se entiende una hidroxilasa como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para introducir un grupo hidroxilo en el anillo ß-ionona opcionalmente sustituido de los carotenoides . En particular, se entiende una hidroxilasa como significando uña proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir el ß-caroteno a zeaxantina o cantaxantina a astaxantina. Por consiguiente, la actividad de hidroxilasa se entiende como significando la cantidad de ß-caroteno o cantaxantina reactiva en un cierto tiempo por la proteína hidroxilasa o una cantidad de zeaxantina o astaxantina formada . Con una actividad de hidroxilasa incrementada comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre, la cantidad de ß-caroteno o cantaxantina reactiva o la cantidad de zeaxantina o astaxantina formada en un cierto tiempo por la hidroxilasa de proteína se incrementa de este modo. De preferencia, este incremento en la actividad de hidroxilasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de hidroxilasa de tipo silvestre. La determinación de la actividad de hidroxilasa en un organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : La actividad de la hidroxilasa se determina in vitro de acuerdo a Bouvier et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328). Ferredoxina, ferredoxina-NADP oxidoreductasa, catalasa, NADPH y beta-caroteno con mono y digalactosiglicéridos se agregan como una cantidad especifica del extracto del organismo. Particularmente de preferencia, la determinación de la actividad de hidroxilasa se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones de acuerdo a Bouvier, Keller, d' Harlingue and Cámara (Xanthophyll biosynthesis : molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L. ; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328): El ensayo in vitro se lleva a cabo en un volumen de 0.250 mi en volumen. El baño comprende 50 mM de fosfato de potasio (pH 7.6), 0.025 mg de ferredoxina a partir de espinaca, 0.5 unidades de ferredoxina-NADP+ oxidoreductasa a partir de espinaca, 0.2-5 mM de NADPH, 0.010 mg de beta- caroteno (emulsificado en 0.1 mg de Tween 80), 0.05 mM de una mezcla de mono- y digalac-tosilglicéridos (1:1), 1 unidad de catalasa, 0.2 mg de albúmina de suero de bovino y extracto del organismo en volumen diferido. La mezcla de reacción se incuba durante 2 horas a 30 °C. Los productos de reacción se extraen utilizando el solvente orgánico tal como acetona o cloroformo/metanol (2:1) y se determina por medio de HPLC. El incremento en o la producción de la actividad de hidroxilasa puede llevarse a cabo en varias formas, por ejemplo, desconectando los mecanismos de regulación inhibidora en la expresión y el nivel de proteínas o incrementando o produciendo la expresión genética de ácidos nucleicos que codifican una hidroxilasa comparada al tipo silvestre . El incremento en o la producción de la expresión genética de los ácidos nucleicos que codifican una hidroxilasa comparada al tipo silvestre puede asi mismo llevarse a cabo en varias formas, por ejemplo, por inducción del gen hidroxilasa, por activadores o por la inserción de una o más copias del gen hidroxilasa, es decir, por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una hidroxilasa dentro del organismo. El incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una hidroxilasa se entiende de acuerdo con la invención también como significando la manipulación de la expresión de la hidroxilasa endógena propia del organismo. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la modificación de la secuencia del ADN promotora de genes gue codifican hidroxilasas . Tal modificación, la cual resulta en una velocidad de expresión incrementada del gen, puede llevarse a cabo, por ejemplo, por la eliminación o la inserción de secuencias de ADN. Es posible, como se describe anteriormente, modificar la expresión de la hidroxilasa endógena por la aplicación de estimulo exógeno. Esto puede llevarse a cabo por condiciones fisiológicas particulares, es decir, por la administración de sustancias extrañas. Además, una expresión producida o incrementada de un gen de hidroxilasa endógena puede lograrse interactuando una proteina reguladora que no ocurre en el organismo no transformado con el promotor de este gen. Tal regulador puede ser una proteina quimérica la cual consiste de un dominio de unión de ADN y un dominio activador de transcripción, tal como se describe, por ejemplo, en WO 96/06166. En una modalidad preferida, el incremento en, o la producción de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una hidroxilasa puede llevarse a cabo por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una hidroxilasa en el organismo.
Para esto, en principio cualquier gen hidroxilasa, es decir cualquier ácido nucleico el cual codifica una hidroxilasa, puede utilizarse. Con las secuencias de hidroxilasa genómica a partir de fuentes eucarióticas las cuales comprenden intrones, en el caso en donde la planta huésped no está en la posición o no puede colocarse en la posición para expresar la hidroxilasa correspondiente, de preferencia secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tal como los ADNc correspondientes van a utilizarse. Ejemplos de genes hidroxilasa son: un ácido nucleico que codifica una hidroxilasa a partir de Haematococcus pluvialis, Acceso AX038729, O 0061764); (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 77, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 78), y también hidroxilasas con los siguientes números de acceso: I emb|CAB55626.1, CAA70427.1, CAA70888.1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443.1, NP_194300.1, NP_200070.1, AAG10430.1, CAC06712.1, AAM88619.1, CAC95130.1, AAL80006.1, AF162276_1, AA053295.1, AAN85601.1, CRTZ_ER HE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1, CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1, ZP_00094836.1, AAC44852.1, BAC77670.1, NP_745389.1, NP_344225.1, NP_849490.1, ZP_00087019.1 , NP 503072.1, NP 852012.1, NP 115929.1, ZP 00013255.1 Una hidroxilasa particularmente preferida es además la hidroxilasa a partir de tomate (Acceso Y14810) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 5; proteina: SEC. DE IDENT. NO. 6) . En los organismos transgénicos preferidos de acuerdo con la invención, al menos un gen de hidroxilasa adicional se presenta de este modo en esta modalidad preferida comparada al tipo silvestre. En esta modalidad preferida, el organismo genéticamente modificado tiene por ejemplo, al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una hidroxilasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una hidroxilasa. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes hidroxilasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO.: 6 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, de preferencia al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 6, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una hidroxilasa. Ejemplos adicionales de hidroxilasas y genes hidroxilasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácido o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos con la SEC. DE IDENT. NO.: 6. Ejemplos adicionales de hidroxilasas y los genes hidroxilasa pueden además encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 5 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida, para incrementar la actividad de hidroxilasa de los ácidos nucleicos que codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido de la hidroxilasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 6 se introducen dentro de organismos. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo, por traducción posterior de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. De preferencia, para esto, se utilizan aquellos codones los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso del codón específico del organismo. El uso del codón puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados .
En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 5 se introduce dentro del organismo. Todos los genes hidroxilasa anteriormente mencionados pueden prepararse además en una manera conocida per se, por síntesis química a partir de las unidades estructurales del nucleótido, tales como por ejemplo, por condensación de fragmento de traslape individual de unidades estructurales de ácido nucleico complementarias de doble hélice. La síntesis química de los oligonucleótidos puede llevarse a cabo por ejemplo, en una manera conocida, de acuerdo al método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, páginas 896-837). La adición de los oligonucleótidos sintéticos y el llenado de aberturas con la ayuda de fragmente Klenow del ADN polimerasa y las reacciones de ligación y también los procesos de clonación general se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: ? laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Particularmente de preferencia, se emplean organismos no humanos,' genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, tienen una actividad de ß-ciclasa y no tienen actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una actividad de ß-ciclasa incrementada, provocada por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. -2, y tiene una actividad de cetolasa producida. Particularmente de preferencia, se emplean además organismos no humanos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los, cuales como organismos de activación, no tienen actividad de ß-ciclasa y no tienen actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre tienen una actividad de ß-ciclasa producida, producida por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2 y tiene una actividad de cetolasa producida. Particularmente de preferencia, se emplean además los organismos no humanos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, tienen una actividad de ß-ciclasa y una actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una actividad de ß-ciclasa incrementada provocada por una ß-ciclasa, que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2 y tiene una actividad de cetolasa incrementada. Particularmente de preferencia, se emplean organismos no humanos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, tienen una actividad de ß-ciclasa, no tienen actividad de cetolasa y no tienen actividad de hidroxilasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una actividad de ß-ciclasa incrementada, provocada por una ß-ciclasa, que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, y tiene una actividad de cetolasa producida y una actividad de hidroxilasa producida. Particularmente de preferencia, se emplean, organismos no humanos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, tienen una actividad de ß-ciclasa, una actividad de hidroxilasa y no tienen actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una actividad de ß-ciclasa incrementada producida por una ß-ciclasa, que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una-identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, una actividad hidroxilasa incrementada y una actividad cetolasa producida. Particularmente de preferencia, se emplean además organismos no humanos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, no tienen actividad de ß-ciclasa, no tienen actividad de hidroxilasa y no tienen actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una' actividad de ß-ciclasa producida, producida por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO: 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, y tienen una actividad de hidroxilasa producida y una actividad de cetolasa producida. Particularmente de preferencia, se emplean además organismos genéticamente modificados en el proceso de acuerdo con la invención, los cuales como organismos de activación, tienen una actividad de ß-ciclasa, una actividad de hidroxilasa y una actividad de cetolasa, los organismos genéticamente modificados en comparación con el tipo silvestre que tienen una actividad de ß-ciclasa incrementada producida por una ß-ciclasa, que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, una actividad de ß-ciclasa incrementada, una actividad de hidroxilasa incrementada y una actividad de cetolasa incrementada. En una modalidad preferida adicional, se cultivan organismos no humanos genéticamente modificados, los cuales comparados adicionalmente al tipo silvestre tienen una actividad incrementada de al menos una de las actividades seleccionadas a partir del grupo que consiste de actividad de HMG-CoA reductasa, actividad de (E) -4-hidroxi--3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa, actividad de geranil difosfato sintasa, actividad de farnesil difosfato sintasa, actividad de geranilgeranil difosfato sintasa, actividad de fitoeno sintasa, actividad de fitoeno desaturasa, actividad de zeta-caroteno desaturasa, actividad de crtISO, actividad de FtsZ y actividad de MinD. La actividad de la HMG-CoA reductasa se entiende como significando la actividad enzimática de una HMG-CoA reductasa ( 3-hidroxi-3-metilglutaril~coenzima A reductasa). Una reductasa HMG-CoA se entiende como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A a mevalonato. Por consiguiente, la actividad de HMG-CoA reductasa se entiende como significando la cantidad de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reactiva o una cantidad de mevalonato formada en un cierto tiempo por la proteina HMG-CoA reductasa. Con una actividad de HMG-CoA reductasa incrementada comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre de la cantidad de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reactiva o la cantidad de mevalonato formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina HMG-CoA reductasa. De preferencia, este incremento en la actividad de HMG-CoA reductasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de HMG-CoA reductasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de HMG-CoA reductasa en un organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención y en tipo silvestre u organismos de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : El material de organismos congelados se homogeniza por pulverización intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM.de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHC03. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La actividad de la reductasa de HMG-CoA puede medirse de acuerdo a descripciones publicadas (por ejemplo, Schaller, Grausem, Benveniste, Chye, Tan, Song and Chua, Plant Physiol. 109 (1995), 761-770; Chappell, Wolf, Proulx, Cuellar y Saunders, Plant Physiol. 109 (1995) 1337-1343). El tejido del organismo puede homogenizarse y extraerse en tampón frió (100 mM de fosfato de potasio (pH 7.0), 4 mM de MgCl2, 5 mM de DTT) . El homogenizato se centrifuga durante 15 minutos a 10.000 g a 4C. El sobrenadante se centrifuga entonces de nuevo a 100.000 g durante 45-60 minutos. La actividad de la HMG-CoA reductasa, se determina en el sobrenadante y en el gránulo de la fracción microsomal (después de resuspender en 100 mM de fosfato de potasio (pH 7.0) y 50 mM de DTT). Las alícuotas de la solución y de la suspensión (el contenido de proteínas de la suspensión corresponde a aproximadamente 1-10 ug) se incuban en 100 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7.0 con 3 mM de NADPH y 20 µ? (14C)HMG-CoA (58 µ??/µ?) idealmente en un volumen de 26 µ? durante 15-60 minutos a 30C. La reacción se termina por la adición de 5 µ? de mevalonolactona (1 mg/ml) y 6 N de HC1. Después de la adición, la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. El (1C) -mevalonato formado en la reacción se cuantifica agregando 125 µ? de una solución de fosfato de potasio saturado (pH 6.0) y 300 µ? de acetato de etilo. La mezcla se combina bien y se centrifuga. La radioactividad puede determinarse por medio de medición de centelleo . La actividad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, también designada como lytB o IspH, se entiende como significando la actividad enzimática de una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. Una (E) -4-hidroxi-3-metilbu-2-enil difosfato reductasa se entiende como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato a isopentenil difosfato y dimetilalil difosfato. Por consiguiente, (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, se entiende como significando la cantidad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reactivo o una cantidad de isopentenil difosfato y/o dimetilalil difosfato formada en un cierto tiempo por la proteina (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. Con una actividad de (E ) -4-hidroxi~3-metilbut-2-enil difosfato reductasa comparada al tipo silvestre, la cantidad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reactivo o la cantidad de isopentenil difosfato y/o dimetilalil difosfato formada en comparación con el tipo silvestre en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. De preferencia, este incremento en la actividad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut^2-enil difosfato reductasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa en organismos no humanos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal es posible. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) de Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHC03. Inmediatamente antes de la extracción se agregan 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La determinación de la actividad de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa puede efectuarse por medio de detección inmunológica . La preparación de anticuerpos especificos se ha descrito por Rohdich and colleagues (Rohdich, Hecht, Gártner, Adam, Krieger, Amslinger, Arigoni, Bacher and Eisenreich: Studies on the nonmevalonate texpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein, Nati. Acad. Nati. Sci. USA 99 (2002), 1158-1163) . Para la determinación de la actividad catalítica, Altincicek and colleagues (Altincicek, Duin, Reichenberg, Hedderich, Kollas, Hintz, Wagner, Wiesner, Beck and Jomaa; LytB protein catalyzes the Terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis ; FEBS Letters 532 . (2002), 437-440) describe un sistema in vitro el cual monitorea la reducción de (E) -4-hidroxi-3-metil-but-2-enil difosfato, isopentenil difosfato y dimetilalil difosfato. Se entiende la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa como significando, la actividad enzimática de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasá. Se entiende una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir hidroxietil-ThPP y gliceraldehido-3-fosfato a l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato . Por consiguiente, se entiende la actividad de 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa como significando la cantidad de hidroxietil-ThPP y/o gliceraldehido-3-fosfato reactivo o una cantidad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato formada en un cierto tiempo por la proteína 1-desoxi-D- xilosa-5-fosfato sintasa. Con una actividad l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa incrementada comparada al tipo silvestre, la cantidad de hidroxietil-ThPP y/o gliceraldehido-3-fosfato reactivo o la cantidad de desoxi-D-xilosa-5-fosfato formada de este modo incrementada en un cierto tiempo por la proteina 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa en comparación con el tipo silvestre . De preferencia, este incremento en la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato' sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismo congelado se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal es posible. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES- OH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) de Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHCO3. Inmediatamente antes de la extracción, se agregan 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La solución de reacción (50-200 ul) para la determinación de la actividad de D-l-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) consiste de 100 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 3 mM de MgCl2, 3 mM de MnCl2, 3 mM de ATP, 1 mM de tiamina difosfato, 0.1% de Tween-60, 1 mM de fluoruro de potasio, 30 ?? (2-1C) -piruvato (0.5 uCi) , 0.6 mM de DL-gliceraldehido-3-fosfato. El extracto del organismo se incuba a 37C durante 1 a 2 horas en la solución de reacción. La reacción se detiene entonces por calentamiento a 80C durante 3 minutos. Después de la centrifugación a 13,000 revoluciones/minuto durante 5 minutos, el sobrenadante se evapora, el residuo se vuelve a suspender en 50 ?? de metanol, se aplica a una placa de TLC para cromatografía de capa delgada (Sílice-Gel 60, Merck, Darmstadt) y se separa en alcohol N-propílico/acetato de etilo/agua (6:1:3; v/v/v) . En el curso de esto, se separa D-l-desoxixilulosa-5-fosfato (o D-l-desoxixilulosa) de (2-14C)-piruvato radioetiquetado . La cuantificación se lleva a cabo por medio de un contador de centelleo. El método se describió en Harker and Bramley (FEBS Letters 448 (1999) 115-119) . Alternativamente, un ensayo fluorométrico para la determinación de la actividad de la DXS sintasa de Querol y colleagues se ha descrito (Analytical Biochemistry 296 (2001) 101-105) . Se entiende la actividad de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa como significando la actividad enzimática de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, también llamada l-desoxi-d-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa. Se entiende una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato a 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato . Por consiguiente, se entiende la 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa como significando la cantidad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reactiva o una cantidad de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato formada en un cierto tiempo por la proteina l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa. Con una actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa incrementada comparada al tipo silvestre, la cantidad de l-desoxi-Q-xilosa-5-fosfato reactiva o la cantidad de 2-C-metil-D-eritritol 4 fosfato formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa en comparación con el tipo silvestre. De preferencia, este incremento en la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600%, de la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de la 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal es posible. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) de Tritón- X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHC03. Inmediatamente antes de la extracción, se agregan 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La actividad de la D-l-desoxixilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) se mide en un tampón que consiste de 100 mM de Tris-ilCl (pH 7.5), 1 mM de MnCl2, 0.3 mM de NADPH y 0.3 mM de l-desoxi-D-xilulosa-4-fosfato, el cual por ejemplo puede sintetizarse enzimáticamente (Kuzuyama, Takahashi, Watanabe y Seto: Tetrahedon letters 39 (1998) 4509-4512). La reacción se inicia por la adición del extracto del organismo. El volumen de reacción puede llega a ser normalmente de 0.2 a 0.5 mi; la incubación se lleva a cabo a 37C durante 30-60 minutos. Durante este tiempo, la oxidación del NADPH se monitorea fotométricamente a 340 nm. Se entiende la actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa como significando la actividad enzimática de isopentenil difosfato ?-isomerasa. Se entiende un isopentenil difosfato ?-isomerasa como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir el isopentenil difosfato a dimetilalil fosfato. Por consiguiente, la actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa se entiende como significando la cantidad de isopentenil difosfato reactivo o una cantidad de dimetilalil fosfato formada en un cierto tiempo por la proteina isopentenil difosfato D-A-isomerasa . Con una actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa incrementada comparada al tipo silvestre en comparación con el tipo silvestre la cantidad de isopentenil difosfato reactiva o la cantidad del dimetilalil fosfato formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina isopentenil difosfato ?-isomerasa. De preferencia, este incremento en la actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia 20%, de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600%, de la actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de isopentenil difosfato ?-isomerasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva- a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal es posible. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) de Tritón X-100,- 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHCO3. Inmediatamente antes de la extracción se agregan 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. Las determinaciones de la actividad de isopentenil difosfato isomerasa (IPP isomerasa) puede llevarse a cabo de acuerdo al método presentado por Fraser and colleagues (Fraser, Rómer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, Schuch and Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002), 1092-1097, basado en Fraser, Pinto, Holloway and Bramley, Plant Journal 24 (2000), 551-558). Para mediciones enzimáticas, las incubaciones con 0.5 uCi de (1-14C(IPP (isopentenil pirofosfato) (56 mCi/mmol, Amersham pie) como un sustrato se lleva a cabo en 0.4 M de Tris-HCl (pH 8.0) con 1 mM de DTT, 4 mM de MgCl2, 6 mM de MnCl2, 3 mM de ATP, 0.1% de Tween 60, 1 mM de fluoruro de potasio en un volumen de aproximadamente 150-500 ??. Los extractos se mezclan con tampón (por ejemplo en la relación de 1:1) y se incuban durante al menos 5 horas a 28 °C. Aproximadamente 200 ?? de metanol se agregan entonces y por la adición de ácido clorhídrico concentrado (25% de concentración final) e hidrólisis ácida se lleva a cabo durante aproximadamente 1 hora a 37C. Subsecuentemente, una doble extracción se lleva a cabo (en cada caso 500 µ?) con éter de petróleo (mezclado con 10% de éter dietilico) . La radioactividad en una alícuota de la hiperfase se determina por medio de un contador de centelleo. La actividad enzimática específica puede determinarse en una incubación corta de 5 minutos, ya que los tiempos de reacción cortos suprimen la formación de subproductos de reacción (véase Lützow y Beyer: The isopentenyl phosphate ?-isomerase and its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts; Biochim. Biophys. Acta 959 (1988), 118-126). La actividad de geranil difosfato sintasa se entiende como significando la actividad enzimática de una geranil difosfato sintasa. Una geranil difosfato sintasa se entiende como significando, una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir el isopentenil difosfato y el dimetilalil fosfato a geranil difosfato. Por consiguiente, la actividad de geranil difosfato sintasa se entiende como significando la cantidad de isopentenil difosfato y/o dimetilalil fosfato reactivo o una cantidad de geranil difosfato formada en un cierto tiempo por la proteína de geranil difosfato sintasa. Con una actividad de geranil difosfato sintasa incrementada comparada al tipo silvestre , en comparación con el tipo silvestre, la cantidad de isopentenil difosfato y/o dimetilalil fosfato reactiva o la cantidad de geranil difosfato formada de este modo se incrementa en un cierto tiempo por la proteina de geranil difosfato sintasa. De preferencia, este incremento en la actividad de geranil difosfato sintasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de geranil difosfato sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de geranil difosfato sintasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHCO3. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La actividad de geranil difosfato sintasa (GPP sintasa) puede determinarse en 50 mM de Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM de MgCl2, 5 mM de MnCl2, 2 mM de DTT, 1 mM de ATP, 0.2% de Tween-20, 5 µ? de (1 c) IPP y 50 µ? de DMAPP (dimetilalil pirofosfato) después de la adición del extracto del organismo (de acuerdo a Bouvier, Suire, d'Harlingue, Backhaus and Cámara: Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant Journal 24 (2000) 241-252) . Después de la incubación de por ejemplo, 2 horas a 37 °C, los productos de reacción se desfosfirilan (de acuerdo a Koyama, Fuji and Ogura: Enzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphates, Methods Enzymol. 110 (1985) , 153-155) y se analizan por medio de cromatografía de capa delgada y la medición de la radioactividad incorporada (Dogbo, Bardat, Quennemet and Cámara: Metabolism of plastid terpenoids: In vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethyl pyrophosphate derivates, FEBS Letters 219 (1987) 211-215) . Se entiende la actividad de farnesil difosfato sintasa como significando la actividad enzimática de una farnesil difosfato sintasa. Se entiende una farnesil difosfato sintasa como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática secuencialmente para convertir 2 moléculas de isopentenil difosfato con dimetilalil difosfato y el geranil difosfato resultante a farnesil difosfato. Por consiguiente, la actividad de farnesil difosfato sintasa se entiende como significando la cantidad de dimetilalil difosfato y/o isopentenil difosfato reactiva o una cantidad de farnesil difosfato formada en un cierto tiempo por la proteina de farnesil difosfato sintasa. Con una actividad de farnesil difosfato sintasa comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre la cantidad de dimetilalil difosfato y/o isopentenil difosfato reactiva o la cantidad de farnesil difosfato formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina farnesil difosfato sintasa. De preferencia, este incremento en la actividad de farnesil difosfato sintasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de farnesil difosfato sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de farnesil difosfato sintasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido s-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHC03. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La actividad de la farnesil pirofosfato sintasa (FPP sintasa) puede determinarse de acuerdo a un procedimiento de Joly y Edwards (Journal of Biological Chemistry 268 (1993), 26983-26989). Más adelante, la actividad enzimática se mide en un tampón que consiste de 10 mM de HEPES (pH 7.2), 1 mM de MgCl2, 1 mM de ditiotreitol, 20 ?? de geranil pirofosfato y 40 µ? (1-14C) de isopentenil pirofosfato (4 Ci/mmol) . La mezcla de reacción se incuba a 37 °C; la reacción se detiene por la adición de 2.5 N de HC1 (en 70% de etanol con 10 µg/p?l de farnesol) . Los productos de reacción se hidrolizan de este modo dentro de 30 minutos por hidrólisis ácida a 37C. La mezcla se neutraliza por la adición de 10% de NaOH y se extrae agitando con hexano. Una alícuota de la fase de hexano puede medirse por medio de un contador de centelleo para la determinación de la radioactividad incorporada. Alternativamente, después de la incubación del extracto del organismo y el IPP radioetiquetado, los productos de reacción se separan por cromatografía de capa delgada (gel de sílice SE60, Merck) en benceno/metanol (9:1). Los productos radioetiquetados se eluyen y la radioactividad se determina (de acuerdo a Gaffe, Bru, Causse, Vidal, Stamitti-Bert , Carde and Gallusci: LEFPS1, un gen de farnesil pirofosfato de tomate altamente expresado durante el desarrollo de la primera fruta; · Plant Physiology 123 (2000) 1351-1362) . Se entiende la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa como significando la actividad enzimática de una geranilgeranil difosfato sintasa. Se entiende una geranilgeranil difosfato sintasa como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir el farnesil difosfato y el isopentenil difosfato a geranilgeranil difosfato.
Por consiguiente, una- actividad de geranilgeranil difosfato sintasa se entiende como significando la cantidad de farnesil difosfato y/o isopentenil difosfato reactiva o una cantidad de geranilgeranil difosfato formada en un cierto tiempo por la proteina de geranilgeranil difosfato sintasa. Con una actividad de geranilgeranil difosfato sintasa incrementada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre la cantidad de farnesil difosfato y/o isopentenil difosfato reactiva o la cantidad de geranilgeranil difosfato formada se incrementa de este modo en un cierto tiempo por la proteina de geranilgeranil difosfato sintasa. De preferencia, este incremento en la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido s-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHCO3. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. Las mediciones de actividad de geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPP sintasa) puede determinarse de acuerdo al método descrito por Dogbo y Cámara (en Biochim. Biophys. Acta 920 (1987), 140-148: Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinity chromatography) . Con este fin, un tampón (50 mM de Tris-HCl (pH 7.6), 2 mM de MgCl2, 1 mM de MnCl2, 2 mM de Ditiotreitol, (1-1 C)IPP (0.1 de uCi, 10 8M) , 15 ocM de DMAPP, GPP o FPP) se agrega con un volumen total de aproximadamente 200 ?? del extracto del organismo. La incubación puede llevarse a cabo durante 1-2 horas (o más) a 30C. La reacción es por la adición de 0.5 mi de etanol y 0.1 mi de 6N de HC1. Después de la incubación a 37 °C durante 10 minutos, la mezcla de reacción se neutraliza con 6N de NaOH, se mezcla con 1 mi de agua y se extrae agitando con 4 mi de éter dietilico. En una alícuota (por ejemplo, 0.2 mi) de la fase etérea, la cantidad de radioactividad se determina por medio de conteo por centelleo. Alternativamente, después de la hidrólisis ácida los alcoholes de prenilo radioetiquetados pueden extraerse en éter agitando y utilizando separado HPLC (25 cm de columna de Spherisorb ODS-1, 5 um; elución con metanol/agua (90:10; v/v) a una velocidad de flujo de 1 ml/minutos) y se c antificó por medio de un monitor de radioactividad (de acuerdo a iedemann, Misawa and Sandmann: Purification and enzymatic characterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Erwinia uredovora alter expression in Escherichia coli; Archives Biochemistry and Biophysics 306 (1993), 152-157). Se entiende la actividad de la fitoeno sintasa como significando la actividad enzimática de una fitoeno sintasa. En particular, se entiende una fitoeno sintasa como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir geranilgeranil difosfato a fitoeno. Por consiguiente, se entiende la actividad de la fitoeno sintasa como significando la cantidad de geranilgeranil difosfato reactiva o una cantidad de fitoeno formada en un cierto tiempo por la proteína de fitoeno sintasa.
Con una actividad de fitoeno sintasa incrementada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre la cantidad de geranilgeranil difosfato reactiva o la cantidad de fitoeno formada en un cierto tiempo se incrementa por la proteina fitoeno sintasa. De preferencia, este incremento en la actividad de fitoeno sintasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de la fitoeno sintasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de fitoeno sintasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de EEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHCO3. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. Las mediciones de actividad de la fitoeno sintasa (PSY) pueden llevarse a cabo de acuerdo al método presentado por Fraser and colleagues (Fraser, Rcmer, Shipton, Mills, Kiano, Misawa, Drake, Schuch and Bramley: Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner; Proc. Nati. Acad. Sci. ÜSA 99 (2002), 1092-1097, basada en Fraser, Pinto, Holloway and Bramley, Plant Journal 24 (2000) 551-558). Para mediciones enzi áticas, las incubaciones con ( H) geranilgeranil pirofosfato de (15 mCi/mM, American Radiolabeled Chemicals, St . Louis) como un sustrato se llevan a cabo en 0.4 M de Tris-HCl (pH 8.0) con 1 mM de DTT, 4 mM de MgCl2, 6 mM de MnCl2, 3 mM de ATP, 0.1% de Tween 60, 1 mM de fluoruro de potasio. Los extractos del organismo se mezclan con un tampón, por ejemplo, 295 ?? del tampón con un extracto en un volumen total de 500 ??. La mezcla se incuba durante al menos 5 horas a 28C. Subsecuentemente, el fitoeno se extrae dos veces agitando (en cada caso 500 ocl) con cloroformo. El fitoeno radioetiquetado formado durante la reacción se separa por medio de una cromatografia de capa delgada en placas de sílice en raetanol/agua (95:5; v/v) . El fitoeno puede identificarse en placas de sílice en una atmósfera enriquecida con yodo (calentando pocos cristales de yodo) . Se utiliza un estándar de fitoeno como una referencia. La cantidad del producto radioetiquetado se determina por medio de mediciones en el contador de centelleo. Alternativamente, el fitoeno puede cuantificarse también por medio de HPLC el cual se proporciona con un detector de radioactividad (Fraser, Albrecht and Sandmañn: Development of high performance liquid chromatographic systems for the separation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specific enzymatic reactions; J. Chromatogr. 645 (1993) 265-272) . Se entiende la actividad de la fitoeno desaturasa como significando la actividad enzimática de una fitoeno desaturasa. Se entiende la fitoeno desaturasa como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir fitoeno a fitoflueno y/o fitoflueno a ?-caroteno ( zetacaroteno) . Por consiguiente, se entiende la actividad de la fitoeno desaturasa como significando la cantidad de fitoeno o fitoflueno reactiva o una cantidad de fitoflueno o ?-caroteno formada en un cierto tiempo por la proteína fitoeno desaturasa . Con una actividad de fitoeno desaturasa incrementada comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre, la cantidad de fitoeno o fitoflueno reactiva o la cantidad de fitoflueno o ?-caroteno formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina fitoeno desaturasa. De preferencia, este incremento en la actividad de la fitoeno desaturasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de fitoeno desaturasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de fitoeno desaturasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones : El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 m de MgCl2, 10 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de KHC03. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. La actividad de la fitoeno desaturasa (PDS) puede medirse por la inserción de (14C) -fitoeno radioetiquetado en carotenos insaturados (de acuerdo a Rómer, Fraser, Kiano, Shipton, Misawa, Schuch and Bramley: Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants; Nature Biotechnology 18 (2000) 666-669). Radiolabeled phytoene can be synthesized according to Fraser (Fraser, De la Rivas, Mackenzie, Bramley: Phycomyces blakesleanus CarB mutants: their use in assays of phytoene desaturase; Phytochemistry 30 (1991), 3971-3976). Las membranas de plástidos del tejido objetivo pueden incubarse con 100 mM de tampón de MES (pH 6.0) con 10 mM de MgCl2 y 1 mM de ditiotreitol en un volumen total de 1 mi. (1C) -fitoeno disuelto en acetona (aproximadamente 100 000 desintegraciones/minuto para en cada caso una incubación) se agrega, en donde la concentración de acetona 5% (v/v) no debe excederse. Esta mezcla se incuba agitando a 28C durante aproximadamente 6 a 7 horas en la oscuridad. Después, los pigmentos se extraen tres veces con aproximadamente 5 mi de éter de petróleo (mezclado con 10% de éter dietilico) y se separa y cuantifica por medio de HPLC.
Alternativamente, la actividad de la fitoeno desaturasa puede medirse de acuerdo a Fraser' et al. (Fraser, Misawa, Linden, Yamano, obayashi y Sandmann: Expression in Escherichia coli , purification, and reactivation of the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase, Journal of Biological Chemistry 267 (1992), 19891-9895). Se entiende la actividad de la zeta-caroteno desaturasa como significando la actividad enzimática de una zeta-caroteno desaturasa. Se entiende una zeta-caroteno desaturasa como significando una proteína la cual tiene la actividad enzimática para convertir ?-caroteno a neurosporina y/o neurosporina a licopeno. Por consiguiente, la actividad de zeta-caroteno desaturasa se entiende como significando la cantidad de ?-caroteno o neurosporina reactiva o una cantidad de neurosporina o licopeno formada en un cierto tiempo por la proteina zeta-caroteno desaturasa. Con una actividad de zeta-caroteno desaturasa incrementada comparada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silveste la cantidad de ?-caroteno o neurosporina reactiva o la cantidad de neurosporina o licopeno formada en un cierto tiempo se incrementa por la proteina zeta-caroteno desaturasa. De preferencia, este incremento en la actividad de la zeta-caroteno desaturasa llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600% de la actividad de zeta-caroteno desaturasa del tipo silvestre. La determinación de la actividad de la zeta-caroteno desaturasa en organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención y en organismos de tipo silvestre o de referencia se lleva a cabo de preferencia bajo las siguientes condiciones: El material de organismos congelados se homogeniza por molienda intensiva en nitrógeno liquido en un mortero y una mano de mortero y se extrae con un tampón de extracción en una relación de 1:1 a 1:20. La relación particular depende de las actividades enzimáticas en el material del organismo disponible, de manera que es posible una determinación y cuantificación de las actividades enzimáticas dentro del rango de medición lineal. Normalmente, el tampón de extracción puede consistir de 50 mM de HEPES-KOH (pH 7.4), 10 mM de MgCl2, 10 mM de KC1, ? mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0.1% (v/v) Tritón X-100, 2 mM de ácido e-aminocaproico, 10% de glicerol, 5 mM de HC03. Inmediatamente antes de la extracción se agregan, 2 mM de DTT y 0.5 mM de PMSF. El análisis para la determinación de la ?-caroteno (ZDS desaturasa) puede llevarse a cabo en 0.2 M de fosfato de potasio (pH 7.8r volumen de tampón de aproximadamente 1 mi). El método del análisis para este se publicó por Breitenbach and colleagues (Breitenbach, Kuntz, Takaichi and Sandmann: Catalytic properties of an expressed and purified higher plant type ?-carotene desaturase from Capsicum annuum; European Journal of Biochemistry, 265 (1) : 376-383, 1999). Cada lote de análisis comprende 3 mg de fosfitidilcolina, la cual se suspende en 0.4 M de tampón de fosfato de potasio (pH 7.8), 5 ug de ?-caroteno de neurosporina, 0.02% de butilhidroxitolueno, 10 ?? de decil-platoquinona (1 mM de solución madre metanólica) y extracto del organismo. El volumen del extracto del organismo debe ajustarse a la cantidad de la actividad de la ZDS desaturasa presente con el fin de hacer posible la cuantificación en un rango de medición lineal. Las incubaciones se llevan a cabo normalmente durante aproximadamente 17 horas con agitación vigorosa (200 revoluciones/minuto) a aproximadamente 28 °C en la oscuridad. Los carotenoides se extraen con agitación por la adición de 4 mi de acetona a 50 °C durante 10 minutos. ? partir de esta mezcla, los carotenoides se transfieren a una fase de éter de petróleo (con 10% de éter dietílico) . La fase de éter dietilico/éter de petróleo se evapora bajo nitrógeno, y los carotenoides se disuelven de nuevo en 20 ?? y se separan y cuantifican por medio de HPLC.
Se entiende la actividad de crtISO como significando la actividad enzimática de una proteina crtISO. Se entiende una proteina crtISO como significando una proteina la cual tiene la actividad enzimática para convertir 7, 9, 1' , 9' -tetra-cis-licopeno a all-trans-licopeno . Por consiguiente, se entiende la actividad de crtISO como significando la cantidad de 7 , 9r 7 ' , ' -tetra-cis-licopeno reactiva o una cantidad de all-trans-licopeno formada en un cierto tiempo por la proteina crtISO. Con una actividad de crtISO incrementada al tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre, la cantidad de 7 , 9-7 9' -tetra-cis-licopeno o la cantidad de all-trans-licopeno formada en un cierto tiempo se incrementa de este modo por la proteina crtISO. De preferencia, este incremento en la actividad de crtISO llega a ser al menos 5%, además de preferencia al menos 20%, además de preferencia al menos 50%, además de preferencia al menos 100%, más preferiblemente al menos 300%, aún más preferiblemente al menos 500%, en particular al menos 600%, de la actividad de crtISO del tipo silvestre. Se entiende la actividad de FtsZ como significando la actividad fisiológica de una proteina FtsZ. Se entiende una proteina FtsZ como significando una proteina la cual tiene una división celular y una acción de promoción de división de plástido y tiene homologías de proteína tubulina. La actividad de MinD se entiende como significando la actividad fisiológica de una proteína MinD. Se entiende una proteína MinD como significando una proteína la cual tiene un papel multifuncional en la división celular. Ésta se asocia con una membrana ATPasa y dentro de la célula puede mostrar un movimiento de oscilación de polo a polo . Además, el incremento en la actividad de las enzimas de la trayectoria sin mevalonato puede conducirse a un incremento adicional en el producto final de cetocarotenoides deseado. Ejemplos de estos son la 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintasa, la 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintasa y la 2-C-metil-D-eritritol-2 , 4-ciclodifosfato sintasa. Por modificaciones de la expresión genética de los genes correspondientes, la actividad de las enzimas mencionadas puede incrementarse. Las concentraciones modificadas de las proteínas relevantes pueden detectarse en una manera estándar por medio de anticuerpos y técnicas de tinción apropiadas. El incremento en la actividad de la HMG-CoA reductasa y/o (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o la actividad de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o la actividad del isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o la actividad de la geranil difosfato sintasa y/o la actividad de la farnesil difosfato sintasa y/o la actividad de la geranilgeranil difosfato sintasa y/o la actividad de la fitoeno sintasa y/o la actividad de la fitoeno desaturasa y/o la actividad de la zeta-caroteno desaturasa y/o la actividad de crtISO y/o la actividad de FtsZ y/o la actividad de MinD puede llevarse a cabo en varias formas, por ejemplo, desconectando' los mecanismos de regulación inhibidora en el nivel de expresión y de proteínas o incrementando la expresión genética de los ácidos nucleicos que codifican una HMG-CoA reductasa y/o los ácidos nucleicos que codifican un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfa o reductasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o los ácidos nucleicos que codifican un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una geranil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una farnesil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una geranilgeranil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno desaturasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una zeta-caroteno desaturasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteína crtISO y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteíña FtzS y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina MinD comparada al tipo silvestre . El incremento en la expresión genética de los ácidos nucleicos que codifican una HMG-CoA reductasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o los ácidos nucleicos que codifican un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una geranil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una farnesil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una geranilgeranil difosfato sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno sintasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno desaturasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una zeta-caroteno desaturasa y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina crtISO y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina FtsZ y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina MinD comparada al tipo silvestre pueden asi mismo llevarse a cabo en diferentes formas, por ejemplo por la inducción del gen HMG-CoA reductasa y/o el gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o el gen l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o el gen 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o el gen isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o el gen geranil difosfato sintasa y/o el gen farnesil difosfato sintasa y/o el gen de geranilgeranil difosfato sintasa y/o el gen de fitoeno sintasa y/o el gen de fitoeno desaturasa y/o el gen de zeta-caroteno desaturasa y/o el gen crtISO y/o el gen FtsZ y/o el gen MinD por activadores o por la inserción de una o más copias del gen HMG-CoA reductasa y/o el gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o el gen 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o el gen l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o el gen isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o el gen de geranil difosfato sintasa y/o el gen farnesil difosfato sintasa y/o el gen de geranilgeranil difosfato sintasa y/o el gen de fitoeno sintasa y/o el gen de fitoeno desaturasa y/o el gen de zeta-caroteno desaturasa y/o el gen crtISO y/o el gen FtsZ y/o el gen MinD, es decir por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una HMG-CoA reductasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una geranil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una geranilgeranil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una fitoeno sintasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una fitoeno desaturasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una zeta-caroteno desaturasa y/o al menos un ácido nucleico que codifica una proteina crtISO y/o al menos un ácido nucleico que codifica una proteina FtsZ y/o al menos un ácido nucleico que codifica una proteina MinD en la planta. El incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una HMG-CoA reductasa y/o (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o la 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o el isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o la geranil difosfato sintasa y/o la farnesil difosfato sintasa y/o al geranilgeranil difosfato sintasa y/o la fitoeno sintasa y/o la fitoeno desaturasa y/o la zeta-caroteno desaturasa y/o la proteína crtISO y/o la proteína FtsZ y/o la proteína MinD se entiende de acuerdo con la invención como significando también la manipulación de la expresión de la HMG-CoA reductasa endógena propia del organismo y/o el (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato · reductoisomerasa y/o el isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o la geranil difosfato sintasa y/o la farnesil difosfato sintasa y/o la geranilgeranil difosfato sintasa y/o la fitoeno sintasa y/o la fitoeno desaturasa y/o la zeta-caroteno desaturasa y/o de la proteína crtISO propia del organismo y/o la proteína FtsZ y/o la proteína MinD. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la modificación de la secuencia de ADN promotora correspondiente. Tal modificación, la cual resulta en una velocidad de expresión incrementada del gen, puede llevarse a cabo por ejemplo, por eliminación o inserción de secuencias de ADN. En una modalidad preferida, el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una HMG-CoA reductasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una geranil difosfato sintasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una geranilgeranil difosfato sintasa y/o el incremento en la expresión genética de una fitoeno sintasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una fitoeno desaturasa y/o el- incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una zeta-caroteno desaturasa y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una proteina crtISO y/o el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una proteina FtsZ y/o. el incremento en la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una proteina MinD por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una HMG-CoA reductasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una geranil difosfato sintasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una geranilgeranil difosfato sintasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una fitoeno sintasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una fitoeno desaturasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una zeta-caroteno desaturasa y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una proteina crtISO y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una proteina FtsZ y/o por la inserción de al menos un ácido nucleico que codifica una proteina MinD en la planta. Con este fin, en principio puede utilizarse cualquier gen HMG-CoA reductasa o el gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa o el gen 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductasa o el gen l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa o el gen isopentenil difosfato ?-isomerasa o el gen geranil difosfato sintasa y/o la farnesil difosfato sintasa o el gen geranilgeranil " difosfato sintasa o el gen fitoeno sintasa o el gen fitoeno desaturasa o el gen zeta-caroteno desaturasa o el gen de crtISO o el gen de FtsZ o el gen de MinD. Con las secuencias de HMG-CoA reductasa genómicas o las secuencias de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa o las secuencias de 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa o las secuencias de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa o las secuencias de isopentenil difosfato ?-isomerasa o las secuencias de geranil difosfato sintasa o las secuencias de farnesil difosfato sintasa o las secuencias de geranilgeranil difosfato sintasa o las secuencias de fitoeno sintasa o las secuencias de fitoeno desaturasa o las secuencias de zeta-caroteno desaturasa o las secuencias de crtISO o las secuencias de FtsZ o las secuencias de MinD a partir de fuentes eucarióticas las cuales comprenden intrones, en el caso en donde la planta huésped no está en la posición o no puede colocarse en la posición para expresar las proteínas correspondientes, de preferencia secuencias de ácido nucleico ya procesadas, tales como los ADNc correspondientes, van a utilizarse. En los organismos transgénicos preferidos de acuerdo con la invención, en esta modalidad preferida comparada al tipo silvestre, se presenta al menos un gen HMG-CoA reductasa adicional y/o un gen (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o un gen l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o un gen l-descxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o un gen isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o el gen de la geranil difosfato sintasa y/o el gen de la farnesil difosfato sintasa y/o el gen de la geranilgeranil difosfato sintasa y/o el gen de la fitoeno sintasa y/o el gen de la fitoeno desaturasa y/o el gen de la zeta-caroteno desaturasa y/o el gen de crtISO y/o el gen de FtsZ y/o el gen de MinD.
En esta modalidad preferida, la planta genéticamente modificada, por ejemplo, tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una HMG-CoA reductasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una HMG-CoA reductasa y/o el menos un ácido nucleico exógeno que codifica un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un isopentenil difosfato ?-isomerasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican un isopentenil difosfato ?-isomerasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una geranil difosfato sintasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una geranil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una farnesil difosfato sintasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una farnesil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una geranilgeranil difosfato sintasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una geranilgeranil difosfato sintasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una fitoeno sintasa o al menos dos ácidos .nucleicos endógenos que codifican una fitoeno sintasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una fitoeno desaturasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una fitoeno desaturasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una zeta-caroteno desaturasa o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una zeta-caroteno desaturasa y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una proteina crtISO o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una proteina crtISO y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una proteina FtsZ o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una proteina FtsZ y/o al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una proteina MinD o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una proteina MinD. Ejemplos de genes HMG-CoA reductasa son: un ácido nucleico que codifica una HMG-CoA reductasa a partir de Arabidopsis thaliana, No. de Acceso NM_106299; (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 7, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 8) , y los genes HMG-CoA reductasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: P54961, P54870, P54868, P54869, 002734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135, 064966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136, 064967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4, 076819, 028538, Q9Y7D2, P54960, 051628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, 024594, P09610, Q58116, 026662, Q01237, Q01559, Q12649, 074164, 059469, P51639, Q10283, 008424, P20715, P13703, P13702, Q96ÜG4, Q8SQZ9, 015888, Q9TÜM4, P93514, Q39628, P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84M 0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9 LM0 Ejemplos de genes de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa son: un ácido nucleico que codifica un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa a partir de Arabidopsis thaliana (lytB/ISPH) , ACCESO AY168881, (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 9, proteína: SEC. DE IDENT. NO. : 102), y los genes del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa a partir de otros órganos con los siguientes números de acceso: T04781, AF270978_1, · NP_485028.1, NP_442089.1, NP_681832.1, ZP_00110421.1, ZP_00071594.1, ZP_00114706.1, ISPH_SYNY3, ZP_00114087.1, ZP_00104269.1, AF398145_1, AF398146_1, AAD55762.1, AF514843_1, NP_622970.1, NP_348471.1, NP 562001.1, NP 223698.1, NP 781941.1, ZP 00080042.1, P__859669.1, NP_214191.1, ZP_00086191.1, ISPH VIBCH, NP 230334.1, NP_742768.1, NP_302306.1, ISPH_ YCLE, NP_ 602581.1, ZE_00026966.1, NP_520563.1, NP_253247.1, P 282047.1, ZP_00038210.1, ZP_00064913.1, CAA61555.1, ZP_ 00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067.1, ZP_ 00029164.1, NPJ790656.1, NP_217899.1, NP_641592.1, NP_ 636532.1, NP_719076.1, NP_660497.1, NP_422155.1, P _715446.1, ZP_00090692.1, NP_759496.1, ISPH_BURPS, ZP _00129657.1, NP_215626.1, NP_335584.1, ZP_00135016.1, NP _789585.1, NP_787770.1, NP_769647.1, ZP_00043336.1, NP 242248.1, ZP_00008555.1, NP 246603.1, ZP_00030951.1, NP 670994.1, NP_404120.1, NP_540376.1, NP_733653.1, NP_ 697503.1, NP_840730.1, NP_274828.1, NP 796916.1, ZP_ 00123390.1, NP_824386.1, NP_737689.1, ZP_00021222.1, NP /757521.1, NP_390395.1, ZP_00133322.1, CAD76178.1, NP 600249.1, NP_454660.1, NPJ712601.1, NP_385018.1, NP 751989.1 Ejemplos de los genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa son: un ácido nucleico que codifica una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa a partir de Lycopersicon esculentum, ACCESO #AF143812 (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 103, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 12), y genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286_1, NP_193291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AA 65798.1, NP_566686.1f CAD22531.1, AAC33513.1, CAC08458.1, AAG10432.1, T08140, AAP14354.1, AF428463_1, ZP_ 00010537. I r NP_769291.1, AAK59424.1, NP 107784. I r P_ 697464.1, NP_540415.1, NP_196699.1, NP_384986. I r ZP_ 00096461. I r ZP_00013656.1, NP_353769.1, BAA83576. I r ZP_ 00005919. 1, ZP_00006273.1, NP_420871.1, AAM48660. I r DX£ ; RHOCA, ZP_00045608.1, ZP_00031686.1 , NP 841218. 1, ZP_ 00022174. I r ZP_00086851.1, NP_742690.1, NP_520342. 1, ZP_ 00082120. I r NP_790545.1, ZP_00125266.1, CAC17468. i, NP_ 252733.1, ZP_00092466.1, NP_439591.1, NP_414954. i , P_ 752465.1, NP_622918.1, NP_286162.1, NP_836085. I r NP_ 706308.1, ZP_00081148.1, NP_797065.1, NP_213598. I r NP_ _245469.1, ZP_00075029.1, NP_455016.1, NP_230536. 1, NP_ _459417.1, NP_274863.1, NP_283402.1, NP_759318. I r NP_ 406652.1, DXS_SYNLE, DXS_SYNP7, NP 440409. I r ZP_ _00067331. I r ZPJ30122853.1, NP_717142.1, ZP_00104889. I r NP 243645.1, NP 681412.1, DXS_SYNEL, NP_637787 .1, DXS CHLTE, ZP_ _00129863. I r NP_661241.1, DXS_XANCP, NP_470738. I r P_ _484643.1, ZP_00108360.1, NP_833890.1, NP_846629. I r P_ 658213.1, NP_642879.1, ZP_ _00039479.1, ZP_00060584. I r Z _ _00041364. I r ZP_00117779.1, NP_ _299528.1 Ejemplos de genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa son: un ácido nucleico que codifica una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa a partir de Arabidopsis thaliana, ACCESO #AF148852, (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 13, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 14), y genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952, AJ242588, AB009053, AY202991, NP_201085.1, T52570, AF331705_1, BAB16915.1, AF367205_1, AF250235_1, CAC03581.1, CAD22156.1, AF182287_1, DXR_MENPI, ZP_00071219.1, NP_488391.1, ZP_00111307.1, DXR_SYNLE, AAP56260.1, NP_681831.1, NP_442113.1, ZP_00115071.1, ??_0010510ß.1, ZP_00113484.1, NP_833540.1, NP_657789.1, NP_661031.1r DXR_BACHD, NP_833080.1, NP_845693.1, P_562610.1, NP_623020.1, NP_810915.1, NP_243287.1, ZP_00118743.1, NP_464842.1, NP_470690.1, ZP_00082201.1 , NPJ781898.1, ZP_00123667.1, NP_348420.1, NP_604221.1, ZP_00053349.1, ZP_00064941.1, NP_246927.1, NP_389537.1, ZP_00102576.1, NP_519531.1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NPJ713472.1, NP_459225.1, NP_454827.1, ZP_00045738.1, NP_743754.1, DXR_PSEPK, ZP_00130352.1 , NP_702530.1, NP 841744.1, NP 438967.1, AF514841 1, NP 706118.1, ZP_00125845.1, NP_404661.1, NP_285867.1, NP_240064.1, NP 414715.1, ZP_00094058.1, NP_791365.1, ZP_00012448.1 , ZP_00015132.1, ZP_00091545.1, NP_629822.1, NP_771495.1, NPJ798691.1, NP_231885.1, NP_252340.1, ZP_00022353.1, NP_355549.1, NP_420724.1, ZP_00085169.1, EAA17616.1, NP_273242.1, NP_219574.1, NP_387094.1, NP_296721.1, ZP_00004209.1, NP_823739.1, NP_282934.1, BAA77848.1, NP_660577.1, NP_760741.1, NP_641750.1, NP_636741.1, NP_829309.1, NP_298338.1, ??_444964·.1, NP_717246.1, NP_224545.1, ZP_00038451.1, DXR_KITGR, NP_778563.1. Ejemplos de genes de isopentenil difosfato ?-isomerasa son: un ácido nucleico que codifica un isopentenil difosfato ?-isomerasa a partir del clon Adonis palaestina ApIPI28, (ipiAal), ACCESO #AF188060, publicado por Cunningham, F. X. Jr., y Gantt, E. : Identification of multigenes families encoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol. 41(1), 119-123 (2000) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 15, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 16) , y genes de isopentenil difosfato ?-isomerasa a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso : Q38929, 048964, Q39472, Q13907, 035586, P58044, 042641, 035760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4, Q42553, 027997, P50740, 051627, 048965, Q8KFR5, Q39471, Q39664, Q9RVE2, Q01335, Q9HHE4, Q9BXSI, Q9K F6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35 Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6, 013504, Q9HF 8, Q8NJL9, Q9UUQI , Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6, 081691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3, Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, . Q9AVJI, Q9AVG8 , Q9M6K6, Q9AVJ5, Q9M6K2, Q9AYS5, Q9M6K8, Q9AVG7 , Q8S3L7, Q8W250, Q94IE1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9 6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382, CAD94476. Ejemplos de genes de geranil difosfato sintasa son: un ácido nucleico que codifica una geranil difosfato sintasa a partir de Arabidopsis thaliana, ACCESO #Y17376, Bouvier, F., Suire, C, d'Harlingue, A. , Backhaus, R.A. y Cámara, B.; Molecular cloning of geranyl phosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant J. 24(2), 241-252 (2000) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 17, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 18), y genes de geranil difosfato sintasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso : Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3, Q9SBR3, Q9SBR4, Q9FET8, Q8LKJ1, Q84LG1, Q9JK86 Ejemplos de genes de farnesil difosfato sintasa son: un ácido nucleico que codifica una farnesil difosfato sintasa a partir de Arabidopsis thaliana (FPS1) , ACCESO #U80605, publicado por Cunillera, . , Arro, M., Delourme, D. , Karst, F. , Boronat, A. y Ferrer, A.: Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed farnesyl phosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271(13), 7774-7780 (1996), (ácido nucleico: SEC. DE IDEN . NO. : 19, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 112), y los genes de farnesil difosfato sintasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso • P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351, 024241 Q43315, P49352, 024242, P49350, P08836, P14324, P49349 P08524, 066952, Q08291, P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0 P22939, P45204, 066126, P55539, Q9SWH9, Q9AV17, Q9FRX2 Q9AYS7, Q941E8, Q9FXR9, Q9ZWF6, Q9FXR8, Q9AR37, 050009 Q94IE9, Q8RVK7, Q8RVQ7 , 004882, Q93RA8, Q93RB0, Q93RB4 Q93RB5, Q93RB3, Q93RBI, Q93RB2, Q920E5. Ejemplos de genes de geranilgeranil difosfato sintasa son: un ácido nucleico que codifica una geranilgeranil difosfato' sintasa a partir de Sinaps alba, ACCESO #X98795, publicada por Bonk, M. , Hoffmann, B., Von Lintig, J. , Schledz, M. , Al-Babili, S., Hobeika, E., Kleining, H. y Beyer, P.: Chloroplat import of tour carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveáis differential fates prior to membran binding and oligomeric assembly, Eur. J. Biochem. 247(3), 942-950 (1997) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 21, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 114), y genes de geranilgeranil difosfato sintasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: P22873, P34802, P56966, P80042, Q42698, Q92236, 095749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2 , Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4, Q9SXZ5, Q AVJ7, Q9AYN1, Q9AVJ4 , Q9FXR7, Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC4, Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0, Q9AVI9, Q FR 3, Q9FXR5, Q94IF0, Q9FRX1, Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA31459 Ejemplos de genes de fitoeno sintasa son: un ácido nucleico que codifica una fitoeno sintasa a partir de Erwinia uredovora, ACCESO #D90087; publicada por Misawa, N., Nakaga a, M., Kobayashi, PC, Yamano, S., Izawa Y., Nakamura, K. y Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic path ay by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J.
Bacteriol. 172(12), 6704-6712 (1990), (ácido nucleico: SEC.
DE IDENT. NO. : 23, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 24), y genes de la fitoeno sintasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: P22873, ?34802 , P56966, P80042, Q42698, Q92236 095749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3 , Q9AYN2 Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4, Q9SXZ5, Q9AVJ7 , Q9AYNI, Q9AVJ4 Q9FXR7, Q8LSC5 , Q AVJ6, Q8LSC4, Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6 Q9SST9, Q9AVJ0, Q AVI9, Q9FR 3, Q9FXR5, Q94IF0, Q9FRX1 Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA3 1459, CAA68575 ?_000130, ?_001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957 BAC76563, ?000242, ?_000551, AAL02001, AAK15621, CAB94795 AAA91951, ?_000448 Ejemplos de genes de fitoeno desaturasa son: un ácido nucleico que codifica una fitoeno desaturasa a partir de Erwinia uredovora, ACCESO #D90087; publicada por Misa a, N., Nakagawa, M. , obayashi, K. , Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K. y Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172(12), 6704-6712 (1990), (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 25, proteína: SEC. DE IDENT. NO.: 26), y genes de fitoeno desaturasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: AAL15300, A39597, CAA42573, AAK51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461, AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AA024235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP 001041, ZP 001163, CAA39004, CAA44452, ZP 001142, ZP_000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091, BAC09113, AAP79175, AAL80005, AAM72642, AAM72043, ZP_000745, ZP_001141f BAC07889, CAD55814, ZP_001041, CAD27442, CAE00192, ZP_001163, ZP_000197, BAA18400, AAG10425, ZP_001119, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081, AAA91161, CAB56041, AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP_001117, ZP_000448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP_000171, AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP_001133, CAA64853, BAB74484, ZP_001156r AAF23289, AAG28703, ???09348, AAM71569, BAB69140, ZP_000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, AAG10645, ZP_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371, ZP_000612, BAC75676, AAF65582 Ejemplos de genes zeta-caroteno desaturasa son: un ácido nucleico que codifica una zeta-caroteno desaturasa a partir de Narcissus pseudonarcissus, ACCESO #AJ224683, publicado por Al-Babili, S., Oelschlegel, J. and Beyer, P.: A cDNA encoding for beta carotene desaturase (No. de Acceso AJ224683) a partir de Narcissus pseudonarcissus L.. (PGR98-103), Plant Physiol. 117-719-719 (1998) (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 119, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 8) y genes zeta-caroteno desaturasa adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4 , 049901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2 , ZDS_NARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617_1, ZDSJTARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278A, ZDS_CAPAN, ZDSJLYCES, NPJL87138.1, AAM63349.1, ZDS_ARATH, AAA91161.1, ZDS_ AIZE, AAG14399.1, NP_441720.1, ??_48d422.1, ZP_00111920.1, CAB56041.1, ZP_00074512.1, ZP_00116357.1 , NP_681127.1, ZP_00114185.1 , ZP_00104126.1, CAB65434.1, NP_662300.1 Ejemplos de genes crtISO son: Un ácido nucleico que codifica crtISO a partir de Lycopersicon esculentum: ACCESO #AF416727, publicado por Isaacson, T., Roñen, G. Zamir, D. y Hirschberg, J. : Cloning of tangerine from tomato reveáis a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14(2), 333-342(2002), (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO. : 29, proteina: SEC. DE IDENT. NO. : 122) , y genes crtISO adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: AAM53952 Ejemplos de genes FtsZ son: un ácido nucleico que codifica FtzS a partir de Tagetes erecta, ACCESO #AF251346, publicado por Moehs, CP., Tian, L . , Osteryoung,. K.W. and Dellapenna, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 31, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 32), y genes FtsZ adicionales a partir de otros organismos con los siguientes números de acceso: CAB89286.1, AF205858_1, NP_200339.1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774, AF383876_1, BAC57986.1, CAD22047.1, BAB91150.1, ZP_00072546.1 , NP_440816.1, T51092, NP_683172.1, BAA85116.1, NP_487898.1, JC4289, BAA82871.1, NP_781763.1, BAC57987.1, ZP_00111461.1, T51088, NP_190843.1, ZP_00060035.1, NP_846285.1, AAL07180.1, NP_243424.1, NP_833626.1, AAN04561.1, AAN04557.1, CAD22048.1, T51089, NP_692394.1, NP_623237.1, NP_565839.1, T51090, CAA07676.1, NP_113397.1, T51087, CAC44257.1, E84778, ZP_00105267.1, BAA82091.1, ZP_00112790.1, BAA96782.1, NP_348319.1, NP_471472.1, ZP_00115870.1, NP_465556.1, NP 389412.1, BAA82090.1, NP_562681.1, AAM22891.1, NP_371710.1, NP_764416.1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117_1, NP_827300.1, JE0282, NP_626341.1, AAC45639.1, NP_785689.1, NP_336679.1, NP_738660.1, ZP_00057764.1 , AAC32265.1, NP_814733.1, FTSZ_MYCKA, NP_216666.1, CAA75616.1, NP_301700.1, NP_601357.1, ZP_00046269.1, CAA70158.1, ZP_00037834.1 , NP_268026.1, FTSZ_ENTHR, NP_787643.1, NP_346105.1, AAC32264.1, JC5548, AAC95440.1, NPJ710793.1, NP_687509.1, NP 269594.1, AAC32266.1, NP 720988.1, NP_657875.1, ZP_00094865.1, ZP_00080499.1 , ZP_00043589.1, JC7087, NP_660559.1f AAC46069.1, AF179611_14, AAC44223.1, NP_404201.1. Ejemplos de genes MinD son: -un ácido nucleico que codifica un MinD a partir de Tagetes erecta, ACCESO #AF251019, publicado por Moehs, C ., Tian, L., Osteryoung, K. . y Dellapenna, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (ácido nucleico: SEC. DE IDENT. NO.: 33, proteina: SEC. DE IDENT. NO.: 34), y genes MinD adicionales con los siguientes números de acceso: NP 197790.1, BAA90628.1, NP_038435. 1, NP_045875. I r AAN33031.1, NP_050910.1, CAB53105.1, NP_050687. I r P_ J582807.1, NP 487496.1, ZP_0011170g.1, ZP_00071109. I r P_ _442592.1, NP_603083.1, NPJ782631.1, ZP_00097367. I r ZP_ _00104319. 1, NP_294476.1, NP_622555.1, NP_56305 . I r NP _347881.1, ZP_00113908.1, NP_834154.1, NP_658480. I r ZP_ _00059858. I r NP_470915.1, NP_243893.1, NP_465069. I r Z _ _00116155. 'I r NP_390677.1, NP_692970.1, NP_298610. I r NP_ _207129.1, ZP_00038874.1, NP_778791.1, NP_223033. I r P_ _641561.1, NP_636499.1, ZP_00088714.1, NP_213595. I r NP_ _743889.1, NP_231594.1, ZP_00085067.1, NP 797252. I r ZP 00136593. I r NP 251934.1, NP 405529.1, NP 759144. I r ZP_00102939.1, NP_793645. lr NP_699517 ¦ 1, NP_460771.1, NP_860754.1, NP_456322.1, NP_718163. 1, NP_229666. 1, NP_357356.1, NP_541904.1, NP_287414. 1, NP 660660. 1, ZP_00128273.1, NP_103411.1, NP_785789 • 1, NPJ715361. 1, AF149810_1, NP__841854.1, NP_437893.1, ZP_00022726. 1, EAA24844.1, ZP_00029547.1, NP_52148 . .1, NP_240148. 1, NP_770852.1, AF345908_2, NP_777923.1, ZP_00048879. 1, NP_579340.1, NP_143455.1, NP_126254. 1, NP_142573. 1, NP_613505.1, NP_127112.1, NP_712786. 1, NP_578214. lr NP_069530.1, NP_247526.1, AAA85593. 1, NP_212403. 1, NP_782258.1, ZP_00058694.1, NP_247137 • 1, NP 219149. 1, NP_276946.1, NP_614522.1, ZP_00019288.1, CAD78330.1 De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes HMG-CoA reductasa utilizados son ácidos nucleicos que codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO.: 8 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 8, y. la cual tiene las propiedades enzimáticas de una HMG-CoA reductasa. Ejemplos adicionales de HMG-CoA reductasa y genes HMG-CoA reductasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácido o de las secuencias de ácido nucleico traducidas de nuevo correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 8. Ejemplos adicionales de HMG-CoA reductasa y los genes de HMG-CoA reductasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 7 a partir de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad . particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de la HMG-CoA reductasa, los ácidos nucleicos se insertan dentro de los organismos cuyas proteínas codificadas que comprenden la secuencia de aminoácido de la HMG-CoA reductasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 8. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo, por traducción posterior de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para éste, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso del codón específico del organismo. El uso del codón puede determinarse fácilmente con la ayuda del análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 7 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 10 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 10, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. Ejemplos adicionales del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa y los genes de (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácido o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 10. Ejemplos adicionales del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasas y el (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 9 a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa se insertan ácidos nucleicos en organismos cuyas proteínas codificadas que comprenden la secuencia de aminoácido del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 10. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso del codón específico de organismos. El uso del codón puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos relacionados .
En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 9 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa se utilizan ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 12 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 12, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una (l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa. Ejemplos adicionales de ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa y de los genes ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de las bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 12. Ejemplos adicionales de las ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasas y los genes de ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa pueden encontrarse además fácilmente por ejemplo, a ¦partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 11 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnica de PCR y en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de la (1-desoxi-D- xilosa-5-fosfato sintasa se insertan los ácidos nucleicos en organismos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la ( l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 12. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de los organismos afectados. En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 11 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. : 14 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 14, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa . Ejemplos adicionales de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasas y los genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa pueden encontrarse fácilmente por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 1 . Ejemplos adicionales de las l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasas y los genes de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 13 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización o técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementár la actividad de la 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa se insertan ácidos nucleicos en organismos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 14. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia de polipéptido de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 13 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de isopentenil-D-isomerasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. : 16 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 16 y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una isopentenil-D-isomerasa. Ejemplos adicionales de las isopentenil-D-isoraerasas .y los genes de isopentenil-D-isomerasa pueden encontrarse fácilmente por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente por comparaciones de homología y de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen SEC. DE IDENT. NO. : 16. Ejemplos adicionales de las isopentenil-D-isomerasas y los genes de isopentenil-D-isomerasa pueden descubrirse además fácilmente, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 15 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de isopentenil-D-isomerasa se insertan ácidos nucleicos dentro de organismos que codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la isopentenil-D-isomerasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 16. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, .por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados. En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 17 se inserta en el organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de la geranil difosfato sintasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 18 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 18, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una geranil difosfato sintasa. Ejemplos adicionales de las geranil difosfato sintasas y los genes de geranil difosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 18. Ejemplos adicionales de la geranil difosfato sintasa y los genes de geranil difosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo, a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 17 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de POR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de la geranil difosfato sintasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos que codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la geranil difosfato sintasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 18. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético.
De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 17 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de la farnesil difosfato sintasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 20 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún mas preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 20 y tiene las propiedades enzimáticas de una farnesil difosfato sintasa. Ejemplos adicionales de las farnesil difosfato sintasas y los genes de farnesil difosfato sintasa pueden determinarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO.: 20. Ejemplos adicionales de las farnesil difosfato sintasas y los genes de farnesil difosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 19 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR en una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de la farnesil difosfato sintasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos . de la farnesil difosfato sintasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 20. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo, por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados.
En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 19 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de la geranilgeranil difosfato sintasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO.: 22 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 22 y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una geranilgeranil difosfato sintasa. Ejemplos adicionales de geranilgeranil difosfato sintasas y los genes de geranilgeranil difosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO.: 22. Ejemplos adicionales de las geranilgeranil difosfato sintasas y los genes de la geranilgeranil difosfato sintasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 21 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la geranilgeranil difosfato sintasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 22. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 21 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de fitoeno sintasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 24 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 24, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una fitoeno sintasa. Ejemplos adicionales de fitoeno sintasas y los genes de fitoeno sintasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 24. Ejemplos adicionales de fitoeno sintasas y de genes fitoeno sintasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 23 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de fitoeno sintasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la fitoeno sintasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 2 . Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos . El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 23 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de fitoeno desaturasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 26 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 26, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una fitoeno desaturasa. Ejemplos adicionales de fitoeno desaturasas y los genes de fitoeno desaturasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 26. Ejemplos adicionales de las fitoeno desaturasas y los genes de la fitoeno desaturasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 25 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se . En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de fitoeno desaturasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la fitoeno desaturasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 26.
Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 25 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de la zeta-caroteno desaturasa utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO.: 28 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 28, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una zeta-caroteno desaturasa. Ejemplos adicionales de las zeta-caroteno desaturasas y los genes de zeta-caroteno desaturasa pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, a partir de varios organismos, cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que continenen la SEC. DE IDENT. NO..: 28. Ejemplos adicionales de las zeta-caroteno desaturasas y los genes de la zeta-caroteno desaturasa pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 119 de varios organismos cuya, secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de la zeta-caroteno desaturasa, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la zeta-caroteno desaturasa de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 28. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 119 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes crtISO utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. : 30 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.:30, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de un Crtlso. Ejemplos adicionales de CrtISO y los genes CrtISO pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO.: 30. Ejemplos adicionales del CrtISO y los genes CrtISO pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 29 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de CrtISO, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteinas que comprenden la secuencia de aminoácidos del CrtISO de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 30. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptidica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos del organismo. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 29 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes FtsZ utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO.: 32 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC . DE IDENT. NO.: 32, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una FtsZ. Ejemplos adicionales de FtsZn y los genes FtsZ pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO. : 32. Ejemplos adicionales de FtsZn y los genes FtsZ pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo a partir de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 31 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnica de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de FtsZ, se insertan ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de FtsZ de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 32. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 31 se inserta dentro del organismo. De preferencia, en la modalidad preferida descrita anteriormente, los genes de MinD utilizados son ácidos nucleicos los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO.: 34 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 30%, de preferencia al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 34, y la cual tiene las propiedades enzimáticas de una MinD. Ejemplos adicionales de inDn y los genes MinD pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo a partir de varios organismos cuya secuencia genómica se conoce, como se describe anteriormente, por comparaciones de homología de las secuencias de aminoácidos o de las secuencias de ácido nucleico de nuevo traducidas correspondientes a partir de bases de datos que contienen la SEC. DE IDENT. NO.: 34. Ejemplos adicionales de MinDn y los genes MinD pueden encontrarse fácilmente además, por ejemplo, partiendo de la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 33 de varios organismos cuya secuencia genómica no se conoce, como se describe anteriormente, por hibridización y técnicas de PCR de una manera conocida per se. En una modalidad particularmente preferida adicional, para incrementar la actividad de MinD, se inserta en ácidos nucleicos en organismos, los cuales codifican proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de MinD de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 34. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas son obtenibles, por ejemplo por traducción posterior de la secuencia polipeptídica de acuerdo al código genético. De preferencia, aquellos codones se utilizan para esto, los cuales se utilizan con frecuencia de acuerdo al uso de codones específicos de organismos. El uso de codones puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis por computadora de otros genes conocidos de los organismos afectados . En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 33 se inserta dentro del organismo. Todos los genes HMG-CoA reductasa anteriormente mencionados, los genes del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa', genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, genes l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, genes del isopentenil difosfato ?-isomerasa, genes de geranil difosfato sintasa, genes de farnesil difosfato sintasa, genes de geranilgeranil difosfato sintasa, genes de fitoeno sintasa, genes de fitoeno desaturasa, cenes de zeta-caroteno desaturasa, genes crtISO, genes FtsZ o genes MinD pueden prepararse además en una manera conocida per se por síntesis química a partir de las unidades estructurales del nucleótido, tales como por ejemplo, por condensación de fragmento de traslape individual de unidades estructurales del ácido nucleico complementario de doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede llevarse a cabo por ejemplo, en una manera conocida, de acuerdo al método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a. edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de los oligonucleótidos sintéticos y el llenado de aberturas con la ayuda del fragmento Klenow de la ADN polimerasa y las reacciones de ligación y los procesos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los ácidos nucleicos que codifican una cetolasa, los ácidos nucleicos que codifican una ß-hidroxilasa, ácidos nucleicos que codifican una ß-ciclasa, que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, y los ácidos nucleicos que codifican una HMG-CoA reductasa, los ácidos nucleicos que codifican un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, los ácidos nucleicos que codifican una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, los ácidos nucleicos que codifican un isopentenil difosfato ?-isomerasa, los ácidos nucleicos que codifican una geranil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una farnesil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una geranilgeranil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno desaturasa, los ácidos nucleicos que codifican una zeta-caroteno desaturasa, los ácidos nucleicos que codifican una proteina crtISO, los ácidos nucleicos que codifican una proteina FtsZ y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina MinD se llaman también "genes de incidencia" posteriormente. La producción de los organismos no humanos genéticamente modificados puede llevarse a cabo, como se describe posteriormente, por ejemplo, por inserción de construcciones de ácido nucleico individuales (casetes de expresión) , que comprende un gen de incidencia o por la inserción de construcciones múltiples, la cual comprende hasta dos o tres de los genes de incidencia o más de tres genes de incidencia. Se entiende organismos de acuerdo con la invención como significando de preferencia organismos los cuales, como organismos de tipo silvestre o de partida, naturalmente o por medio de la complementacion genética y/o la re-regulación de las trayectorias metabólicas están en la posición para producir carotenoides , en particular ß-caroteno y/o zeaxantina y/o neoxantina y/o violaxantina y/o luteina. Organismos preferidos adicionales, como organismos de tipo silvestre o de partida, ya tienen una actividad de hidroxilasa y son de este modo, como organismos de tipo silvestre o de partida, en la posición para producir zeaxantina .
Los organismos preferidos son plantas o microorganismos, tales como por ejemplo, bacterias, levaduras, algas u hongos. Las bacterias utilizadas pueden ser ambas bacterias las cuales, a cuenta de la inserción de genes de la biosintesis de carotenoides de un organismo que produce carotenoides están en la posición para sintetizar xantofilas, tales como por ejemplo, bacterias del género Escherichia, las cuales por ejemplo, comprenden genes crt a partir de Erwinia y bacterias las cuales en su parte están en la posición para sintetizar xantofilas, tales como por ejemplo, bacterias del género Erwinia r Agrobacteriurnr Flavohacterium , Alcaligenes , Paracoccusr Nostoc o cianobacterias del género Synechocystis . Las bacterias preferidas son Escherichia coli, Erwinia herbicola , Erwinia uredovora, Agrobacteriurn aurantiacum, Alcaligenes sp. PC-1, Flavohacterium sp. Cepa R1534, la cianobacteria Synechocystis s . PCC6803, Paracoccus marcusii o Paracoccus caroteneifaciens. Las levaduras preferidas son Candida, Saccharomycesr Hansenula, Pichia o Phaffia. Las levaduras particularmente preferidas son Xanthophyllomyces dendrorhous o Phaffia rhodozyma . Los hongos preferidos son Aspergillus r Trichoderma , Ashbya , Neuroscopora , Blakeslea, en particular Blakeslea trispora r Phycomyces, Fusarium u hongos adicionales descritos en Indian Chem. Er.gr. Sección B. Vol. 37, No. 1, 2 (1995) en la página 15, Tabla 6. Las algas preferidas son algas verdes, tales como por ejemplo, algas del género Haematococcus, Phaedactylum tricornatumr Volvox o Dunallella. Las algas particularmente preferidas son Haematococcus puvialis o Dunallella bardawll. Otros microorganismos utilizables y su producción para llevar a cabo el proceso de acuerdo con la invención se conocen, por ejemplo, a partir de DE-A-199 16 140, a cual se hace referencia en la presente. Las plantas particularmente preferidas son plantas seleccionadas a partir de las familias Amaranthaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Balsaminaceae, Begoniaceae, Berberidaceae, Brassicaceae, Cannabaceae, Caprifoliaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Cruciferae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Graminae, Illiaceae, Labiatae, Lamiaceae, Leguminosae, Liliaceae, Linaceae, Lobeliaceae, Malvaceae, Oleaceae, Orchidaceae, Papaveraceae, Plumbaginaceae, Poaceae, Polemoniaceae, Primulaceae, Ranunculaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tropaeolaceae, ümbelliferae, Verbanaceae, Vitaceae y Violaceae. Plantas muy particularmente preferidas, se seleccionan a partir del grupo que consiste del género de plantas Marigold, Tagetes errecta, Tagetes patilla, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica, Aquilegia , Aster, Astragalus , Bignonia, Caléndula, Caltha, Campánula , Canna , Centaurea , Cheiranthus , Chrysanthemum , Citrus, Crepis, Crocus , Curcurbita , Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus , Dimorphotheca , Doronicum, Eschscholtzia , Forsythia , Fremontia , Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana , Geranium , Gerbera, Geum, Grevillea , Helenium, Helianthus , Hepática , Heracleum, Hisbiscus , Heliopsis , Hypericum, Hypochoeris , Impatiens, Iris, Jacaranda , Kerria, Laburnum, Lathyrus, Leontodón, Lilium, Linum, Lotus, Lycopersicon, Lysimachia , Maratia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera , Osmanthus , Petunia, Photinia, Physalis, Phyteuma, Potentílla , Pyracantha , Ranunculus , Rhododendron, Rosa, Rudbeckia , Senecio, Silene, Silphium, Sinapsis , Sorbus, Spartium, Tecoma, Torenia, Tragopogón, Trollius, Tropaeolum, Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola o Zinna, seleccionadas particularmente de preferencia a partir del grupo que consiste del género de la planta Clavelón, Tagetes erecta, Tagetes patula, Lycopersicon, Rosa, Caléndula, Physalis, Medicago, Helianthus, Crisantemo, Áster, Tulipán, Narciso, Petunia, Geranio, Tropaeolum o Adonis. En el proceso de acuerdo con la invención para la producción de cetocarotenoxdes, una cosecha de los organismos y de preferencia adicionalmente además un aislamiento de cetocarotenoides a partir de los organismos sigue la etapa para cultivar los organismos genéticamente modificados. La cosecha de los organismos se lleva a cabo en una manera conocida per se que corresponde · al organismo respectivo. Los microorganismos, tales como bacterias, levaduras, algas u hongos o células de plantas se cultivan por fermentación en un medio de nutriente liquido, pueden separarse, por ejemplo, por centrigugación, por decantación o por filtración. Las plantas se cultivan en el medio nutriente en una manera conocida per se y se cosechan correspondientemente . El cultivo de los microorganismos genéticamente modificados se lleva a cabo de preferencia en la presencia de oxigeno en una temperatura de cultivo de al menos aproximadamente 20°C, tal como por ejemplo, 20°C a 40°C, y un pH de aproximadamente 6 a 9. En el caso de los microorganismos genéticamente modificados, el cultivo de microorganismos tiene lugar de preferencia primero en la presencia de oxigeno y en un medio complejo, tal como por ejemplo, medio TB o LB, en una temperatura de cultivo de aproximadamente 20 °C o más, y un pH de aproximadamente 6 a 9, hasta que se logra una densidad celular suficiente. Con el fin de permitir controlar la reacción de oxidación mejor, el uso de un promotor inducible se prefiere. El cultivo se continúa después de la inducción de la expresión de cetolasa en la presencia de oxígeno, por ejemplo, durante 12 horas a 3 dias . El aislamiento de los cetocarotenoides a partir de la biomasa cosechada se lleva a cabo en una manera conocida per se, por ejemplo por extracción y, si es apropiado, los procesos de purificación química o física adicionales tales como por ejemplo, métodos de precipitación, cristalografía, procesos de separación térmica, tales como procesos de rectificación o procesos de separación física, tales como por ejemplo, cromatografía. Como se menciona posteriormente, los cetocarotenoides pueden producirse específicamente en las plantas genéticamente modificadas de acuerdo con la invención, de preferencia en varios tejidos de plantas, tales como por ejemplo, semillas, hojas, frutas, flores, en particular pétalos de flores. El aislamiento de cetocarotenoides a partir de los pétalos de las flores se lleva a cabo en una manera conocida per se, por ejemplo, secando y por extracción subsecuente y, si es apropiado, los procesos de purificación química o física adicionales, tales como por ejemplo, métodos de precipitación, cristalografía, procesos de separación térmica, tales como procesos de rectificación o procesos de separación física, tales como por ejemplo, cromatografía. El aislamiento de cetocarotenoides a partir de los pétalos de las flores se lleva a cabo, por ejemplo, de preferencia por medio de solventes orgánicos tales como acetona, hexano, éter o ter-metil butil éter. Procesos adicionales para aislar - cetocarotenoides, en particular de los pétalos de las flores, se describen por ejemplo, en Egger y Kleinig ( Phytochemistry (1967) 6, 437-440) y Egger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618). De preferencia, se seleccionan los cetocarotenoides a partir del grupo que consiste de astaxantina, cantaxantina, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3' -hidroxiequinenona, adonirubina y adonixantina . Un cetocarotenoide particularmente preferido es astaxantina . Dependiendo del organismo utilizado, los cetocarotenoides se obtienen en forma libre como ésteres del ácido graso o como diglucósidos. En los pétalos de las flores de las plantas, los cetocarotenoides se obtienen en el proceso de acuerdo con la invención, en la forma de sus mono o diésteres con ácidos grasos. Algunos ácidos grasos detectados son por ejemplo, ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linolénico y ácido laúrico (Kamata and Simpson (1987) Comp. Biochem. Physiol. Vol . 86B (3), 587-591). La producción de los cetocarotenoides puede tener lugar en una planta completa o, en una modalidad preferida, específicamente en tejidos de plantas los cuales comprenden cromoplastos . Los tejidos de plantas preferidos son por ejemplo, raices, semillas, hojas, frutas, flores y en particular néctares y pétalos de .las flores, los cuales se llaman también pétalos. En una modalidad particularmente preferida del proceso de acuerdo con la invención, se utilizan plantas genéticamente modificadas las cuales tienen la velocidad de expresión más elevada de una cetolasa en las flores. De preferencia, esto se consigue por la expresión genética de la cetolasa teniendo lugar bajo el control de un promotor especifico de flores. Por ejemplo, para esto, los ácidos nucleicos descritos anteriormente, como se describe en detalle posteriormente, se insertan en una construcción de ácido nucleico enlazada funcionalmente a un promotor especifico de flores en la planta. En una modalidad particularmente preferida, adicional del proceso de acuerdo con la invención, se utilizan plantas genéticamente modificadas las cuales tienen la velocidad de expresión más elevada de una cetolasa en la f ut . De preferencia, esto se consigue por la expresión genética de la cetolasa teniendo lugar bajo el control de un promotor especifico de frutas. Por ejemplo, para esto los ácidos nucleicos descritos anteriormente, como se describen en detalle en lo siguiente, se insertan dentro de una construcción del ácido nucleico enlazada funcionalmente a un promotor especifico de frutas en la planta. En una modalidad particularmente preferida, adicional del proceso de acuerdo con la invención, se utilizan plantas genéticamente modificadas, las cuales tienen una velocidad de expresión más elevada de una cetolasa en semillas . De preferencia, esto se consigue por la expresión genética de la cetolasa teniendo lugar bajo el control de un promotor especifico de semillas. Por ejemplo, para esto, los ácidos nucleicos descritos anteriormente, como se describen en detalle en lo siguiente, se insertan dentro de una construcción de ácido nucleico enlazada funcionalmente a un promotor especifico de semillas en la planta. El objetivo en los cromoplastcs se lleva a cabo por un péptido de tránsito plastídico enlazado funcionalmente . Posteriormente, a manera de ejemplo, se describe la producción de plantas genéticamente modificadas que han incrementado o producido la actividad de la cetolasa e incrementado o producido la actividad de ß-ciclasa, la actividad de ß-ciclasa que se produce por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. El incremento de actividades adicionales, tales como por ejemplo, la actividad de hidroxilasa, la actividad de HMG-CoA, la actividad del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, la actividad de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, la actividad de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, la actividad del isopentenil difosfato ?-isomerasa, la actividad de la geranil difosfato sintasa, la actividad de la farnesil difosfato sintasa, la actividad de geranilgeranil difosfato sintasa, la actividad de la fitoeno sintasa, la actividad de la' fitoeno desaturasa, la actividad de la zeta-caroteno desaturasa, la actividad de crtISO, la actividad de FtsZ y/o la actividad de MinD pueden llevarse a cabo análogamente utilizando los genes de incidencia correspondientes. En las combinaciones de las modificaciones genéticas, las transformaciones pueden llevarse a cabo individualmente o por medio de múltiples construcciones. La producción de plantas transgénicas se lleva, a cabo de preferencia por la transformación de las plantas de partida con una construcción de ácido nucleico la cual comprende los ácidos nucleicos descritos anteriormente que codifican una cetolasa y que codifican una ß-ciclasa, los cuales se enlazan funcionalmente a una o más señales de regulación las cuales garantizan la transcripción y la traducción en plantas, el ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. Alternativamente, la producción de las plantas transgénicas se lleva a cabo de preferencia por transformación de las plantas de partida con dos construcciones de ácido nucleico. Una construcción de ácido nucleico comprende al menos un ácido nucleico descrito anteriormente, que codifica una cetolasa la cual se enlaza funcionalmente a una o más señales de regulación lo que garantiza la transcripción y traducción en plantas. La segunda construcción de ácidos nucleicos comprende al menos un ácido nucleico descrito anteriormente, que codifica una ß-ciclasa la cual se enlaza funcionalmente a una o más señales de regulación que garantiza la transcripción y traducción en plantas, el ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una ' identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. Estas construcciones de ácido nucleico, en donde los genes de incidencia se enlazan funcionalmente a una o más señales de regulación que garantizan la transcripción y traducción en plantas, se llaman también casetes de expresión posteriormente. De preferencia, las señales de regulación comprenden uno o más promotores que garantizan la transcripción y la traducción en plantas. Los casetes de expresión comprenden señales de expresión, es decir, las secuencias de ácido nucleico que controlan la expresión de los genes de incidencia en la célula huésped. De acuerdo a una modalidad preferida, un cásete de expresión comprende corriente arriba, es decir, en el extremo 5' de la secuencia de codificación, un promotor y corriente abajo, es decir, en el extremo 3' , y una señal de poliadenilación, y si es apropiado, los elementos de regulación adicionales los cuales, con la secuencia de codificación del gen de incidencia que se sitúan en un medio, se enlazan operativamente a al menos uno de los genes descritos anteriormente. Una conexión operativa se entiende como significando la disposición secuencial del promotor, la secuencia de codificación, el terminador y, si es apropiado, los elementos reguladores adicionales de tal manera que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función en la expresión de la secuencia de codificación como se pretende . Posteriormente, las construcciones de ácido nucleico preferidas, los casetes de expresión y los vectores para plantas y los procesos para la producción de plantas transgénicas , y las plantas transgénicas mismas se describen a manera de ejemplo. Las secuencias preferidas, pero no restringidas a la mismas, para la conexión operativa son secuencias objetivo para garantizar la localización subcelular en el apoplasto, en las vacuolas, en los plástidos, en la mitocondria, en el retículo endoplasmático (ER) , en el núcleo celular, en los elaioplastos u otros compartimientos y mej oradores de traducción tales como la secuencia de guía 5f a partir del virus del mosaico de tabaco (Galliet et al., Nucí. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711). Como un promotor del cásete de expresión, en principio es adecuado cualquier promotor el cual puede controlar la expresión de los genes extraños en las plantas. El promotor "constitutivo" significa aquellos promotores los cuales garantizan la expresión en numerosos , de preferencia todos los tejidos sobre un periodo relativamente largo de tiempo en el desarrollo de las plantas, de preferencia incomparable en el desarrollo de las plantas .
De preferencia, en particular un promotor de plantas o un promotor el cual se origina a partir de un virus de plantas se utiliza. En particular, un promotor particular es aquel de la transcripción 35S del virus del mosaico de coliflor CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228), el promotor de 19S CaMV (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202), el promotor del tránslocalizador de fosfato de triosa (TPT) a partir de Arabidopsls thaliana No. de Acceso AB006698, par de base 53242 a 55281; el gen comenzando a partir de pb 55282 se anota por "el translocalizador de fosfato/fosfato de triosa", o el promotor 34S a partir del virus del mosaico de figwort, No. de Acceso X16673, par de base 1 a 554. Un promotor constitutivo adecuado adicional es el promotor pds (Pecker et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4962-4966) o el promotor de "subunidad pequeña de rubisco (SSU)" (US 4,962,028), el promotor de legumina B (GenBank No. de Acceso X03677), el promotor de la nopalina sintasa a partir de Agrobacterium, el doble promotor TR, el promotor OCS (octopina sintasa) a partir de Agrobacterium, el promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), el promotor de ubiquitina 1 (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc, Nati Acad Sci USA 86:9692-9696), el promotor Smas, el promotor de alcohol cinamilico deshidrogenasa (US 5,683,439), los promotores de las subunidades ATPasa vacuolares o el promotor de una proteina rica en prolina a partir del trigo (WO 91/13991), el promotor Pnit (Y07648. L, Hillebrand et al. (1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrand, et al. (1996), Gene, 170, 197-200) y los promotores adicionales de genes cuya expresión constitutiva en plantas se conoce por la persona experimentada en la técnica. Los casetes de expresión pueden comprender también un promotor químicamente inducible (articulo de vista general: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), por lo cual la expresión de los genes de incidencia en las plantas puede controlarse en un cierto punto de tiempo. Los promotores de este tipo, tales como por ejemplo, el promotor PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), un promotor inducible por ácido salicilico (WO 95/19443), un promotor inducible por bencensulfonamida (EP 0 388 186) , un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), un promotor inducible por ácido abscisico (EP 0 335 528) o un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (WO 93/21334) pueden asi mismo utilizarse. Además, se utilizan promotores los cuales se inducen por tensión biótica o abiótica, tal como por ejemplo, el promotor inducible por patógenos del gen PRPl (Ward et al-. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), el promotor hsp70 o hsp80 inducible por calor a partir del tomate (US 5,187,267), el promotor alfa-amilasa inducible por frió a partir de la papa (WO 96/12814), el promotor PPDK inducible por luz o el promotor pinll inducible por lesiones (EP375091) . Los promotores inducibles por patógenos comprenden aquellos de los genes los cuales se inducen como un resultado de un ataque patogénico, tal como por ejemplo, genes de proteínas PR, proteínas SAR, b-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. (por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Mlcrobe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10: 955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 : 961-968 (1989) . También comprendidos son los promotores inducibles por lesiones tales como aquel del gen pinll del gen sistemina Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), del gen wunl y wunl gene (US 5,428,148), del gen winl y in2 gene (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), del gen de sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), del gen WIPI (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Ekelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), del gen MPI (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 ( 2 ) : 141-159c y similares. Los promotores adecuados adicionales son por ejemplo, promotores específicos de la maduración de frutas, tales como por ejemplo, el promotor específico de la maduración de frutas a partir del tomate ( O 94/21794, EP 409 625) . Los promotores dependientes de desarrollo incluyen parcialmente los promotores específicos de tejido, ya que la formación del tejido individual tiene lugar naturalmente en una manera dependiente de desarrollo. Además, aquellos promotores son particularmente preferidos, los cuales aseguran expresión en tejidos o partes de las plantas, en donde por ejemplo, la biosíntesis de cetocarotenoides o sus precursores tiene lugar. Los promotores preferidos son por ejemplo, aquellos con especificidades para las anteras, los ovarios, los pétalos, los sépalos, las flores, las hojas, los tallos, las semillas y las raíces y combinaciones de los mismos. Los promotores específicos de raíces, de almacenamiento de raíz, de bulbos o de tubérculos son por ejemplo, el promotor de patatina de clase I (B33) o el promotor del inhibidor de catepsina D de la papa.
Los promotores específicos de hojas son por ejemplo, el promotor de la FBPasa citosólica a partir de papa (WO 97/05900), el promotor de SSÜ (subunidad pequeña) del rubisco (1, 5-bis-fosfato de ribulosa carboxilasa) o el promotor de ST-LSI de papa (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451) . Los promotores específicos de flores son por ejemplo, el promotor de fitoeno sintasa (WO 92/16635) o el promotor del gen P-rr (WO 98/22593) , el promotor AP3 de Arabidopsis thaliana, el promotor CHRC (proteína asociada con el promotor del de carotenoide, específica de cromoplastos (CHRC) de Cucumis sativus No. de Acceso AF099501, pares de bases 1 a 1532) , el promotor de EPSP_sintasa (el promotor de gen de 5-enolpiruvil shikimate-3-fosfato sintasa de Petunia híbrida, No. de Acceso M37029, pares de bases 1 a 1788), el promotor PDS (promotor del gen de fitoeno desaturasa a partir de Solanum lycopersicum, No. de Acceso U46919, pares de bases 1 a 2078), el promotor DFR-A (el promotor del gen A de dihidroflavonol 4 reductasa a partir de Petunia híbrida, No. de Acceso X79723, pares de bases 32 a 1902) o el promotor FBP1 (el promotor del gen de la proteína 1 de unión floral de Petunia híbrida, No. de Acceso L10115, pares de bases 52 a 1069) . Ls promotores específicos de anteras son por ejemplo, el promotor 5126 (US 5,689,049, US, 5,689,051), el promotor glob-1 o el promotor g-zeina. Los promotores específicos de semillas son por ejemplo, el promotor ACP05 (gen de proteína portadora de acilo, WO 9218634), los promotores AtSl y AtS3 de Arabidopsis (WO 9920775), el promotor LeB4 de Vicia faba (WO 9729200 y US 06403371), el promotor de napin de Brassica napus (US 5608152; EP 255378; US 5420034), el promotor SBP de Vicia faba (DE 9903432) o los promotores de maíz Endl y End2 (WO 0011177). Los promotores adicionales adecuados para la expresión en plantas se describen en Rogers et al. (1987) Meth en Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11 y Berger et al. (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:8402-8406) . En el proceso de acuerdo con la invención, los promotores constitutivos, específicos de semillas, específicos de frutas, específicos de flores y en particular específicos de los pétalos de las flores son particularmente preferidos . La producción de un cásete de expresión tiene lugar por la fusión de un promotor adecuado con al menos uno de los genes de incidencia descrito anteriormente, y de preferencia un ácido nucleico insertado entre el promotor y la secuencia del ácido nucleico, la cual codifica para un péptido de tránsito específico de plástido, y una señal de poliadenilación de acuerdo con la recombinación usual y técnicas de clonación, tales como se describen por ejemplo, en T. Maniatas, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y también en T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experimenta with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) . Los ácidos nucleicos insertados de preferencia, que codifican un péptido de tránsito plastidico, garantizan la ubicación en plástidos y en particular en cromoplastos . Pueden utilizarse también casetes de expresión, cuya secuencia de ácido nucleico codifica para una proteina de fusión del producto genético de efecto, una parte de la proteina de fusión que es un péptido de tránsito el cual controla la translocalización del polipéptido. Los péptidos de tránsito específicos para los cromoplastos son preferidos, los cuales después de la translocalización de los genes de incidencia en los cromoplastos se remueven enzimáticamente a partir de la parte del producto genético de efecto. En particular, se prefiere el péptido de tránsito el cual se deriva a partir de la transcetolasa plastidica Nicotiana tabacum u otro péptido de tránsito (por ejemplo, el péptido de tránsito de la subunidad pequeña del rubisco (rbcS) o de la ferredoxin NADP oxidoreductasa y también el de isopentenil pirofosfato isomerasa-2) o su equivalente funcional . Las secuencias de ácido nucleico de los tres casetes del péptido de tránsito de plástido de la transcetolasa plastidica del tabaco en tres marcos de lectura como fragmentos CPU/BamHl que tienen un codón de ATG en el sitio de desdoblamiento Ncol son particularmente preferidos: pTP09 pnI GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTT TTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTC CGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCG AAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC BamHI pTP IO KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCT CTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTT TTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTC CGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCG AAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC BamHI pTPl l pnI GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGT TCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTT TTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTC CGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCG AAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC BamHI Ejemplos adicionales de un péptido de tránsito plastldico son el péptido de tránsito del isopentenil pirofosfato isomerasa-2 plastidico (IPP-2) a partir de Arabisopsis thaliana y el péptido de tránsito de la subunidad pequeña del bifosfato de ribulosa carboxilasa (rbcS) de chícharo (Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) . Un cásete de expresión para proteínas extrañas objetivo dentro de los cloroplastos . Nucí. Acids Res. 16: 11380) . Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden prepararse sintéticamente u obtenerse naturalmente o comprender una mezcla de constituyentes de ácido nucleico sintéticos y naturales, y consistir de varias secciones de genes heterólogos de varios organismos. Como se describe anteriormente, se prefieren las secuencias de nucleótidos sintéticos con codones los cuales son de preferencia a partir de plantas. Estos codones preferidos a partir de plantas pueden identificarse a partir de codones con la frecuencia de proteínas más elevada, los cuales se expresan en las especies de plantas más interesantes . En la preparación de un cásete de expresión, varios fragmentos de ADN pueden manipularse con el fin de obtener una secuencia de nucleótidos la cual lee expedientemente en la dirección correcta y la cual se equipa con un marco de lectura correcto. Paxa la conexión de los fragmentos de ADN a otro, los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos . Expedientemente, el promotor y las regiones del terminador pueden proporcionarse en la dirección de transcripción con un enlazador o un polienlazador el cual comprende uno o más sitios de restricción para la inserción de esta secuencia. Como una regla, el enlazador tiene 1 a 10, usualmente 1 a 8, de preferencia 2 a 6, sitios de restricción. En general, el enlazador tiene, dentro de las regiones reguladoras, un tamaño menor de 100 pb, con frecuencia menos de 60 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser cualquier nativo u homólogo, o extraño o heterólogo a la planta huésped. El cásete de expresión comprende de preferencia en la dirección de transcripción 5' -3' del promotor, una secuencia de ácido nucleico de codificación o una construcción de ácido nucleico y una región para la terminación transcripcional . Varias regiones de terminación son mutuamente intercambiables a voluntad. Ejemplos de un terminador son el terminador 35S (Guerineau et al. (1988) Nucí Acids Res. 16:11380), el terminador nos (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. opaline synthase: trancript mapping and DNA sequence J Mol Appl Genet. 1982; l(6):561-73) o el terminador oes (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of t e TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5, EMBO J. 3:835-846). Además, las manipulaciones que hacen posible los sitios de desdoblamiento de restricción adecuados o remueven el ADN superfluo o los sitios de desdoblamiento de restricción pueden emplearse. En donde las inserciones, eliminaciones o sustituciones tales como por ejemplo, las transiciones y transversiones son posibles, la mutagénesis in vitro, "reparación cebadora", puede utilizarse la restricción o la ligación. Con las manipulaciones adecuadas, tales como por ejemplo, la restricción, "retro-masticación" o llenado de salientes para "extremos afilados", extremos complementarios de los fragmentos pueden estar disponibles para la ligación. Las señales de poliadenilación preferidas son señales de poliadenilación de plantas, de preferencia aquellas de las cuales corresponden esencialmente a señales de poliadenilación de T-ADN a partir de Agrobacterium tumefaciens, en particular del gen 3 del ADN-T (octopina sintasa) del plásmido Ti PTÍACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) o equivalentes funcionales. La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se llama transformación. Con este fin, los métodos conocidos per se para la transformación y la regeneración de plantas a partir de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados para la transformación de plantas son la transformación de protoplastos por la incorporación de ADN inducida por polietilenglicol, el proceso biolistico que utiliza el cañón de gen - el método de "bombardeo de partículas",- electroporación, la incubación de embriones secos en solución que contiene ADN, microinyección y transferencia genética, descrita anteriormente, mediada por Agrobacterium. Los procesos mencionados se describen por ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and ütilization, editada por S.D. Kung y R. Wu. Academic Press (1993), 128-143 y en Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) , 205-225) . De preferencia, la construcción que se expresa se clona en un vector el cual es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984), 8711) o de preferencia particular pSÜN2, pSUN3, pSÜN4 o pSUN5 (WO 02/00900). Las agrobacterias transformadas utilizando un plásmido de expresión pueden utilizarse en una manera conocida para la transformación de plantas, por ejemplo, lavando hojas dañadas o piezas de hojas en una solución de Agrobacteria y cultivando subsecuentemente en un medios adecuados . Para la producción preferida de plantas genéticamente modificadas, también llamadas plantas transgénicas posteriormente, el cásete de expresión combinado se clona en un vector, por ejemplo, pBinl9 o en particular pSUN5 y pSUN3, que es adecuado para transformarse en Agrobacterium tumefaciens. La agrobacteria transformada que utiliza tal vector puede entonces utilizarse en una manera conocida para la transformación de plantas, en particular de plantas de cultivos, por ejemplo, lavando hojas dañadas o piezas de hojas en una solución de Agrobacteria y cultivando subsecuentemente en un medios adecuados. La transformación de plantas por Agrobacteria se conoce, inter alia, a partir de F.F. hite, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editada por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. A partir de las células transformadas de las hojas dañadas o piezas de hojas, las plantas transgénicas pueden regenerarse en una manera conocida, la cual comprende uno o más genes integrados en el cásete de expresión. Para la transformación de una planta huésped que utiliza uno o más genes de incidencia de acuerdo con la invención, un cásete de expresión se incorpora dentro de un vector recombinante como una inserción cuyo ADN vector comprende señales de regulación funcionales adicionales, por ejemplo, secuencias para la replicación o la integración. Vectores adecuados se describen inter alia, en "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press) , Capitulo 6/7, pp . 71-119 (1993). Utilizar las técnicas de recombinación y clonación citadas anteriormente, los casetes de expresión pueden clonarse en vectores de expresión los cuales hacen posible su proliferación, por ejemplo, en E. coli. Los vectores de clonación adecuados son, inter alia, pJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucí. Acids Res. 16:11380), series pBR332, pUC, series M13mp y pACYC184. Particularmente adecuados son los vectores binarios, los cuales pueden replicar ambos en E. coli y en Agrobacteria . Posteriormente, a manera de ejemplo, la producción de microorganismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención que tiene actividad de cetolasa incrementada o producida y la actividad de ß-ciclasa incrementada o producida se describe en mayor detalle, la actividad de ß-ciclasa modificada producida por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia de SEC. DE IDENT. NO. 2.
El incremento de actividades adicionales, tales como por ejemplo, la actividad de hidroxilasa, la actividad de HMG-CoA reductasa, la actividad del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, la actividad del isopentenil difosfato ?-isomerasa, la actividad de la geranil difosfato sintasa, la actividad de farnesil difosfato sintasa, la actividad de la geranilgeranil difosfato sintasa, la actividad de fitoeno sintasa, la actividad de fitoeno desaturasa, la actividad de zeta-caroteno desaturasa, la actividad de crtISO, la actividad de FtsZ, y/o la actividad de MinD puede llevarse a cabo análogamente utilizando los genes de incidencia correspondientes. Los ácidos nucleicos descritos anteriormente, que codifican una cetolasa, ß-hidroxilasa o ß-ciclasa, y los ácidos nucleicos que codifican una HMG-CoA reductasa, los ácidos nucleicos que codifican un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, los ácidos nucleicos que codifican un isopentenil difosfato ?-isomerasa, los ácidos nucleicos que codifican una geranil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una farnesil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una geranilgeranil difosfato sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno sintasa, los ácidos nucleicos que codifican una fitoeno desaturasa, los ácidos nucleicos que codifican una zeta-caroteno desaturasa, los ácidos nucleicos que codifican una proteina crtISO, los ácidos nucleicos que codifican una proteina FtsZ y/o los ácidos nucleicos que codifican una proteina MinD se insertan de preferencia en las construcciones de expresión que comprenden, bajo el control genético de las secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima de acuerdo con la invención; y vectores que comprenden al menos una de estas construcciones de expresión. De preferencia, tales construcciones de acuerdo con la invención comprenden 5' -corriente arriba a partir de la secuencia de codificación respectiva, un promotor y Socorriente abajo de una secuencia terminadora y, si es apropiado, los elementos reguladores usuales adicionales, es decir, en cada caso enlazados operativamente con el gen de incidencia. Una "conexión operativa" se entiende como significando la disposición secuencial del promotor, la secuencia de codificación (gen de incidencia) , el terminador y, si es apropiado, los elementos reguladores adicionales de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueden cumplir su función en la expresión de la secuencia de codificación como se pretende. Ejemplos de secuencias operativamente enlazables son secuencias objetivo y mej oradores de traducción, mej oradores , señales de poliadenilación y similares. Los elementos reguladores adicionales comprenden marcadores seleccionables , señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Además de las secuencias de regulación artificiales, la secuencia de regulación natural puede presentarse aún antes del gen de incidencia actual. Por medio de la modificación genética, esta regulación natural puede, si es apropiado, desconectarse y la expresión de los genes incrementarse o disminuirse. La construcción genética sin embargo, puede ser también de una construcción más simple, es decir no se insertan señales de regulación adicionales antes del gen estructural, y el promotor natural con su regulación no se remueve. Independientemente de esto, la secuencia de regulación natural se muta de manera que la regulación no tiene lugar más y la expresión genética se incrementa o disminuye. Las secuencias de ácido nucleico pueden abarcarse en una o más copias en la construcción genética. Ejemplos de promotores u-tilizables en microorganismos son: eos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, lambda-PR-, o en el promotor lambda-PL los cuales se utilizan ventajosamente en bacterias gram-negativas ; y los promotores gram-positivos amy y SP02 o los promotores de levadura ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH. El uso de promotores inducibles se prefiere particularmente, tal como por ejemplo, promotores inducibles por luz y en particular por temperatura, tales como el promotor PrPi- En principio, todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación pueden utilizarse. Además, los promotores sintéticos pueden utilizarse ventajosamente. Las secuencias reguladoras deben realizar la expresión selectiva de las secuencias de ácido nucleico y la expresión de proteínas. Esto puede significar, por ejemplo, dependiendo del organismo huésped, que el gen se expresa o sobreexpresa sólo después de la inducción, o que se expresa inmediatamente lo se sobreexpresa. Las secuencias o factores reguladores pueden en este caso influenciar de preferencia positivamente la expresión y por consiguiente incrementarla o disminuirla. De este modo, una mejora de los elementos reguladores puede tener lugar ventajosamente en el nivel de transcripción utilizando señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o "mej oradores". Además, sin embargo, una mejora de la traducción es también posible por ejemplo, mejorando la estabilidad del ARNm. La producción de un cásete de expresión se lleva a cabo por fusión de un promotor adecuado con las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, codificando una cetolasa, una ß-hidroxilasa, una ß-ciclasa, una HMG-CoA reductasa, un (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, una l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, una 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, un isopentenil difosfato ?-isomerasa, una geranil difosfato sintasa, una farnesil difosfato sintasa, una geranilgeranil difosfato sintasa, una fitoeno sintasa, una fitoeno desaturasa, una zeta-caroteno desaturasa, una proteina crtISO, una proteina FtsZ y/o una proteina MinD y un terminador o una señal de poliadenilación. Con este fin, se utilizan técnicas de recombinación y clonación usuales, tal como se describen por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y también en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M., et al., Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987). La construcción del ácido nucleico recombinante o una construcción genética, por la expresión en un organismo huésped adecuado, se inserta ventajosamente dentro del vector especifico de huésped, el cual hace posible una expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son bien conocidos por la persona experimentada en la técnica y pueden inferirse, por ejemplo, a partir de "Cloning Vectors" (Pou els P.H. et al., Ed, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Los vectores aparte de los plásmidos, se entienden también como significando todos los otros vectores conocidos por la persona experimentada en la técnica, tal como por ejemplo, fagos, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN circular o lineal. Estos vectores pueden replicarse automáticamente en el organismo huésped o replicarse cromosomalmente. Ejemplos de vectores de expresión adecuados los cuales pueden mencionarse son: Los vectores de expresión de fusión usuales, tales como pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) en donde la glutation S-transferasa (GST) , la proteina de unión de maltosa E o la proteina A se fusionan a la proteina objetivo recombinante . Los vectores de expresión de proteínas sin fusión tales como pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al. Gene Expression Technology: ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89) o vectores pBluescript y pUC. Los vectores de expresión de levadura para la expresión en levadura S. cerevisiae, tal como pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Hersowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los vectores y procesos para la construcción de vectores los cuales son adecuados para uso en otros hongos, tales como hongo filamentoso, comprenden aquellos los cuales se describen en detalle en: van den Hondel, C.A.M.J.J & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungí, J.F. Peberdy et al., Eds . , S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. Los vectores de baculovirus, los cuales están disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf9) , comprenden la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)· y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39). Los sistemas de expresión adecuados adicionales para las células procarióticas y eucarióticas se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. , Fritsch, E.F. y maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Con la ayuda de las construcciones o vectores de expresión de acuerdo con la invención, los organismos genéticamente modificados pueden prepararse, los cuales se transforman, por ejemplo, utilizando al menos un vector de acuerdo con la invención. Venta osamente, las construcciones recombinantes de acuerdo con la invención descritas anteriormente se insertan dentro de un sistema huésped adecuado y se expresan. En esta conexión, los métodos de clonación y transfección familiares conocidos de preferencia por la persona experimentada en la técnica, tales como por ejemplo la co-precipitación, la fusión de protoplastos, la electroporación, la transfección retroviral y similares, con el fin de expresar tales ácidos nucleicos en el sistema de expresión respectiva. Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., iley Interscience, New York 1997. La selección de organismos exitosamente transformados puede llevarse a cabo por genes marcadores los cuales están comprendidos asi mismo en el vector o en el cásete de expresión. Ejemplos de tales genes marcadores son genes para resistencia antibiótica y para enzimas que catalizan una reacción de coloración, la cual provoca una tensión de la célula transformada. Estos pueden seleccionarse entonces por medio de clasificación celular automática. Los microorganismos transformados exitosamente que utilizan un vector, los cuales portan un gen de resistencia apropiado al antibiótico (por ejemplo G418 o higromicina ) pueden seleccionarse por medio de medios que comprenden antibióticos apropiados o medios de nutrientes. Las proteínas marcadoras las cuales se presentan en la superficie celular pueden utilizarse para la selección por medio de cromatografía por afinidad. La combinación de los organismos huéspedes y los vectores adecuados para los organismos, tales como plásmidos, virus o fagos, tales como por ejemplo plásmidos que tienen el sistema de polimerasa/promotor de ARN, los fagos 8 u otros fagos moderados o transposones y/u otras secuencias reguladoras ventajosas, forman un sistema de expresión. La invención se relaciona además a los organismos no humanos genéticamente modificados, en donde la modificación genética A para el caso en donde el organismo de tipo silvestre ya tiene una actividad de cetolasa, incrementa la actividad de cetolasa comparada al tipo silvestre y B para el caso en donde el organismo de tipo silvestre no tiene actividad de cetolasa, provoca la actividad de una cetolasa comparada al tipo silvestre, y en donde la modificación genética C para el caso en donde el organismo de tipo silvestre tiene ya una actividad de ß-ciclasa, incrementa la actividad de una ß-ciclasa comparada al tipo silvestre y D para el caso en donde el organismo de tipo silvestre no tiene actividad de ß-ciclasa, provoca la actividad de una ß-ciclasa comparada al tipo silvestre y la actividad de ß-ciclasa incrementada de acuerdo a C o producida de acuerdo a D se produce por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. Como se explica anteriormente, el incremento (de acuerdo a A) o la producción (de acuerdo a B) de la actividad de cetolasa comparada al tipo silvestre tiene lugar de preferencia por el incremento de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa. En una modalidad preferida adicional, el incremento de la expresión genética del ácido nucleico que codifica una cetolasa se lleva a cabo insertando los ácidos nucleicos los cuales codifican cetolasas dentro del organismo. En los organismos transgénicos de acuerdo con la invención, en esta modalidad comparada al tipo silvestre a al menos un gen cetolasa adicional se presenta de este modo. En esta modalidad, el organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención tiene de preferencia al menos un ácido nucleico exógeno (= heterólogo) que codifica una cetolasa, o tiene al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una cetolasa: Con este fin, en principio cualquier gen cetolasa, es decir cualesquiera ácidos nucleicos que codifican una cetolasa, pueden utilizarse. Los ácidos nucleicos preferidos que codifican una cetolasa se describen anteriormente en el proceso de acuerdo con la invención. De preferencia, el incremento o producción de una actividad de ß-ciclasa, como se describe anteriormente, se lleva a cabo incrementando la expresión genética comparada al tipo silvestre de ácidos nucleicos que codifican una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. En una modalidad preferida, el incremento de la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa para la inserción dentro del organismo de al menos un ácido nucleico que codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2. En los organismos transgénicos de acuerdo con la invención, en esta modalidad al menos un gen ß-ciclasa adicional se presenta de este modo comparado al tipo silvestre. En esta modalidad, el organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención tiene de preferencia al menos un ácido nucleico exógeno (= heterólogo) que codifica una ß-ciclasa, o al menos dos ácidos nucleicos endógenos que codifican una ß-ciclasa. Con este fin, en principio cualquier gen ß-ciclasa, es decir cualquier ácido nucleico el cual codifica una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2, puede utilizarse. Los genes ß-ciclasa preferidos se describen anteriormente . Los organismos genéticamente modificados particularmente preferidos como se menciona anteriormente, tienen adicionalmente una actividad de hidroxilasa incrementada o producida comparada al organismo de tipo silvestre. Las modalidades preferidas adicionales se describen anteriormente en el proceso de acuerdo con la invención. Además, los organismos no humanos genéticamente modificados, particularmente preferidos como se menciona anteriormente, tienen adicionalmente, comparados al tipo silvestre, al menos una actividad incrementada adicional, seleccionada a partir del grupo que consiste de la actividad de HMG-CoA reductasa, la actividad del (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa, la actividad de l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato sintasa, la actividad de la l-desoxi-D-xilosa-5-fosfato reductoisomerasa, la actividad del isopentenil difosfato ?-isomerasa, la actividad de la geranil difosfato sintasa, la actividad de la farnesil difosfato sintasa, la actividad de la geranilgeranil difosfato sintasa, la actividad de la fitoeno sintasa, la actividad de fitoeno desaturasa, la actividad de zeta-caroteno desaturasa, la actividad de crtISO, la actividad de FtsZ y la actividad de MinD. Se describen modalidades preferidas adicionales anteriormente en el proceso de acuerdo con la invención. Se entienden los organismos de acuerdo con la invención de preferencia como significando organismos los cuales, como el organismo de tipo silvestre o de partida, naturalmente o por complementación genética y/o re-regulación de las trayectorias metabólicas están en la posición para producir carotenoides , en particular ß-caroteno y/o zeaxantina y/o neoxantina y/o violaxantina y/o luteina. Los organismos preferidos adicionales, como los organismos de tipo silvestre o de partida, tienen ya una actividad de hidroxilasa y de este modo están en la posición, como los organismos de tipo silvestre o de partida, para producir zeaxantina. Los organismos preferidos son plantas o microorganismos tales como por ejemplo, bacterias, levaduras, algas u hongos. Las bacterias utilizadas pueden ser cualesquier bacterias las cuales, por motivos de la inserción de genes de la biosintesis de carotenoides de un organismo que produce carotenoides, están en la posición para sintetizar xantofilas, tales como por ejemplo, bacterias del género Escherichia, las cuales por ejemplo, comprenden genes crt a partir de Erwinia, también bacterias las cuales por si mismas están en la posición para sintetizar xantofilas, tales como por ejemplo, bacterias del género Erwinia , Agrobacterium, Flavobacteriumr Alcaligenes, Paracoccus , Nostoc o cianobacterias del género Synechocystxs. Las bacterias preferidas son Escherichia coli r Erwinia herbicola , Erwinia uredovora , Agrobacterium aurantiacum, Alcaligenes sp. PC-1, cepa R1534 Flavobacterium sp., la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803, Paracoccus arcusii o Paracoccus caroteneifaciens. Las levaduras preferidas son Candida, Saccharomyces , Hansenula , Pichia o Phaffia. Las levaduras particularmente preferidas son Xanthophyllomyces dendrorhous o Phaffia rhodozy a. Los hongos preferidos son Aspergillus, Trichoderma , Ashbya , Neurospora , Blakeslea, en particular Blakeslea trispora , Phycomyces , Fusarium u hongos adicionales descritos en Indian Chem. Engr. Sección B. Vol . 37, No. 1, 2 (1995) en la página 15, Tabla 6. Las algas preferidas son algas verdes, tales como por ejemplo, algas del género Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox o Dunaliella . Las algas particularmente preferidas son Haematococcus puvialis o Dunaliella bardawil . Los microorganismos utilizables y su producción para llevar a cabo el proceso de acuerdo con la invención se conocen, por ejemplo, a partir de DE-A-199 16 140, a la cual se hace referencia en la presente. Las plantas particularmente preferidas son plantas seleccionadas a partir de las familias Amaranthaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Balsaminaceae, Begoniaceae, Berberidaceae, Brassicaceae, Cannabaceae, Caprifoliaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Cruciferae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Graminae, Illiaceae, Labiatae, Lamiaceae, Leguminosae, Liliaceae, Linaceae, Lobeliaceae, Malvaceae, Oleaceae, Orchidaceae, Papave aceae, Plumbaginaceae, Poaceae, Polemoniaceae, Primulaceae, Ranunculaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tropaeolaceae, Umbelliferae, Verbanaceae, Vitaceae y Violácea. Plantas muy particularmente preferidas se seleccionan a partir del grupo que consiste del género de plantas Marigold, Tagetes errecta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Arnica, Aquilegia, Aster, Astragalus, Bignonia , Caléndula , Caltha, Campánula , Canna , Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthe um, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita , Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus , Dimorphotheca , Doronicum, Eschscholtzia , Forsythia , Fremontia, Gazania , Gelsemium, Genista , Gentiana , Geranium, Gerbera , Geum, Grevillea , Helenium, Helianthus, Hepática , Heracleum, Hisbiscus, Heliopsis, Hypericum , Hypochoeris, Impatiens, Iris, Jacaranda , Kerria, Laburnum, Lathyrus , Leontodón, Lilium, Linum, Lotus, Lycop rsicon, Lysimachia , Maratia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera , Osmanthus, Petunia, Photinia , Physalis, Phyteuma, Potentilla, Pyracantha, Ranunculus , Rhododendron , Rosa, Rudbeckia , Senecio, Silener Silphiumr Sinapsis r Sorbusr Spartium, Tecoma r Torenia, Tragopogón , Trolliusr Tropaeolum , Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola o Zinnia, seleccionadas particularmente a partir del grupo que consiste del género Clavelón, Tagetes erecta, Tagetes patula, Lycopersicon, Rosa, Caléndula, Physalis, Medicago, Helianthus, Crisantemo, Áster, Tulipán, Narciso, Petunia, Geranio, Tropaeolum o Adonis. Las plantas genéticamente modificadaes muy particularmente preferidas se seleccionan a partir del grupo del género de planta Clavelón, Tagetes erecta, Tagetes patula, Adonis, Lycopersicon, Rosa, Caléndula, Physalis, Medicago, Helianthus, Crisantemo, Áster, Tulipán, Narciso, Petunia, Geranio o Tropaeolum, la planta genéticamente modificada que comprende al menos un ácido nucleico transgénico que codifica una cetolasa. Las plantas transgénicas, su material reproductivo, y sus células, tejidos o partes de la planta, en particular su fruto, semillas, flores y pétalos de flores son un objeto adicional de la presente invención. Las plantas genéticamente modificadas pueden, como se describe anteriormente, utilizarse para la producción de cetocarotenoides , en particular astaxantina. Los organismos genéticamente modificados de acuerdo con la invención consumibles por seres humanos y animales, en particular plantas o partes de la planta, tales como en particular, pétalos · de flores que tienen un contenido incrementado de cetocarotenoides, en particular astaxantina, pueden utilizarse también, por ejemplo, directamente o después del procesamiento conocido per se como alimentos o forrajes o como comida y suplementos alimenticios. Además, los organismos genéticamente modificados pueden utilizarse para la producción de extractos que contienen cetocarotenoides de los organismos ylo para la producción de comida y suplementos alimenticios. Los organismos genéticamente modificados tienen, en comparación con el tipo silvestre, un contenido incrementado de cetocarotenoides. Un contenido incrementado de cetocarotenoides es una regla entendida como significando un contenido incrementado de cetocarotenoides totales. Un contenido incrementado de cetocarotenoides se entiende también sin embargo en particular, como significando un contenido modificado de los cetocarotenoides preferidos, sin el contenido de carotenoides total teniendo inevitablemente que incrementarse. En una modalidad particularmente preferida, las plantas genéticamente modificadas de acuerdo con la invención tienen un contenido incrementado de astaxantina en comparación con el tipo silvestre. Un contenido incrementado en este caso se entiende también como significando un contenido producido de cetocarotenoides, o astaxantina. La invención se ilustra por los ejemplos los cuales siguen ahora, pero se restringen a estos: Condiciones experimentales generales: Análisis de secuencia del ADN recom inante La secuenciación de las moléculas del ADN recombinante se llevan a cabo utilizando un secuenciador de ADN de fluorescencia de láser a partir de Licor (comercializado por MWG Biotech, Ebersbach) de acuerdo al método de Sanger (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74 (1977) , 5463-5467) . Ejemplo 1: Amplificación de un ADN el cual codifica la secuencia primaria entera de la cetolasa NOST a partir de Nostoc sp. PCC 7120 El ADN que codifica para la cetolasa NOST a partir de Nostoc sp. PCC 1120 se amplificó por medio de PCR de Nostoc sp. PCC 7120 (cepa de la "colección de Cultivo Pasteur de Cianobacteria") . Para la preparación del ADN genómico a partir del cultivo de suspensión de Nostoc sp. PCC 7120, el cual se ha cultivado durante 1 semana con iluminación continua y agitación constante (150 rpm) a 25°C en un medio BG 11 (1.5 g/1 de NaN03, 0.04 g/1 de K2P04x3H20, 0.075 g/1 de MgS04xH20, 0.036 g/1 de CaCl2x2H20, 0.006 g/1 de ácido cítrico, 0.006 g/1 de citrato de amonio férrico, 0.001 g/1 de EDTA de magnesio-disodio, 0.04 g/1 de NA2C03, 1 mi de mezcla de metal de traza "A5+Co" (2.86 g/1 de H3B03, 1.81 g/1 de MnC12x4H2o, 0.222 g/1 de ZnS04x7H2o, 0.39 g/1 de NaMo04X2H20, 0.079 g/1 de CuS04x5H20, 0.0494 g/1 de Co (N03) 2x6H20) ) , las células se cosecharon por centrifugación, se congelaron en nitrógeno líquido y se pulverizaron en un mortero. El protocolo para el aislamiento de ADN a partir de Nostoc PCC7120: Las células bacteriales a partir de 10 mi de cultivo líquido se granularon por centrifugación a 8000 rpm durante 10 minutos. Subsecuentemente, las células bacteriales se pulverizaron y molieron en un nitrógeno líquido utilizando un mortero. El material celular se volvió a suspender en 1 mi de 10 mM de Tris HC1 (pH 7.5) y se transfirieron en un recipiente de reacción Eppendorf (2 mi de volumen) . Después de la adición de 100 µ? de proteinasa K (concentración: 20 mg/ml) , la suspensión celular se incubó durante 2 horas a 37°C. Subsecuentemente, la suspensión se extrajo utilizando 500 µ? de fenol. Después de la centrifugación a 13, 000 rpm durante 5 minutos, la fase acuosa superior se transfirió a un nuevo recipiente de reacción Eppendorf de 2 mi. La extracción con fenol se repitió 3 veces. El ADN se precipitó por la adición de un volunen 1/10 de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y un volumen 0.6 de isopropanol y se lavó subsecuentemente con 70% de etanol . El gránulo de ADN se secó a temperatura ambiente, se tomó en 25 µ? de agua y se disolvió a 65°C con calentamiento . El ácido nucleico que codifica una cetolasa a partir de Nostoc PCC 7120 se amplificó por medio de ""reacción en cadena de polimerasa" (PCR) a partir de Nostoc sp. PCC7120 utilizando un cebador especifico sentido (NOSTF, SEC. DE IDENT. NO. 79) y un cebador especifico antisentido (NOSTG SEC. DE IDENT. NO. 80) . Se utilizaron condiciones de PCR como sigue: La PCR para la amplificación del ADN la cual codifica para una proteina cetolasa que consiste de la secuencia primaria entera se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendió: - 1 ul de un ADN Nostoc sp. PCC 7120 (preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de NOSTF (SEC. DE IDENT. NO. 79) - 0.2 mM de NOSTG (SEC. DE IDENT. NO. 80) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TAKARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TAKARA) - 25.8 ul de agua destilada Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: IX 94 °C 2 minutos 35X 94°C 1 minuto 550C 1 minuto 72 °C 3 minutos 1X72 °C 10 minutos La amplificación de PCR con la SEC. DE IDENT. NO. 79 y la SEC. DE IDENT. NO. 80 resulta en un fragmento de 805 pb, el cual codifica para una proteina que consiste de una secuencia primaria entera (SEC. DE IDENT. NO. 81) . Al utilizar los métodos estándares, el amplificado se clonó en el vector de clonación de PCR pGEM-T (Promega) y se obtuvo el clon pNOSTF-G. La secuenciacion del clon pNOSTF-G que utiliza M13F y el cebador M13R confirma una secuencia la cual es idéntica con la secuencia de ADN de 88, 886-89, 662, de la entrada de base de datos AP003592. Esta secuencia de nucleótidos se reprodujo en un experimento de amplificación independiente y de este modo representa la secuencia de nucleótidos en el Nostoc sp. PCC 7120 utilizado. Este clon pNOSTF-G se utilizó por lo tanto para la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucí. Acids Res. 16:11380). La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Sphl de 799 pb a partir de pNOSTF-G y la ligación en el vector desdoblado Sphl pJIT117. El clon el cual comprende la cetolasa de Nostoc sp.
PCC 1120 en la orientación correcta como una fusión de traducción N-terminal con el péptido de tránsito rbcS se llama pJNOST. Ejemplo 2: Construcción del plásmido pMCL-CrtYIBZ/idi/gps para la síntesis de la zeaxantina en E. coli La construcción de pMCL-CrtYIBZ/idi/gps se llevó a cabo en tres etapas a través de las etapas intermedias pMCL-CrtYIBZ y pMCL-CrtYIBZ/idi . Como un vector, el plásmido pMCL200 compatible con vectores de número de copias se utilizó (Nakano, Y., Yoshida, Y., Yamashita, Y y Koga, T.; Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors; Gene 162 (1995), 157-158). Ejemplo 2.1.: Construcción de pMCL-CrtYIBZ Los genes de biosíntesis crtY, crtB, crtl y crtZ se originaron de la bacteria Erwinia uredovora y se amplificaron por medio de PCR. El ADN genómico a partir de Erwinia uredovora (DSM 30080) se preparó por la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Brunswick) en una unidad de servicio. La reacción de PCR se llevó a cabo de acuerdo a los detalles del fabricante (Roche, Long Témplate PCR: Procedure for amplification of 5-20 kb targets wit the expand long témplate PCR system) . Las condiciones de PCR para la amplificación del grupo de biosíntesis de Erwinia uredovora fue como sigue: Mezcla Maestra 1: - 1.75 ul de dNTPs (concentración final 350 µ?) - 0.3 µ? del cebador Crtl (SEC. DE IDENT. NO. 82) - 0.3 µ? del cebador Crt2 (SEC. DE IDENT. NO. 83) - 250 - 500 ng del ADN genómico de DSM 30080 Agua destilada hasta un volumen total de 50 µ? Mezcla Maestra 2: - 5 ul de tampón 1 lOx de PCR (concentración final lx, que comprende 1.75 mM de Mg2+) - tampón 2 lOx de PCR (concentración final lx, que comprende 2.25 mM de Mg2+ ) tampón 3 lOx de PCR (concentración final lx, que comprende 2.25 mM de Mg2+) - 0.75 ul de Mezcla de Enzima de Plantilla Larga Expandida (concentración final 2.6 unidades) agua destilada hasta un volumen total de 50 µ? Los dos lotes "Mezcla Maestra 1" y "Mezcla Maestra 2 " se pipetearon juntos. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 ul bajo las siguientes condiciones del ciclo: 1X94 °C 2 minutos 30X94 °C 30 segundos 58 °C 1 minuto 68 °C 4 minutos 1X72 °C 10 minutos La amplificación de PCR con la SEC. DE IDENT. NO. 82 y la SEC. DE IDEN . NO. 83 resultó en un fragmento (SEC. DE IDENT . NO. 84), la cual codifica para los genes CrtY (proteina: SEC. DE IDENT. NO. 85), CrtI (proteina: SEC. DE IDENT. NO. 86), crtS (proteina: SEC. DE IDENT. NO. 87) y CrtZ (iDNA) . Se utilizaron métodos estándares, se clonó el amplificado en el vector de clonación PCR pCR2.1 (Invitrogen) y el clon pCR2.1-CrtYIBZ se obtuvo. El plásmido pCR2.1-CrtYIBZ se desdobló por Salí y HindIII, los fragmentos resultantes SalI/HindIII se aislaron y transfirieron por ligación al vector desdoblado SalI/HindIII pMCL200. El fragmento SalI/HindIII a partir de pCR2.1-CrtYIBZ clonado en pMCL 200 es 4624 pb de largo, los códigos para los genes Crtr, CrtI, crtB y CrtZ y corresponde a la secuencia de la posición 2295 a 6918 en D90087 (SEC. DE IDENT. NO. 84). El gen CrtZ se transcribe contra la dirección de lectura de los genes CrtY, CrtI y CrtB por medio de su promotor endógeno. El clon resultante se llama pMCL-CrtYIBZ . Ejemplo 2.2: Construcción de pMCL-CrtYIBZ/idi El gen idi (fosfato de isopentenil isomerasa; IPP isomerasa) se amplificó a partir de E. coli por medio de PCR. El ácido nucleico gue codifica el gen idi entero con el promotor idi y el sitio de unión de ribosoma se amplificó a partir de E. coli por medio de la "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) utilizando un cebador especifico sentido (5' -idi SEC. DE IDENT. NO. 88) y un cebador especifico antisentido (3'-idi SEC. DE IDENT. NO. 89). Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 µ?, en donde se comprendió: - 1 ul de una suspensión E. coli TOP10 - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de 5'-idi (SEC. DE IDENT. NO. 88) - 0.2 mM de 3'-idi (SEC. DE IDENT. NO. 89) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TARARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TARARA) - 28.8 ul de agua destilada La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1x94 °C 2 minutos 20X94 °C 1 minuto 62 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 1X72°C 10 minutos La amplificación de PCR con la SEC. DE IDENT. NO. 88 y la SEC. DE IDENT. NO. 89 resultó en un fragmento de 679 pb el cual codifica para una proteina que consiste de una secuencia primaria entera (SEC. DE IDENT. NO. 90) . Al utilizar métodos estándares, se clonó el amplificado en el vector de clonación de PCR pCR2.1 (Invitrogen) y se obtuvo el clon pCR2.1-idi.
La secuenciación del clon pCR2.1-idi confirma una secuencia la cual no difirió de la secuencia publicada AE000372 en la posición 8774 a la posición 9440. Esta región comprende la región promotora, el sitio de unión de ribosoma potencial y el "marco de lectura abierto" entero para la IPP isomerasa. El fragmento clonado en pCR2.1-idi tiene, debido a la inserción de un sitio de desdoblamiento Xhol en el extremo 5' y un sitio de desdoblamiento Salí en el extremo 3' del gen idi, una longitud total de 679 pb. Este clon se utilizó por lo tanto para la clonación del gen idi en el vector pMCL-CrtYIBZ . La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Xhol/Sall a partir de pCR2.1-idi y la ligación en el vector desdoblado Xhol/Sall pMCL-CrtYIBZ . El clon resultante se llama pMCL-CrtYIBz/idi . Ejemplo 2.3: Construcción de pMCL-CrtYIBZ/idi/gps El gen gps (geranilgeranil pirofosfato sintasa; GGPP sintasa) se amplificó a partir de Archaeglobus fulgidus por medio de PCR. El ácido nucleico que codifica gps a partir de Archaeoglobus fulgidus se amplificó por medio de "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) utilizando un cebador especifico sentido (5' -gps SEC. DE IDENT. NO. 92) y un cebador especifico antisentido (3' -gps SEC. DE IDENT. NO. 93) . El ADN a partir de Archaeoglobus fulgidus se preparó por la Colección Alemana de Microorganismos y los Cultivos Celulares (/DSMZ, Brunswick) en una unidad de servicio. Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN, la cual codifica para una proteina GGPP sintasa que consiste de la secuencia primaria entera se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 µ? en donde se comprendió: - 1 ul de un ADN Archaeoglobus fulgidus - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de 5'-gps (SEC. DE IDENT . NO. 92) - 0.2 mM de 3'-gps (SEC. DE IDENT. NO. 93) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TARARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TARARA) - 28.8 ul de agua destilada La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1x94 °C 2 minutos 20X94°C 1 minuto 56°C 1 minuto 72 °C 1 minuto 1X72°C 10 minutos El fragmento de ADN por medio de la PCR y los cebadores SEC. DE IDENT. NO. 92 y la SEC. DE IDENT. NO. 93 se eluyó a partir del gel de agarosa utilizando métodos conocidos per se y se desdobló utilizando las enzimas de restricción Ncol y HindIII. A partir de esto, un fragmento de 962 pb resultó, el cual codifica para una proteina que consiste de la secuencia primaria entera (SEC. DE IDENT. NO. 94). Al utilizar métodos estándares, se clonó el amplificado desdoblado NcoI/HindIII en el vector pCB97-30 y se obtuvo el clon pCB-gps . La secuenciación del clon pCB-gps confirma una secuencia para la GGPP sintasa a partir de A. fulgidus la cual difiere a partir de la secuencia publicada AF120272 en un nucleótido. Por la inserción de un sitio de desdoblamiento Ncol en el gen gps, el segundo codón de la GGPP sintasa se modificó. En la secuencia publicada AF120272, los códigos CTG (posición 4-6) para leucina. Por medio de la amplificación con los dos cebadores SEC. DE IDENT. NO. 92 y la SEC. DE IDENT. NO. 93, este segundo codón en GTG, el cual codifica para valina, se modificó. El clon pCB-gps se utilizó por lo tanto para la clonación del gen gps en el vector pMCL-CrtYIBZ/idi . La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Kpnl/Xhol a partir de pCB-gps y la ligación en el vector desdoblado Kpnl y Xhol pMCL-CrtYIBZ/idi . El fragmento Kpnl/Xhol clonado (SEC. DE IDENT. NO. 94) transporta el promotor Prrnl6 junto con una secuencia 5'-ÜTR minima de rbcL, los primeros 6 codones de rbcL, los cuales prolongan la GGPP sintasa N-terminalmente, y 3r a partir del gen gps ña secuencia psbA. El término N de la GGPP sintasa de este modo, tiene en lugar la secuencia de aminoácidos naturales con Met-Leu-Lys-Glu (aminoácido 1 a 4 de AF120272), la secuencia de aminoácidos modificada Met-Thr-Pro-Gln-Thr-Ala-Met-Val-Lys-Glu. Resulta a partir de esto que la GGPP sintasa recombinante, empezando con Lys en la posición 3 (en AF120272) es idéntica y no tiene modificaciones adicionales en la secuencia de aminoácidos. Las secuencias rbcL y psbA se utilizaron como en una referencia a Eibl et al. (Plant J. 19. (1999), 1-13). El clon resultante se llama pMCL-CrtYIBZ/idi/gps. Ejemplo 3: Biotransformación de zeaxantina en las cepas E. coli recombinante Para la biotransformación de zeaxantina, se producen las cepas E. coli recombinantes las cuales se equipan para producción de zeaxantina por complementación heteróloga. Las cepas de E. coli TOP10 se utilizaron como células huéspedes para los experimentos de complementación con los plásmidos pNOSTF-G y pMCL-CrtYIBZ/idi/gps . Con el fin de producir cepas E. coli las cuales hacen posible la síntesis de zeaxantina en concentración elevada, se construyó el plásmido pMCL-CrtYIBZ/idi/gps . El plásmido porta los genes de biosíntesis crtYr crtBr crtl y crtY de Erwinia uredovora, el gen gps (para la geranilgeranil pirofosfato sintastasa) de Archaeoglobus fulgidus y el gen idi (isopentenil fosfato isomerasa) de E. coli. Con esta construcción, las etapas limitantes para una acumulación elevada de carotenoides y sus precursores biosintéticos se eliminaron. Esto se ha descrito de antemano por Wang et al., en una manera similar utilizando varios plásmidos (Wang, C.~ W., Oh, M.-K. y Liao, J.C.; Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthin production in Escherichia coli, Biotechnology and Bioengineering 62 (1999), 235-241). Los cultivos de E.coli TOP10 se transformaron en una manera conocida per se con los dos plásmidos pNOSTF-G y pMCL-CrtYIB/idi/gps y se cultivaron durante la noche en el medio LB a 30 °C o 37 °C. Se agregaron asi mismo ampicilina (50 g/ml) , cloranfenicol (50 yg/ml) e isopropil ß-tiogalactosida (1 mmol) durante la noche en una manera habitual per se. Para el aislamiento de los carotenoides a partir de las cepas recombinantes , las células se extrajeron con acetona, el solvente orgánico se evaporó a sequedad y los carotenoides se separaron por medio de HPLC en una columna C30. Se establecieron las siguientes condiciones del proceso. Columna de separación: columna Prontosil C30, 250 x 4.6 mm (Bischoff, Leonberg) Velocidad de flujo: 1.0 ml/min Eluyentes: Eluyente ? - 100% de metanol .Eluyente B - 80% de metanol, 0.2% de acetato de amonio Eluyente C - 100% de t-butil metiléter Detección: 300 - 500 nm Se determinaron los espectros directamente a partir de los picos de elución utilizando un detector de disposición de fotodiodo. Se identificaron sustancias aisladas por medio de sus espectros de absorción y sus tiempos de retención en comparación con las muestras estándares. Ej emplo 4 Análogamente a los ejemplos previos, se preparó una cepa E. coli la cual expresa una cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis Flotow em. Wille. Con este fin, el ADNc el cual codifica para la secuencia primaria entera de la cetolasa a partir de JTaejaatococcus pluvialis Flotow em. Wille se amplificó y clonó en el mismo vector de expresión como en el Ejemplo 1. El ADNc, el cual codifica para la cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis se amplificó por medio de PCR de un cultivo de suspensión Haematococcus pluvialis (cepa 192.80 de "Collection of algal cultures of the üniversity of Góttingen") . Para la preparación del ARN total a partir de un cultivo de suspensión de Haematococcus pluvialis (cepa 192.80), la cual se ha cultivado durante 2 semanas con luz del día indirecta a temperatura ambiente en un medio de Haematococcus (1.2 g/1 de acetato de sodio, 2 g/1 de extracto de levadura, 0.2 g/1 de MgC12x6H20, 0.02 de CaC12x2H20; pH 6.8; después de la adición de auto-clave de 400 mg/1 de L-asparagina, 10 mg/1 de FeS04xH20) , las células se cosecharon, se congelaron en nitrógeno liquido y se pulverizaron en el mortero. Subsecuentemente, 100 mg de las células pulverizadas, congeladas se transfirieron a un recipiente de reacción y se. tomaron en 0.8 mi de tamón Trizol (LifeTechnologies ) . La suspensión se extrajo con 0.2 mi de cloroformo. Después de la centrifugación a 12 000 g durante 15 minutos, el sobrenadante acuoso se removió y se transfirió a un nuevo recipiente de reacción y se extrajo con un volumen de etanol. El ARN se precipitó con un volumen de isopropanol, se lavó con 75% de etanol y el gránulo se disolvió en. agua DEPC (incubación durante la noche de agua con 1/1000 volumen de pirocarbonato de dietilo a temperatura ambiente, subsecuentemente de auto-clave) . La concentración de ARN se determinó fotométricamente . Para la síntesis de ADNc, 2.5 pg de ARN total se desnaturalizó durante 10 minutos a 60 °C, se enfrió durante 2 minutos en hielo y se transcribió en ADNc por medio de un equipo de ADNc (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un cebador PRl especifico antisentido (gcaagctcga cagctacaaa ce) . El ácido nucleico que codifica una cetolasa a partir de Haematococcus pluvialis (cepa 192.80) se amplificó por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de Haematococcus pluvialis utilizando un cebador PR2 especifico sentido (gaageatgea gctagcagcgacag) y un cebador PRl especifico antisentido. Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADNc la cual codifica para una proteina cetolasa que consiste de la secuencia primaria total se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 mi, en donde se comprendió: - 4 mi de un ADNc Haematococcus pluvialis (preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de PRl - 0.2 mM de PR2 - 5 mi de tampón 10X de PCR (TARARA) - 0.25 mi de R Taq polimerasa (TAKARA) - 25.8 mi de agua destilada La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1x94 °C 2 minutos 35X94 °C 1 minuto 53 °C 1 minuto 72 °C 3 minuto 1X72 °C 10 minutos La amplificación de PCR con PR1 y PR2 resultó en un fragmento de 1155 pb el cual codifica para una proteina que consiste de la secuencia primaria entera: gaagcatgca gctagcagcg acagtaatgt tggagcagct taccggaagc gctgaggcac 60 tcaaggagaa ggagaaggag gttgcaggca gctctgacgt gttgcgtaca tgggcgaccc 120 agfcactcgct tccgtcagag gagtcagacg cggcccgccc gggactgaag aatgcctaca 180 agccaccacc ttccgacaca aagggcatca caatggcgct agctgtcatc ggctcctggg 240 ccgcagtgtt cctccacgcc atttttcaaa tcaagcttcc gacctccttg gaccagctgc 300 actggctgcc cgtgtcagat gccacagctc agctggttag cggcagcagc agcctgctgc 360 acatcgtcgt agtattcttt gtcctggagt tcctgtacac aggccttttt atcaccacgc 420 atgatgctat gcatggcacc atcgccatga gaaacaggca gcttaatgac ttcttgggca 480 gagtatgcat ctccttgtac gcctggtttg attacaacat gctgcaccgc aagcattggg 540 agcaccacaa ccacactggc gaggtgggca aggaccctga cttccacagg ggaaaccctg 600 gcattgtgcc ctggtttgcc agcttcatgt ccagctacat gtcgatgtgg cagtttgcgc 660 gcctcgcatg gtggacggtg gtcatgcagc tgctgggtgc gccaatggcg aacctgctgg 720 tgttcatggc ggccgcgccc atcctgtccg ccttccgctt gttctacttt ggcacgtaca 780 tgccccacaa gcctgagcct ggcgccgcgt caggctcttc accagccgtc atgaactggt 840 ggaagtcgcg cactagccag gcgtcegacc tggtcagctt tctgacctgc taccacttcg 900 acctgcactg ggagcaccac cgctggccct ttgccccctg gtgggagctg cccaactgcc 960 gccgcctgtc tggccgaggt ctggttcctg cctagctgga cacactgcag tgggccctgc 1020 tgccagctgg gcatgcaggt tgtggcagga ctgggtgagg tgaaaagctg caggcgctgc 1080 tgccggacac gctgcatggg ctaccctgtg tagctgccgc cactagggga gggggtttgt 1140 agctgtcgag cttgc Al utilizar los métodos estándares, se clonó el amplificado en el vector de clonación de PCR pGE -Teasy (Promega) y el clon pGKET02 se obtuvo. La secuenciación del clon pGKET02 con T7 y el cebador SP6 confirmó una secuencia la cual difiere solamente en tres codones 73, 114 y 119 en una base cada una de la secuencia X86782 publicada. Estos intercambios de nucleótido se reprodujeron en un experimento de amplificación independiente y de este modo representan la secuencia de nucleótido en la cepa Haematococcus píuvialis 192.80 utilizada . Este clon se utilizó para la expresión de la cetolasa de Haematococcus píuvialis. La transformación de las cepas E. coli, su cultivo y el análisis del perfil de carotenoides se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3. La Tabla 1 muestra una comparación de las cantidades de carctenoides producidas bacterialmente : Tabla 1: Comparación de la síntesis de cetocarotenoides bacteriales cuando utilizan dos diferentes cetolasas, la cetolasa NOST de Nostoc sp. PCC7120 (Ejemplo 1) y la cetolasa a partir de Haematococcus píuvialis (Ejemplo 4) . Cantidades de carotenoides se indican en ng/ml de fluido de cultivo.
Ejemplo 5: Amplificación de un ADN el cual codifica la secuencia primaria total de la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 El ADN, el cual codifica para la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 se amplificó por medio de PCR a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 (cepa de "American Type Culture Collection"). Para la preparación del ADN genómico a partir de un cultivo de suspensión de Nostoc punctiforme ATCC 29133, el cual se había cultivo durante 1 semana con iluminación continua y agitación constante (150 rpm) a 25°C en un medio BG 11 {1.5 g/1 de NaN03, 0.04 g/1 de K2P04x3H20, 0.075 g/1 de MgS04xH20, 0.036 g/1 de CaCl2x2H20, 0.006 g/1 de ácido cítrico, 0.006 g/1 de citrato de amonio férrico, 0.001 g/1 de EDTA de magnesio-disodio, 0.04 g/1 de Na2C03, 1 mi de Mezcla de Metal de Traza "A5+Co" (2.86 g/1 de H3B03, 1.81 g/1 de MnCl2x4H2o, 0.222 g/1 de ZnS04x7H20, 0.39 g/1 de NaMo04X2H2o, 0.079 g/1 de CuS04x5H20, 0.0494 g/1 de Co (N03) 2x6H20) ) , las células se cosecharon por centrifugación, se congelaron en nitrógeno líquido y se pulverizaron en el mortero. El protocolo para el aislamiento de ADN a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133: Las células bacteriales a partir de un cultivo líquido de 10 mi se granularon por centrifugación a 8000 rpm durante 10 minutos. Subsecuentemente, las células bacteriales se pulverizaron en nitrógeno líquido con un mortero y se molieron. El material celular se volvió a suspender en 1 mi de 10 mM de Tris HC1 (pH 7.5) y se transfirieron en un recipiente de reacción Eppendorf (2 mi de volumen) . Después de la adición de 100 o l de proteinasa K (concentración: 20 mg/ml), la suspensión celular se incubó durante 3 horas a 37 °C. Subsecuentemente, la suspensión se extrajo con 500 µ? de fenol. Después de la centrifugación a 13,000 rpm durante 5 minutos, la fase acuosa superior se transfirió a un nuevo recipiente de reacción Eppendorf de 2 mi. La extracción con fenol se repitió 3 veces. El ADN se precipitó .por la adición de un volumen 1/10 de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) -y un volumen 0.6 de iscpropanol y se lavó subsecuentemente con 70% de etanol. El gránulo de ADN se secó a temperatura ambiente, se tomó en 25 µ? de agua y se disolvió a 65 °C con calentamiento. El ácido nucleico que codifica una cetolasa a partir de Nostoc punctifor e ATCC 29133 se amplificó por medio de "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 utilizando un cebador especifico sentido (NP196-1, SEC. DE IDENT. NO. 100) y un cebador especifico antisentido (NP196-2 SEC. DE IDENT. NO. 101) . Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN la cual codifica para una proteina cetolasa que consiste de la secuencia primaria entera se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendió: - 1 ul de un ADN Nostoc punctiforme ATCC 29133 ('preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de NP196-1 (SEC. DE IDENT. NO. 100) - 0.2 mM de NP196-2 (SEC. DE IDENT. NO. 101) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TAKARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TAKARA) - 25.8 ul de agua destilada Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1X94 °C 2 minutos 35X94 °C 1 minuto 55 °C 1 minuto 72 °C 3 minutos 1X72 °C 10 minutos La amplificación de PCR con la SEC. DE IDENT. NO. 100 y la SEC. DE IDENT. NO. 101 resulta en un fragmento de 792 pb, el cual codifica para una proteina que consiste de una secuencia primaria entera (NP196, SEC. DE IDENT. NO. 102) . Al utilizar los métodos estándares, el amplificado se clonó en el vector de clonación de PCR pCR 2.1 (Invitrogen) y se obtuvo el clon pNP196. La secuenciación del clon pNP196 que utiliza M13F y el cebador M13R confirma una secuencia la cual es idéntica con la secuencia de ADN de 140, 571-139, 810 de la entrada de base de datos NZ_AABC01000196 (inversamente orientada a la entrada de base de datos publicada) con la excepción que G en la posición 140,571 se reemplazó por A con el fin de producir un codón ATG de inicio estándar. Esta secuencia de nucleótidos se reprodujo en un experimento de amplificación independiente y de este modo representa la secuencia de nucleótidos en el Nostoc punctiforme ATCC 29133 utilizado. Este clon pNPl96 se utilizó por lo tanto para la clonación en el vector de expresión pJIT117 (Guerineau et al. 1988, Nucí. Acids Res. 16:11380). Se modificó pJIT117 reemplazando el terminador 35S por el terminador OCS (octopina sintasa) del plásmido Ti pTil5955 de Agrobacterium tumefaciens (entrada de base de datos X00493 a partir de la posición 12,541-12,350, Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 835-846). El fragmento de ADN el cual comprende la región terminadora OCS se preparó por medio de PCR utilizando el plásmido pHELLSGATE (entrada de base de datos AJ311874, esley et al. (20C1) Plant J. 27 581-590, aislado a partir de E. coli de acuerdo a métodos estándares) y el cebador OSC-1 (SEC. DE IDENT. NC. 133) y OCS-2 (SEC. DE IDENT. NO. 134). Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN la cual comprende la región terminadora de la octopxna sintasa (OCS ) (SEC. DE IDENT. NO. 106) se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendieron: - 100 ng del ADN plásmido pHELLSGATE - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de OCS-1 (SEC. DE IDENT. NO. 104) - 0.2 mM de OCS-2 (SEC. DE IDENT. NO. 105) - 5 ul de tampón 10X de PCR (Stratagene) - 0.25 ul de Pfu polimerasa (Stratagene) - 28.8 ul de agua destilada Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1X94 °C 2 minutos 35X9 °C 1 minuto 50°C 1 minuto 72 °C 1 minutos 1X72°C 10 minutos Se clonó el amplificado de 210 pb utilizando métodos estándares en el vector de clonación PCR pCR 2.1 (Invitrogen) y el plásmido pOCS se obtuvo. La secuenciación del clon pOCS confirmó una secuencia la cual corresponde a una sección de secuencia del plásmido Ti pTil5955 de Agrobacterium tumefacxens (entrada de base de datos X00493) de la posición 12,541 a 12,350. La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Sall-Xhol de 210 pb de pOCs y la ligación en el vector desdoblado Sall-Xhol pJIT117. Este clon se llama pJO y se utilizó por lo tanto en el vector de expresión pJONP196. La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Sphl de 782 pb de pNP196 y la ligación en el vector desdoblado Sphl pJO. El clon el cual comprende la cetolasa NP196 de Nostoc punctiforme en la orientación correcta como la fusión translacional M-terminal con el péptido de tránsito rbcS se llama pJONP196. Ejemplo 6: La preparación de los vectores de expresión para la expresión constitutiva de la cetolasa NP196 de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en ycopersicon esculentum y Tagetes erecta. La expresión de la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme en L. esculentum y en Tagetes erecta se llevó a cabo baje el control del promotor FNR constitutivo (ferredoxin-NADPH oxidoreductasa, entrada de bases de datos AB011474 posición 70127 a 69493; WO 03/006660), a partir de Arabidopsis thaliana. El gen FNR comienza en los pares de base 69492 y se anota por ferredoxin-NADP+ reductasa". La expresión se llevó a cabo con el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709-715) .
El fragmento de ADN el cual comprende la región promotora FNR a partir de Arabidopsis thaliana se preparó por medio de PCR utilizando ADN genómico (aislado de acuerdo a métodos estándares a partir de Arabidopsis thaliana) y también los cebadores FNR-1 (SEC. DE IDEN . NO. 107) y FNR-2 (SEC. DE IDENT. NO. 108). Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN la cual comprende el fragmento promotor FNR FNR (SEC. DE IDENT. NO. 109) se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendió: - 100 ng de ADN genómica a partir de A. thaliana - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de FNR-1 (SEC. DE IDENT. NO. 107) - 0.2 mM de F R-2 (SEC. DE IDENT. NO. 108) - 5 ul de tampón 10X de PCR (Stratagene) - 0.25 ul de Pfu polimerasa (Stratagene) - 28.8 ul de agua destilada. Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1X94 °C 2 minutos 35X9 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 72 °C 1 minuto 1X72 °C 10 minutos Se clonó el amplificado de 652 pb utilizando métodos estándares en el vector de clonación de PCR pCR 2.1 (Invitrogen) y el plásmido pFNR se obtuvo. La secuenciación del clon pFNR confirma una secuencia la cual corresponde a una sección de secuencia en el cromosoma 5 de Arabidopsis thaliana (entrada de bases de datos AB011474) de posición 70127 a 69493. Este clon se llama pFNR y se utilizó por lo tanto para clonación en el vector de expresión pJONP196 (descrito en el Ejemplo 5) . La clonación se llevó a cabo por aislamiento del fragmento Smal-HindIII de 644 pb de pFNR y ligación en el vector desdoblado Ecll36II-HindIII pJONP196. Este clon el cual comprende el promotor FNR en lugar del promotor original d35S y el fragmento NP196 en la orientación correcta como la fusión N-terminal con el péptido de tránsito rbcS se llama pJOFNR:NP196. La preparación de un cásete de expresión para la transformación mediada por Agrobacteria de la cetolasa NP196 de Nostoc en L. esculentum se llevó a cabo utilizando el vector binario pSUN3 (WO 02/00900) . . Para la preparación del vector de expresión MSP105, el fragmento EcoRI-Xhol de 1839 pb de pJOFNR:NP196 se ligó con el vector desdoblado EcoRI-Xhol pSUN3. El vector de expresión MSP105 comprende el fragmento FNR promoter el promotor FNR (635 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS de chicharo (194 pb) , el fragmento NP196 KETO CDS (761 pb) , la codificación para la cetolasa NP196 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación de la octopina sintasa. La preparación de un cásete de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium del vector de expresión con la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme en Tagetes erecta se llevó a cabo utilizando el vector binario pSUN5 ( O 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión Tagetes MSP106, el fragmento EcoRI-XhoI 1839 a partir de pJOF R:NP196 se ligó con el vector desdoblado EcoRI-XhoI pSUN5. MSP106 comprende el fragmento el FNR promoter el promotor FNR (635 pb) , el fragmento r¿>cS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS de chicharo (194 pb) , el fragmento NP196 KETO CDS (761 pb) , la codificación para la cetolasa NP196 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación de la octopina sintasa. Ejemplo 7: La preparación de los vectores de expresión para la expresión especifica de flores de la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en Lycopersicon esculentum y Tagetes erecta La expresión de la cetolasa NP196 a partir de Nostoc pucntiforme en L. esculentum y Tagetes erecta se llevó a cabo con el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709-715). La expresión se llevó a cabo bajo el control del promotor especifico de flores EPSPS a partir de Petunia híbrida (entrada de base de datos M37029: región de nucleótido 7-1787; Benfey et al. (1990) Plant Cell 2:849-856). El fragmento de ADN el cual comprende la región del promotor EPSPS (SEC. DE IDENT. NO. 112) a partir de Petunia híbrida se preparó por medio de la PCR que utiliza el ADN genómico (aislado de acuerdo a métodos estándares de Petunia híbrida) y el cebador EPSPS-1 (SEC. DE IDENT. NO. 110) y EPSPS-2 (SEC. DE IDENT. NO. 111) . Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN la cual comprende el fragmento del promotor EPSPS (entrada de base de datos M37029: región de nucleótido 7-1787) se levó a cabo en un lote de reacción de 50 µ?, en donde se comprendió: - 100 ng del ADN genómico de A. thaliana - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de EPSPS-1 (SEC. DE IDENT. NO. 110) - 0.2 mM de EPSPS-2 (SEC. DE IDENT. NO. 111) - 5 ul de tampón 10X de PCR (Stratagene) - 0.25 ul de Pfu polimerasa (Stratagene) - 28.8 ul de agua destilada Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1X9 °C 2 minutos 35X94 °C 1 minuto 50 °C 1 minuto 7-2 °C 2 minutos 1X72°C 10 minutos Se clonó el amplificado de 1773 pb utilizando métodos estándares en el vector de clonación de PCR pCR 2.1 (Invitrogen) y se obtuvo el plásmido pEPSPS. La secuenciación del clon pEPSPS confirma una secuencia la cual sólo se difiere por dos eliminaciones (bases caagtttcagga en la posición 46-58 de la secuencia M37029: basdes aaaaatat en la posición 1422-1429 de la secuencia 37029) y los intercambiadores de base (T en lugar de G en la posición 1447 de la secuencia M37029; A en lugar de C en la posición 1525 de la secuencia M37029; A en lugar de G en la posición 1627 de la secuencia M37029) a partir de la secuencia EPSPS publicada (entrada de base de datos M37029: región de nucleótido 7-1787). Las dos eliminaciones y los dos intercambiadores de base en las posiciones 1447 y 1627 de la secuencia M37029 se reprodujeron en un experimento de amplificación independiente y representa de este modo la secuencia de nucleótido actual en las plantas de Petunia híbrida utilizadas.
El clon pEPSPS se utilizó por lo tanto para la clonación en el vector de expresión pJONP196 (descrito en el Ej emplo 5 ) . La clonación se llevó cabo por aislamiento del fragmento SacI-HindIII a partir de pEPSPS y ligación en el vector desdoblado SacI-HindIII pJONP196. El clon el cual comprende el promotor EPSPS en lugar del promotor original d35S se llama pJOESP : NP196. Este cásete de expresión comprende el fragmento NP196 en la orientación correcta como la fusión N-terminal con el péptido de tránsito rbcS. La preparación de un vector de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de la cetolasa NP196 controlada por EPSPS a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en L. esculentum se llevó a cabo utilizando el vector binario pSÜN3 (WO 02/00900). Para la preparación del vector de expresión MSP107, el fragmento Sacl-Xhol 2.961 KB pb a partir de pJOESP: P196 se ligó con el vector desdoblado Sacl-Xhol pSUN3. ?1 vector de expresión MSP107 comprende el fragmento EPSPS el promotor EPSPS (1761 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (194 pb) , el fragmento NP196 KETO CDS (761 pb) , la codificación para la cetolasa NP196 de Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación de octopina sintasa. La preparación de un vector de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de la cetolasa NP196 controlada por EPSPS a partir de Nostoc punctiforme en Tagetes erecta se llevó cabo utilizando el vector binario pSÜN5 (WO 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión MSP108, el fragmento Sacl-Xhol de 2961 KB de pb a partir de pJOESP:NP196 se ligó con el vector pSUN5 desdoblado Sacl-Xhol . El vector de expresión MSP108 comprende el fragmento EPSPS el promotor EPSPS (1761 pb) , el fragmento sbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS de chícharo (194 pb) , el fragmento NP196 KETO CDS (761 pb) , que codifica para la cetolasa NP196 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación de la octopina sintasa. Ejemplo 8: Amplificación de un ADN, el cual codifica la secuencia primaria total de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133. El ADN el cual codifica para la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 se amplificó por medio de PCR a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 (cepa de la "American Type Culture Collection") . La preparación del ADN genómico a partir de un cultivo de suspensión de Nostoc punctiforme ATCC 29133 se describió en el Ejemplo 5. El ácido nucleico que codifica una cetolasa a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 se amplificó por medio de "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 que utiliza un cebador especifico sentido (NP195-1, SEC. DE IDENT. NO. 113) y un cebador especifico antisentido (NP195-2 SEC. DE IDENT. NO. 114) . Las condiciones de PCR fueron como sigue: La PCR para la amplificación del ADN el cual codifica para una proteina cetolasa que consiste de la secuencia primaria total se llevó a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendió: - 1 ul de un ADN Nostoc punctiforme ATCC 29133 (preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 mM de NP195-1 (SEC. DE IDENT. NO. 113) - 0.2 mM de NP195-2 (SEC. DE IDENT. NO. 114) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TARARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TARARA) - 25.8 ul de agua destilada Se llevó a cabo la PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 1X94 °C 2 minutos 35X94 °C 1 minuto 55°C 1 minuto 72 °C 3 minutos 1X72°C 10 minutos La amplificación de PCR con la SEC. DE IDENT. NO. 113 y la SEC. DE IDEN . NO. 114 resulta en un fragmento de 819 pb el cual codifica para una proteir.a la cual consiste de la secuencia primaria total (NP195, SEC. DE IDENT. NO. 115) . Al utilizar métodos estándares, el amplificado se clonó en el vector pCR 2.1 de clonación de PCR (Invitrogen) y el clon pNP195 se obtuvo. La secuenciación del clon pNP195 con el M13F y el cebador M13R confirmó una secuencia la cual es idéntica con la secuencia de ADN a partir de 55, 604-56,392 de la entrada de bases de datos NZ_AABC010001965, con la excepción de que T en la posición 55, 604 se reemplazó por A con el fin de producir un codón de inicio estándar ATG. Esta secuencia de nucleótido se reprodujo en un experimento de amplificación independiente y representa de este modo la secuencia de nucleótido en Nostoc punctiforme ATCC 29133 utilizado. Este clon pNP195 se utilizó por lo tanto para clonarse en el vector de expresión pJO (descrito en el Ejemplo 5). La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Sphl de 809 pb a partir de pNP195 y la ligación en el vector pJO desdoblado con Sphl. El clon el cual comprende la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme en la orientación correcta como la fusión translacional N-terminal con el péptido de tránsito rbcS se llama pJONP195.
Ejemplo 9: La preparación de los vectores de expresión para la expresión constitutiva de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en Lycopersicon esculentum y Tagetes erecta. La expresión de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme en L. esculentum y en Tagetes erecta se llevó a cabo bajo el control del promotor constitutivo FNR (ferredoxin-NADPH oxidoreductasa, entrada de base de datos AB011474 posición 70127 a 69493; WO 03/006660), a partir de Arabidopsis thaliana. El gen FNR empieza en el par de bases 69492 y se anota por la "ferredoxin-NADP+reductasa" . La expresión se llevó a cabo con el péptido de tránsito rbcS a 'partir de chícharo (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709- 715) . El clon pFNR (descrito en el Ejemplo 6) se utilizó por lo tanto para clonarse en el vector de expresión pJONPl 95 (descrito, en el Ejemplo 8). La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento Sma-HindIII de 644 pb a partir de pFNR y la ligación en el vector pJONP195 desdoblado de Ecll36II- HindlII. El clon, el cual comprende el promotor FNR en lugar del promotor original d35S y el fragmento NP195 en la orientación correcta como la fusión N-terminal con el péptido de tránsito rbcS, se llama pJOFNR: NP195.
La preparación de un cásete de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme en L. esculentuia se llevó a cabo utilizando el vector binario pSUN3 (WO 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión MSP109, el fragmento EcoRI-X oi de 1866 pb a partir de pJOFNR: P195 se ligó con el vector pSUN3 desdoblado de EcoRI-Xhoi . El vector de expresión MSP109 comprende el fragmento FNR promoter el promotor FNR (635 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (194 pb) , el fragmento NP195 KETO CDS (789 pb) , la codificación para la cetolasa NP195 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación a partir de la octopina sintasa. La preparación de un cásete de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium del vector de expresión con la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme punctiforme en Tagetes erecta se llevó a cabo utilizando el vector binario pSUN5 (WO 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión Tagetes MSPllO, el fragmento EcoRI-Xhoi de 1866 pb a partir de pJOFNR:NP195, se ligó con el vector pSUN5 desdoblado de EcoRI-Xhoi. El vector de expresión MSP110 comprende el fragmento FNR promoter el promotor FNR (635 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (194 pb) r el fragmento NP195 KETO CDS (789 pb) , la codificación para la cetolasa NP195 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilacion de la octopina sintasa. Ejemplo 10: La preparación de los vectores de expresión para la expresión específica de las flores de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en Lycopersicon esculentum y Tagetes erecta. La expresión de la cetolasa NP195 a partir de Nostoc punctiforme en L. esculentum y Tagetes erecta se llevó a cabo con el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240:709-715). La expresión se llevó a cabo bajo el control del promotor específico de flores EPSPS a partir de Petunia híbrida (entrada de base de datos M37029: región de nucleótido 7-1787; Benfey et al. (1990) Plant Cell 2:849-856). El clon pEPSPS (descrito en el Ejemplo 7) se utilizó por lo tanto para clonación en el vector de expresión pJONP195 (descrito en el Ejemplo 8) . La clonación se llevó a cabo por el aislamiento del fragmento SacI-HindIII de 1763 pb a partir de pEPSPS y la ligación en el vector pJONP195 desdoblado de SacI-HindIII . El clon, el cual comprende el promotor EPSPS en lugar del promotor d35S original, se llama pJOESP:NP195. Este cásete de expresión comprende el fragmento NP195 en la orientación-correcta como la fusión N-terminal con el péptido de tránsito rbcS . La preparación de un vector de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de la cetolasa NP195 controlada por EPSPS a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 en L. esculentum se llevó a cabo utilizando el vector binario pSUN3 (WO 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión MSP112, el fragmento Sacl-Xhol de 2988 KB de pb a partir de pJOES : NP195 se ligó con el vector pSÜN5 desdoblado de SacI-Xhol . El vector de expresión MSP111 comprende el fragmento EPSPS el promotor EPSPS (1761 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (194 pb), el fragmento NP195 RETO CDS (789 pb) , la codificación para la cetolasa NP1 5 Nostoc punctiforme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación a partir de la octopina sintasa. La preparación de un vector de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de la cetolasa NP195 controlada por EPSPS a partir de Nostoc punctiforme en Tagetes erecta se llevó a cabo utilizando el vector binario pSÜN5 (WO 02/00900) . Para la preparación del vector de expresión MSP112, el fragmento Sacl-Xhol de 2988 KB de pb a partir de pJOESP : NP195 se ligó con el vector pSÜN5 desdoblado de Sacl-Xhol . El vector de expresión MSP112 comprende el fragmento EPSPS el promotor EPSPS (1761 pb) , el fragmento rbcS TP FRAGMENT el péptido de tránsito rbcS a partir de chícharo (194 pb), el fragmento NP195 KETO CDS (789 pb) , la codificación para la cetolasa NP195 Nostoc puncti orme, el fragmento OCS terminator (192 pb) la señal de poliadenilación a partir de la octopina sintasa. Ejemplo 11: La preparación de un cásete de expresión para la sobre-expresión especifica de flores de la beta-hidroxilasa específica de cromoplastos a partir de Lycopersicon esculentum. La expresión de la beta-hidroxilasa específica de cromatoplastos a partir de Lycopersicon esculentum en Tagetes erecta se lleva a cabo bajo el control del promotor EPSPS específico de flores a partir de Petunia (Ejemplo 7) . Como el elemento terminador, LB3 a partir de Vicia faba se utiliza. La secuencia de la beta-hidroxilasa específica de cromatoplastos se preparó por el aislamiento de ARN, transcripción inversa y la PCR. Para la preparación de la secuencia terminadora LB3 a partir de Vicia faba, el ADN genómico a partir del tejido Vicia faba se aisla de acuerdo a los métodos estándares y empleados por la PCR genómica utilizando los cebadores PR206 y PR207. La PCR para la amplificación de este fragmento de ADN LB3 se lleva a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprende: - 1 ul de ADNc (preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.25 uM de PR206 (SEC. DE IDENT. NO. 116) - 0.2 uM de PR207 (SEC. DE IDENT. NO. 117) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TAKARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TAKARA) - 28.8 ul de agua destilada La amplificación de PCR con PR206 y PR207 resulta en un fragmento de 0.3 kb el cual comprende para el terminador LB. El amplificado se clonó en el vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) . La secuenciación con los cebadores T7 y M13 confirma una secuencia idéntica a la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 118. Este clon se llama pTA-LB3 y se utiliza por lo tanto para clonación en el vector pJIT117 (véase posteriormente) . Para la preparación de la secuencia beta-hidroxilasa, el ARN total a partir de tomate se prepara. Con este fin, 100 mg de flores pulverizadas congeladas, se transfieren a un recipiente de reacción y se toman en 0.8 mi del tampón Trizol (LifeTec nologies ) . La suspensión se extrae con 0.2 mi de cloroformo. Después de la centrifugación a 12,000 g durante 15 minutos, el sobrenadante acuoso se remueve y se transfiere a un nuevo recipiente de reacción y se extrae con un volumen de etanol. El ARN se precipita utilizando un volumen de isopropanol, se lava con 75% de etanol y el gránulo se disuelve en agua DEPC (incubación durante la noche de agua con 1/1000 volumen de pirocarbonato de dietilo a temperatura ambiente, con auto-clave subsecuentemente) . La concentración de ARN se determina fotométricamente . Para la síntesis de ADNc, se desnaturalizan 2.5 ug del ARN total durante 10 minutos a 60°C, se enfría durante 2 minutos en hielo y se transcribe por medio de un equipo de ADNc (Ready-to-go-you-prime-beads, Pharmacia Biotech) de acuerdo a los detalles del fabricante utilizando un cebador específico antisentido (PR215 SEC. DE IDENT. NO. 119) en el ADNc. Las condiciones de las reacciones de PCR subsecuentes son como sigue: La PCR para la amplificación del fragmento de ADN VPR203-PR215 el cual codifica para la beta-hidroxilasa se lleva a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprendió : - 1 ul de ADNc (preparado como se describe anteriormente ) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 u de VPR203 (SEC. DE IDENT. NO. 120) - 0.2 uM de PR215 (SEC. DE IDENT. NO. 119) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TAKARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TAKARA) - 28.8 ul de agua destilada. La amplificación de PCr con VPR203 y PR215 resulta en un fragmento de 0.9 kb el cual codifica para la beta-hidroxilasa. El amplificado se codifica en el vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) . Las secuencias con los cebadores T7 y M13 confirman una secuencia idéntica a la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 121. Este clon se llama pTA-CrtR-b2 y se utiliza por lo tanto para clonación en el vector pCSP02 (véase posteriormente) . La secuencia promotora EPSPS a partir de Petunia se prepara por amplificación de PCR utilizando el plásmido MSP107 (véase Ejemplo 7) y los cebadores VPR001 y VPR002. La PCR para la amplificación de este fragmento de EPSPS-ADN se lleva a cabo en un lote de reacción de 50 ul, en donde se comprende : - 1 ul de ADNc (preparado como se describe anteriormente) - 0.25 mM de dNTPs - 0.2 uM de VPR001 (SEC. DE IDENT. NO. 122) - 0.2 uM de VPR002 (SEC. DE IDENT. NO. 123) - 5 ul de tampón 10X de PCR (TAKARA) - 0.25 ul de R Taq polimerasa (TAKARA) - 28.8 ul de agua destilada La amplificación de PCR con VPR001 y VPR002 resulta en un fragmento de 1.8 kb el cual codifica el promotor EPSPS. El amplificado se clona en el vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) . Las secuencias con los cebadores T7 y I3 confirman una secuencia idéntica a la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 124. Este clon se llama pTA-EPSPS y se utiliza por lo tanto para clonarse en el vector pCSP03 (véase posteriormente) . La primera etapa de clonación se lleva a cabo por el aislamiento del fragmento EcoRI-Xhol PR206-PR207 de 0.3 kb de pTa-LB3, derivado a partir del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) , y la ligación con el vector pJIT117 desdoblado de EcoRI-Xhol. El clon, el cual comprende el terminador LB3 de 0.3 kb se llama pCSP02. La segunda etapa de clonación se lleva a cabo por el aislamiento del fragmento EcoRI-HindIII VPR003-PR215 de 0.9 kb a partir de pTA-CrtR-b2, derivado a partir del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) , y la ligación con el vector pCSP02 desdoblado de EcoRI-HindIII . El clon, el cual comprende el fragmento CrtR-b2 de beta-hidroxilasa 0.9 kb, se llama pCSP03. Por medio de la ligación, una fusión transcripcional resulta entre el terminador LB3 y el fragmento CrtR-b2 beta-hidroxilasa. La tercera etapa de clonación se lleva a cabo por el aislamiento del fragmento NcoI-SacI VPR001-VPR002 1.8 kb a partir de pTA-EPSPS, derivado a partir del vector de clonación pCR-BluntlI (Invitrogen) , y la ligación con el vector pCSP03 desdoblado de NcoI-SacI. El clon, el cual comprende el fragmento promotor EPSPS de 1.8 kb, se llama pCSP04. Por medio de la ligación, una fusión transcripcional resulta entre el promotor EPSPS y el fragmento beta-hidroxilasa CrtR-b2. pCSP04 comprende el fragmento, fragmento EPSPS (1792 pb) , el promotor EPSPS, el fragmento crtP,b2 (929 pb) , la beta hidroxilasa CrtRb2, el fragmento LB3 (301 pb) el terminador LB3. Para la clonación de este cásete de sobre-expresión de hidroxilasa en los vectores de expresión para la transformación mediada por Agrobacterium de Tagetes erecta, el cásete de beta-hidroxilasa se aisla como el fragmento Ecll36II-XhoI de 3103 pb . El llenado de extremos 3' (30 minutos a 30 °C) se lleva a cabo de acuerdo a métodos estándares (llenado Klenow) . El vector de expresión se llama pCESbhyd Ejemplo 12: La preparación de los vectores de expresión para la expresión especifica de flores de la licopeno beta-Cciclasa especifica de cromoplastos a partir de Lycopersicon esculentum bajo el control del promotor P76 y para la expresión especifica de flores de la cetolasa NP196 a partir de Nostoc punctiforme ATCC 29133 bajo el control del promotor EPSPS. El aislamento del promotor P76 (SEC. DE IDENT. NO. 125) por medio de la PCR con el ADN genómico a partir de Arabidopsis thaliana como la matriz. Para esto, los cebadores oligonucleótidos P76for (SEC. DE IDENT. NO. 126) y P76rev (SEC. DE IDENT. NO. 127) se utilizaron. Los oligonucleótidos se proporcionaron durante la síntesis con el residuo 5' -fosfato. P76 for 5 ' -CCCGGGTGCCAAAGTAACTCTTTAT-3 ' P76 rev 5' -GTCGACAGGTGCATGACCAAGTAAC-3 ' El ADN genómico se aisló a partir de Arabidopsis thaliana como se describe (Galbiati M et al. Funct . Integr. Genomics 2000, 20 1:25-34). La amplificación de PCR se llevó a cabo como sigue: 80 ng del ADN genómico tampón lx de PCR de Plantilla Larga Expandida 350 µ? cada uno de dATPr dCTP, dGTP, dTTp 300 nM de cada uno de cada cebador 2.5 unidades de Polimerasa de Plantilla Larga Expandida en un volumen final de 25 µ? Se utiliza el siguiente programa -de temperatura: 1 ciclo con 120 segundos a 94 °C 35 ciclos con 94 °C durante 10 segundos, 48 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 3 minutos 1 ciclo con 68 °C durante 10 minutos El producto de PCR se separa utilizando lectroforesis de gel de agarosa y el fragmento de 1032 pb se aisla por la elución de gel. El vector pSun5 se digiere con la endonucleasa EcoRV de restricción y asi mismo se purifica por medio de electroforesis de gel de agarosa y se recupera por elución de gel. El producto de PCR purificado se clona en el vector tratado en esta manera. Esta construcción se designa por p76. El fragmento de 1032 pb largo, el cual representa el promotor P76 a partir de Arabidopsis, se secuenció (SEC. DE IDENT. NO. 131) . El terminador 35ST se obtiene a partir de pJIT117 por digestión con las endonucleasas de restricción Kpnl y Smal . El fragmento de 969 pb que resulta en este proceso se purifica utilizando la electroforesis de gel de agarosa y se aisla por elución de gel. El vector p76 se digiere asi mismo con las endonucleasas de restricción Kpnl y Smal. El fragmento de 7276 pb resultante se purifica utilizando electroforesis de gel de agarosa y se aisla por elución de gel. El fragmento 35ST obtenido asi se clona en el p76 tratado de este modo. El vector resultante se designa por p76_35ST. El aislamiento del gen B (SEC. DE IDENT. NO. 128) se llevó a cabo por medio de PCR con ADN genómico a partir de Lycopersicon esculentum como la matriz. Para esto, los cebadores oligonucleótidos BgeneFor (SEC. DE IDENT. NO. 129) y BgeneRev (SEC. DE IDENT. NO. 130) se utilizaron. Los oligonucleótidos se proporcionaron en la síntesis con un residuo 5' fosfato. SEC. DE IDENT. NO.: 129: Bgenefor: ' -CTATTGCTAGATTGCCAATCAG-3 ' SEC. DE IDENT. NO. 130: Bgenerev: ' -ATGGAAGCTCTTCTCAAG-3' El ADN genómico se aisló a partir de Lycopersicon esculentum como se describe (Galbiati M et al. Funct . Integr. Genomics 2000, 20 1:25-34). La amplificación de PCR se llevó a cabo como sigue: 80 ng del ADN genómico tampón lx de PCR de Plantilla Larga Expandida 2.5 mM de MgC12 350 µ? de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTp 300 nM de cada uno de cada cebador 2.5 unidades de Polimerasa de Plantilla Larga Expandida en un volumen final de 25 µ? Se utilizó el siguiente programa de temperatura: 1 ciclo con 120 segundos a 94 °C 35 ciclos con 94 °C durante 10 segundos, 48 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 3 minutos 1 ciclo con 68 °C durante 10 minutos El producto de PCR se purificó utilizando electroforesis de gel de agarosa y el fragmento de 1665 pb se aisló por elución de gel. El vector p76_35ST se digiere con la endonucleasa de restricción Smal y asi mismo se purifica por medio de electroforesis de gel de agarosa y se recupera por elución de gel . El producto de PCR purificado se clona en el vector tratado de este modo. Esta construcción se designa por pB. El fragmento de 1486 pb largo, el cual representa el Bgene de tomate, se secuenció y es idéntico en su secuencia de nucleótido con la entrada de base de datos AF254793 (SEC. DE IDENT. NO. 1). pB se digiere con las endonucleasas de restricción Pmel y SspI y el fragmento 3906 pb que comprende el promotor P76, Bgene y el 35ST se purifica por electroforesis de gel de agarosa y se recupera por la elución de gel. SP108 (Ejemplo 7) se digiere con la endonucleasa de restricción Ecll26II, se purifica por electroforesis de gel de agarosa y se recupera por elución de gel. El fragmento de 3906 pb purificado que comprende el promotor P76, Bgene y el 35ST de pB se clona en el vector MSP108 tratado de este modo. Esta construcción se designa por pMKPl. Ejemplo 13: Preparación y análisis de- plantas transgénicas Lycopersicon esculentum La transformación y la regeneración de las plantas del tomate se llevó a cabo de acuerdo al método publicado de Ling et al. (Plant Cell Reports (1998), 17:843-847). Para la variedad Microtom, la selección se llevó a cabo utilizando una concentración de kanamicina más elevada (100 mg/1) . Como la explanta de partida para la transformación, las cotiledóneas y las hipocotiledoneas de las plántulas de la linea Microtom de siete a diez días se utilizaron. Para la germinación, el medio de cultivo de acuerdo a Murashige y Skoog (1962: Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473-) que comprende 2% de sacarosa, pH 6.1 se utilizó. La germinación tuvo lugar a 21C con poca luz (20 a 100 µ?) . Después de siete a diez días, se dividieron las cotiledóneas diagonalmente y las hipocotiledoneas se cortaron en secciones aproximadamente 5 a 10 mm de largo y se tomaron en el medio MSBN (MS, pH 6.1, 3% de sacarosa + 1 mg/1 de BAP, 0.1 mg/1 de NAA) , el cual se recubrió en el dia antes con las células de tomate cultivadas en suspensión. Las células de tomate se cubrieron con papel filtro estéril en una manera libre de burbujas de aire. El pre-cultivo de las explantas en el medio descrito se llevó a cabo durante tres a cinco días. Las células de la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se transformaron individualmente con los plásmidos. En cada caso, un cultivo durante la noche en un medio YEB que comprende kanamicina (20 mg/1) de las cepas Agrobacterium transformadas individualmente con los vectores binarios se cultivó a 28 grados Celsius y las células se centrifugaron. El gránulo bacterial se volvió a suspender utilizando medio MS (3% de sacarosa, pH 6.1) y se ajustaron a una densidad óptica de 0.3 (a 600 nm) . Las explantas pre-cultivadas se transfirieron a la suspensión y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. Subsecuentemente, las explantas se secaron utilizando papel filtro estéril y reemplazaron en su medio de pre-cultivo durante los tres días del co-cultivo (21°C) . Después del co-cultivo, las explantas se transfirieron a medio MSZ2 (MS pH 6.1 + 3% de sacarosa, 2 mg/1 de zeatina, 100 mg/1 de kanamicina, 160 mg/1 de timentina) y se almacenaron para regeneración selectiva a 21°C bajo condiciones débiles (20 a 100 µ?, ritmo ligero 16 h/8 h) . Cada dos a tres semanas, la transferencia de las explantas se llevó a cabo ' hasta que se forman los brotes. Es posible separar pequeños brotes a partir de la explanta y plantarlos en MS (pH 6.1 + 3% de sacarosa) 160 mg/1 de timentina, 30 mg/1 de kanamicina, 0.1 mg/1 de IAA. Las plantas enraizadas se transfirieron al invernadero. De acuerdo al método de transformación descrito anteriormente, con las siguientes construcciones de expresión se obtuvieron las siguientes lineas: Con MSP105: se obtuvo mspl05-l, mspl05-2, mspl05-3 Con MSP107: se obtuvo mspl07-l, mspl07-2, mspl07-3 Con MSP109: se obtuvo mspl09-l, mspl09-2, mspl09-3 Con MSP111: se obtuvo msplll-1, msplll-2, msplll-3 Ejemplo 14: Preparación de plantas transgénicas Tagetes Se esterilizan las semillas de Tagetes y se colocan en un medio de germinación (medio MS: Murashige y Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473-497) pH 5.8, 2% de sacarosa). La germinación se lleva a cabo en un intervalo de temperatura/luz/tiempo de 18 a 28°C/20-200 µ? a 16 semanas, pero de preferencia a 21C, 20 a 70 mE, curante 4 a 8 semanas. Todas las hojas de las plantas in vitro desarrolladas hasta entonces, se cosechan y se cortan transversalmente a la costilla central. Las explantas de hojas que resultan tienen por lo tanto un tamaño de 10 a 60 mm2 se almacenan en el curso de la preparación en un medio liquido MS a temperatura ambiente durante más de 2 horas.
Cualquier cepa Agrobacterium tumefaciens deseada, pero de preferencia, una cepa supervirulenta, tal como, por ejemplo, EHA105 con un plásmido binario apropiado, el cual puede comprender un gen marcador de selección (de preferencia bar o pat) y uno o más genes reporteros o de rasgos, se cultivan durante la noche y se utilizan para el co-cultivo con el material ce hojas. El cultivo de la cepa bacteriana puede llevarse a cabo como sigue: Una colonia individual de la cepa apropiada se inocula en YEB (0.1% de extracto de levadura, 0.5% de extracto de res, 0.5% de peptona, 0.5% de sacarosa, 0.5% de sulfato de magnesio x 7 H20) con 25 mg/1 de kanamicina y se cultiva a 28 °C durante 16 a 20 horas. Subsecuentemente, la suspensión bacteriana se cosecha por centrifugación a 6000 g durante 10 minutos y se vuelve a suspender en un medio MS liquido de tal modo que un ??ß?? de aproximadamente 0.1 a 0.8 resulta. Esta suspensión se utiliza para el co-cultivo con el material de hojas. Inmediatamente antes del co-cultivo, el medio MS en donde las hojas se han almacenado se reemplaza por la suspensión bacterial. La incubación de las hojas en ía Agrobacteria se lleva a cabo durante 30 minutos con agitación ligera a temperatura ambiente. Subsecuentemente, las explantas infectadas se colocan en un agar (por ejemplo, medio MS solidificado con 0.8% de agar de planta (Duchefa, NL) que comprende reguladores de crecimiento, tales como por ejemplo, 3 mg/1 de bencilaminopurina (???) y 1 mg/1 de ácido indolilacético (IAA) . La orientación de las hojas en el medio es insignificante. El cultivo de las explantas tiene lugar durante 1 a 8 dias, pero de preferencia por 6 dias, en esta conexión las siguientes condiciones pueden utilizarse: intensidad de luz: 30 a 80 µ???/m2 x seg, temperatura: 22 a 24 °C, cambio de luz/oscuridad de 16/8 horas. Subsecuentemente, las explantas co-cultivadas se transfieren a un medio MS fresco, de preferencia comprende los mismos reguladores de crecimiento, este segundo medio gue comprende adicionalmente un antibiótico para la supresión del crecimiento bacterial. La timentina en una concentración de 200 a 500 mg/1 es muy adecuada para este propósito. Como un segundo componente selectivo, uno para la selección de los resultados de la transformación se emplea. La fosfinotricina en una concentración de 1 a 5 mg/1 se selecciona muy eficientemente, pero otros componentes selectivos son también concebibles de acuerdo al proceso que se utiliza. Después de una a tres semanas en cada caso, la transferencia de las explantas del medio fresco se lleva a cabo hasta que los retoños brotan y se desarrollan pequeños retoños, los cuales se transfieren entonces para enraizarse al mismo medio basal incluyendo timentina y PPT o los componentes alternativos con reguladores de crecimiento, es decir, por ejemplo, 0.5 mg/1 de ácido indolilbutirico (IBA) y 0.5 mg de ácido giberélico GA3. Los retoños enraizados pueden transferirse al invernadero. Además de los métodos descritos, son posibles las siguientes modificaciones ventajosas: • Antes que se infecten las explantas con las bacterias, estas pueden pre-incubarse durante 1 a 12 días, de preferencia 3 a 4, en el medio descrito anteriormente para el · co- cultivo. Subsecuentemente, la infección, el co-cultivo y la regeneración selectiva se llevan a cabo como se describe anteriormente. • El pH para la regeneración (normalmente 5.8) puede disminuirse a pH 5.2. El control del crecimiento de la Agrobacteria se mejora por lo tanto. • La adición de g O^ (3 a 10 mg/1) al medio de regulación mejora la condición del cultivo incluyendo la regeneración misma. • Los componentes los cuales reducen la formación de fenol y se conocen por la persona experimentada en la técnica, tales como por ejemplo, ácido cítrico, ácido ascórbico, PVP y muchos otros, tienen un efecto positivo en el cultivo. • El medio de cultivo líquido puede utilizarse también para el proceso total. El cultivo puede también incubarse en portadores comercialmente disponibles, los cuales se colocan en el medio liquido. De acuerdo al método de transformación descrito anteriormente, las siguientes lineas se obtuvieron con las siguientes construcciones de expresión. Con MSP106 se obtuvo: mspl06-l, mspl06-2r mspl06-3 Con MSP108 se obtuvo: mspl08-l, mspl08-2r mspl08-3 Con MSP110 se obtuvo: mspllO-1, mspll0-2r mspllO-3 Con MSP112 se obtuvo: mspll2-l, mspll2-2, mspll2-3 Con pCSEbhyd se obtuvo: csehyd-1, csebhyd-2, csebhdy-3. Con pMKPl se obtuvo: mkpl-l, mkpl-2, mkpl-3. Ejemplo 15: Hidrólisis catalizada con lipasa enzimática de esteres carotenoides a partir del material de planta y la identificación de los carotenoides Procedimiento de elaboración general a) El material de planta molido en un mortero (por ejemplo, material de pétalos) (30-100 mg de peso reciente) se extrae con 100% de acetona (tres veces 500 µ?; en cada caso se agita durante aproximadamente 15 minutos) . El solvente se evapora. Los carotenoides se toman subsecuentemente en 495 µ? de acetona, 4.95 mi de tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH 7.4) se agregan y las soluciones se mezclan bien. La adición de aproximadamente 17 mg de sales biliares (Sigma) y 149 µ? de una solución de NaCl/CaCl2 (3M de NaCl y 75 mM de CaCl2) se lleva a cabo entonces. La suspensión se incuba durante 30 minutos a 37 °C. Para la hidrólisis enzimática de los ásteres carotenoides , 595 µ? de una solución de lipasa (50 mg/ml de lipasa del Tipo 7 a partir de Candida rugosa (Sigma)) se agregan y se incuban con agitación a 37°C. Después de aproximadamente 21 horas, una adición de 595 µ? de lipasa con incubación reciente de al menos 5 horasa 37 °C se llevó a cabo de nuevo. Subsecuentemente, aproximadamente alrededor de 700 mg de Na2S04 se disuelven en la solución. Después de la adición de 1800 µ? de éter de petróleo, los carotenoides se extraen en la fase orgánica por mezclado vigoroso. Esta extracción por agitación se repite hasta que la fase orgánica permanece incolora. Las fracciones de éter de petróleo se combinan y el éter de petróleo se evapora. Tres carotenoides se extraen en 100-120 µ? de acetona. Por medio de HPLC y una columna de fase inversa C30, pueden identificarse carotenoides libres en la base del tiempo de retención y los espectros UV-VIS. Las sales biliares o sales de ácido biliar utilizadas son mezclas 1:1 de colato y desoxicolato. b) Procedimiento de elaboración para desarrollarse si sólo pequeñas cantidades de ásteres de carotenoides se presentan en el material de plantas Alternativamente, la hidrólisis de los ásteres de carotenoides puede lograrse por lipasa a partir de Candida rugosa después de la separación por medio de cromatografía de capa delgada. Con este fin, 50-100 mg del material de planta se extraen tres veces con aproximadamente 750 µ? de acetona. El extracto del solvente se concentra in vacuo en un evaporador giratorio (temperaturas incrementadas de 40-50°C son tolerables) . La adición de 300 µ? de éter de petróleo : acetona (relación 5:1) y el mezclado meticuloso se lleva a cabo entonces. La sustancia suspendida se sedimenta por centrifugación (1-2 minutos) . La fase superior se transfiere a un nuevo recipiente de reacción. El residuo restante se extrae de nuevo con 200 µ? de éter de petróleo: acetona (relación 5:1) y las sustancias suspendidas se remueven por centrifugación. Los dos extractos se presentan juntos (volumen 500 µ?) y los solventes se evaporan. El residuo se vuelve a suspender en 30 µ? de éter de petróleo: acetona (relación 5:1) y se aplica a una placa de capa delgada (gel de sílice 60, Merck) . Si más de una aplicación es necesaria para los propósitos preparativos/analíticos, varias alícuotas en cada caso teniendo un peso reciente de 50-100 mg deben prepararse en la manera descrita para la separación cromatográfica de capa delgada. La placa de capa delgada se desarrolla en éter de petróleo : acetona (relación 5:1). Las bandas de carotenoides pueden identificarse visualmente tomando en cuenta su color. Las bandas de carotenoides individuales se remueven y pueden agruparse para los propósitos preparativos/analíticos. Al utilizar acetona, los carotenoides se eluyen a partir del material de sílice; el solvente se evapora in vacuo. Para la hidrólisis de los ésteres de carotenoides, el residuo se disuelve en 495 µ? de acetona, 17 mg de sales biliares (Sigma) , 4.95 mi de tampón de fosfato de potasio 0.1M (pH 7.4) y 149 µ? (3M de NaCl, 75 mM de CaCl2) se agregan. Después del mezclado minucioso, la solución se equilibra durante 30 minutos a 37 °C. La adición de 595 µ? de lipasa de Candida rugosa (Sigma, solución de 50 mg/ml en 5 mM de CaCl2) se lleva a cabo entonces. Durante la noche, la incubación con lipasa con agitación a 37 °C se lleva cabo. Después de aproximadamente 21 horas, la misma cantidad de lipasa se agrega de nuevo; la mezcla se incuba de nuevo a 37 °C con agitación durante al menos 5 horas. La adición de 700 mg de Na2S04 (anhidro) se lleva a cabo entonces; la mezcla se extrae agitando con 1800 _ µ? de éter de petróleo durante aproximadamente 1 minuto y la mezcla se centrifuga a 3500 revoluciones/minuto durante 5 minutos. La fase" superior se transfiere a un nuevo recipiente de reacción y la extracción con agitación se repite hasta que la fase superior es incolora. La fase de éter de petróleo combinada se concentra in vacuo (temperaturas de 40-50°C son posibles) . El residuo se disuelve en 120 µ? de acetona, si es necesario por medio de ultrasonido. Los carotenoides disueltos pueden separarse por medio de HPLC utilizando una columna C30 y se cuantifica con la ayuda de sustancias de referencia. Ejemplo 16: Análisis de HPLC de carotenoides libres El análisis de las muestras obtenidas de acuerdo a los procedimientos de elaboración en el Ejemplo 15 se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones: Se establecen las siguientes condiciones de HPLC. Columna de separación: columna Prontosil C30, 250 x 4.6 mm (Bischoff, Leonberg, Germany) índice de flujo: 1.0 ml/minutos Eluyentes: Eluyente A - 100% de metanol Eluyente B - 80% de metanol, 0.2% de acetato de amonio Eluyente C - 100% de t-butil metil éter Detección: 300-530 nm Perfil de gradiente: Tiempo Indice de flujo % solución A % solución B % solución C 1.00 1.0 95.0 5.0 0 12.00 1.0 95.0 5.0 0 12.10 1 .0 80.0 5.0 15.0 22.00 1.0 76.0 5.0 19.0 22.10 1.0 66.5 5.0 28.5 38.00 1.0 15.0 5.0 80.0 45.00 1 .0 95.0 5.0 0 46.0 1.0 95.0 5.0 0 Algunos tiempos de retención típicos para los carotenoides formados de acuerdo con la invención son por ej emplo : Violaxantina 11.7 minutos, astaxantina 17.7 minutos, adonixanrina 19 minutos, adonirubina 19.9 minutos, zeaxantina 21 minutos.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la preparación de un cetocarotenoide cultivando un organismo no humano, genéticamente modificado, que en comparación con el tipo silvestre tiene una actividad de cetolasa modificada y una actividad de ß-ciclasa modificada, y la actividad de ß-ciclasa modificada se provoca por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2.
  2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un organismo no humano se utiliza, el cual, como el tipo silvestre, tiene ya una actividad de cetolasa, y la modificación genética provoca un incremento en la actividad de la cetolasa en comparación con el tipo silvestre.
  3. 3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde para incrementar la actividad de cetolasa la expresión genética de un ácido nucleico que codifica una cetolasa se incrementa comparada al tipo silvestre.
  4. 4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde para incrementar la expresión genética un ácido nucleico el cual codifica una cetolasa se inserta dentro del organismo .
  5. 5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde como un ácido nucleico que codifica una cetolasa, se inserta un ácido nucleico el cual codifica una cetolasa que comprende la secuencia de aminoácido SEC. DE IDENT. NO. 4 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 4.
  6. 6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utiliza un organismo no humano, el cual, como el tipo silvestre, no tiene actividad de cetolasa y la modificación genética provoca una actividad de cetolasa en comparación con el tipo silvestre.
  7. 7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde se utiliza un organismo genéticamente modificado el cual expresa transgénicamente una cetolasa.
  8. 8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde, para provocar la expresión genética, un ácido nucleico el cual codifica una cetolasa se inserta dentro del organismo .
  9. 9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde se inserta un ácido nucleico que codifica una cetolasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 4 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70% en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 4.
  10. 10. Un organismo no humano, genéticamente modificado, en donde la modificación genética, A para el caso en donde el organismo de tipo silvestre ya tiene una actividad de cetolasa, se incrementa la actividad de cetolasa comparada al tipo silvestre y B para el caso en donde el organismo de tipo silvestre no tiene actividad de cetolasa, provoca la actividad de una cetolasa comparada al tipo silvestre , y en donde la modificación genética C para el caso en donde el organismo de tipo silvestre tiene ya una actividad de ß-ciclasa,- incrementa la actividad de una ß-ciclasa comparada al tipo silvestre y D para el caso en donde el organismo de tipo silvestre no tiene actividad de ß-ciclasa, provoca la actividad de una ß-ciclasa comparada al tipo silvestre y la actividad de ß-ciclasa incrementada de acuerdo a C o producida de acuerdo a D se produce por una ß-ciclasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC. DE IDENT. NO. 2 o una secuencia derivada a partir de esta secuencia por la sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos, la cual tiene una identidad de al menos 70%, en el nivel de aminoácidos con la secuencia SEC. DE IDENT. NO. 2.
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