JP5973425B2 - 同位体を有するリン酸化合物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、同位体を有するリン酸化合物の製造方法に関する。

生体内における化合物の挙動を確認する方法として、同位体を導入した標識化合物の使用が一般的となっている。前記化合物は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸があり、前記同位体は、生体への影響がないことから安定同位体の利用が注目されている。

中でも、安定同位体を導入した核酸の合成は、一般に、予めモノマーに安定同位体を導入し、これを原料としてポリヌクレオチドの合成が行われている。そして、安定同位体を高感度で検出するには、前記ポリヌクレオチドにおいて多数の安定同位体が導入されることが望まれる。しかしながら、この方法によると、多数の安定同位体を導入するには、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ／Ｕの各塩基を含む全てのモノマーに、標識化を行う必要があり、労力がかかりおよびコストが極めて高くなるという問題がある。

また、安定同位体の導入方法として、２，２’−シクロウリジンを安息香酸（ＰｈＣ^１８Ｏ_２Ｈ）により開環し、糖の２’位に、安定同位体を有する水酸基（−^１８ＯＨ）を導入する方法が開示されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法によると、特定のピリミジン塩基を有するヌクレオシドについて標識化できるのみであって、他の塩基を有するヌクレオシドを得ることができない。

このように安定同位体による標識化の労力およびコスト面の問題は、前記核酸に限られたものではなく、例えば、医薬、農薬等の低分子化合物についても同様である。

Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８ Ｊａｎ. ４；７３（１）：３０９−３１１

そこで、本発明は、同位体を有するリン酸化合物を容易に製造する方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の製造方法は、同位体を有するリン酸化合物の製造方法であって、３価リン化合物を、同位体を含む酸化剤で酸化することによって、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する酸化工程を含むことを特徴とする。

本発明の製造方法によれば、前記同位体を含む酸化剤を使用するのみで、同位体を含むリン酸化合物を容易に製造できる。本発明の製造方法は、例えば、リン酸基を有する核酸の合成や、リン酸基を有する農薬、医薬、リン脂質等の低分子化合物の合成に有用である。

図１は、実施例１において、^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の質量分析クロマトグラムである。 図２は、実施例１において、所定のｐＨで処理した^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の質量分析クロマトグラムである。 図３は、実施例２において、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡのＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの写真である。 図４は、実施例２において、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡの円偏光二色性スペクトルを示すグラフである。 図５は、実施例２において、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。 図６は、実施例３において、^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の濃度と、δ^１８Ｏ[‰]との関係を示すグラフである。 図７は、実施例４において、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡの細胞内局在を観察した写真である。

本発明の製造方法は、前述のように、同位体を有するリン酸化合物の製造方法であって、３価リン化合物を、同位体を含む酸化剤（以下、「同位体酸化剤」という）で酸化することによって、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する酸化工程を含むことを特徴とする。

本発明の製造方法によれば、前記同位体酸化剤によって、３価リン化合物の３価リンが５価リンに酸化され、これにともない、前記５価リンに前記同位体酸化剤由来の前記同位体が結合する。このため、前記同位体酸化剤による酸化反応を行うのみで、同位体が導入された５価のリン酸化合物が得られる。このため、本発明によれば、例えば、同位体が導入されたリン酸化合物の用途を、さらに広げることが可能になるといえる。

本発明は、前述のように、前記同位体酸化剤を用いて３価リン化合物を酸化することが特徴であり、その他の構成およびその他の条件は、特に制限されない。

本発明の製造方法は、前述のように、例えば、リン酸基を有する農薬、医薬、リン脂質等の合成、リン酸基を有するＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸や、モノマーであるヌクレオシド−モノリン酸、ヌクレオシド−ジリン酸、ヌクレオシド−トリリン酸の合成等に適用することが好ましく、中でも、前記核酸の合成に適用することが特に好ましい。前記核酸の合成方法は、何ら制限されず、例えば、ホスファイト法、ホスホアミダイト法（またはホスホロアミダイト法ともいう）（以下、アミダイト法）等があげられる。以下に、アミダイト法を例にあげて説明するが、本発明はこれには限定されない。核酸の固相合成において、アミダイト法は、一般に、モノマーアミダイトのカップリング工程、それによって生ずる３価リンの５価リン（リン酸基）への酸化工程および５’末端の糖の保護基をはずす脱保護工程を１サイクルとして、所望の長さになるまで前記サイクルを繰り返し行う。本発明によれば、前記酸化工程において、前記同位体酸化剤を使用するのみで、容易に、ホスホジエステル結合のリン酸基に同位体を導入できる。また、所望のサイクルの酸化工程のみにおいて、前記同位体酸化剤を使用することで、所望のホスホジエステル結合のみに前記同位体を導入できる。さらに、全てのサイクルの酸化工程において、前記同位体酸化剤を使用することで、全てのホスホジエステル結合のリン酸基に前記同位体を導入することもできる。また、従来では、前述のように、標識したい塩基ごとに、同位体が導入されたアミダイトを合成する必要があったため、労力およびコストがかかるという問題があった。しかしながら、本発明によれば、塩基にかかわらず、ホスホジエステル結合のリン酸基に同位体を導入するため、前述のような塩基ごとに同位体が導入されたアミダイトを合成する必要もない。したがって、労力およびコストを極めて低減することが可能であり、また、目的の合成核酸の塩基配列にも影響受けることがない。

本発明において、前記酸化剤による酸化反応は、例えば、前記３価リン化合物における３価リンを５価リンに酸化し、且つ、前記５価リンに前記酸化剤由来の原子を結合させる酸化反応である。このため、本発明において、前記同位体酸化剤は、前記５価リンに結合する前記原子が、前記同位体であればよい。

本発明において、前記同位体酸化剤は、特に制限されず、例えば、前記３価リン化合物における３価リンを５価リンに酸化し、且つ、前記５価リンに原子を供与するものであり、前記５価リンに供与される原子として同位体を有するものであればよい。このような酸化反応を示す酸化剤は、当業者であれば出願時の技術常識から理解可能であり、前記供与される原子として同位体を有する酸化剤は、例えば、市販品を入手でき、また、出願時の技術常識から製造可能である。

前記同位体は、特に制限されず、例えば、安定同位体でもよく、放射性同位体でもよく、好ましくは前者である。前記安定同位体であれば、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから、取り扱い性に優れ、また、コストも抑えることができる。また、前記安定同位体は、例えば、蛍光標識と異なり、標識された化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れている。

前記同位体酸化剤は、特に制限されず、例えば、酸化によって５価リンに同位体酸素を供与する酸素供与体があげられる。前記同位体は、例えば、^１７Ｏ、^１８Ｏ等があげられ、好ましくは、^１８Ｏである。

前記酸素供与体は、例えば、同位体酸素を有する、水またはペルオキシド（過酸化物）があげられる。前記ペルオキシドは、例えば、化学式Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｒ’で表わされ、ＲおよびＲ’は、例えば、Ｈまたは任意の置換基である。ＲおよびＲ’は、同じでも異なってもよい。前記置換基は、特に制限されず、例えば、炭素数１〜１０のアルキル基等があげられ、直鎖でも分岐鎖でもよい。前記アルキル基は、例えば、ｔ-ブチル基等のブチル基等が例示できる。前記ペルオキシドは、例えば、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が、水素、ハロゲンまたは一価金属であることが好ましく、より好ましくは、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が水素であるヒドロペルオキシドがあげられる。前記ヒドロペルオキシドは、例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド等があげられる。前記一価金属は、例えば、アルカリ金属があげられ、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等が例示できる。

前記酸素供与体は、中でも、例えば、純度の高い市販品を入手可能であることから、特に好ましくは、^１８Ｏを有するＨ_２ ^１８Ｏである。前記同位体酸素を有する水を使用する場合、例えば、ヨウ素（Ｉ_２）とピリジン（Ｐｙ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を併用することが好ましい。前記同位体酸素を有する水を使用した場合、得られる５価のリン酸化合物は、例えば、５価のリンに、同位体酸素を有する水酸基（−^１８ＯＨ）が結合していることが好ましく、前記水酸基における水素は、例えば、アルカリ金属等の一価金属等で置換されてもよい。前記アルカリ金属は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等があげられる。

前記同位体酸化剤は、この他に、例えば、酸化によって５価リンに同位体硫黄を供与する硫黄供与体があげられる。前記同位体は、例えば、^３３Ｓ、^３４Ｓ、^３６Ｓ等があげられ、好ましくは、^３４Ｓである。

前記硫黄供与体は、例えば、同位体硫黄を有するジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−を有する化合物）が好ましく、より好ましくは、有機ジスルフィドであり、さらに好ましくは、環状有機ジスルフィドである。ジスルフィドの具体例としては、例えば、３Ｈ−１，２−ベンゾチオール３−オン１，１−ジオキシド、５−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン等があげられ、好ましくは３Ｈ−１，２−ベンゾジチール３−オン１，１−ジオキシドであり、より好ましくは、^３４Ｓを有する３Ｈ−１，２−ベンゾジチール３−オン１，１−ジオキシドである。前記同位体硫黄を有する硫黄供与体を使用した場合、得られる５価のリン酸化合物は、例えば、５価のリンに、同位体硫黄が結合していることが好ましく、具体的には、ホスホロチオエートを形成していることが好ましい。

また、前記同位体酸化剤は、例えば、酸化によって５価リンに同位体ホウ素を供与するホウ素供与体があげられる。前記同位体は、例えば、^１０Ｂ等があげられる。

前記ホウ素供与体は、例えば、同位体ホウ素を有する、アミン・ボラン複合体が好ましく、より好ましくは、トリアルキルアミン・ボラン複合体である。前記トリアルキルアミン・ボラン複合体は、例えば、Ｃ_８Ｈ_１９Ｎ・ＢＨ_３で表わされるジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）・ボラン複合体等があげられ、好ましくは、^１０Ｂを有するＤＩＰＥＡ・ボラン複合体Ｃ_８Ｈ_１９Ｎ・^１０ＢＨ_３である。前記同位体ホウ素を有するＤＩＰＥＡ・ボラン複合体を使用した場合、得られる５価のリン酸化合物は、例えば、５価のリンに、同位体ホウ素を有するボラン基（−^１０ＢＨ_３ ⁻）が結合していることが好ましく、具体的には、ボラノフォスフェートを形成していることが好ましい。前記アミン・ボラン複合体において、前記ボラン基の水素は、例えば、ハロゲンで置換されてもよい。前記ハロゲンは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等があげられる。また、前記ボラン基は、例えば、一価金属または二価金属と塩を形成してもよい。前記一価金属は、例えば、アルカリ金属であり、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等が例示できる。二価金属は、例えば、アルカリ土類金属であり、例えば、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウム等があげられる。

本発明において、前記３価リン化合物は、特に制限されず、３価のリンを有する化合物であればよい。前記３価リン化合物は、例えば、亜リン酸、亜リン酸エステルがあげられる。

前記亜リン酸は、例えば、亜リン酸［ＨＰ（Ｏ）（ＯＨ）_２］の他に、亜リン酸塩、亜リン酸誘導体等を含む。本発明の製造方法によれば、前記３価リン化合物として前記亜リン酸を使用することにより、リンに同位体が結合したリン酸を製造できる。得られるリン酸は、例えば、リン酸塩、リン酸誘導体等の意味も含む。

前記亜リン酸エステルは、例えば、亜リン酸モノエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＸ^２）−ＯＸ^３］、亜リン酸ジエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＸ^３］、亜リン酸トリエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＲ^３］のいずれでもよい。前記Ｘ^２およびＸ^３は、例えば、水素、または一価金属である。前記一価金属は、例えば、アルカリ金属であり、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等が例示できる。前記Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、何ら限定されず、後述する炭化水素基等の各種有機基があげられる。前記３価リン化合物として前記亜リン酸エステルを使用することにより、リンに同位体が結合したリン酸エステルを製造できる。

本発明の製造方法により合成される前記５価のリン酸化合物が、前記核酸の場合、前記核酸は、例えば、モノマーでもよいし、前記モノマーが重合したポリマーでもよい。

前記モノマーは、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡを構成するヌクレオチドがあげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、糖と塩基からなるヌクレオシドに、５価のリン酸基が結合している。前記ヌクレオチドは、具体的には、糖、塩基および５価のリン酸基を有し、前記糖の１’位に前記塩基が結合し、前記糖の５’位、３’位または２’位に前記５価のリン酸基が結合している。前記ヌクレオチドは、具体的には、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドがあげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、前記ヌクレオチドの誘導体の意味も含む。前記ポリマーは、例えば、前記ヌクレオチドの重合体であり、具体的には、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの重合体（ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）等があげられる。前記ポリマーにおいて、例えば、前記モノマーの重合数は限定されず、オリゴマーの意味も含む。前記ポリマーは、例えば、一方のヌクレオチドの糖と、他方のヌクレオチドの糖とが、前記リン酸基を介して結合している。具体的には、例えば、前記ヌクレオチド残基間は、一方の糖の５’位、３’位または２’位と、他方の糖の５’位、３’位または２’位とが、前記リン酸基を介して結合していることが好ましい。前記一方のヌクレオチドの糖と、前記他方のヌクレオチドの糖との結合部位の組合せは、特に制限されず、５’位と３’位の組合せ、５’位と５’位の組合せ、３’位と３’位の組合せ、２’位と５’位の組合せ等があげられる。

前記ヌクレオチドにおいて、前記糖は、例えば、２’位の炭素原子にヒドロキシ基が結合したリボースでもよいし、前記２’位の炭素原子に水素原子が結合したデオキシリボースでもよい。前記リボースは、例えば、前記ヒドロキシ基が、任意の原子または基で置換（修飾）されてもよい。前記原子は、例えば、水素原子、ハロゲン原子等があげられ、前記ハロゲン原子は、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等があげられ、中でもＦ（フッ素原子）が好ましい。前記基は、例えば、アルコキシ基（−Ｏ−アルキル基）、アシルオキシ基（−Ｏ−アシル基）および、アミノ基（ＮＨ_２基）またはそのＨが置換基で置換された置換アミノ基等があげられる。前記アルコキシ基（−Ｏ−アルキル基）は、特に制限されず、例えば、メトキシ基（−Ｏ−Ｍｅ基）があげられ、前記アルキル基は、制限されない。前記アシルオキシ基（−Ｏ−アシル基）は、特に制限されず、例えば、−Ｏ−ＣＨＯ基等があげられ、前記アシル基は、制限されない。また、前記デオキシリボースは、例えば、前記水素原子が、任意の原子に置換（修飾）されてもよい。前記原子は、例えば、前記ハロゲン原子等があげられる。

前記塩基は、特に制限されず、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等があげられ、その他に、これらの置換塩基として、例えば、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノプリン、５−フロロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、４−トリアゾロ−５−メチルウラシルおよびヒポキサンチン等があげられる。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。

前記同位体が導入された前記モノマーを製造する場合、例えば、前記３価リン化合物として、前記３価リンを有するヌクレオシドを、前記同位体酸化剤により酸化する。この方法によれば、前記ヌクレオシドに結合した前記３価リンが酸化により前記５価リンとなり、前記５価リンに前記同位体酸化剤由来の同位体が結合する。このため、同位体を有するモノマーを得ることができる。

前記３価リンを有するヌクレオシドは、例えば、糖と塩基を含み、前記糖の１’位に塩基が結合し、前記糖に前記３価リンが結合していることが好ましく、より好ましくは、前記糖の５’位、３’位または２’位に前記３価リンが結合している。

前記３価リンを有するヌクレオシドは、前述のように、例えば、前記亜リン酸エステルであり、具体的に、亜リン酸モノエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＸ^２）−ＯＸ^３］、亜リン酸ジエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＸ^３］または亜リン酸トリエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＲ^３］のいずれで表わすこともできる。前記Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３のいずれかが、前記ヌクレオシドであることが好ましい。

前記同位体が導入された前記ポリマーを製造する場合、例えば、以下に示す第１の方法および第２の方法があげられる。

第１の方法は、例えば、前記３価リン化合物として、予め合成した３価リンを有するヌクレオシド残基を含むポリマーを使用し、これを前記同位体酸化剤により酸化して、同位体を導入する方法である。この方法によれば、前記ポリマーにおける前記３価リンが酸化により前記５価リンとなり、前記５価リンに前記同位体酸化剤由来の同位体が結合するため、同位体を有するポリマーを得ることができる。

前記３価リンを有する前記ポリマーは、２以上のヌクレオシド残基を含むポリマーである。前記ヌクレオシド残基は、糖と塩基を含み、前記糖の１’位に前記塩基が結合し、前記ヌクレオシド残基間は、それぞれの糖が、リンを介して結合している。具体的には、例えば、前記ヌクレオシド残基間は、一方の糖の５’位、３’位または２’位と、他方の糖の５’位、３’位または２’位とが、リンを介して結合していることが好ましい。前記一方のヌクレオチドの糖と、前記他方のヌクレオチドの糖との結合部位の組合せは、特に制限されず、５’位と３’位の組合せ、５’位と５’位の組合せ、３’位と３’位の組合せ、２’位と５’位の組合せ等があげられる。そして、少なくとも一組のヌクレオシド残基間のリンが、前記３価リンである。前記ポリマーにおいて、前記ヌクレオシド残基間のリンは、例えば、少なくとも一つが３価リンでもよいし、全てが３価リンでもよい。前者の場合、前記ポリマーにおける３価リンのみが５価リンに酸化され、前記５価リンに前記同位体酸化剤由来の同位体が導入され、後者の場合、全てのヌクレオシド残基間の３価リンが５価リンに酸化され、前記５価リンに前記同位体酸化剤由来の同位体が導入される。

前記３価リン化合物は、例えば、前述のように、前記亜リン酸エステルである。前記亜リン酸エステルは、例えば、亜リン酸ジエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＸ^３］、亜リン酸トリエステル［Ｒ^１Ｏ−Ｐ（ＯＲ^２）−ＯＲ^３］のいずれかで表わすことができる。前記Ｒ^１およびＲ^２が、前記ヌクレオシド残基または前記ヌクレオシド残基のポリマーであることが好ましく、両者は、同じでも異なってもよい。前記Ｒ^１および／またはＲ^２が、前記ヌクレオシド残基のポリマーの場合、前記ポリマーは、例えば、前記ヌクレオチド残基がホスホジエステル結合したポリマー（ポリヌクレオチド）でもよいし、前記ヌクレオチド残基が３価リンを介して結合したポリマーでもよい。前記ポリマーを構成するヌクレオチド残基の数は、制限されない。

第２の方法は、例えば、ヌクレオシドのカップリングと、前記同位体酸化剤を用いた酸化による同位体の導入とを行う方法である。これにより、任意のヌクレオシド残基間の５価リンに前記同位体を導入して、同位体を有するポリマーを合成できる。前記ポリマーの合成方法は、特に制限されず、例えば、ホスファイト法、アミダイト法等があげられる。これらの合成方法は、例えば、固相合成でもよいし、液相合成でもよく、特に制限されない。

具体的に、第２の方法は、例えば、さらに、ヌクレオシドを含む２分子のモノマーをカップリングして、前記３価リン化合物を合成するカップリング工程を有し、前記酸化工程において、前記カップリング工程により得られた前記３価リン化合物を、前記同位体酸化剤により酸化して、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する方法である。

前記モノマーの種類は、特に制限されず、公知のモノマーが使用できる。前記一方のモノマーは、例えば、前記ヌクレオシドの糖において、前記他方のモノマーと結合する部位に、３価リンが結合し、その他の水酸基を有する部位に、前記水酸基に対する保護基が結合していることが好ましい。前記３価リンが結合する部位は、特に制限されず、５’位、３’位または２’位があげられ、前記保護基が結合する部位は、特に制限されず、５’位、３’位または２’位があげられる。前記３価リンの結合部位と前記保護基の結合部位の組合せは、特に制限されず、例えば、５’位と３’位の組合せ、５’位と５’位の組合せ、３’位と３’位の組合せ、２’位と５’位の組合せ等があげられる。具体例として、前記一方のモノマーは、例えば、前記ヌクレオシドの糖の３’位に３価リンが結合し、前記糖の５’位に水酸基の保護基が結合していることが好ましい。前記３価リンは、水酸基と反応する反応基を有することが好ましい。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等があげられる。

前記他方のモノマーは、前記ヌクレオシドの糖において、前記一方のモノマーと結合する部位が、前記保護基がはずれた水酸基であることが好ましい。前記一方のモノマーと結合する部位は、特に制限されず、５’位、３’位または２’位があげられる。具体例として、前記他方のモノマーは、前記ヌクレオシドの糖の５’位の保護基がはずれ、水酸基であることが好ましい。前記カップリング工程において、前記２分子のモノマーをカップリングすると、前者の前記反応基（例えば、３’位）と、後者の前記糖の水酸基（例えば、５’位）とが反応し、前記モノマー間が３価リンを介して結合する。前記モノマー間の３価リンを前記同位体酸化剤で酸化することにより、３価リンが５価リンに酸化され、同位体を有するホスホジエステル結合で前記ヌクレオシドが結合したポリマーが合成される。

前記保護基が結合したモノマーは、特に制限されず、例えば、前述のようなホスファイト法、アミダイト法等に使用するモノマーが適用できる。前記アミダイト法のモノマーは、例えば、公知のホスホロアミダイトがあげられ、具体例としては、例えば、ＴＢＤＭＳ−アミダイト、ＴＯＭ-アミダイト、ＡＣＥ−アミダイト等があげられる。

前記ヌクレオシドは、特に制限されず、前述と同様に、糖と塩基を含み、前記糖の１’位に前記塩基が結合している。固相合成を行う場合、前記後者のモノマーは、例えば、前記前者のモノマーとの結合部位以外が、固相に固定化されていることが好ましい。具体例として、前記後者のモノマーが、例えば、前記糖の５’位が水酸基であるモノマーの場合、例えば、前記糖の３’位が固相に固定化されていることが好ましい。

前記第２の方法は、例えば、さらに、前記ヌクレオシドの糖の前記保護基（例えば、５’位）をはずす脱保護工程を含んでもよい。脱保護の方法は、特に制限されず、例えば、保護基の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。

また、前記第２の方法は、ヌクレオシドのカップリングと前記同位体酸化剤を用いた酸化による同位体の導入とを、繰り返し行うこともできる。具体的には、さらに、前記５価のリン酸化合物に、ヌクレオシドを含む新たなモノマーをカップリングして、前記３価のリン化合物を合成するカップリング工程を有し、前記カップリング工程により得られた前記３価リン化合物を、前記同位体酸化剤により酸化して、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する方法でもよい。

このようにカップリング工程と酸化工程とを繰り返し行い、所望の前記酸化工程または全ての酸化工程において、前記同位体酸化剤を使用することで、所望のホスホジエステル結合に同位体を導入できる。

前記５価のリン酸化合物に新たなモノマーをカップリングする際、例えば、前記５価のリン酸化合物について、５’末端のヌクレオシドにおける糖の保護基（例えば、５’位）を脱保護した後、前記モノマーをカップリングすることが好ましい。すなわち、前記第２の方法は、前記カップリング工程と前記酸化工程と前記脱保護工程とを繰り返し行うことが好ましい。この繰り返しの回数は、何ら制限されず、所望のポリマーの長さとなるまで行うことができる。

以下に、前記同位体を有する同位体酸化剤を使用して、核酸へ同位体を導入する反応の一例を示す。本発明は、これらの例に制限されない。下記式において、糖の２’位におけるＲは、特に制限されず、例えば、前述した炭化水素基があげられる。下記式に示すように、例えば、Ｉ_２／Ｐｙ／Ｈ_２ ^１８Ｏで酸化することによって、リン酸基に−^１８ＯＨを導入でき、^３４Ｓを有する３Ｈ−１，２−ベンゾジチール３−オン１，１−ジオキシドで酸化することによって、リン酸基に−^３４Ｓ⁻を導入でき、ＤＩＰＥＡ・ボラン複合体で酸化することによって、リン酸基に−^１０ＢＨ_３ ⁻を導入できる。

本発明の製造方法によれば、例えば、リン酸基に同位体が導入された農薬、医薬、リン脂質等を製造することもできる。前記農薬は、例えば、マラソン、スミチオン等があげられ、前記医薬は、例えば、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウム（商品名：クレイトン）等があげられる。

以下に、アルコールを出発原料として、リン酸基に同位体が導入された低分子リン酸化合物を合成する反応の一例を示す。本発明は、これには制限されない。下記式（１）において、Ｒは、何ら制限されず、例えば、前述のような炭化水素基があげられる。まず、反応１において、Ｒ−ＯＨと３価リン供与体とを反応させ、３価リン化合物を合成する。前記３価リン供与体は、特に制限されず、例えば、以下に示すシアノ基を有する化合物として、クロロ（ジイソプロピルアミノ）亜ホスフィン酸２−シアノエチル（N,N-Diisopropylamino cyanoethyl phosphonamidic chloride）または２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピル ホスファン（2-Cyanoethyl N,N,N,N-tetraisopropyl phosphane）があげられる。そして、前述のような前記同位体酸化剤を用いて、反応２を行うことで、Ｘに同位体が導入された５価のリン酸化合物が得られる。前記同位体酸化剤は、例えば、Ｘに同位体酸素を導入する場合は、前記酸素供与体、Ｘに同位体硫黄を導入する場合は、前記硫黄供与体、Ｘに、同位体ホウ素を導入する場合は、前記ホウ素供与体を使用することが好ましい。

本発明の製造方法により得られる同位体含有リン酸化合物は、例えば、従来のリン酸化合物に代えて使用でき、その用途は何ら制限されない。

つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により限定及び制限されない。

［実施例１］
（１）^１８Ｏで標識されたＲＮＡの合成
合成ＲＮＡとして、ホスホジエステル結合の各リン酸基に１つの^１８Ｏを導入した、塩基長２０ｍｅｒの^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）を合成した。モノマー原料として、ＴＢＤＭＳ−アミダイトを使用し、核酸合成機（商品名ＡＢＩ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９、ＡＢＩ社）を用いて、ホスホロアミダイト法に基づいて、カップリング工程、酸化工程、およびリボース残基の５’位の保護基ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基をはずす脱保護工程を１サイクルとして１９サイクル繰り返した。全ての酸化工程において、同位体酸化剤として、同位体酸素^１８Ｏを有するＨ_２ ^１８Ｏ（ＷＡＴＥＲ−^１８Ｏ、純度^１８Ｏ ａｔｏｍ％＝９９．２％、大陽日酸株式会社）を含む組成物を使用した。前記組成物は、０．１ｍｏｌ／Ｌヨウ素を含むＴＨＦ／ピリジン／水の混合液を使用した。前記混合液において、ＴＨＦ：ピリジン：水の混合比（体積比）は、７８：２０：２とした。なお、前記Ｈ_２ ^１８Ｏを含む前記組成物を使用した以外は、定法に従った。

（２）分子量測定
得られた^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）について、定法に基づき、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（商品名Ｂｒｕｋｅｒ ＡＵＴＯＦＬＥＸ）を使用して分子量を測定した。

分析結果を図１に示す。図１は、合成ＲＮＡの質量分析結果を示すクロマトグラムである。^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の実測値は６０９４．２であった。

^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）は、前述のようにカップリング工程、酸化工程および脱保護工程を１９サイクル行っていることから、理論上、^１８Ｏが１９個導入されていることとなる。このため、^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の分子量は、未標識ポリ（Ｕ）の分子量６０６１．４と比較して、３８（２×１９原子）増加する計算となる。しかしながら、実際には、使用したＨ_２ ^１８Ｏの純度が９９．２％であるため、分子量は、２×１９原子×（純度０．９９２）^１９＝３２．６増加することとなる。これに基づくと、合成した前記^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の理論分子量は、６０６１．４＋３２．６＝６０９４．０となる。前述のように実測値は６０９４．２であることから、理論分子量６０９４．０と極めて近似している。したがって、この結果から、実施例により、２０ｍｅｒのポリ（Ｕ）において、１９箇所のホスホジエステル結合のリン酸基に^１８Ｏが導入されたことが証明された。

（３）ｐＨ安定性評価
得られた^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）について、ｐＨ安定性を評価した。具体的には、所定ｐＨ（ｐＨ３、４、５．５、７、８．５）の５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に、２０μｍｏｌ/Ｌとなるように^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）を混合し、３７℃で２８日間インキュベートした。そして、インキュベート後の前記^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）について、ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−Ｔｏｆ-ＭＳ（商品名：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＮＡＰＴ Ｇ２ ＭＳ）を用いて分子量を分析することにより、その安定性を確認した。

これらの結果を図２に示す。図２は、前記各ｐＨでインキュベートした後の^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の質量分析結果を示すクロマトグラムである。図２において、上のグラフから順に、ｐＨ３．０、４．０、５．５、７．０および８．５で処理した後の結果である。図２に示すように、いずれのｐＨで処理しても、^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の分子量は、インキュベート前の分子量（実測値：６０９４．２）から変化が無かった。この結果から、^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）は、ｐＨ３〜８．５において安定であることが確認された。すなわち、^１８Ｏ標識は、ｐＨ３〜８．５において、周辺環境の水分子（Ｈ_２ ^１６Ｏ）と交換されずに安定であることが確認された。このことは、^１８Ｏ標識が、生体環境においても同様に安定であり、^１８Ｏ標識が、トレーサーとして必要な安定性を有していることを示す。

［実施例２］
（１）^１８Ｏ標識化ｓｉＲＮＡの合成
前記実施例１と同様のＲＮＡ合成方法により、下記配列番号１〜４に示す２１塩基長のＲＮＡを合成した。なお、前記カップリング工程、前記酸化工程および前記脱保護工程は、これらを１サイクルとして２０サイクル繰り返した。これらのＲＮＡは、いずれも、前記ＲＮＡ合成方法により、ホスホジエステル結合の各リン酸基に１つの^１８Ｏが導入された。つまり、各ＲＮＡは、２０個の^１８Ｏが導入された。他方、酸化剤として、未標識のＨ_２ ^１６Ｏを使用した以外は、同様にして、配列番号１〜４のＲＮＡを合成した。

ターゲット用センスＲＮＡ
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAG-3’ （配列番号１）
ターゲット用アンチセンスＲＮＡ
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’ （配列番号２）
コントロール用センスＲＮＡ
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUU-3’ （配列番号３）
コントロール用アンチセンスＲＮＡ
5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’ （配列番号４）

^１８Ｏが導入された一本鎖ＲＮＡを、それぞれ、ターゲット用^１８Ｏ‐センスＲＮＡ、ターゲット用^１８Ｏ-アンチセンスＲＮＡ、コントロール用^１８Ｏ‐ＲＮＡセンス、コントロール用^１８Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとした。また、^１８Ｏが未導入である^１６Ｏを有する一本鎖ＲＮＡを、それぞれ、ターゲット用^１６Ｏ‐センスＲＮＡ、ターゲット用^１６Ｏ-アンチセンスＲＮＡ、コントロール用^１６Ｏ‐センスＲＮＡ、コントロール用^１６Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとした。

（２）一本鎖ＲＮＡの分子量測定
得られた各一本鎖ＲＮＡについて、前記実施例１と同様にして、分子量を測定した。下記表１に、測定した分子量（Observed mass）および理論上の算出値（Calculated mass）を併せて示す。なお、理論上の算出値は、使用したＨ_２ ^１８Ｏの^１８Ｏ純度９９．２％を考慮して求めた。

前記表１に示すように、^１８Ｏを導入した各ＲＮＡは、実測値が、理論値と極めて近似していた。この結果から、^１８Ｏを導入した２１塩基長のＲＮＡは、それぞれ、２０箇所のホスホジエステル結合のリン酸基に^１８Ｏが導入されたことが証明された。

前記ターゲット用センスＲＮＡの３’末端の２塩基（ＡＧ）および前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡの３’末端の２塩基（ＵＵ）は、オーバーハング配列であり、前記ターゲット用センスＲＮＡおよび前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡは、前記オーバーハングを除く１９塩基長が完全に相補である。以下に示す前記ターゲット用センスＲＮＡと前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡとの二本鎖は、ヒトＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ（ターゲット^１８Ｏ‐ｓｉＲＮＡ）である。

前記コントロール用センスＲＮＡの３’末端の２塩基（ＵＵ）および前記コントロール用アンチセンスＲＮＡの３’末端の２塩基（ＵＵ）は、オーバーハング配列であり、前記コントロール用センスＲＮＡおよび前記コントロール用アンチセンスＲＮＡは、前記オーバーハングを除く１９塩基長が完全に相補である。前記コントロール用センスＲＮＡと前記コントロール用アンチセンスＲＮＡとの二本鎖は、ヒトＧＡＰＤＨに対するＲＮＡ干渉能を示さないｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロール^１８Ｏ‐ｓｉＲＮＡ）である。

（３）各一本鎖ＲＮＡの純度評価
得られた各一本鎖ＲＮＡについて、下記条件のＨＰＬＣによって純度を分析した。前記純度は、前記ＨＰＬＣにおける全ピーク面積を１００％とし、前記各一本鎖ＲＮＡの理論分子量に該当するリテンションタイムにおけるピーク面積の割合で示す。

（ＨＰＬＣ条件）
分析装置：Shimadzu LC-10A system（島津製作所）
カラム：XBridge OST C18, 2.5μm（Waters）
カラムサイズ：4.6×50mm
溶出液：
Ａ：50mmol/L 酢酸トリエチルアンモニウム（pH7.4） ＋ 5% アセトニトリル
Ｂ：50mmol/L 酢酸トリエチルアンモニウム（pH7.4） ＋ 50% アセトニトリル
グラジェント：%B 5%→10%／20min
流速：1.0 mL/min
検出器：UV検出器（254nm）

これらの分析結果を、下記表２に示す。下記表２に示すように、^１８Ｏを導入した各ＲＮＡは、いずれも高い純度を示し、^１８Ｏ未導入の^１６Ｏ‐ＲＮＡと同程度であった。この結果から、^１８Ｏ標識したＲＮＡは^１８Ｏ未導入のＲＮＡと同収率、同純度で合成できることが証明された。

（４）二本鎖ＲＮＡの形成
得られた各一本鎖ＲＮＡを組合せて、以下に示すように、二本鎖ＲＮＡを形成した。

前記コントロール用センスＲＮＡ（配列番号３）の３’末端の２塩基（ＵＵ）および前記コントロール用アンチセンスＲＮＡ（配列番号４）の３’末端の２塩基（ＵＵ）は、オーバーハング配列であり、前記コントロール用センスＲＮＡおよび前記コントロール用アンチセンスＲＮＡは、前記オーバーハングを除く１９塩基長が完全に相補である。前記コントロール用センスＲＮＡと前記コントロール用アンチセンスＲＮＡとの二本鎖は、ヒトＧＡＰＤＨに対するＲＮＡ干渉能を示さないｓｉＲＮＡである。

そこで、下記組合せのコントロール用ｓｉＲＮＡを形成した。
（ｃ１）前記コントロール用^１６Ｏ‐センスＲＮＡと前記コントロール用^１６Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１６Ｏ／^１６Ｏ）
（ｃ２）前記コントロール用^１６Ｏ‐センスＲＮＡと前記コントロール用^１８Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１６Ｏ／^１８Ｏ）
（ｃ３）前記コントロール用^１８Ｏ‐センスＲＮＡと前記コントロール用^１６Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１８Ｏ／^１６Ｏ）
（ｃ４）前記コントロール用^１８Ｏ‐センスＲＮＡと前記コントロール用^１８Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）

他方、前記ターゲット用センスＲＮＡ（配列番号１）の３’末端の２塩基（ＡＧ）および前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡ（配列番号２）の３’末端の２塩基（ＵＵ）は、オーバーハング配列であり、前記ターゲット用センスＲＮＡおよび前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡは、前記オーバーハングを除く１９塩基長が完全に相補である。以下に示す前記ターゲット用センスＲＮＡと前記ターゲット用アンチセンスＲＮＡとの二本鎖は、ヒトＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡである。

そこで、下記組合せのターゲット用ｓｉＲＮＡを形成した。
（ｔ１）前記ターゲット用^１６Ｏ‐センスＲＮＡと前記ターゲット用^１６Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１６Ｏ／^１６Ｏ）
（ｔ２）前記ターゲット用^１６Ｏ‐センスＲＮＡと前記ターゲット用^１８Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１６Ｏ／^１８Ｏ）
（ｔ３）前記ターゲット用^１８Ｏ‐センスＲＮＡと前記ターゲット用^１６Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１８Ｏ／^１６Ｏ）
（ｔ４）前記ターゲット用^１８Ｏ‐センスＲＮＡと前記ターゲット用^１８Ｏ‐アンチセンスＲＮＡとの組み合わせ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）

そして、電気泳動により前記（ｃ１）〜（ｃ４）および（ｔ１）〜（ｔ４）のｓｉＲＮＡを電気泳動に供し、それぞれの分子量を確認した。電気泳動は、１５％アクリルアミドゲルを使用した。

図３に、前記各ｓｉＲＮＡの二本鎖形成の確認結果を示す。図３は、各ｓｉＲＮＡの形成を確認するＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの写真であり、レーン１〜４は、前記（ｃ１）〜（ｃ４）のコントロール用ｓｉＲＮＡであり、レーン５〜８は、前記（ｔ１）〜（ｔ４）のターゲット用ｓｉＲＮＡである。図３に示すように、レーン１〜４の前記コントロール用ｓｉＲＮＡは、同程度の分子量を示し、レーン５〜８の前記ターゲット用ｓｉＲＮＡは、同程度の分子量を示した。この結果から、^１８Ｏを導入したＲＮＡは、^１８Ｏ未導入のＲＮＡと同様に二本鎖を形成し、ｓｉＲＮＡとなることが示された。

（５）ｓｉＲＮＡの構造
前記（４）における各ｓｉＲＮＡについて、円偏光二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）により、構造を比較した。測定は、分光偏光計（商品名Ｊ−７２０Ｗ、ジャスコインターナショナル）を用いて行った。図４に、ＣＤスペクトルの結果を示す。図４には、前記（ｃ１）〜（ｃ４）および（ｔ１）〜（ｔ４）のｓｉＲＮＡのうち、前記（ｃ４）コントロール用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）および前記（ｔ４）ターゲット用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）の結果を示した。図４において、縦軸が、ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ（分子楕円率）（ミリ度：ｍｄｅｇ）であり、横軸が、波長（ｎｍ）である。図４（Ａ）は、前記（ｃ４）コントロール用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）の結果であり、図４（Ｂ）は、前記（ｔ４）ターゲット用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）の結果である。

前記（ｃ１）〜（ｃ３）コントロール用ｓｉＲＮＡ（図示せず）は、全て、図４（Ａ）の前記（ｃ４）コントロール用ｓｉＲＮＡと同じＣＤスペクトルを示し、前記（ｔ１）〜（ｔ３）ターゲット用ｓｉＲＮＡ（図示せず）は、全て、図４（Ｂ）の前記（ｔ４）ターゲット用ｓｉＲＮＡと同じＣＤスペクトルを示した。この結果から、４種類のコントロール用ｓｉＲＮＡは、同様の構造を有し、４種類のターゲット用ｓｉＲＮＡは、同様の構造を有していることが、それぞれ確認された。すなわち、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡは、^１８Ｏ未導入のｓｉＲＮＡと同様の構造を有していることが示された。

（６）ｓｉＲＮＡの熱力学的安定性
前記（４）における各ｓｉＲＮＡについて、熱力学的安定性を確認した。前記熱力学的安定性（Ｔｍ値）は、分光光度計（商品名ＵＶ−１８００ ＵＶ−ＶＩＳ、島津製作所）により測定した。

下記表３に、前記熱力学的安定性の確認結果を示す。下記表３に示すように、ターゲット用ｓｉＲＮＡについて、各ｓｉＲＮＡは、同様の熱力学的安定性を示すことが確認された。また、コントロール用ｓｉＲＮＡについて、各ｓｉＲＮＡは、同様の熱力学的安定性を示すことが確認された。これにより、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡは、熱力学的安定性が、^１８Ｏ未導入のｓｉＲＮＡと同程度であることがわかった。

（７）ｓｉＲＮＡの生物活性
前記（４）における各ｓｉＲＮＡについて、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、発現抑制能を確認した。

細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２とした。培地は、１０％の非働化仔牛血清を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地を使用した。

まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０^４細胞／ウェルとなるように分注した。そして、前記細胞に、トランスフェクション試薬（商品名Lipofectamine 2000、Invitrogen)を用いて、添付プロトコールに従って、前記ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたり、前記ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬との複合体１００μＬを添加し、全量を５００μＬとし、前記ｓｉＲＮＡの最終濃度を、０．１ｎｍｏｌ／Ｌとした。

トランスフェクション後、前記細胞を２４時間培養した。そして、試薬（商品名RNeasy Mini Kit、Qiagen）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名SuperScript III、Invitrogen社製）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。前記ＰＣＲにおいて、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ下記のプライマーセットを使用した。発現量は、前記ｓｉＲＮＡを添加していない細胞におけるヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１として、相対的に比較した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’ （配列番号５）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’ （配列番号６）
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’ （配列番号７）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’ （配列番号８）

なお、コントロール１として、前記ｓｉＲＮＡおよび前記トランスフェクション試薬を添加していない細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ｓｉＲＮＡを未添加とし、前記トランスフェクション試薬のみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。

これらの結果を、図５に示す。図５は、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図５に示すように、^１８Ｏを導入したターゲット用ｓｉＲＮＡは、いずれも、^１８Ｏ未導入のターゲット用ｓｉＲＮＡと同様の発現抑制活性を示した。この結果から、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡについても、^１８Ｏ未導入である^１６Ｏを有するｓｉＲＮＡと同様に使用できることが確認できた。

［実施例３］
前記実施例１で合成した^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）について、血清中濃度の測定を行った。

マウスのプール血清に、前記^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）を、所定濃度となるように添加して、血清サンプルを調製した。前記所定濃度は、０、０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２μｇ／ｍＬとした。前記血清サンプルを銀カプセルに入れて凍結乾燥した。そして、凍結乾燥した前記血清サンプルを、ガス化前処理装置に接続した安定同位体比質量分析計に供した。前記ガス化前処理装置は、Thermo Fisher Scientific社製のTC/TAを使用し、前記安定同位体比質量分析計は、Thermo Fisher Scientific社製のVELTA V Plusを使用した。そして、前記血清サンプルの測定値を下記式に代入して、δ^１８Ｏ（千分率：‰）を求めた。下記式において、Ｒ（ｓ）は、前記血清サンプルの^１８Ｏ／^１６Ｏ比率の測定値であり、Ｒ（ｒ）は、標準物質の^１８Ｏ／^１６Ｏ比率の測定値である。
δ^１８Ｏ（‰）＝[Ｒ（ｓ）／Ｒ（ｒ）−１]×１０００

図６に、δ^１８Ｏ値と^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）濃度との相関関係のグラフを示す。図６において、縦軸がδ^１８Ｏ値（‰）であり、横軸が前記^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の濃度である。図６に示すように、δ^１８Ｏ値と前記^１８Ｏ標識化ポリ（Ｕ）の濃度とは、正の相関があり、相関係数（Ｒ）０．９９９という優れた相関性を示した。

従来、ＲＮＡの血中濃度を測定する方法は、放射性同位体標識したＲＮＡが用いられている。しかし、放射性同位体は、被爆の危険性が懸念されている。これに対して、本実施例では、安定同位体である^１８Ｏが導入されたＲＮＡを使用しており、図６に示すように、^１８Ｏ標識化ＲＮＡによっても、血中において、ＲＮＡ濃度とδ^１８Ｏ値（‰）とが相関関係を示すことが確認された。このため、医薬品等のＲＮＡとして^１８Ｏが導入されたＲＮＡを使用することで、例えば、生体への投与後、安全を維持し且つ血中濃度を測定することが可能であることがわかる。

［実施例４］
前記実施例２で合成した^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡについて、安定同位体顕微鏡を用いて、細胞内局在を観察した。

（１）ｓｉＲＮＡ
前記実施例２で調製した前記^１８Ｏ−センスＲＮＡと^１８Ｏ−アンチセンスＲＮＡとを組合せた前記（ｃ４）コントロール用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）を使用した。

（２）サンプルの調製
７ｍｍ×７ｍｍのシリコンウェハーを、３５ｍｍディッシュの中央に置いた。前記ディッシュに、ヒト肺由来Ａ５４９細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ディッシュとなるように播種し、培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２、２４時間とした。培地は、１０％ＦＣＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ｓｉｇｍａ）を使用した。培養後、２ｍＬの新しい培地に交換し、ｓｉＲＮＡを最終濃度３００ｎｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、トランスフェクション試薬（商品名Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００、Invitrogen社製）を用いて、トランスフェクションした。前記トランスフェクション後、さらに、２４時間培養した。前記培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液で、３７℃、１時間処理して、前記細胞を固定した。その後、前記固定した細胞を、２０、４０、６０、７０、８０、９０、１００％エタノールに、この順序で１０分間ずつ浸すことで、脱水した。そして、ｔｅｒｔ−ブタノールを前記脱水後の細胞に添加し、冷凍庫で凍結後、乾燥した。前記凍結乾燥物に、厚さ３０ｎｍの金コーティングを施した。このようにして、サンプルを作製した。

（３）安定同位体顕微鏡による観察
前記サンプルを、安定同位体顕微鏡システム（北海道大学、Ｃａｍｅｃａ ｉｍｓ−１２７０＋ＳＣＡＰＳ）で観察した。前記観察において、一次ビームとしてセシウムを使用し、^１２Ｃ^１４Ｎ、^１６Ｏ、^１８Ｏの２次イオンイメージを得た。この観察結果を、図７に示す。図７は、前記コントロール用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）の細胞内局在を観察した顕微鏡写真である。図７において、左上の写真は、^１６Ｏの２次イオンイメージであり、左下の写真は、^１２Ｃ^１４Ｎの２次イオンイメージであり、右上の写真は、^１８Ｏの２次イオンイメージであり、右下の写真は、^１８Ｏ／^１６Ｏの２次イオンイメージである。

^１２Ｃ^１４Ｎの２次イオンイメージは、有機物のイメージングであることから、図７の左下の写真（^１２Ｃ^１４Ｎ）により、細胞の形態が確認できた。^１６Ｏの２次イオンイメージは、^１６Ｏの強度が強い部分が白く、弱い部分は黒く見える。図７の左上の写真（^１６Ｏ）は、全体的に黒っぽいことから、天然の^１６Ｏが均等に存在していることが確認できた。また、^１８Ｏの２次イオンイメージは、^１８Ｏの強度が強い部分が白く、弱い部分は黒く見える。図７の右上の写真（^１８Ｏ）では、細胞質に該当する領域に、白い点が多数見られることから、投与した前記コントロール用ｓｉＲＮＡ（^１８Ｏ／^１８Ｏ）が、細胞質に局在していることが確認できた。つぎに、^１８Ｏ／^１６Ｏの２次イオンイメージは、^１８Ｏの２次イオンイメージ（^１８Ｏの強度）を、^１６Ｏの２次イオンイメージ（^１６Ｏの強度）で割ったものをイメージしており、^１８Ｏ比率が低い部分は青く、高い部分は赤くなる。図７の右下の写真（^１８Ｏ／^１６Ｏ）において、前記右上の写真（^１８Ｏ）の白い点に対応する箇所は、^１８Ｏ／^１６Ｏ比率が高く、赤色にイメージングされ（図において白い点）、その他の箇所は、^１８Ｏ／^１６Ｏ比率が、天然の０．００２前後であるため、青色にイメージングされた。これらの結果から、^１８Ｏを導入したｓｉＲＮＡを使用すれば、例えば、蛍光ラベル等を使用することなく、^１８Ｏ／^１６Ｏ比率から、前記ｓｉＲＮＡの局在を示すイメージ像が得られることがわかった。

従来、イメージングには、一般的に蛍光標識した核酸が用いられている。しかし、蛍光物質は、通常、疎水性であり、分子量が大きいため、核酸の末端等に付加することで、前記核酸の物性が、蛍光標識で修飾していない未修飾体とは異なってしまう可能性がある。また、前記蛍光物質は、生体内で切断される可能性もある。これに対して、^１８Ｏでの標識は、例えば、核酸の物性変化が抑制され、全てのリン酸基へ修飾が可能であり、且つ、修飾が外れることも抑制できる。このため、^１８Ｏを導入した核酸を用いることで、例えば、より効率よく細胞内局在を観察することが可能である。

以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

この出願は、２０１１年５月１０日に出願された日本出願特願２０１１−１０５７２２を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。

以上のように、本発明の製造方法によれば、前記同位体を含む酸化剤を使用するのみで、同位体を含むリン酸化合物を容易に製造できる。本発明の製造方法は、例えば、リン酸基を有する核酸の合成や、リン酸基を有する農薬、医薬、リン脂質等の低分子化合物の合成に有用である。

Claims (12)

1. ３価リン化合物を、同位体を含む酸化剤で酸化することによって、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する酸化工程を含み、
   前記３価リン化合物が
   
   で表される基を有し、
   前記酸化剤が、酸素供与体であり、供与される酸素が、前記同位体であり、かつ
   前記同位体が、 ^１７ Ｏおよび ^１８ Ｏからなる群から選択された少なくとも一つの同位体であることを特徴とする、同位体含有リン酸化合物の製造方法。
2. 前記酸化剤による酸化反応が、前記３価リン化合物における３価リンを５価リンに酸化し、且つ、前記５価リンに前記酸化剤由来の原子を結合させる酸化反応であり、
   前記酸化剤が、前記５価リンに結合する前記原子として、前記同位体を有する、請求項１記載の製造方法。
3. 前記酸素供与体が、水またはペルオキシドである、請求項１記載の製造方法。
4. 前記ペルオキシドが、ヒドロペルオキシドである、請求項３記載の製造方法。
5. 前記ヒドロペルオキシドが、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドである、請求項４記載の製造方法。
6. 前記３価リン化合物は、前記３価リンを有するヌクレオシドを含むモノマーであり、
   前記ヌクレオシドは、糖と塩基を含み、前記糖の１’位に前記塩基が結合し、
   前記糖に前記３価リンが結合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記糖の５’位、３’位または２’位に前記３価リンが結合している、請求項６記載の製造方法。
8. 前記３価リン化合物は、２以上のヌクレオシド残基を含むポリマーであり、
   前記ヌクレオシド残基は、糖と塩基を含み、前記糖の１’位に前記塩基が結合し、
   前記ヌクレオシド残基間は、それぞれの糖が、リンを介して結合し、
   少なくとも一組のヌクレオシド残基間のリンが、前記３価リンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
9. 前記ヌクレオシド残基間は、一方の糖の５’位、３’位または２’位と、他方の糖の５’位、３’位または２’位とにおいて、前記リンを介して結合している、請求項８記載の製造方法。
10. さらに、ヌクレオシドを含む２分子のモノマーをカップリングして、前記３価リン化合物を合成するカップリング工程を有し、
    前記酸化工程において、前記カップリング工程により得られた前記３価リン化合物を、前記酸化剤により酸化して、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する、請求項１から９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. さらに、前記５価のリン酸化合物に、ヌクレオシドを含むモノマーをカップリングして、前記３価のリン化合物を合成するカップリング工程を有し、
    前記酸化工程において、前記カップリング工程により得られた前記３価リン化合物を、前記酸化剤により酸化して、前記同位体が導入された５価のリン酸化合物を合成する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
12. 前記５価のリン酸化合物が、農薬、医薬またはリン脂質である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法。