JP4068971B2 - 非メバロン酸イソプレノイド経路の中間体及び酵素 - Google Patents

非メバロン酸イソプレノイド経路の中間体及び酵素 Download PDF

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Description

本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸依存性生合成経路の生合成生成物又は中間体又は酵素の効率的な形成のための細胞、細胞培養物又は生物、又はその部分に関する。さらに、本発明は、これらを生成するためのベクターに関する。さらに、本発明は前記生合成経路の中間体又は生成物又は酵素の形成又は生成へのそれらの使用並びに酵素及び中間体に関する。さらに、本発明は前記生合成経路の阻害物質又は酵素のスクリーニングに関する。
どの生物の生合成経路の系も非常に効率的であり、少数の中心幹経路（ｔｒｕｎｋ ｐａｔｈｗａｙ）が非常に多数の末梢経路に枝分かれしている。中心幹経路には、高度に統合された出発物質が含まれている。従って、中心又は幹経路は高度に制御されている。同時に、これらの経路は、阻害物質又は代謝エンジニアリングのいずれかによって任意の生物の代謝を干渉しようとする試みにとって非常に重要である。
イソプレノイド経路はこの代謝機構の最も重要な例である。この経路は非常に長く、高度に分岐しており、約３００００種のイソプレノイド又はテルペノイド化合物を導く。これらの化合物はすべて、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）から得られるものと思われる。これらは２つの別々な幹経路で生成される（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈら、２００１に総説）。Ｂｌｏｃｈ、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ、Ｌｙｎｅｎらの古典的な研究により、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）はメバロン酸を介したイソプレノイドの生合成の主要な中間体として確立された。しかし、いくつかの細菌、すべての植物のプラスチド及び原虫である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を介した別の経路でＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを合成する。この経路の発見は主として、大腸菌から得たメナキノンのイソプレノイド側鎖への同位体標識１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの取り込みによるものであった。このメバロン酸非依存性経路はこれまで、部分的にしか探索されていない（図１）。本発明のこれらの態様をより理解するために、この経路を簡単に説明する。この経路は３つの部分に分けることができる。
図１に示す第１の経路部分では、ピルビン酸（１）がグリセロアルデヒド３−リン酸（２）又は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）（３）と縮合する。続いて、リアレンジメントと還元を含む２段階反応によって、ＤＸＰは２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換される。これによって５炭素イソプレノイド骨格が確立される。
メバロン酸非依存性経路（図１）の次の部分では、ＭＥＰ（４）は先ず、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼによってＣＴＰと縮合して、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）（５）になる（ＰＣＴ／ＥＰ００／０７５４８）。続いて、ＣＤＰ−ＭＥ（５）は４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼによりＡＴＰ依存的にリン酸化されて、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸（ＣＤＰ−ＭＥＰ）（６）になる。この中間体は続いて、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼにより２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（ｃＭＥＰＰ）（７）になる（ＰＣＴ／ＥＰ００／０７５４８）になる。これらの３つの酵素的ステップにより、イソプレノイドＣ５骨格を第３経路部分のために活性化する生合成単位を形成する（Ｒｏｈｄｉｃｈら、１９９９；Ｌｕｔｔｇｅｎら、２０００；Ｈｅｒｚら、２０００）。
バイオインフォマティックスの研究（ドイツ特許出願第１００２７８２１．３）及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．の変異株（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２０００）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の変異株（Ｃａｍｐｏｓら、２００１；Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら、２００１）の研究は、イソプレノイド経路にｌｙｔＢ遺伝子及びｇｃｐＥ遺伝子が関与していることを示している。しかし、対応の遺伝子生成物が触媒する機能及び反応についてはまだ知られていない。
最近、１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸への高率の変換を触媒するキナーゼ（ＸｙＩＢ）が記載されている（Ｗｕｎｇｓｉｎｔａｗｅｅｋｕｌら、２０００）。さらに下流の反応に参加する遺伝子及び酵素が記載されている。しかし、遺伝子機能、中間体及び生成物へ導く機構についてはまだ知られていない。
多数の病原性真性細菌及びマラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）には、非メバロン酸経路に関与する酵素が必須である。病原性真性細菌及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍはメバロン酸非依存性経路の中間体を環境から同化することができない。代替イソプレノイド経路の酵素は哺乳類には存在せず、哺乳類はメバロン酸経路を介してのみ哺乳類のイソプレノイド及びテルペノイドを合成する。さらに、この経路の反応の特異性により他の酵素、特に哺乳類の酵素との交差阻害の危険性が低い。
したがって、代替イソプレノイド経路の酵素は、病原性微生物に対する新規作用剤及び除草剤の標的として特に適しているように思われる。このためには、未知のステップの解明やこれらの標的、例えばこれらの経路の遺伝子及び同族酵素の解明が必要である。
非メバロン酸経路が興味深い別の理由は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのある種の病原体がこの経路を使用してγδＴ細胞を活性化しているということである（Ｆｏｕｒｎｉｅ及びＢｏｎｎｅｖｉｌｌｅ、１９９６）。したがって、γδＴ細胞はこのような病原体による感染に対する防御の最前線として作用するように思われる。非メバロン酸経路の中間体はγδＴ細胞活性化を担っていることが示唆されている（Ｊｏｍａａら、１９９９）。最近、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ｄｘｒ遺伝子又はｇｃｐＥ遺伝子がノックアウトされると、γδＴ細胞刺激能を失うことが示されている（Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら、２００１）。
さらに、これらの経路は有用なビタミン及びイソプレノイド又はテルペノイド生成物を導くので、これらの経路に対してバイオテクノロジー的に大きな興味が持たれている。
これらの目標に到達するための以前の試みは、これまで研究されていた野生型細胞でのこれらの経路による生合成率が低いことによって阻まれてきた。
本発明の目的は、酵素、前記酵素をコードする核酸及び２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸をイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸に変換するための中間体を提供することである。
驚くべきことに、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸からイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸への変換の中間体が１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸であることが発見された。この中間体は、大腸菌ゲノムではｇｃｐＥと呼ばれる遺伝子がコードする酵素により形成される。また、この酵素は還元剤としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを好むことも発見された。さらに、これはＣｏ２＋により促進されることも発見された。
上記中間体は、大腸菌ゲノムでｌｙｔＧと呼ばれる遺伝子がコードする酵素によって、イソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸に変換される。後者の酵素は還元剤としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、メディエータとしてＦＡＤを好む。さらに、これは、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルから選択される金属のイオンで促進することができる。
これらの知見により、ここで、幹経路の第３部分が確立された。これらの知見の中心は、中間体１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にＥ型の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸である。この結果、この中間体への反応、この中間体からの反応に関する本発明の統合された原理が確立される。
さらに、本発明の目的は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース及び／又はグルコールからの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の生成に依存する非メバロン酸生合成経路のイソプレノイド生成物又は中間体の効率的な生合成のための細胞、細胞培養物、生物、又はその部分を提供することである。
本発明は、未知の中間体の構造解明及び代替イソプレノイド生合成経路の推定的な遺伝子又は同族酵素の生物学的機能の割当に使用することができる新規なｉｎ ｖｉｖｏの系を作成する。例示として、イソプレノイド生合成のメバロン酸非依存性経路へのｇｃｐ遺伝子（今はｉｓｐＧと示されている）及びｌｙｔＢ遺伝子（今はｉｓｐＨと示されている）の機能の割当を達成する。
より具体的には、前記のｉｎ ｖｉｖｏの系は、Ｄ−キシルロキナーゼの遺伝子（ｘｙｌＢ）並びにテルペノイド生合成のさらに下流ステップの遺伝子、例えば大腸菌由来のｄｘｓ、ｄｘｒ及び／又はｉｓｐＰ、及び／又はｉｓｐＥ、及び／又はｉｓｐＦ、及び／又はｇｃｐＥ、及び／又はｌｙｔＢ、及び／又はＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のカロテノイド遺伝子クラスターを担持し、発現するベクター構築体を有する組換え大腸菌株からなる。
発明を解決するための手段
本発明の一態様では、遺伝子改変した株に１−デオキシ−Ｄ−キシルロース、特に同位体標識された１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを与えることができ、これは高い率でメバロン酸非依存性テレプレノイド経路の共通の中間体である１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸に変換され、さらに、前記経路の別の中間体である、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸などに変換される。さらに、グルコール及び解糖中間体を供給して、前記経路の前記別の中間体への変換を実施することができる。
前記の系は、生合成経路のこれまで理解されていない中間体の構造の解明のため、新規抗生物質、抗マラリア剤及び除草剤のｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングのため、並びに外因性１−デオキシ−Ｄ−キシルロース及び／又はグルコースの、テルペノイド生合成の非メバロン酸経路の中間体及び生成物への生体変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）のプラットフォームとしても有用である。前記系は、メバロン酸非依存性イソプレノイド経路の遺伝子、すなわち、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｊｏＥ、ｉｓｐＦ、ｇｃｐＥ及びｌｙｔＢの遺伝子生成物の潜在的な阻害物質の存在下又は不在下でｉｎ ｖｉｖｏで生成されるある種の中間体の量を検出、測定することによって、潜在的な除草剤及び／又は抗マラリア剤及び／又は抗微生物物質の化学ライブラリーをスクリーニングするにも使用することができる。
前記系はさらに、例えば供給材料としてグルコースを使用することにより、非メバロン酸経路を介するイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸の生合成を増強することにより、カロテン、α−トコフェロール又はビタミンなどのより高級なイソプレノイド（例えば炭素原子を２０、１５、２０、３０、又は４０個有するイソプレノイド）の生成に使用することもできる。使用できる別の供給材料は、グリセルアルデヒド３−リン酸又はピルビン酸などの解糖の中間体又は生成物である。
さらに、本発明は式Ｉ（下記参照）の新規化合物、特に１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸及び前記化合物を調製する酵素的及び化学的方法を提供する。本明細書に示すように、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸はｇｃｐＥ遺伝子生成物により２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸から生成される。
本明細書にはさらに、ｌｙｔＢ遺伝子生成物により（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸がジメチルアリル二リン酸及びイソペンテニル二リン酸に変換されることも示す。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を介した代替テルペノイド経路の共通の中間体である。この後者の経路は細菌、ある種の原虫、最も重要なことには植物のプラスチドで機能し、この経路は、天然ゴム、カロテノイド、メントール、メントン、樟脳又はパクリタキセルなどの多くの重要なテルペノイド生成物の生合成を担っている。代替テルペノイド経路は今、熱心に研究されている。しかし、これまで、グリセルアルデヒド３−リン酸及びピルビン酸から、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸及び２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸及び２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸を介した最初のステップ（図１）しか解明されていない。
中間体１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸はいくつかの商用の目的で非常に重要な意味を有する。
（１）代替テルペノイド経路の生合成の下流酵素の潜在的な阻害物質に関する商用のスクリーニング手順のための重要な中間体として使用することができる。
（２）テルペノイド又はその中間体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成の重要な中間体として使用することができる。
（３）グリセルアルデヒド３−リン酸及びピルビン酸の酵素的縮合生成物としてテルペノイド生合成でｉｎ ｖｉｖｏに生じる。グリセルアルデヒド３−リン酸及びピルビン酸は代謝の中心的な中間体及び多くの生合成経路の必須の出発材料である。したがって、天然又は組換えにより当該経路を与えた微生物又は細胞培養物で、細胞の基本的な中間代謝に影響を与えることなく、テルペノイド又はその中間体の生合成を増強するために、外来源から、したがって、グリセルアルデヒド３−リン酸及びピルビン酸のプールとは独立して、ｉｎ ｖｉｖｏで１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を高いレベルで生成することが望ましい。
（４）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸は１−デオキシ−Ｄ−キシルロースから、ｘｙｌＢ遺伝子生成物の触媒作用によって生成することができる。ｘｙｌＢ遺伝子を有する組換え株を使用すると、この反応がｉｎ ｖｉｖｏで起こり、外因性の１−デオキシ−Ｄ−キシルロースは高い率で細胞内１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸に変換される。
（５）１−ＤＸＰは、解糖酵素及びＤＸＰシンターゼの触媒作用によってグルコールから生成することができる。ｄｘｓ遺伝子を有する組換え株を使用すると、この反応がｉｎ ｖｉｖｏで起こり、外因性グルコールが高い率で細胞内１−ＤＸＰに変換される。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸依存性経路の生合成の率が増大するように１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを前駆体として使用することは本発明の１態様である。１−デオキシ−Ｄ−キシルロースは、様々な発表された手順で調製することができる（Ｂｌａｇｇ及びＰｏｕｌｔｅｒ、１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、１９９５；Ｐｉｅｌ及びＢｏｌａｎｄ、１９９７；Ｓｈｏｎｏら、１９８３；Ｇｉｎｅｒ、１９９８）。
様々な同位体標識された形で１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用することは本発明の一態様である。１−デオキシ−Ｄ−キシルロースはＣ（１３Ｃ又は１４Ｃ）、Ｈ（Ｄ又はＴ）又はＯ（１７Ｏ又は１８Ｏ）の放射性同位体又は非放射性同位体の任意の組み合わせで標識することができる。
同位体標識された１−デオキシ−Ｄ−キシルロースは、同位体標識されたグルコース及び／又はピルビン酸から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ及び市販の解糖酵素及びホスファターゼを使用して酵素的に調製することができる（ＰＣＴ／ＥＰ００／０７５４８）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロースは遊離の酸又は塩として、好ましくはアルカリ（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム）塩又はアンモニウム若しくはアミン塩として使用することができる。
生合成生成物又は中間体又は酵素の生成又は抗微生物剤、抗マラリア剤又は除草剤のスクリーニングのために組換え細胞、細胞培養物、又は生物若しくはその一部を使用することは本発明の一態様である。
本発明を実施するために、分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術の様々な手法を使用するが、これらは総合的にＳａｍｂｒｏｃｋら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｄ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；ＤＮＡクローニング：実践的な方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）第１巻及び第２巻、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；及び転写及び翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編）に記載されている。
核酸
本発明は、原核生物、原虫及び植物の配列又は誘導配列を含む核酸を含む。誘導配列は、配列又はそのオルソログの領域に対応する又はその「配列保存的」若しくは「機能保存的」変異体に相補的な核酸配列に関連する。
配列はよく知られている手法から単離することができ、あるいは市販されている（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｔｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）。また、ＰＣＲによる方法を使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから関連配列を増幅することができる。
本発明の核酸は様々な量で、プリン及びピリミジン含有ポリマーを、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチド混合物のいずれかで含んでいる。核酸は細胞から直接単離することができる。あるいは、鋳型として化学合成した鎖又はゲノム材料を使用して、ＰＣＲにより核酸を調製することもできる。ＰＣＲに使用するプライマーは、本発明で提供される配列情報又はデータベースからの配列情報を使用して合成し、さらに組換え発現ベクターでのクローニングを容易にするために任意選択の新しい制限部位を使用して構築することができる。
本発明の核酸は天然の調節配列に隣接してよく、あるいはプロモーター、エンハンサー、反応要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’及び３’非コード領域などと結合していてもよい。核酸はよく知られている方法に基づいて修飾することができる。これらの修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、１つ又は複数の天然ヌクレオチドのアナローグでの置換、ヌクレオチド間修飾、すなわち、非荷電結合によるもの（すなわち、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）及び荷電結合（すなわち、ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｈｏｒｏｔｈｉａｃｔｅ）など）を有するものである。核酸は、タンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジンなど）、インターカレーター（すなわち、アクリジン、プソラレンなど）、キレーター（すなわち、金属、放射活性金属、鉄、酸化性金属など）及びアルキレーター（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）などの追加の共有結合した単位を有していてもよい。核酸はメチル又はエチルホスホトリエステル結合又はアルキルホスホロアミダート結合の形成によるものであってもよい。さらに、本発明の核酸は標識によって修飾することができ、この標識は直接又は間接的に検出可能なシグナルを提供する。これらの標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどがある。
ベクター
本発明は核酸ベクターを提供し、このベクターは、本発明により提供される配列又はその誘導体を含む。プラスミド又は真菌用ベクターを含む様々なベクターが、様々は真核宿主及び原核宿主での複製及び／又は発現に関して記述されている。本発明の目的では高コピー数複製ベクターが好ましい。非限定的な例には、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンジエゴ、ＣＡ）、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マジソン、ＷＩ）又はｐＲＳＥＴ若しくはｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びよく知られた手法に基づく様々な適した宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターはしばしば、１種を超えるクローニング及び発現用の複製系、１種又は複数の宿主選択用マーカー、すなわち抗生物質耐性、及び１種又は複数の発現カートリッジを含んでいる。適した宿主を、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２−媒介ＤＮＡ取り込み、スナノミ感染、ミクロ注入、ミクロ衝撃又は他の確立された方法を含む適した方法で形質転換／トランスフェクト／感染させることができる。
適した宿主は、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、植物、特にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ又はイチイ種（Ｔａｘｕｓ ｓｐ．）及び動物細胞、特に哺乳動物細胞が含まれる。最も重要なものは、大腸菌、枯草菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ及びＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、並びに不滅化したミエロイド及びリンフォイド哺乳動物細胞などである。好ましい複製系には、Ｍ１３、ＣｏｌＥｌ、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルスなどがある。多数の転写、開始（リボソーム結合部位を含む）、終結制御領域が単離されており、それらの異種タンパク質の転写及び翻訳の効率は様々な宿主で証明されている。これらの領域、単離方法及び使用方法の例はよく知られている。発現に適した条件下で、組換え合成タンパク質源として宿主細胞を使用することができる。
発現系
好ましいベクターは、酵素ドメインに機能的に結合した転写要素（すなわちプロモーター）を含むことができる。場合により、プロモーターは、オペレーター領域及び／又はリボソーム結合部位の一部を含むことができる。大腸菌と相容性のある細菌プロモーターの非限定的な例には、ｔｒｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、アラビノースＢＡＤオペロンプロモーター、ラムダ由来のＰ１プロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結合部位並びにｔｒｐ及びｌａｃのＵＶ５プロモーターの配列由来のハイブリッドＴａｃプロモーターがある。酵母プロモーターの非限定的な例には、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、ガラクトエピメラーゼプロモータ及びアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）プロモーターがある。哺乳動物細胞の適したプロモーターには、ウイルスプロモータ例えば、すなわち、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などがあるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物細胞はターミネーター配列及びポリＡ配列及びエンハンサー配列を必要とすることもあり、これらは発現を増加させることができる。遺伝子を増幅する配列も好ましいことがある。さらに、細胞からの組換えタンパク質の分泌を容易にする配列も含むことができ、この配列は細菌、酵母又は動物細胞の、例えば、すなわち、分泌シグナル配列及び／又はプレホルモン配列であってよいが、これらに限定されるものではない。
ｘｙｌＢ及び代替Ｃ５イソプレノイド経路の他の遺伝子と、場合により、より高級なイソプレノイド又はテルペノイドの遺伝子を組み合わせて付与した組換え体がこれらの経路を増強することは本発明の重要な態様である。好ましくは、ｘｙｌＢを遺伝子の完全なセットと組み合わせて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を所望の中間体又は最終生成物に変換させる。Ｃ５−イソプレノイド経路の中間体のためには、請求項７６に記載の遺伝子の組み合わせの１つを細胞に付与するのが好ましい。
本明細書に引用した遺伝子については、一般的な大腸菌の標記を使用した。大腸菌又は他の生物由来の他の遺伝子（オルトローガス遺伝子）も、同じ機能を有していれば（機能保存的遺伝子）、特に遺伝子生成物が同じ反応を触媒すれば、使用することができる。さらに、欠失又は挿入変異体又はこれらの遺伝子と他の遺伝子又は核酸との融合体も、これらの変異体が機能保存的である限り、使用することができる。上記の遺伝子は細菌、原虫又はより高級な又は低級な植物由来であってよい。
ｇｃｐＥの機能がｉｓｐＦのすぐ下流にあると決定されたことが本発明の別の重要な態様である。本発明者らの知見は、ｇｃｐＥ遺伝子生成物が、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸からの新規化合物１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の生成に関与していることを示している。したがって、本発明者らはｇｃｐＥの名称をｉｓｐＧと変更した。
本発明の別の態様では、化学合成した１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の（Ｅ）及び（Ｚ）異性体との比較により、ｇｃｐＥの遺伝子生成物が２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸からの１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸のＥ−異性体の形成に関与していることが示された。したがって、本発明はさらに、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸塩又はそのプロトン付加体の（Ｅ）及び（Ｚ）異性体に関する。
ｌｙｔＢの機能がｉｓｐＧのすぐ下流であると決定されたことが本発明の別の重要な態様である。したがって、この名称はｉｓｐＨと変更する。ｉｓｐＨが、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸のイソペンテニル４−二リン酸及び／又はジメチルアリル４−二リン酸への変換に関与していることは本発明者らの知見である。
「１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−リン酸」及び「１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸」はそれぞれ、遊離のリン酸及び二リン酸、その単一又は多重脱プロトン化体、すなわち任意のカチオン（Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ及びＣｏカチオン）の塩であってよい塩を含むものと理解されたい。水溶液中での（二）リン酸エステル及びリン酸誘導体又はその共役塩のプロトン化の状態は、当業者に公知のように、溶液のｐＨに依存する。他のリン酸エステル又はリン酸誘導体についても同様である。
本発明の別の態様では、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸をトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）の葉緑体の液体可溶性画分に取り入れることに成功した。１４Ｃ標識した本発明化合物を、Ｃ．ａｎｎｕｕｍの葉緑体のゲラニルゲンラニオール、β−カロテン、フィトエン及びフィトフルエン画分に取り込ませて、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸が非メバロン酸経路の２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の下流、イソペンテニル二リン酸の上流にある中間体であることを確立した。
組換え工学用ベクター内で、ｘｙｌＢをｇｃｐＥ及び場合により、代替Ｃ５イソプレノイド経路及び／又はより高級なイソプレノイド経路の他の遺伝子と合わせることができることが本発明の別の態様である。
ｇｃｐＥ（現在のｓｉｐＧ）に関する本発明者らの知見の結果、遺伝子ｌｙｔＢはｇｃｐＥの下流で作用し、したがって、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸のＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰへの変換に作用する。したがって、遺伝子ｌｙｔＢをｘｙｌＢ、及び場合により一般的なＣ５−イソプレノイド経路及び／又はより高級なイソプレノイド経路の他の遺伝子を組み合わせることが本発明の別の態様である。
本発明者らの知見は、任意の所望の標識を有する、イソプレノイド経路の中間体又は生成物、特に次の中間体、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸の効率的な形成又は生成を可能にする。
本発明の方法により、テルペノイド経路の最終生成物（例えば、β−カロチン、ゼアキサンチン、パクリタキセル、メントール、メントン、カンナビノイド類）の形成を促進することができる。
組換えプラスミドを有する株は、１５から４０℃で、慣用の培地、好ましくはテリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）で培養することができる。好ましい温度は３７℃である。大腸菌株を６００ｎｍでの光学密度０．５から５で、０．５から２ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導する。１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを、０．００１ｍＭから１Ｍの濃度、好ましくは０．０１から３０ｍＭの濃度で加えた後、細胞を３０分間から１５時間、好ましくは１から５時間インキュベートする。
本発明の遺伝子操作した生物によりイソプレノイド中間体又は生成物を生成する方法は、ＣＴＰ源、例えば、シチジン及び／又はウリジン及び／又はシトシン及び／又はウラシル及び／又はリボース及び／又はリボース５−リン酸及び／又はＣＴＰ生合成前駆物質を、０．０１から１０ｍＭの濃度、好ましくは０．３から１ｍＭの濃度で供給すること、及び／又はリン酸化活性源、例えば、グリセロール３−リン酸及び／又はホスホエノールピルビン酸及び／又はリボース５−リン酸を０．１から１００ｍＭの濃度、好ましくは０．５から１０ｍＭの濃度で、及び／又は無機ホスフェート及び／若しくは無機ピロホスフェートを１から５００ｍＭの濃度、好ましくは１０から１００ｍＭの濃度で、及び／又は任意の有機ホスフェート及び／又は有機ピロホスフェートを供給すること、還元等価物源を例えば０．１から１０００ｍＭ、好ましくは１０から１０００ｍＭで、ラクテート及び／又はサクシネート及び／又はグリセロール及び／又はグルコース及び／又は脂肪を０．１から１００ｍＭの濃度、好ましくは０．５から１０ｍＭの濃度で供給することにより、強化できることが発見された。特に効率の高い生成方法は請求項７２及び８０から８４に特定する。
本発明の方法は、検出するイソプレノイドの中間体又は生成物の選択に応じて、関与する酵素又は下流の酵素の阻害物質のスクリーニングに非常に有利に使用することもできる。酵素ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ（以前はｇｃｐＥ）及びｉｓｐＨ（以前はｙｔＢ）は動物には存在しない。したがって、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ（以前はｇｃｐＥ）及びｉｓｐＨ（以前はｙｔＢ）に対する阻害物質は、（ａ）雑草及び藻に対する除草剤、（ｂ）病原性細菌に対する抗生物質、（ｃ）熱帯熱マラリア原虫、マラリア病原体など原虫に対する作用剤として非常に有用である。
前記酵素の活性は（潜在的な阻害物質の存在下及び不在下で）、好ましくはＴＬＣ、ＨＰＬＣ又はＮＭＲで生成物の生成又は中間体の消費を測定することによって検出することができる。
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸が非メバロン酸テルペノイド経路の中間体であるという発見により、本発明者らは、阻害物質の構造の本質的な決定因子を獲得した。すなわち、阻害物質のサブセットの構造は、出発物質、又は生成物、又は出発物質例えば２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸から生成物例えば１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の間への移行状態の少なくとも一部と類似しているべきである。
本発明は、次の式Ｉの新規な化合物又はその塩を開示する。
Figure 0004068971
（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに異なり、Ｒ１及びＲ２の一方は水素であり、他方は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２及び−ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ａは−ＣＨ２ＯＨ又は−ＣＨＯである。）これらの化合物は同位元素で標識することができる。
式Ｉで、Ａは好ましくは−ＣＨ２ＯＨである。
Ｒ１及びＲ２では、Ｒ１は好ましくは水素であり、Ｒ２は好ましくは−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２及び−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２の群から選択する。−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２及び−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２の群では、−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２が好ましい。
式Ｉの化合物が塩である場合、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、マンガンの塩であってよい。これらの塩は（二）リン酸部分の単一又は多重脱プロトン化によるものであってよい。
本明細書に開示の新規化合物は、例えば、電子供与体の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏでの又はｉｎ ｖｉｖｏでの、イソプレノイド又はテルペノイドの生合成の遺伝子、酵素又は阻害物質のスクリーニングなどの様々な用途に有用である。
本発明はさらに、下記ステップによる式Ｉの化合物又はその塩の、化学的調製法も提供する。
Figure 0004068971
（式中、Ａは−ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ１及びＲ２は異なっており、Ｒ１及びＲ２の一方は水素であり、他方は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又は−ＣＨ２ＯＨである。）
（ａ）下記式（ＩＩ） の化合物を
Figure 0004068971
（式中、Ｂは保護基である）、ウィッティヒ試薬又はホルナー試薬により、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物に変換するステップ
Figure 0004068971
（式中、基Ｄは還元により−ＣＨ２−ＯＨ−基に変換される前駆体基である）、
（ｂ）基Ｄを還元により−ＣＨ２−ＯＨ−基に変換するステップ、
（ｃ）場合により、それ自体公知の方法で、ステップ（ｂ）で得られた−ＣＨ２−ＯＨ−基を−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又はその塩に変換するステップ、
（ｄ）場合により、所望の塩に変換するステップ、
（ｅ）保護基Ｂを除去するステップ。
上記方法で、前記保護基Ｂはそれが結合している位置でヒドロキシ基を再生することができる任意の基であってよい。前記保護基Ｂは、ステップ（ａ）からステップ（ｄ）の条件下で安定であることが好ましい。前記保護基Ｂは、ヒドロキシ基を生成するために前記方法のステップ（ｅ）で除去する。ヒドロキシ基の保護基は当業者に公知である。基Ｂは例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物の残りの部分と共にアセタール基を形成することができる。アセタールは酸性条件下で加水分解することができる。最も好ましくは、基Ｂは２−テトラヒドロキシピラニル基である。
上記方法で、前記基Ｄは還元によって−ＣＨ２−ＯＨ−基に変換できる前駆体基である。基Ｄは炭酸の誘導体であってよい。このような基の例には、アルコキシカルボニル及びアミノカルボニル基が含まれる。前記アミノカルボニル基は、アミノ基を１個又は２個のアルキル基で置換することができる。アルコキシカルボニル基を使用することが最も好ましい。前記アルコキシカルボニル基のアルキル基又は前記アミノカルボニル基の前記アルキル基は、直鎖又は分岐アルキル基であってよく、一置換又は多置換されていてもよい。メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル又はヘキシル基などのＣ１〜Ｃ６アルキル基が好ましい。メチル基又はエチル基が最も好ましい。前記基Ｄの最も好ましい例はエトキシカルボニル基である。
式（ＩＩ）の前記化合物は、ヒドロキシアセトンのヒドロキシ基を前記基Ｂで保護することにより調製することができる。基Ｂがテトラヒドロキシピラニル基の場合、式（ＩＩ）の化合物は、好ましくはピリジニウムトルエン−４−スルホン酸を触媒として使用して、ヒドロキシアセトンと３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランから調製することができる。アセトニルテトラヒドロピラニルエーテルを調製する具体的な方法は実施例２４に示す。
前記方法のステップ（ａ）では、式（ＩＩ）の化合物を、ウィッティヒ試薬又はホルナー試薬により、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物に変換する。ウィッティヒ型反応及び試薬は当業者に公知である（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９６及びその引用文献参照）。上記反応に使用すべき一般的なウィッティヒ試薬は、メチレン−トリフェニルホスホランであり、これはメチレン基が置換されていてよい。本発明の上記方法には、メチレン基が上記基Ｄで置換されているメチレン−トリフェニルホスホランを使用する。このようなウィッティヒ試薬は市販されているか、公知の方法で調製することができる。
ステップ（ａ）で生成するオレフィンは、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のシス／トランス異性体の混合物として形成することができる。前記異性体の一方が好ましい場合、当業界で公知の方法、好ましくはクロマトグラフィーにより富化又は他方の異性体から分離することができる。あるいは、前記異性体の分離は以下のステップ（ｂ）から（ｅ）の１つの後で実施することができる。
上記方法のステップ（ｂ）では、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物又は前記化合物の混合物の基Ｄを還元により−ＣＨ２−ＯＨ−基に変換する。当技術分野では、このような還元を実施する様々な方法が知られている。基Ｄが還元され、オレフィン部分は還元されないように条件を選択する。このステップで使用すべき還元剤の例は、分子水素又は金属水素化物である。有用な金属水素化物の例には、水素化ホウ素ナトリウムなどのホウ素水素化物、水素化アルミニウムリチウム又は水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＨ）などのアルミニウム水素化物、水素化ナトリウム又は水素化カルシウムなどのアルカリ金属又は土類金属水素化物が含まれる。ステップ（ｂ）を実施する具体的な例は実施例２４に記載する。
前記方法の所望の最終生成物が、Ｒ１又はＲ２が−ＣＨ２−ＯＨ−基である式（Ｉ）の化合物の場合、ステップ（ｂ）で得られた化合物又は化合物の混合物を直接ステップ（ｄ）又はステップ（ｅ）にかけることができる。好ましくは、ステップ（ｅ）を実施して、保護基Ｂを除去する。前記方法の所望の最終生成物が、Ｒ１又はＲ２が−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２である式（Ｉ）の化合物の場合、ステップ（ｂ）で得られた化合物又は化合物の混合物を前記方法のステップ（ｃ）にかけて、ステップ（ｂ）で得られた−ＣＨ２−ＯＨ−基を−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２に変換する。
ステップ（ｃ）は当業者に公知のいくつかの方法で実施することができる。ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）で得られた前記−ＣＨ２−ＯＨ−基のヒドロキシ基を脱離基で置換することを含むことができる。ステップ（ｃ）は、ハロゲン化剤による前記−ＣＨ２−ＯＨ−基の−ＣＨ２−ハライド基への変換を含むことができる。硫酸、スルホン酸又はリン酸のハロゲン化物をハロゲン化剤として使用することができる。トシルクロリドが最も好ましい。前記ハロゲン化物は、フッ化物、塩化物、臭化物又はヨウ化物であってよく、好ましくは塩化物である。前記−ＣＨ２−ハライド基を有する化合物は好ましくは単離する。前記脱離基は、ステップ（ｂ）で得られた前記−ＣＨ２−ＯＨ−基を、スルホン酸ハロゲン化物、好ましくはトシルクロリドと反応させて生成することもできる。
前記脱離基を有する前記中間体を次に、リン酸又は二リン酸又はその単一又は多重脱プロトン化体と反応させることができる。好ましくは、リン酸又は二リン酸のアルキルアンモニウム塩を使用し、より好ましくはテトラアルキルアンモニウム塩、最も好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を使用する。極性非プロトン溶媒がこの反応には好ましい。好ましくは、得られた化合物又は化合物の混合物を標準的な手順により精製する。ステップ（ｃ）を実施する具体的な例は実施例２４に記載する。
ステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）で得られた化合物又は化合物の混合物を所望の塩に変換することができる。ステップ（ｄ）を実施する方法はよく知られている。このような方法は、水溶液のｐＨを適当な酸又は塩で所望のｐＨ値に調製することを含むことができる。
ステップ（ｅ）では、ステップ（ｂ）から（ｄ）の１つで得られた化合物の保護基Ｂを除去して、Ａが−ＣＨ２−ＯＨ−基である式（Ｉ）の化合物を得る。保護基を除去する方法は、保護基の種類に依存する。このような方法はよく知られている。保護基がアセタールを形成する場合、前記保護基の除去は酸加水分解により実施できる（実施例２４参照）。
本発明は、好ましくはＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの存在下及び／又はＣｏ２＋の存在下での、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にその（Ｅ）型への酵素的変換に機能的な形態のタンパク質を提供する。前記酵素は好ましくは、大腸菌のｉｓｐＥ（以前はｇｃｐＥ）遺伝子がコードする配列又は前記配列の機能保存的相同体を有し、すなわち、前記相同体は前記タンパク質と同じ機能を行うことができる。前記タンパク質の多くの用途では、融合タンパク質、特にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現、精製することができる。この方法で、酵素活性のあるタンパク質を容易に得ることができる。
本発明はさらに、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にその（Ｅ）型のイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸への酵素的変換に機能的な形態のタンパク質を提供する。前記タンパク質は好ましくは、その機能のためにＦＡＤ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする。さらに、前記タンパク質は、マンガン、鉄、コバルト又はニッケルイオンの群から選択される金属イオンを必要とすることがある。前記タンパク質は好ましくは、大腸菌のｉｓｐＥ（以前はｇｃｐＥ）遺伝子がコードする配列又は前記配列の機能保存的相同体でコードされる配列を有する。前記タンパク質の多くの用途では、融合タンパク質、特にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現、精製することができる。この方法で、酵素活性のあるタンパク質を容易に得ることができる。
上記タンパク質は植物タンパク質、特にシロイヌナズナ由来の植物タンパク質、細菌タンパク質、特に大腸菌由来のタンパク質、又は原虫タンパク質、特に熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質とすることができる。
本発明はまた、イントロンを含む又は含まない上記タンパク質の一方又は両方をコードする精製単離された核酸を提供する。さらに、本発明は前記精製単離核酸の配列を含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、前記精製単離核酸の配列又は前記ＤＮＡ発現ベクターを組換えによって付与された細胞、細胞培養物、生物、又はその部分も提供し、前記細胞は、細菌細胞、原虫細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される。前記細胞、細胞培養物、生物、又はその部分にはさらに、次の群、大腸菌のｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ（以前はｙｇｂＰ）、ｉｓｐＥ（以前はｙｃｈＢ）、ｉｓｐＦ（以前はｙｇｂＢ）又はその機能保存的相同体又は上記遺伝子の機能保存性な融合変異体、欠失変異体又は挿入変異体から選択される少なくとも１種の遺伝子を付与することができる。
本発明はまた、形質転換又はトランスフェクションされていない細胞、細胞培養物、生物、又はその部分と比較して、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にその（Ｅ）型の形成率が増大するように形質転換又はトランスフェクションされた細胞、細胞培養物、生物、又はその部分も提供する。形質転換又はトランスフェクションは好ましくは、大腸菌のｇｃｐＥ又は他の生物、例えば植物又は原虫生物由来の機能保存的相同体の付与を含む。
本発明はまた、形質転換又はトランスフェクションされていない細胞、細胞培養物、生物、又はその部分と比較して、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸のイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸への変換率が増大するように形質転換又はトランスフェクションされた細胞、細胞培養物、生物、又はその部分も提供する。形質転換又はトランスフェクションは好ましくは大腸菌のｌｙｔＢ又は他の生物、例えば植物又は原虫生物由来の機能保存的相同体の付与を含む。
本発明はまた、形質転換又はトランスフェクションされていない細胞、細胞培養物、生物、又はその部分と比較して、請求項１から４までの一項に記載のタンパク質及び／又は請求項５から８までの一項に記載のタンパク質の発現レベルを上昇させるために形質転換又はトランスフェクションされた細胞、細胞培養物、生物、又はその部分も提供する。
さらに、本発明は、ｉｓｐＧ及び／又はｉｓｐＨ又は他の生物由来のその機能保存的相同体又はその変異体の遺伝子生成物の細胞内での発現レベルを変化させる方法を提供し、この方法は、
（ａ）宿主細胞をｉｓｐＧ及び／又はｉｓｐＨ遺伝子で形質転換させるステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換宿主細胞を、ｉｓｐＧ及び／又はｉｓｐＨの効率的な発現に適した条件下で増殖させて、非形質転換細胞の発現レベルと比較して形質転換細胞でのｉｓｐＧ及び／又はｉｓｐＨ遺伝子生成物のレベルを変化させるステップ
を含む。
さらに、本発明は、下記のステップ
（ａ）潜在的な阻害物質の存在下及び不在下で、前記酵素を場合により同位体標識されたその基質である２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸と共に含む混合物を前記変換に適した条件下でインキュベートするステップ、
（ｂ）続いて、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸及び１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の濃度を決定するステップ、及び
（ｃ）前記潜在的な阻害物質の存在下及び不在下の濃度を比較するステップ
により、非メバロン酸イソプレノイド経路の２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にその（Ｅ）型への変換に作用する酵素の阻害物質を同定する方法を提供する。
さらに、本発明は、下記のステップ
（ａ）潜在的な阻害物質の存在下及び不在下で、前記酵素を場合により同位体標識されたその基質である１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸と共に含む混合物を前記変換に適した条件下でインキュベートし、前記混合物は好ましくはＦＡＤを含むステップ、
（ｂ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸及び／又はイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸の濃度を決定するステップ、及び
（ｃ）前記潜在的な阻害物質の存在下及び不在下の濃度を比較するステップ
により、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸、特にその（Ｅ）型のイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸への変換に作用する酵素の阻害物質を同定する方法を提供する。
阻害物質を同定する上記方法は好ましくは、特徴的な吸収スペクトルを利用してＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの消費を追跡することにより実施する。あるいは、約３４０ｎｍで励起させると、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの蛍光を追跡することができる。阻害物質を同定する上記方法は有利には特に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの消費の光度測定による検出と組み合わせて、阻害物質のハイスループットスクリーニングアッセイとして実施することができる。さらに、１種又は複数のフラビン類似体（例えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ）を、好ましくは触媒量で、前記方法のインキュベーション混合物に加えることができる。ＦＡＤの添加が最も好ましい。前記酵素は前記方法で、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質として使用することができ（実施例３８から４１、４４、４５）、マルトース結合タンパク質は酵素活性型の前記酵素の直接的な発現及び精製を可能にする。前記同定法の別の実施形態はこれらの方法のサブクレームに定義する。
非メバロン酸経路の中間体が様々な病原性細菌のγδＴ細胞の活性化を担っていることは知られている。γδＴ細胞の活性化に続いて、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン及びケモカインの分泌が起こり、γδＴ細胞の活性化は病原体に感染した後の免疫応答の制御に重要である可能性が非常に高い（Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら、２００１及びその引用文献）。ｄｘｒ又はｇｃｐ遺伝子がノックアウトされると、大腸菌株はγδＴ細胞刺激能を失うことが明らかになっており、ｇｃｐＥのすぐ下流、イソペンテニルピロリン酸の上流にある中間体が最も強力な抗原活性を示すことを強く示唆している（Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら、２００１）。しかし、この経路でｇｃｐＥ遺伝子生成物により生成される中間体はまだ知られていない。本発明で、驚くべきことに、この中間体がこれまで知られていない化合物として同定され、この化合物の新規な用途の全範囲がもたらされた。
式Ｉの化合物は免疫調節剤又は免疫刺激剤として、例えば、γδＴ細胞の活性化に使用することができる。前記化合物によるγδＴ細胞の活性化を介した免疫調節は、病原体に対する戦いを支持するだけではなく、免疫系の刺激が望ましい様々な状態にも有用であることを証明することができる。したがって、本発明の新規な化合物は病原体感染の医学的治療に使用することができる。このような治療は、病原体に対する免疫系の活性を刺激する。好ましくは、Ｒ１がＨであり且つ／又はＡが−ＣＨ２ＯＨである化合物をこの用途に使用する。あるいは、Ａ＝ＣＨＯである酸化生成物は非常に活性であることが証明される。式Ｉの化合物から、当技術分野で公知の試験系（例えば、Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら、２００１に記載のもの）で、最も高い又は最も適したγδＴ細胞刺激活性を有するものを選択することができる。重要なことは、本発明の化合物は抗生物質として作用しないので、耐性の発生は、本明細書に開示の治療法にとっては問題ではない。
有利な実施形態では、病原体感染を治療するために、前記化合物を抗生物質として活性な化合物と組み合わせることができる。このような治療は、抗生物質による病原体増殖の阻害と、病原体に対して免疫系を刺激することの利点を組み合わせ、その結果、より迅速でより効率のよい治療が得られる。このような抗生活性作用活性化合物は静菌的な抗生物質（例えば、テトラサイクリン）である。
したがって、本発明の新規化合物は、医薬品の調製に使用することができる。本発明はさらに、式Ｉの化合物と薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物に関する。前記薬剤組成物はさらに上記の抗生作用活性化合物を含むことができる。
本発明はさらに、式Ｉの化合物に対する抗体を含む。前記抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、慣用の手法で作製することができる。このような抗体の作製は、免疫原性とするために、ハプテンとしての式Ｉの化合物をタンパク質などの大分子の担体と結合することを含む。このような式Ｉの免疫原性化合物はさらにワクチンとして使用することができる。
本発明の抗体は、式Ｉの化合物の検出に使用することができる。前記化合物は非メバロン酸イソプレノイド経路を有する生物で生成されるので、前記抗体を使用してこのような生物を検出することができる。診断方法で体液中のこのような生物を検出し、それによって非メバロン酸経路を有する病原体による感染を示唆できると好ましい。このような診断方法での陽性結果は同時に、本発明の化合物による可能な治療を示唆する。
本発明の抗体を式Ｉの化合物の検出に使用するとき、測光による検出を可能にするように標識すること及び／又は支持体に固定することが好ましい。このような方法は当技術分野でよく知られている。
本発明はさらに、下記ステップによる、式Ｉの化合物又はその塩の化学的調製法も提供する（図７参照）。

Figure 0004068971
（式中、Ａは−ＣＨ２ＯＨ又は−ＣＨＯであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２又は−ＣＨ２ＯＨである。）
（ａ）２−メチル−２−ビニル−オキシランを４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アルに変換するステップ、
（ｂ）４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アルをそのアセタールに変換するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物の塩素原子を、ヒドロキシル基、リン酸基又はピロリン酸基で置換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたアセタールを加水分解して、アルデヒド基を生成するステップ、
（ｅ）場合により、ステップ（ｄ）のアルデヒド基を−ＣＨ２ＯＨ基に変換するステップ。
この方法の好ましい実施形態はサブクレームに定義しており、実施例４２に例示している。
以下に、具体的な実施例を参照して本発明を詳細に記述する。
Ｄ−キシルロキナーゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子を担持するベクターの構築
Ｍｅａｄｅら、１９８２の方法に従って、大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の染色体ＤＮＡ（Ｂｕｌｌｏｃｋら、１９８７；商業源：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）を単離する。
塩基対（ｂｐ）位置８５９６から１０１４４の大腸菌ＯＲＦｘｙｌＢ（受託番号ｇｂＡＥ０００４３３）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＧＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃７５秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．０μｇのベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び０．５μｇの精製ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する。制限反応混合物を顧客（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ、ドイツ（ＮＥＢ））から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び２０ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。Ｄｏｗｅｒら、１９８８の方法に従って、１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｘｙｌＢを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ、米国）製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ、米国）製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法（サンガーら、１９９２）により、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００４３３）のＤＮＡ配列と同一である。
Ｄ−キシルロキナーゼ及びＤＸＰレダクトイソメラーゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子及びｄｘｒ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置９８８７から１１０８３の大腸菌ＯＲＦｄｘｒ（受託番号ｇｂＡＥ０００１２６）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣＴＧＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＧＡＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＧＡＧＡＣＧＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃７５秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．２μｇのベクターｐＢＳｘｙｌＢ（実施例１）及び０．６μｇの精製ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１８ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１２６）のＤＮＡ配列と同一である。
ベクター構築物ｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒのＤＮＡ配列を添付Ａに示す。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、及びＣＤＰ−ＭＥシンターゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、及びｉｓｐＤ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置６７５４から７４６４の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＤ（受託番号ｇｂＡＥ０００３５８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃３０秒、５０℃３０秒、及び７２℃４５秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．５μｇのベクターｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒ（実施例２）及び０．８μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１２ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１２６）のＤＮＡ配列と同一である。
ベクター構築物ｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤのＤＮＡ配列を添付Ｂに示す。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、ＣＤＰ−ＭＥシンターゼ、及びｃＭＥＰＰシンターゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、及びｉｓｐＦ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置６２７５から７４６４の大腸菌ＯＲＦのｉｓｐＤ及びｉｓｐＦ（受託番号ｇｂＡＥ０００３５８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＴＡＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＡＡＴＧＡＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃７５秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．４μｇのベクターｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒ（実施例２）及び０．７μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１８ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１２６）のＤＮＡ配列と同一である。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、ＣＤＰ−ＭＥシンターゼ、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ、及びｃＭＥＰＰシンターゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、及びｉｓｐＦ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置５７２０から６５７１の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＥ（受託番号ｇｂＡＥ０００２１９）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．２μｇのベクターｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦ（実施例４）及び０．６μｇの精製ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１５ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００２１９）のＤＮＡ配列と同一である。ベクター構築物ｐＢＳｃｙｃｌｏのＤＮＡ配列を添付Ｃに示す。
転写及び発現できる大腸菌のｇｃｐＥ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置３７２から１２０４の大腸菌ＯＲＦｇｃｐＥ（受託番号ｇｂＡＥ０００３３８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．０μｇのベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ １９７８、ＮＥＢ）及び０．７μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び２０ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｇｃｐＥを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｇｃｐＥを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｇｃｐＥのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００３３８）のＤＮＡ配列と同一である。
ベクター構築物ｐＡＣＹＣｇｃｐＥのＤＮＡ配列を添付Ｄに示す。
βカロチンをｉｎ ｖｉｖｏで生成することができる氷核活性細菌由来のカロチノイドオペロンを担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置２３７２から６００５の氷核活性細菌（受託番号ｇｂＤ９００８７）由来のカロチノイドオペロンのオープンリーディングフレームｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、及びｃｒｔＢを、染色体氷核活性細菌ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＧＣＡＣＣＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣ−３’、４０ｎｇの氷核活性細菌の染色体ＤＮＡ、８ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、及びＴａｑエクステンダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、１×Ｔａｑエクステンダーバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃３００秒のＰＣＲを４０サイクル行う。７２℃で２０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．０μｇのベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び２．０μｇの精製ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び４０ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃａｒｏ３４を得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃａｒｏ３４を単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃａｒｏ３４のＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＤ９００８７）のＤＮＡ配列と同一である。
塩基対（ｂｐ）位置１７５から１１４８の氷核活性細菌ＯＲＦｃｒｔＥ（受託番号ｇｂＤ９００８７）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＣＣＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．５μｇのベクターｐＢＳｃａｒｏ３４（上記参照）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製ＰＣＲ生成物０．６μｇをＭｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１６ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃａｒｏ１４を得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃａｒｏ１４を単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃａｒｏ１４のＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＤ９００８７）のＤＮＡ配列と同一である。プラスミドｐＢＳｃａｒｏ１４のＤＮＡ配列を添付Ｅに示す。
５μｇのベクターｐＢＳｃａｒｏ１４（上記参照）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。この制限反応混合物をアガロースゲルで分離し、２２３７及び２３４１塩基対サイズの断片をＱｉａｇｅｎ製のゲル抽出キットで精製する。
３μｇのベクターｐＡＣＹＣ１８４（上記参照）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。この制限反応混合物をアガロースゲルで分離し、３９６８塩基対サイズの断片をＱｉａｇｅｎ製のゲル抽出キットで精製する。
３０ｎｇの精製ベクターＤＮＡとそれぞれ２５ｎｇの精製２２３７及び２３４１塩基対断片を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｃａｒｏ１４を得る。この連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。連結混合物１μｌを形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｃａｒｏ１４を単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｃａｒｏ１４のＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＤ９００８７）のＤＮＡ配列と同一である。プラスミドｐＡＣＹＣｃａｒｏ１４のＤＮＡ配列を添付Ｆに示す。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の酵素的調製
１５０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ８．０中、９６０ｍｇの［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース（５．１ｍｍｏｌ）、６．１ｇのＡＴＰ（１０．２ｍｍｏｌ）、３３７ｍｇのチアミンピロリン酸、１．１４ｇの［２，３−１３Ｃ２］ピルビン酸（１０．２ｍｍｏｌ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオスレイトールを含む反応混合物を調製する。４１０ユニットのトリオースリン酸イソメラーゼ（ウサギ筋肉由来、タイプＩＩＩ−Ｓ、Ｅ．Ｃ．５．３．１．１、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのヘキソキナーゼ（Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ製、タイプＶＩ、Ｅ．Ｃ．２．７．１．１、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのホスホグルコースイソメラーゼ（Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ製、タイプＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．５．３．１．９、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのホスホフルクトキナーゼ（中等度好熱菌由来、タイプＶＩＩ、Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１、Ｓｉｇｍａ）、５０Ｕのアルドラーゼ（ウサギ筋肉由来、Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３、Ｓｉｇｍａ）、及び枯草菌由来の１２Ｕの組換えＤＸＰシンターゼを加えて、最終量を３１５ｍｌにする。この反応混合物を３７℃で終夜インキュベートし、インキュベート中ｐＨを８．０の一定に保つ。反応を１３Ｃ ＮＭＲ分光法で監視する。
［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の酵素的調製
１５０ｍＭのトリス塩酸塩、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０ｇの［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース（５．４ｍｍｏｌ）、０．２３ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のジチオスレイトール、０．３ｇ（０．７ｍｍｏｌ）のチアミンピロリン酸、０．１ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のＡＴＰ（ジナトリウム塩）、及び２．２ｇ（１１ｍｍｏｌ）のホスホエノールピルビン酸（カリウム塩）を含む溶液に８Ｍの水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調整する。４０３Ｕ（２．８ｍｇ）のピルビン酸キナーゼ（ウサギ筋肉由来、Ｅ．Ｃ．２．７．１．４０）、４１０ユニットのトリオースリン酸イソメラーゼ（ウサギ筋肉由来、タイプＩＩＩ−Ｓ、Ｅ．Ｃ．５．３．１．１、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのヘキソキナーゼ（Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ製、タイプＶＩ、Ｅ．Ｃ．２．７．１．１、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのホスホグルコースイソメラーゼ（Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ製、タイプＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．５．３．１．９、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕのホスホフルクトキナーゼ（中等度好熱菌由来、タイプＶＩＩ、Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１、Ｓｉｇｍａ）、５０Ｕのアルドラーゼ（ウサギ筋肉由来、Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３、Ｓｉｇｍａ）、及び枯草菌由来の１２Ｕの組換えＤＸＰシンターゼを加えて、最終量を３００ｍｌにする。この反応混合物を３７℃で終夜インキュベートする。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの酵素的調製
実施例８又は９で得た反応混合物のｐＨ値を９．５に調整する。塩化マグネシウムを加えて濃度を３０ｍＭにする。５０ｍｇ（９５０ユニット）のウシ腸粘膜由来のアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）を加え、この反応混合物を１６時間インキュベートする。変化を１３Ｃ−ＮＭＲ分光法で監視する。ｐＨを７．０に調整し、溶液を１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。標識グルコース（実施例８又は９）から出発して、１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの総収率は約５０％である。
上清又は凍結乾燥上清を取り込み実験で使用する（実施例１１から１７参照）。
［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｘｙｌＢの取り込み実験
アンピシリン３６ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．２リットルに、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する（実施例１参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．６の光学密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。ＩＰＴＧでの誘導の２時間後に、５０ｍｌ（０．９ｍｍｏｌ）の粗製［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ｐＨ７．０）（実施例９及び１０参照）を加える。アリコート２５ｍｌを３０分間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。さらに精製することなく上清の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。ＮＭＲ分析は公表されたシグナル割当（Ｗｕｎｇｓｉｎｔａｗｅｅｋｕｌら、２００１）に基づく。
［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを加えた３０分後に、［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の形成が認められる。［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の最大収率は、［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを培地に加えた３〜５時間後に認められる。１３Ｃ ＮＭＲシグナルは、モル比ほぼ１：９の［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースと［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の混合物を示す。［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の細胞内濃度は、定量的ＮＭＲ分光法により２０ｍＭと推定される。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒの取り込み実験
アンピシリン２２ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．１２リットルに、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する（実施例２参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．６の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。ＩＰＴＧでの誘導の２時間後に、約１．０ｍｍｏｌの粗製［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ｐＨ７．０）（実施例８及び１０参照）を加える。アリコート２５ｍｌを１時間間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。さらに精製することなく上清のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。
ＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験により、それぞれモル比約６．６：７：１の［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、及び［１，２，２’，３，４−１３Ｃ５］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの１Ｈ−１３Ｃ及び１Ｈ−１Ｈスピン系が示される。［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の細胞内濃度は、定量的ＮＭＲ分光法により１０ｍＭと推定される。
表１で要約したＮＭＲデータは、信頼できる化合物の公表されたＮＭＲデータと同一である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９８；Ｒｏｈｄｉｃｈら、１９９９）。
Figure 0004068971
［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦの取り込み実験
アンピシリン１８ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．１リットルに、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する（実施例４参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．５の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。ＩＰＴＧでの誘導の２時間後に、約１．０ｍｍｏｌの粗製［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（実施例９及び１０参照）を加える。３時間後、細胞を回収し、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を１．５ｍｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１５秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。さらに精製することなく上清のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。
ＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験により、［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、及び［１，３，４−１３Ｃ５］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの１Ｈ−１３Ｃ及び１Ｈ−１Ｈスピン系が示される（表１）。［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、及び［１，３，４−１３Ｃ５］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールのモル比はそれぞれ１：０．６：０．９である。
この結果は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの合成に必要なＣＴＰの細胞内量が限定的であることを示す。このため、修正された発酵作用プロトコルが開発された（実施例１４参照）。
［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｘｙｌＢｄｘｒｉｓｐＤＦの取り込み実験
アンピシリン１８ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．１リットルに、プラスミドｐＢＳｘｙｌＢｉｓｐＤＦを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する（実施例４参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．５の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。ＩＰＴＧでの誘導の２時間後に、１０ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）のシチジン、５ｍｌの１ＭのＮａＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、及び約１．０ｍｍｏｌの粗製［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（実施例９及び１０参照）を加える。３時間後、細胞を回収し、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。さらに精製することなく上清のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計で直接記録する。
ＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験により、それぞれモル比が約１：３．４：４．２の［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸、［１，３，４−１３Ｃ３］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、及び［１，３，４−１３Ｃ３］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの１Ｈ−１３Ｃ及び１Ｈ−１Ｈスピン系（表１）が示される。［１，３，４−１３Ｃ３］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの相対量は実施例１３の相対量と比較して２倍に増大する。［１，３，４−１３Ｃ３］４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの細胞内濃度は定量的ＮＭＲ分光法により１０ｍＭと推定される。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの相対量が高いことは、非特定的なホスファターゼが中間体として形成した２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに変換することを示す。このため、十分な量の有機リン酸を細胞に供給し、ホスファターゼの活性を抑制するために、修正された発酵作用プロトコルが開発された（実施例１５から１７参照）。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏの取り込み実験
アンピシリン３６ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．２リットルに、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する（実施例５参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で増殖させる。１．３の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。ＩＰＴＧでの誘導の２時間後に、３０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のシチジン、３００ｍｇ（０．９５ｍｍｏｌ）のＤＬ−α−グリセロール３−リン酸、及び１０ｍｌの１ＭのＮａＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）を加える。３０分後に、約１ｍｍｏｌの［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（実施例８及び１０参照）を加える。アリコート２５ｍｌを１時間間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。さらに精製することなく細胞を含まない抽出液のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。１３Ｃ ＮＭＲ並びにＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹスペクトルにより、［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（Ｈｅｒｚら、２０００）が唯一の生成物であることが確定した。［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の形成は［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを加えた３０分後に認められ、最大収率は［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを加えた５時間後に認められる。［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の細胞内濃度は定量的ＮＭＲ分光法により２０ｍＭと推定される。［Ｕ−１３Ｃ５］２Ｃ−メチル−エリスリトールなどの任意のその他の同位体標識生成物の形成は完全に抑制される。
［２−１４Ｃ］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース及び［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏ−ｐＡＣＹＣｇｃｐＥの取り込み実験
アンピシリン３６ｍｇ及びクロラムフェニコール２．５ｍｇを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地０．２リットルに、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏ及びｐＡＣＹＣｇｃｐＥを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを接種する（実施例５及び６参照）。細胞は振盪培養物中３７℃で終夜増殖させる。４．８から５．０の最適密度（６００ｎｍ）において、３０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のシチジン、３００ｍｇ（０．９４ｍｍｏｌ）のＤＬ−α−グリセロール３−リン酸、及び１０ｍｌの１ＭのＮａＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）を加える。３０分後、２．６μｍｏｌの［２−１４Ｃ］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（１５μＣｉμｍｏｌ−１）（Ｗｕｎｇｓｉｎｔａｗｅｅｋｕｌら、２００１）及び１ｍｌの粗製［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（０．０２ｍｍｏｌ）（実施例８及び１０参照）の混合物を加える。１．５時間後、細胞を回収し、５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を２０ｍＭのＮａＦ（２ｍｌ）及びメタノール（２ｍｌ）の混合物に懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１５秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清の放射能をシンチレーション計数（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、ＬＳ７８００）で測定する。１４Ｃ標識１−デオキシ−Ｄ−キシルロースとして最初に加えた放射能の１０％が上清中に検出される。アリコートを実施例１９で記載の通りにＴＬＣ及びＨＰＬＣによって分析し、生成物を実施例２０で記載の通りに精製する。これらのデータを基に、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸及び２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸を、モル比７：３の生成物として同定した（実施例１７及び１８もまた参照）。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース又は［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏ−ｐＡＣＹＣｇｃｐＥの取り込み実験
アンピシリン３６ｍｇ及びクロラムフェニコール２．５ｍｇを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地０．２リットルに、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏ及びｐＡＣＹＣｇｃｐＥを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを接種する。細胞は振盪培養物中３７℃で終夜増殖させる。４．８から５．０の最適密度（６００ｎｍ）において、３０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のシチジン、３００ｍｇ（０．９３ｍｍｏｌ）のＤＬ−α−グリセロール３−リン酸、及び１０ｍｌの１ＭのＮａＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）を加える。３０分後、３ｍｌの粗製［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース又は［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（０．０５ｍｍｏｌ）（実施例８、９、及び１０参照）を加える。アリコート２５ｍｌを１時間間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦ又はメタノールと１０ｍＭのＮａＦを含むＤ２Ｏ（６：４；ｖ／ｖ）の混合物７００μｌに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。後処理中の劣化を避けるために、さらに精製することなく生成物の構造をＮＭＲ分光法で決定する（実施例１８参照）。
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の構造決定
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを出発材料とする１Ｈデカップルド１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（Ｈｅｒｚら、２０００）に属する５つの１３Ｃ−１３Ｃカップルドシグナル及び未知の代謝生成物に属する５つの１３Ｃ−１３Ｃカップルドシグナルを１４．７、６４．５、６８．６、１２２．７、及び１３９．５ｐｐｍ（表２）に示す。未知の代謝生成物の化学シフトは、二重結合モチーフ（１２２．７及び１３９．５ｐｐｍのシグナル）、メチル基（１４．７ｐｐｍのシグナル）、及びＯＲ（Ｒ＝未知）に結合した２つの炭素原子（６４．５及び６８．６ｐｐｍのシグナル）を示唆している。ｓｐ３ハイブリダイゼーションを有する炭素原子を示す３つのシグナル（１４．７、６４．５、及び６８．５ｐｐｍ）は、カップリング定数４０〜５０Ｈｚを有する１つの隣接した１３Ｃ原子との１３Ｃ−１３Ｃカップリングを示す（表２）。１２２．７ｐｐｍのシグナルは２つの隣接した１３Ｃ隣接基との１３Ｃカップリングを示し（カップリング定数、７４及び５０Ｈｚ）、一方、１４１．５ｐｐｍのシグナルは３つの隣接した１３Ｃ原子との１３Ｃカップリングを示す（カップリング定数、７４、４３、及び４３Ｈｚ）。化学シフト位相幾何学と合わせると、このカップリングシグネチャーは２−メチル−２−ブテニル骨格を示している。ＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験は、１３Ｃ−１Ｈ及び１Ｈ−１Ｈスピン系（表３）と共に１Ｈ ＮＭＲ化学シフトが示す（表３）。より具体的には、１２２．７ｐｐｍの１３Ｃ ＮＭＲシグナルは、ＣＣ二重結合に結合したＨ原子の典型的な化学シフト領域内である５．６ｐｐｍの１Ｈ ＮＭＲと相関している。一方、１３９．５ｐｐｍのシグナルは１３Ｃ−１Ｈの相関を与えない。６４．５及び６８．６ｐｐｍのシグナルは、それぞれ４．５及び３．９ｐｐｍで１Ｈシグナルへの１３Ｃ−１Ｈ相関を与える。１４．７ｐｐｍのメチルシグナルは１．５ｐｐｍのプロトンシグナルと相関する。１３Ｃ−１３Ｃカップリングパターン（表２）及び１Ｈ−１３Ｃ長領域相関（ＨＭＢＣ実験、表３）と共に、これらのデータは１，４−ジヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル系を確定している。
供給材料としての［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースから、新たな生成物のそれぞれ原子４、１、及び３を表す６４．５、６８．６、及び１２２．７ｐｐｍの３つのシグナルが認められる。新たな生成物の１、３、及び４位の炭素原子は［３，４，５−１３Ｃ３］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の３、４、及び５位の炭素原子と生物発生的に同等であると判断することができる。このカップリング位相幾何学は２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸のカップリングパターンと同様であり（実施例１３参照）、新たな化合物が２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を介して導出されることが確認される。
６４．５及び１２２．７ｐｐｍのＣ−４及びＣ−３１３Ｃ ＮＭＲシグナルは、それぞれ５．５及び８．０Ｈｚの１３Ｃ−３１Ｐカップリングを示す。これらのカップリングは２−メチル−２−ブテニル骨格の４位にリン酸基又はピロリン酸基が存在することを示す。
この観察と一致して、この生成物の１Ｈデカップルド３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは−９．２で二重線（３１Ｐ−３１Ｐカップリング定数、２０．９Ｈｚ）及び−１０．６ｐｐｍで二重−二重−二重線（３１Ｐ−１３Ｃカップリング定数、５．８及び７．４Ｈｚ、３１Ｐ−３１Ｐカップリング定数、２０．９Ｈｚ）を示す。１Ｈデカップリングなしで、−１０．６ｐｐｍの３１Ｐ ＮＭＲシグナルはブロードであり、一方、−９．２ｐｐｍのシグナルは１Ｈカップリングの影響を受けていない。化学シフト並びに認められたカップリングパターンは、４位に遊離の二リン酸部分が存在することを確認している。
要約すると、これらのデータすべては、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸としての構造を確定している。

Figure 0004068971
Figure 0004068971
非メバロン酸経路のリン酸化代謝生成物の検出
ＴＬＣ法による方法Ａ）
上述の通り調製した組換え細胞からの細胞を含まない抽出物のアリコート（１０μｌ）（実施例１６参照）をＰｏｌｙｇｒａｍ（登録商標）ＳＩＬ ＮＨ−Ｒ薄層プレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）にスポットする。次いで、ＴＬＣプレートをｎ−プロパノール：酢酸エチル：水、６：１：３（ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒系中で展開する。実験時間は約４時間である。ラジオクロマトグラムを監視し、蛍光体イメージャー（Ｓｔｏｒｍ８６０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、米国）で評価する。研究した化合物のＲｆ値を表４に示す。
Figure 0004068971
ＨＰＬＣ法による方法Ｂ）
上述の通り調製した組換え細胞からの細胞を含まない抽出物のアリコート（１００μｌ）（実施例１６参照）を、１０ｍＭのテトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（ＴＢＡＳ）、ｐＨ６．０、流量０．７５ｍｌ／分−１で１５分間平衡化したＭｕｌｔｏｓｐｈｅｒ１２０ＲＰ１８−ＡＱ−５（４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、ドイツ）を使用するＨＰＬＣで分析する。試料を注入した後、カラムを１０ｍＭのＴＢＡＳで２０分間、次いで１０ｍＭのＴＢＡＳ中０〜４２％（ｖ／ｖ）のメタノールの直線勾配で６０分間展開する。流出物を連続流ラジオ検出器（Ｂｅｔａ−ＲＡＭ、Ｂｉｏｓｔｅｐ ＧｍｂＨ、Ｊａｈｎｓｄｏｒｆ、ドイツ）で監視する。研究した化合物の保持体積を表５に示す。
Figure 0004068971
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の精製
［２−１４Ｃ］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース及び［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（実施例１６参照）を使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏ−ｐＡＣＹＣｇｃｐＥでの供給実験で得られた粗製細胞を含まない抽出物を凍結乾燥する。残渣を水６００μｌに溶解し、１４０００ｐｐｍで１０分間遠心分離する。アリコート９０μｌをＮｕｃｌｅｏｓｉｌ １０ ＳＢ（４．６×２５０ｍｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）のカラムにかけ、７０ｍｌ中０．１〜０．２５Ｍのギ酸アンモニウムの直線勾配により流量２ｍｌ／分−１で展開する。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸及び１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の保持体積はそれぞれ２５及び４４ｍｌである。画分を集め、凍結乾燥する。１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸のＮＭＲデータは実施例１８、表２で示したデータと同一である。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、ＣＤＰ−ＭＥシンターゼ、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ、ｃＭＥＰＰシンターゼ、及び１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸シンターゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、及びｉｓｐＧ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置３７２から１２０４の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＧ（受託番号ｇｂＡＥ０００３３８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．４μｇのベクターｐＢＳｃｙｃｌｏ（実施例５）及び０．８μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１８ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００３３８）のＤＮＡ配列と同一である。
ベクター構築物ｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥのＤＮＡ配列を添付Ｈに示す。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、ＣＤＰ−ＭＥシンターゼ、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ、ｃＭＥＰＰシンターゼ、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、及びＬｙｔＢを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、及びｌｙｔＢ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置７５０４から８４５４の大腸菌ＯＲＦｌｙｔＢ（受託番号ｇｂＡＥ００５１７９）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＡＡＡＴＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＴＡＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．３μｇのベクターｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥ（実施例２１）及び０．７μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｃＩ及びＳａｃＩＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１６ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ００５１７９）のＤＮＡ配列と同一である。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥの取り込み実験
アンピシリン１８ｍｇを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地０．１リットルに、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを接種する。細胞は振盪培養物中３７℃で終夜増殖させる。４．８から５．０の最適密度（６００ｎｍ）において、３０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のシチジンを加える。１．２ｇの乳酸リチウム（１２．５ｍｍｏｌ）及び６ｍｌの粗製［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（０．０５ｍｍｏｌ）（実施例８、９、及び１０参照）を０．１Ｍのトリス塩酸塩（ｐＨ＝７．５）を含む溶液を最終量３０ｍｌで２時間以内に連続的に加える。アリコート２５ｍｌを１時間間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞を７００μｌのＤ２Ｏ中の２０ｍＭのＮａＦ又はメタノールと１０ｍＭのＮａＦを含むＤ２Ｏ（６：４；ｖ／ｖ）の混合物７００μｌに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。後処理中の劣化を避けるために、さらに精製することなく生成物の構造をＮＭＲ分光法で決定する。
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸に対する相対量は、乳酸リチウムを培地に加えることにより約２〜３倍に増大することができる。
（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル二リン酸三アンモニウム（８）の調製
一般：化学物質は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、ドイツ）、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）、及びＭＥＲＣＫ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手し、さらに精製することなく使用する。溶媒は蒸留及び／又は乾燥して使用する。クロマトグラフィーはシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ、Ｆｌｕｋａ Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）、ＤＯＷＥＸ ５０ ＷＸ８（２００〜４００メッシュ、ＳＥＲＶＡ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、及びＣｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ａｖｉｃｅｌ、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｉｋｒｏｋｒｉｓｔａｌｌｉｎ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で実施する。ＴＬＣは、シリカゲル６０Ｆ２５４プラスチックシート（ＭＥＲＣＫ）又はセルロースＦプラスチックシート（ＭＥＲＣＫ）で実施し、アニスアルデヒド溶液（アニスアルデヒド：Ｈ２ＳＯ４：ＨＡｃ＝０．５：１：５０ｖ／ｖ／ｖ）で検出する。ＮＭＲスペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ ＡＭＸ ４００、ＤＲＸ ５００、及びＡＣ ２５０分光器で室温において記録する。
アセトニルテトラヒドロピラニルエーテル（１２）（Ｈａｇｉｗａｒａら、１９８４）
ピリジニウム−トルエン−４−スルホネート３３９ｍｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、ヒドロキシアセトン９．３５ｍｌ（１０．０ｇ、０．１３５ｍｏｌ）、及び３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン２４．７ｍｌ（２２．７ｇ、０．２７０ｍｏｌ）の混合物を室温で２．５時間攪拌する。残留する３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランを減圧下で除去する。粗製混合物をシリカゲルのＦＣ（ヘキサン／アセトン＝４：１、６．５×２０ｃｍ）で精製し、無色の液体１８．７ｇ（０．１１８ｍｏｌ、８８％）を得る。
Figure 0004068971
（Ｅ，Ｚ）−エチル−２−メチル−１−テトラヒドロピラニルオキシ−ブト−２−エノエート（１３）（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９６）
（エトキシカルボニルメチレン）−トリフェニルホスホラン３３．０ｇ（９４．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、室温で乾燥トルエン５００ｍｌに溶解する。次いで、１０．０ｇ（６３．２ｍｍｏｌ）のアセトニルテトラヒドロピラニルエーテル１２を加え、この混合物を加熱還流する。この温度で３９時間後、溶媒を減圧下で蒸発させて橙色の油状物を得る。過半量のトリフェニルホスフィンオキシドをヘキサン／アセトン（９：１）１００ｍｌを加えることにより沈殿させる。濾過後、濾液を濃縮し、さらに１００ｍｌのヘキサン／アセトン（９：１）を加える。固体を濾去し、溶媒を除去して橙色の油状物１８ｇを得、これをシリカゲルのＦＣ（ヘキサン／アセトン＝９：１、６．５×２８ｃｍ）で精製して（Ｅ）−１３／（Ｚ）−１３＝５：１の混合物１２．９ｇ（５６．５ｍｍｏｌ、８９％）を得る。
Figure 0004068971
（Ｅ，Ｚ）−２−メチル１−テトラヒドロピラニルオキシ−ブト−２−エン−４−オール（１４）（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９６）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌ中のエステル１３（８．７３ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。次いで、ヘキサン中の９１．８ｍｌ（９１．８ｍｍｏｌ）の１．０ＭのＤＩＢＡＨを窒素雰囲気下で徐々に加える。得られる溶液を−７８℃で３時間攪拌し、１．５ｍｌの１ＭのＮａＯＨを加えることにより反応をクエンチする。室温まで加温した後、溶媒を減圧下で除去する。得られる粘着性の残渣を、１００ｍｌのＭｅＯＨを２回加えることによって広く溶解する。得られる混合物をＳｉＯ２のカラムに通し、溶媒から蒸発させ、１４００ｍｌのＭｅＯＨでパージしたＳｉＯ２／Ｎａ２ＳＯ４のカラムに負荷する。溶媒を蒸発させると無色の液体９．５ｇが得られ、これをシリカゲルのＦＣ（ヘキサン／アセトン＝１：３、６．５×１６ｃｍ）で精製して、６．９８ｇ（３７．４ｍｍｏｌ、９８％）の無色の液体（Ｅ）−１４／（Ｚ）−１４＝６：１を得る。
Figure 0004068971
（Ｅ，Ｚ）−４−クロロ−２−メチル１−テトラヒドロピラニルオキシ−ブト−２−エン（１５）（Ｈｗａｎｇら、１９８４）
１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のアルコール１４（１．００ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＤＭＡＰ（９１８ｍｇ、７．５２ｍｍｏｌ）及び１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のｐ−ＴｓＣｌ（１．２３ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）を加える。得られる溶液を室温で１時間攪拌する。減圧下で溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲルのＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２、５×２０ｃｍ）で精製して６９３ｍｇ（３．３９ｍｍｏｌ、６３％）の無色の液体（Ｅ）−１５／（Ｚ）−１５＝６：１を得る。
Figure 0004068971
（Ｅ，Ｚ）−２−メチル１−テトラヒドロピラニルオキシ−ブト−２−エニル二リン酸三アンモニウム（１６）（Ｄａｖｉｓｓｏｎら、１９８６）
１．３ｍｌのＭｅＣＮ中のクロリド１５（２６０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、３．０ｍｌのＭｅＣＮ中のトリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）水素ピロリン酸１．３８ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）を室温で徐々に加え、橙赤色の溶液を得る。反応後に１Ｈ−ＮＭＲを実施し、Ｈ−３の多重線のアップフィールドシフトを利用する。２時間後に反応は終了し、溶媒を減圧下で除去する。橙色の油状物を２．５ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、カラム２個分の量（４０ｍｌ）の２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＤＯＷＥＸ ５０ ＷＸ８（２．５×３ｃｍ）カチオン交換樹脂（ＮＨ４ ＋形）のカラムを通す。カラムを６０ｍｌの２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で溶離する。得られた溶液を凍結乾燥し、イソプロパノール／１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（１：１）５ｍｌに溶解し、イソプロパノール／１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（１：１）で溶離するセルロースカラム（２×１８ｃｍ）に負荷する。流出物を凍結乾燥して、４９５ｍｇ（１．２５ｍｍｏｌ、９８％）の（Ｅ）−１６／（Ｚ）−１６＝６：１を白色固形物として得る。
Figure 0004068971
（Ｅ，Ｚ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−ブト−２−エニル二リン酸三アンモニウム（８）（Ｄａｖｉｓｓｏｎら、１９８６）
２６８ｍｇ（０．６７５ｍｍｏｌ）の保護されたピロリン酸１６を２．０ｍｌのＤ２Ｏに溶解し、４０μｌのＤ２Ｏ中の３７％ＤＣｌを加えることによりｐＨを１に調整する。このｐＨで１分後、４０μｌのＤ２Ｏ中の４０％ＮａＯＤを加えることにより中和し、１Ｈ ＮＭＲを測定すると、５０％の脱保護を示した。この手順を脱保護が終了するまで繰り返すと、ほんの少量の分解生成物が形成し、合計７分、ｐＨ１で得られる。イソプロパノール／１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（１：１）２ｍｌをセルロースカラム（イソプロパノール／１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（１：１）、２×１０．５ｃｍ）に加えることによって希釈された中性溶液を負荷することにより精製すると、１９３ｍｇ（０．６１６ｍｍｏｌ、９１％）の（Ｅ）−８／（Ｚ）−８＝７：１の白色固形物が得られる。
Figure 0004068971
試薬及び条件（図４：１のステップ（ａ）から（ｆ））：（ａ）ＤＨＰ、ＰＰＴＳ、２５℃（２．５時間）；（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨＣＯ２Ｅｔ、トルエン、還流（３９時間）；（ｃ）（１）ＤＩＢＡＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃（３時間）、（２）１ＭのＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ；（ｄ）ｐ−ＴｓＣｌ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２、２５℃（１時間）；（ｅ）（（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）４Ｎ）３ＨＰ２Ｏ７、ＭｅＣＮ、２５℃（２時間）；（ｆ）ＨＣｌ／Ｈ２Ｏ、ｐＨ１、２５℃（７分間）。
（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の同定
ＧｃｐＥ生成物の構造を１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸の合成試料の化学シフトと比較することによってさらに分析する。
そのために、［Ｕ１３Ｃ５］−１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを供給した（実施例１６参照）、ｘｙｌＢ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｇｃｐＥ遺伝子を発現する人工遺伝子構築物を与えられ生物工学処理された大腸菌細胞から得られた細胞抽出物に［２−１４Ｃ］１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（０．３６μＣｉ）を加える。この細胞抽出物の上清を、ＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５ ＳＢ、７．５×２５０ｍｍ、１００ｍＭから２５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯＯの勾配で展開、流量２ｍｌ／分、３５分間）で精製する。生成物を２３分で溶離し、集める。凍結乾燥後、残渣をＤ２Ｏ（ｐＨ６）に溶解し、１Ｈ ＮＭＲ分析にかける（図３−Ａ）。
次に、合成的に調製した（Ｅ，Ｚ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸（Ｅ／Ｚ＝７：１）（Ｄ２Ｏ、ｐＨ７）の溶液４０μｌをＮＭＲ試料に加え、１Ｈ ＮＭＲ分光法で再び分析する（図３−Ｂ）。一方では、図３−Ｂで示した通り、（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニルを示すシグナルは選択的に増大し、生物学的に生成した構造は合成的に生成したもの、すなわち、（Ｅ）−異性体と同一である証拠を提供している。他方では、少ない方の（Ｚ）−異性体は生物学的に得られた生成物のシグナルとはいかなる相関もなく増大する。図３−Ｃは、合成的に調製した（Ｅ，Ｚ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の溶液をさらに４０μｌ加えた後の同じ効果を示す。
トウガラシ有色体の脂溶性画分への（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の取り込み
Ｃａｍａｒａ（Ｃａｍａｒａ、１９８５；Ｃａｍａｒａ、１９９３）の方法をわずかに修正することによって有色体を単離する。赤トウガラシ（６５０ｇ）の果皮を、１ｍＭのＤＴＥ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．４Ｍのスクロースを含む６００ｍｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）（バッファーＡ）中、４℃で均質化する。この懸濁液をナイロン布（５０μｍ）４層で濾過し、遠心分離して（１０分間、４５００ｒｐｍ、ＧＳＡローター）、２００ｍｌのバッファーＡに均質化された粗製有色体のペレットを得る。この懸濁液を遠心分離する（１０分間、４５００ｒｐｍ、ＧＳＡローター）。ペレットを均質化し、１ｍＭのＤＴＥを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）３ｍｌに再懸濁する。この懸濁液をナイロン布（５０μｍ）１層で濾過する。
反応混合物は、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、６ｍＭのＡＴＰ、２０μＭのＦＡＤ、及び有色体２ｍｇを含む。８．８ｎｍｏｌの［２−１４Ｃ］２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、［２−１４Ｃ］１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル二リン酸、又は［２−１４Ｃ］イソペンテニル二リン酸（具体的濃度１５．８μＣｉ／μｍｏｌ）を加え、混合物を３０℃で終夜インキュベートする。塩化メチレン抽出で反応を終了する。有機相を窒素流下で濃縮する。アリコートをシリカゲルプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ ＳＩＬ−Ｇ、ＵＶ２５４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）上にスポットする。プレートをヘキサン：エーテル＝６：１（系Ｉ）及び／又はヘキサン：トルエン＝９：１（系ＩＩ）でそれぞれ展開する。クロマトグラムを蛍光体イメージャー（Ｓｔｏｒｍ ８６０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州、米国）で監視する。系Ｉのゲラニルゲラニオール及びカロチン画分のＲｆ値はそれぞれ０．３５及び０．９である。系ＩＩのβカロチン、フィトエン、及びフィトフルエンのＲｆ値はそれぞれ０．６５、０．６０、及び０．５５である。
クロマトグラムを評価することにより、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル二リン酸からトウガラシ有色体のゲラニルゲラニオール、βカロチン、フィトエン、及びフィトフルエン画分に放射能を効果的に転じることができ、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル二リン酸が２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の下流かつイソペンテニル二リン酸の上流の非メバロン酸経路の実際の中間体であることを示している。
転写及び発現できる大腸菌のｉｓｐＧ（ｇｃｐＥ）遺伝子及びｉｓｐＨ（ｌｙｔＢ）遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置５６１８から６５６８の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＨ（ｌｙｔＢ）（受託番号ｇｂＡＥ０００１１３）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＴＴＡＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．４μｇのベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ １９７８、ＮＥＢ）及び０．７μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｌＩ及びＥａｇＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１８ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１１３）のＤＮＡ配列と同一である。
塩基対（ｂｐ）位置３７２から１２０４の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＧ（ｇｃｐＥ）（受託番号ｇｂＡＥ０００３３８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．０μｇのベクターｐＡＣＹＣｌｙｔＢ及び０．９μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び２３ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００３３８）のＤＮＡ配列と同一である。
ベクター構築物ｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥのＤＮＡ配列を添付Ｉに示す。
大腸菌由来のｉｓｐＨ（ｌｙｔＢ）のＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を添付Ｊに示す。
Ｄ−キシルロキナーゼ、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ、ＣＤＰ−ＭＥシンターゼ、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ、ｃＭＥＰＰシンターゼ、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、及びＩＰＰ／ＤＭＡＰＰシンターゼを転写及び発現できる大腸菌のｘｙｌＢ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、及びｉｓｐＨ遺伝子を担持するベクターの構築
大腸菌ＯＲＦｉｓｐＧ（以前はｇｃｐＥ）及びｉｓｐＨ（以前はｌｙｔＢ）を、プラスミドｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥ（実施例２７参照）を鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＧ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＡＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧ−３’、２ｎｇのｐＡＣＹＣｇｃｐＥｌｙｔＢ ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃１５０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で２０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、１．７μｇのベクターｐＢＳｃｙｃｌｏ（実施例５）及び１．３μｇの精製ＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２２ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１９ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２を得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２を単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２のＤＮＡ挿入物の配列決定をする。ベクター構築物ｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２のＤＮＡ配列を添付Ｋに示す。
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２の取り込み実験
アンピシリン１８ｍｇを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地０．１リットルに、プラスミドｐＢＳｃｙｃｌｏｇｃｐＥｌｙｔＢ２を収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを接種する。細胞は振盪培養物中３７℃で終夜増殖させる。１．３から１．７の最適密度（６００ｎｍ）において、乳酸リチウム２．４ｇ（２５ｍｍｏｌ）及び粗製［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース１０ｍｌ（０．０５ｍｍｏｌ）（実施例８参照）を最終量３０ｍｌ（ｐＨ＝７．４）で２時間以内に連続的に加える。アリコート４０ｍｌを３０分間隔で取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞をメタノールと１０ｍＭのＮａＦを含むＤ２Ｏ（６：４；ｖ／ｖ）の混合物７００ｍｌに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。後処理中の劣化を避けるために、さらに精製することなく生成物の構造をＮＭＲ分光法で決定する。
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の構造決定
［Ｕ−１３Ｃ５］１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを出発材料とする１Ｈデカップルド１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは（実施例８及び３０参照）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（Ｈｅｒｚら、２０００）に属する５つの強い１Ｃ−１３Ｃカップルドシグナル、及び１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸（実施例１８参照）に属する強度の低い５つの１３Ｃ−１３Ｃカップルドシグナル（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸と１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の比率１００：３の２−メチル１３Ｃ ＮＭＲシグナル強度）を示す。
さらに、２１．１（二重線）、３９．６（三重線）、５９．３（二重線）、１１１．８（二重線）、及び１４３．２ｐｐｍ（三重線の二重線）（未知の代謝生成物Ｂ）のシグナルを伴う、２１．６（二重線）、３７．８（三重線）、６４．１（二重線）、１１１．６（二重線）、及び１４３．３ｐｐｍ（三重線の二重線）（未知の代謝生成物Ａ）の５つの１３Ｃ−１３Ｃカップルドシグナルの一組を検出する。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の２−メチルシグナルと２１．６ｐｐｍ（代謝生成物Ａ）及び２１．１ｐｐｍ（代謝生成物Ｂ）の未知の化合物の推定メチルシグナルの比は、それぞれ１００：２４：４である。
さらに、１７．１（二重線）、２４．９（二重線）、６２．７（二重線）、１１９．６（二重二重線）、及び１３９．４ｐｐｍ（多重線）の別の未知の化合物（代謝生成物Ｃ）に属する強度の低い１３Ｃカップルドシグナルが検出される。２１．６（代謝生成物Ａ）、１７．１及び２４．９（代謝生成物Ｃ）の推定メチルシグナルの強度比は、それぞれ１００：１３：１３である。
反応混合物の３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の強いシグナルによって特徴付けられる（Ｈｅｒｚら、２０００）。さらに、３１Ｐ３１Ｐカップルドブロードシグナルは有機二リン酸に典型的な化学シフト範囲（−６から−１３ｐｐｍ、３１Ｐ３１Ｐカップリング定数、２０Ｈｚ）で認められる。
代謝生成物Ａ
１１１．６及び１４３．３ｐｐｍの代謝生成物Ａのシグナルは、二重結合モチーフの助けとなり、６４．１、３７．８、及び２１．６ｐｐｍのシグナルは３個の脂肪族炭素原子を反映し、そのうちの１つ（６４．１ｐｐｍのシグナル）はＯＨ又はＯＲ（Ｒ＝未知）に結合していると思われる。
未知の代謝生成物Ａの構造に関する追加情報は、１３Ｃカップリングパターンから見つけることができる。１３Ｃ ＮＭＲシグナルのうちの３つ（２１．６、６４．１、及び１１１．６ｐｐｍ）は分断されて二重線となることにより３つの１３Ｃ原子がそれぞれただ１個の１３Ｃ標識隣接基に結合していることを表し、１つのシグナル（３７．８ｐｐｍ）はプソイド三重線シグネチャーを示すことにより２個の隣接する１３Ｃ原子を有する１３Ｃ原子を表し、１つのシグナル（１４３．３ｐｐｍ）は分断されて三重線の二重線となることにより３つの１３Ｃ結合を有する１３Ｃ原子を表す。化学シフトと合わせると、この結合性パターンは代謝生成物Ａをイソペンテニル誘導体として確立している。
１４３．３ｐｐｍのシグナルの複雑なシグネチャーは、より詳細な分析に値する。大きなカップリング（７１Ｈｚ）は炭素−炭素二重結合に関与する炭素原子間の１３Ｃ１３Ｃカップリングで典型的である。７１Ｈｚのカップリングは１１１．６ｐｐｍの二重線シグナルでも見られ、これは二重結合の第２の炭素を表す。カップリングパターン及び化学シフトにより、エキソ−メチレン官能性が存在することは明らかである。さらに２つの１３Ｃカップリングが１４３．３ｐｐｍのシグナルの三重線サブ構造に見られ、これらは両方とも４１Ｈｚであり、各炭素を構造の分岐点として確立している。
ＨＭＱＣ実験は１Ｈ ＮＭＲ化学シフト並びに１３Ｃ−１Ｈ及び１−１Ｈスピン系を表す。より具体的には、１１１．６ｐｐｍの１３Ｃ ＮＭＲシグナルは４．７３ｐｐｍの１Ｈ ＮＭＲシグナルと相関する。一方、１４３．３ｐｐｍのシグナルは１３Ｃ−１Ｈ相関を与えない。６４．１、３７．８、及び２１．６ｐｐｍのシグナルは、それぞれ４．００、２．３１、及び１．６８ｐｐｍの１Ｈシグナルに１３Ｃ−１Ｈ相関を与える。ＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験が示す通り、２．３１及び４．００のプロトンシグナルは連結され、一方、４．７３及び１．６８ｐｐｍのシグナルはＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験の一重線として見られる。認められた１Ｈ ＮＭＲ化学シフトをカップリングパターンと組み合わせてみると、代謝生成物Ａが１位に単結合のヘテロ原子（殆どの場合Ｏ）を有するイソペンテニル誘導体であることを示している。
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ、同じ溶媒混合物中で測定）の確実な試料の３１Ｃ及び１Ｈ化学シフトは、代謝生成物Ａの化学シフトと同一である。したがって、代謝生成物Ａは［Ｕ−１３Ｃ５］ＩＰＰであると同定する。
代謝生成物Ｂ
上記の通り、１３Ｃ ＮＭＲシグナル並びにＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹスペクトルで認められた代謝生成物Ｂのカップリング及び相関パターンは、代謝生成物Ａ（ＩＰＰ）と事実上同じであり、代謝生成物ＢとＩＰＰの炭素結合性は同一であることを示唆している。代謝生成物ＢとＩＰＰのＮＭＲデータ間の最も重要な差異は、ＩＰＰのＣ−１シグナル（６４．１ｐｐｍ）に対応する代謝生成物Ｂ（５９．３ｐｐｍ）の１つの二重線シグナルの１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトが４．９ｐｐｍアップフィールドシフトしていることである。これは、代謝生成物ＢのＣ−１でリン酸部分が失われていることを示唆する。したがって、代謝生成物Ｂは［Ｕ−１３Ｃ５］イソペンテン−１−オールである。イソペンテン−１−オールは、実験系内に存在するピロホスファターゼとホスファターゼの触媒作用によって形成すると思われる。
代謝生成物Ｃ
代謝生成物Ａ（ＩＰＰ）に関して上記した通り、代謝生成物Ｃの構造はＮＭＲ分析によって与えられる。代謝生成物Ｃのシグナル（３つの二重線、１つの二重二重線、１つの多重線）の１３Ｃカップリングパターンは、この化合物が別のイソペンタン誘導体であることを示唆している。二重二重線（１１９．６ｐｐｍ）及び多重線（１３９．４ｐｐｍ）で認められた化学シフトは、炭素−炭素二重結合が分子のＣ−２（２個の１３Ｃ隣接基と連結）とＣ−３（３つの１３Ｃ隣接基を結合していることを示す。
代謝生成物Ｃの１Ｈ ＮＭＲ化学シフトはＨＭＱＣ及びＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験によって明らかにされ、１．７５及び１．７１ｐｐｍで２つの一重線並びに５．４３及び４．４５ｐｐｍにシグナルを含むスピン系を示す。化学シフトと合わせると、この相関パターンは代謝生成物Ｃがジメチルアリル誘導体であることを示す。
ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の確実な試料の１３Ｃ及び１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、代謝生成物Ｃのシグナルの化学シフトと同一である。これにより、代謝生成物Ｃは、疑いなく［Ｕ−１３Ｃ５］ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。
代謝生成物Ａ（ＩＰＰ）及び代謝生成物Ｃ（ＤＭＡＰＰ）のＮＭＲデータを表６及び７に要約する。

Figure 0004068971
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シロイヌナズナ由来のｉｓｐＧ遺伝子（断片）のクローニング
２週齢のシロイヌナズナのコロンビア系統（茎及び葉）１ｇから公表された手法（Ｌｏｇｅｍａｎｎら、１９８７）によりＲＮＡを単離する。
２．７５μｇのＲＮＡ、５０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、１μｇのランダムヘキサマーのプライマー、１μｇのＴ１５プライマー、及び２０％のファーストストランド５×バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む総量５０μｌの混合物を９５℃で５分間インキュベートし、氷冷し、５００ＵのＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素Ｐｒｏｍｅｇａを加える。混合物を４２℃で１時間インキュベートする。９２℃で５分間インキュベートした後、ＲＮアーゼＡ（２０Ｕ）及びＲＮアーゼＨ（２Ｕ）を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。
得られるｃＤＮＡ（この混合物１μｌ）を使用してＰＣＲによりｉｓｐＧを増幅する。
塩基対（ｂｐ）位置２８８９から６４７６の推定リーダー配列のコード領域を有さないシロイヌナズナＯＲＦｉｓｐＧ（受託番号ｄｂｊＡＢ００５２４６）を、シロイヌナズナ由来のｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。反応混合物は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００中、総量１００μｌの２５ｐｍｏｌのプライマーＣＣＴＧＣＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣ、２５ｐｍｏｌのプライマーＣＡＧＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣ、１μｌのｃＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを含む。
この混合物を９５℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを４０サイクル行う。７２℃で２０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。精製ＰＣＲ生成物１．７μｇが得られる。
ＰＣＲ増幅生成物を第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用する。反応混合物は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌ中、２５ｐｍｏｌのプライマーＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧ、２５ｐｍｏｌのプライマーＴＣＣＧＴＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＧＧ、２μｌの第１のＰＣＲ増幅生成物、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを含む。
この混合物を９５℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを４０サイクル行う。７２℃で２０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
ＰＣＲ増幅生成物をＱｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットで精製する。精製ＰＣＲ生成物１．４μｇが得られる。２．０μｇのベクターｐＱＥ３０及び１．４μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化して粘着末端を生成する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から提供された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡ及びＰＣＲ生成物をＱｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇのベクターＤＮＡ及び１２ｎｇのＰＣＲ生成物を、１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び総量１０μｌ中のＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）２μｌで連結すると、プラスミドｐＱＥｇｃｐＥａｒａが得られる。連結混合物を４℃で終夜インキュベートする。連結混合物２μｌを形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＭ１５［ｐＲＥＰ４］（Ｚａｍｅｎｈｏｆら、１９７２）細胞にする。プラスミドｐＱＥｇｃｐＥａｒａを上述の通りに単離する。７μｌのプラスミドＤＮＡを得る。
プラスミドｐＱＥｇｃｐＥａｒａのＤＮＡ挿入物を上述の通りに配列決定する。このＤＮＡ配列はデータベース中の配列（受託番号ｄｂｊＡＢ００５２４６、添付Ｌ参照）と同一ではないことが分かる。
ＩｓｐＧ（ＧｃｐＥ）酵素活性のスクリーニング
ＸＬ１−ｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥ細胞の０．２ｇを５０ｍＭのトリス塩酸塩１ｍｌ（ｐＨ７．４）及び２ｍＭのＤＴＴに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力８０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×７秒間超音波処理する。この懸濁液を１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を下記の通りのアッセイ中の粗製細胞抽出液として使用する。
アッセイ混合物は、総量１５０μｌ中、１００ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、１．２ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＣｏＣｌ２、２ｍＭのＮＡＤＨ、２０ｍＭ（１８μＣｉｍｏｌ−１）の［２−１４Ｃ］２Ｃ−メチル−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、０．５ｍＭのパミドロネート、ＸＬ１−ｐＡＣＹＣｌｙｔＢｇｃｐＥの細胞抽出物１００μｌを含む。この混合物を３７℃で１０から４５分間インキュベートし、氷冷する。３０％（ｇ／ｖ）のトリクロロ酢酸１０μｌを加え、混合物を２０μｌの１ＭのＮａＯＨで中和する。混合物を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清１３０μｌのアリコートをＭｕｌｔｏｓｐｈｅｒ１２０ＲＰ１８−ＡＱ−５（４．６×２５０ｍｍ、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、ドイツ）のカラムを使用する逆相イオン対ＨＰＬＣにより分析する。このカラムを、１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中の７〜２１％（ｖ／ｖ）のメタノールの直線勾配、流量１ｍｌ／分−１で、さらに１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）１５ｍｌ中の２１〜４９％（ｖ／ｖ）のメタノールの直線勾配で展開する。カラムを１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）５ｍｌ中の４９％（ｖ／ｖ）のメタノールで洗浄した後、１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中の７％（ｖ／ｖ）のメタノールで平衡化する。流出物を連続流ラジオ検出器（Ｂｅｔａ−ＲＡＭ、Ｂｉｏｓｔｅｐ ＧｍｂＨ、Ｊａｈｎｓｄｏｒｆ、ドイツ）で監視する。２Ｃ−メチル−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸、及びＤＭＡＰＰ／ＩＰＰの保持体積は、それぞれ１８、２４、及び３９ｍｌである。
１０分間インキュベートした後、約１３％の２Ｃ−メチル−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸をそれぞれ１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸（５％）及びＤＭＡＰＰ／ＩＰＰ（８％）に変換した。
４５分後、アッセイ混合物中に１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸はなかったが、約２１％のＤＭＡＰＰ／ＩＰＰが見つかった。
ＩｓｐＨ（ＬｙｔＢ）活性のスクリーニング
アッセイ混合物は、総量１５０μｌ中、１００ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、１．２ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＮａＦ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、６０μＭのＦＡＤ、０．００４μＭ（１８μＣｉμｍｏｌ−１）の［２−１４Ｃ］１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸、０．５ｍＭのパミドロネート（Ｄｕｎｆｏｒｄら、２００１）、及びＭ１５−ｐＭＡＬｌｙｔＢ細胞の粗製細胞抽出物（実施例２で記載の通りに調製）２０μｌを含む。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。氷冷することによって反応を終了し、３０％（ｇ／ｖ）のトリクロロ酢酸１０μｌを加え、１Ｍの水酸化ナトリウム２０μｌで即座に中和する。混合物を遠心分離し、上清のアリコート（１３０μｌ）をＭｕｌｔｏｓｐｈｅｒ１２０ＲＰ１８−ＡＱ−５（４．６×２５０ｍｍ、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、ドイツ）のカラムを使用する逆相イオン対ＨＰＬＣにより分析し、Ｍｕｌｔｏｓｐｈｅｒ１２０ＲＰ１８−ＡＱ−５（４．６×２５０ｍｍ、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、ドイツ）のカラムを使用する逆相イオン対ＨＰＬＣにより分析する。このカラムを、１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中の７〜２１％（ｖ／ｖ）のメタノールの直線勾配、流量１ｍｌ／分−１で、さらに１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）１５ｍｌ中の２１〜４９％（ｖ／ｖ）のメタノールの直線勾配で展開する。カラムを１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）５ｍｌ中の４９％（ｖ／ｖ）のメタノールで洗浄した後、１０ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素リン酸（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中の７％（ｖ／ｖ）のメタノールで平衡化する。流出物を連続流ラジオ検出器（Ｂｅｔａ−ＲＡＭ、Ｂｉｏｓｔｅｐ ＧｍｂＨ、Ｊａｈｎｓｄｏｒｆ、ドイツ）で監視する。
標準アッセイ条件下で、基質１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸に対応するＨＰＬＣピークは完全に減少し、一方、大腸菌Ｍ１５−ｐＭＡＬｌｙｔＢ細胞の粗製細胞抽出物をタンパク源として使用する場合、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰに対応する２つの新たなピークが現れる。大腸菌野生型の粗製細胞抽出物をタンパク源として使用する場合、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰへの変換は認められない。この発見は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰへのＦＡＤ及びＮＡＤＨ−又はＮＡＤＰＨ依存の変換が組換えＬｙｔＢタンパク質で触媒されることを明らかに示す。アッセイ混合物にパミドロネートを加えると、大腸菌抽出物に存在する高度に活性なプレニルトランスフェラーゼによるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのさらなる代謝を妨げ、そのため、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰへの完全な変換に影響する。
転写及び発現できるｄｘｓ、ｘｙｌＢ、及びｉｓｐＣ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置１９３９９１から１９５８９２の枯草菌ＯＲＦｄｘｓ（受託番号ｄｂｊＤ８４４３２）を、ｐＢＳＤＸＳＢＡＣＳＵプラスミドＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０７５４８参照）。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＧＣＧＡＣＴＣＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＡＧＧＡＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＧ−３’、２０ｎｇのｐＢＳＤＸＳＢＡＣＳＵプラスミドのＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃１２０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．４μｇのベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ １９７８、ＮＥＢ）及び１．８μｇの精製ＰＣＲ生成物をＮｒｕＩ及びＥａｇＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１９ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｄｂｊＤ８４４３２）のＤＮＡ配列と同一である。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．０μｇのベクターｐＡＣＹＣｄｘｓ及び８μｇのベクターｐＢＳｃｙｃｌｏ（実施例ＸＸｘ参照）をＥａｇＩ及びＳａｌＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの消化し精製したｐＡＣＹＣｄｘｓベクターＤＮＡ及び３０ｎｇのＤＮＡ電気泳動で分離し精製した２．７ｋｂのＥａｇＩ／ＳａｌＩ断片（大腸菌由来のＯＲＦｘｙｌＢ及びｉｓｐＣを含む）を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。
転写及び発現できるｄｘｓ、ｘｙｌＢ、ｉｓｐＣ、及びｉｓｐＧ、並びに場合によりｉｓｐＨ遺伝子を担持するベクターの構築
塩基対（ｂｐ）位置５６１８から６５６８の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＨ（ｌｙｔＢ）（受託番号ｇｂＡＥ０００１１３）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．５μｇのベクターｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣ（実施例３４参照）をＳａｌＩで線状化し、精製ＰＣＲ生成物０．９μｇをＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
１５ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１８ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１１３）のＤＮＡ配列と同一である。
塩基対（ｂｐ）位置３７２から１２０４の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＧ（ｇｃｐＥ）（受託番号ｇｂＡＥ０００３３８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、それぞれ２．０μｇのベクターｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣ（実施例３４参照）及びｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢ（上記参照）をＳａｌＩで線状化し、精製ＰＣＲ生成物１．１μｇをＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
１８ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び２３ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｇｃｐＥ及びｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢｇｃｐＥを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｇｃｐＥ及びｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢｇｃｐＥを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｇｃｐＥ及びｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢｇｃｐＥのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００３３８）のＤＮＡ配列と同一である。
［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｇｃｐＥの取り込み実験
クロラムフェニコール５ｍｇを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地０．２リットルに、プラスミドｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｇｃｐＥを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを接種する。細胞は振盪培養物中３７℃で終夜増殖させる。１．７から２．４の最適密度（６００ｎｍ）において、乳酸リチウム１ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース２００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）を含む溶液を最終量２４ｍｌ（ｐＨ＝７．４）で２時間以内に連続的に加える。次いで、１時間後にアリコート４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。細胞を０．９％のＮａＣｌを含む水で洗浄し、上述の通り遠心分離する。細胞をメタノール−ｄ４と１０ｍＭのＮａＦを含むＤ２Ｏ（６：４；ｖ／ｖ）の混合物７００μｌに懸濁し、氷冷し、デューティーサイクル出力９０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で３×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液のＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００分光計（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で直接記録する。後処理中の劣化を避けるために、さらに精製することなく生成物の構造をＮＭＲ分光法で決定する。
１３Ｃ−ＮＭＲにより、主要な生成物として１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（表２及び４、実施例１８参照）のシグナルが示された。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸の形成は認められなかった。
グルコースを使用する組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢｇｃｐＥの取り込み実験
グルコースを使用して組換え大腸菌ＸＬ１−ｐＡＣＹＣｄｘｓｘｙｌＢｉｓｐＣｌｙｔＢｇｃｐＥで実施例３６を実施することにより、グルコースをイソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸に変換することができる。
大腸菌のｉｓｐＧ遺伝子のクローニング及びマルトース結合融合タンパク質（ＭＢＰ−ｌｓｐＧ）としての発現
塩基対（ｂｐ）位置３７２から１２０４の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＧ（ｇｃｐＥ）（受託番号ｇｂＡＥ０００３３８）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃６０秒、５０℃６０秒、及び７２℃９０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．２μｇのベクターｐＭＡＬ−Ｃ２（ＮＥＰ）及び精製ＰＣＲ生成物０．８μｇをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１５ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＭＡＬｇｃｐＥを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＭＡＬｇｃｐＥを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＭＡＬｇｃｐＥのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００３３８）のＤＮＡ配列と同一である。
大腸菌のｉｓｐＨ遺伝子のクローニング及びマルトース結合融合タンパク質（ＭＢＰ−ｌｓｐＨ）としての発現
塩基対（ｂｐ）位置５６１８から６５６８の大腸菌ＯＲＦｉｓｐＨ（ｌｙｔＢ）（受託番号ｇｂＡＥ０００１１３）を、大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより増幅する。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＴＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＣ−３’、１０ｐｍｏｌのプライマー５’−ＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＴＡＧＧＣ−３’、２０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、及び２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．８）、及び０．１％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００を含む総量１００μｌに含む。
この混合物を９４℃で３分間変性させる。次いで、９４℃４５秒、５０℃４５秒、及び７２℃６０秒のＰＣＲを３０サイクル行う。７２℃で１０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃に冷却する。アリコート２μｌをアガロースゲル電気泳動にかける。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）製のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ増幅生成物を精製する。
重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、２．２μｇのベクターｐＭＡＬ−Ｃ２（ＮＥＰ）及び精製ＰＣＲ生成物０．７μｇをＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化する。制限反応混合物を顧客（ＮＥＢ）から供給された条件に従って調製し、３７℃で３時間インキュベートする。消化したベクターＤＮＡとＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを使用して精製する。
２０ｎｇの精製ベクターＤＮＡ及び１４ｎｇの精製ＰＣＲ生成物を総量１０μｌ中の１ＵのＴ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び２μｌのＴ４リガーゼバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で連結し、プラスミドｐＭＡＬｌｙｔＢを得る。連結混合物を２５℃で２時間インキュベートする。１μｌの連結混合物を形質転換してエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にする。Ｑｉａｇｅｎ製のプラスミド単離キットでプラスミドｐＭＡＬｌｙｔＢを単離する。
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（商標）ＤＮＡシーケンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）配列決定分析ソフトウェアを使用する自動化ジデオキシヌクレオチド法により、プラスミドｐＭＡＬｌｙｔＢのＤＮＡ挿入物の配列決定をする。これは、データベースエントリー（ｇｂＡＥ０００１１３）のＤＮＡ配列と同一である。
組換えＩｓｐＧマルトース結合融合タンパク質（ＭＲＰ−ｌｓｐＧ）の調製及び精製
アンピシリン９０ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．５リットルに、プラスミドｐＭＡＬｇｃｐＥを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する。この培養物は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．７の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。培養物をさらに５時間増殖させる。５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより細胞を回収する。細胞を２０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）で洗浄し、上述の通り遠心分離し、−２０℃で冷凍して保存する。
細胞２ｇを２０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、０．２Ｍの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｇ／ｖ）のナトリウム酸（バッファーＡ）２０ｍｌ中、１ｍｇ／ｍｌ−１のリゾチーム及び１００μｇ／ｍｌ−１のＤＮアーゼＩの存在下で解凍する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、氷冷し、デューティーサイクル出力７０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で６×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液を、バッファーＡにより流量２ｍｌ／分−１で予め平衡化したアミロース樹脂ＦＦのカラム（カラム容量２５ｍｌ、ＮＥＢ）にかける。このカラムを１３０ｍｌのバッファーＡで洗浄する。ＭＲＰ−ｌｓｐＧをバッファーＡ中０〜１０ｍＭのマルトースの直線勾配で溶離する。画分を含むＭＲＰ−ｌｓｐＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥに従って合わせ、１００ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）で終夜透析する。ＭＲＰ−ｌｓｐＧの均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定する。８４ｋＤａの１つのバンドは可視であり、計算した分子の質量と一致する。純粋なＭＲＰ−ｌｓｐＧの収量は９ｍｇである。
組換えＩｓｐＨマルトース結合融合タンパク質（ＭＲＰ−ｌｓｐＨ）の調製及び精製
アンピシリン９０ｍｇを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地０．５リットルに、プラスミドｐＭＡＬｌｙｔＢを収容した大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの終夜培養物１０ｍｌを接種する。この培養物は振盪培養物中３７℃で増殖させる。０．７の最適密度（６００ｎｍ）において、２ｍＭのＩＰＴＧで培養物を誘導する。培養物をさらに５時間増殖させる。５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより細胞を回収する。細胞を２０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）で洗浄し、上述の通り遠心分離し、−２０℃で冷凍して保存する。
細胞２ｇを２０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、０．２Ｍの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｇ／ｖ）のナトリウム酸（バッファーＡ）２０ｍｌ中、１ｍｇ／ｍｌ−１のリゾチーム及び１００μｇ／ｍｌ−１のＤＮアーゼＩの存在下で解凍する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、氷冷し、デューティーサイクル出力７０％、制御値４出力に設定したＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ ＳＯＮＩＣ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で６×１０秒間超音波処理する。この懸濁液を１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。細胞を含まない抽出液を、バッファーＡにより流量２ｍｌ／分−１で予め平衡化したアミロース樹脂ＦＦのカラム（カラム容量２５ｍｌ、ＮＥＢ）にかける。このカラムを１３０ｍｌのバッファーＡで洗浄する。ＭＲＰ−ｌｓｐＨをバッファーＡ中０〜１０ｍＭのマルトースの直線勾配で溶離する。画分を含むＭＲＰ−ｌｓｐＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥに従って合わせ、１００ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）で終夜透析する。ＭＲＰ−ｌｓｐＨの均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定する。７８ｋＤａの１つのバンドは可視であり、計算した分子の質量と一致する。純粋なＭＲＰ−ｌｓｐＨの収量は１４ｍｇである。
１−ヒドロキシ−２−メチル−ブト−２−エニル−４−二リン酸の合成（図７参照）
４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アール（Ｃｈｏｉら（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４、８０５１〜８０５３）
酢酸エチル１０ｍｌ中の１．１７ｍｌの２−メチル−２−ビニル−オキシラン（１２ｍｍｏｌ）、１．６ｇのＣｕＣｌ２（１２ｍｍｏｌ）、及び５１０ｍｇのＬｉＣｌ（１２ｍｍｏｌ）を含む溶液を８０℃に３０分間加熱した。氷５０ｇを加えることにより反応を停止させた。減圧下において焼結ガラス漏斗で混合物を濾過した。１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、有機相を分離した。水層を１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。合わせた有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗製生成物をシリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２、３×３７ｃｍ）で精製すると、黄色の液体（６．４ｍｍｏｌ、５３％）０．７５５ｇが得られた。
Figure 0004068971
４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アール−ジメチル−アセタール
１８４ｍｇの４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アール（１．５５ｍｍｏｌ）、６００μｌのＨＣ（ＯＭｅ）３（５．６ｍｍｏｌ）、及び触媒量のｐ−ＴｓＯＨの溶液を室温で３時間インキュベートした。粗製混合物をシリカゲルのクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル７：３）で精製すると、無色の液体（１．０８ｍｍｏｌ、７２％）１７７ｍｇが得られた。
Figure 0004068971
（Ｅ）−３−ホルミル−２−ブテン−１−二リン酸三アンモニウム（Ｄａｖｉｓｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５１、４７６８）
２５０μｌのＭｅＣＮ中の４−クロロ−２−メチル−２−ブテン−１−アール−ジメチル−アセタールクロリド（２５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、４００μｌのＭｅＣＮ中の０．１６２ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のトリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）水素ピロリン酸の溶液を室温で徐々に加え、橙赤色の溶液にした。２時間後、反応を終了させ、溶媒を減圧下で除去した。橙色の油状物を３ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、２０ｍｌの２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８（１×４ｃｍ）カチオン交換樹脂（ＮＨ４ ＋体）のカラムを通した。カラムを２０ｍｌの２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で溶離した。得られた溶液を凍結乾燥した。得られた固形物を水２ｍｌに溶解し、水性ＨＣｌで酸化してｐＨ３にした。２分後、溶液を中和し、凍結乾燥した。
Figure 0004068971
［１−３Ｈ］１−ヒドロキシ−２−メチル−ブト−２−エニル−４−二リン酸
５０ｍＣｉ（１５μｍｏｌ）のＮａＢＨ３Ｔ、１５μｍｏｌの３−ホルミル−２−ブテン−１−二リン酸三アンモニウム及び１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）を含む溶液を室温で３０分間インキュベートした。１ＭのＨＣｌを加えることによって溶液を酸化してｐＨ２にした。２分後、１ＭのＮａＯＨを加えることにより溶液を中和した。
イオン交換クロマトグラフィーで生成物を特性付けた（実施例２０及び２５参照）。
γδＴ細胞刺激アッセイ
健常なドナー（ドナーＡ及びドナーＢ）由来のＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）による密度遠心分離でヘパリン化した末梢血から単離する。１０％のヒトＡＢ血清（Ｋｌｉｎｉｋ ｒｅｃｈｔｓ ｄｅｒ ｌｓａｒ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０μＭのメルカプトエタノールを補充した１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０５ＰＢＭＣ／ウェルを培養する。組換えヒトＩＬ−２（Ｅｕｒｏｃｅｔｕｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダから提供を受けた）及び基質の量はそれぞれ１から１０Ｕ及び１０から０．１μＭの間で変化する。２０μＭのＩＰＰ（Ｅｃｈｅｌｏｎ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、米国）をポジティブ対照とし、培地のみをネガティブ対照とする。３７℃で７日間、７％のＣＯ２の存在下でインキュベートする。回収した細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートマウス抗ヒトモノクローナル抗体Ｖδ２ＴＣＲ及びフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲートモノクローナルＣＤ３抗体で二重染色する。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）で支持したＦＡＣＳｃａｎを使用して細胞を分析する。
基質（Ｅ）−１−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）及び３−ホルミル−ブト−２−エニル１−二リン酸（Ａｌｄｅｈｙｄ）を上述の通り合成的に調製した。
合成的に調製した基質（ＨＭＢＰＰ及びＡｌｄｅｈｙｄ）はどちらも、ＩＰＰ試料の濃度の２００分の１の濃度で使用した場合、ＩＰＰと比較して少なくとも２倍の刺激を示すことがわかる（表８）。

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１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）活性の高スループットスクリーニングアッセイ
アッセイ混合物は、総量１ｍｌ中、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、０．４ｍＭのＮＡＤＨ、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．２ｍＭの２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、及び５０μｌのタンパク質を含む。この混合物を３７℃でインキュベートする。ＮＡＤＨの酸化を３４０ｎｍで測光的に監視する。別法として、ＮＡＤＨの濃度を３４０ｎｍ励起／４６０ｎｍ放射でのＮＡＤＨの相対蛍光を測定することによって決定する。
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素（ＩｓｐＨ）活性の高スループットスクリーニングアッセイ
アッセイ混合物は、総量１ｍｌ中、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０、ｐＨ８．０）、０．４ｍＭのＮＡＤＨ、２０μＭのＦＡＤ、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．２ｍＭの１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸、及び５０μｌのタンパク質を含む。この混合物を３７℃でインキュベートする。ＮＡＤＨの酸化を３４０ｎｍで測光的に監視する。別法として、ＮＡＤＨの濃度を３４０ｎｍ励起／４６０ｎｍ放射でのＮＡＤＨの相対蛍光を測定することによって決定する。
（参考文献）
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メバロン酸非依存性経路を介したイソプレノイド前駆体であるイソペンテニルピロリン酸及びジメチルアリルピロリン酸の生合成を示す図である。 メバロン酸非依存性イソプレノイド生合成などの生合成経路の、場合により同位体標識された中間体を生成するための、及びカロテノイドなどの高級テルペノイドを生成するための大腸菌のｉｎ ｖｉｖｏの系のスキームである。 実施例２５により得られたＤ２Ｏ（ｐＨ６）中での１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。＊は不純物を示す。 実施例２４による１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸の調製を示す図である。試薬及び条件は次の通りであった。：（ａ）ＤＨＰ、ＰＰＴＳ、２５℃（２．５時間）；（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨＣＯ２Ｅｔ、トルエン、還流（３９時間）；（ｃ）（１）ＤＩＢＡＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃（３時間）、（２）１Ｍ ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ；（ｄ）ｐ−ＴｓＣｌ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２、２５℃（１時間）；（ｅ）（（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）４Ｎ）３ＨＰ２Ｏ７、ＭｅＣＮ、２５℃（２時間）；（ｆ）ＨＣｌ／Ｈ２Ｏ ｐＨ１、２５℃（７分）。 ｉｓｐＨ（以前はｌｙｔＢ）遺伝子生成物により触媒される反応を示す図である。 ｉｓｐＧ（以前はｇｃｐＥ）遺伝子生成物により触媒される反応を示す図である。 ３−ホルミル−ブト−２−エニル１−二リン酸の化学的調製（実施例４２参照）を示す図である。

Claims (4)

  1. 同位体標識されていてもよい１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸塩又はそのプロトン付加体。
  2. 同位体標識されていてもよい（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸塩又はそのプロトン付加体。
  3. 同位体標識されていてもよい（Ｚ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−二リン酸塩又はそのプロトン付加体。
  4. 電子供与体の存在下でイン・ビトロ又はイン・ビボで、イソプレノイドもしくはテルペノイド生合成の遺伝子、酵素、又は阻害物質をスクリーニングするための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
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