ES2372942B1 - Nueva enzima para la biosíntesis de isoprenoides. - Google Patents

Abstract

Nueva enzima para la biosíntesis de isoprenoides.#Se ha encontrado una nueva enzima con actividad 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa que cataliza la reacción de producción de 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato a partir de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41. La enzima es útil en la síntesis de isoprenoides, particularmente en la síntesis de 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato.

Description

Nueva enzima para la biosíntesis de isoprenoides.

La presenteinvención se enmarcade manera general enel campodela biología molecularyla microbiología.En particular, la invención se refiere a enzimas involucradas en la síntesis de isoprenoides en bacterias.

Estado de la técnica

Los isoprenoidesoterpenoides,unodelosgruposmásabundantesde compuestos naturales,tienenpapelesvariados en la respiración, fotosíntesis, estructura de membranas, interacciones aleloquímicas,y regulación del crecimiento, entre otras.Todoslosorganismosde vidalibre sintetizan isoprenoidesa partirdelos precursoresde cinco átomosde carbono isopentenil difosfato (IPP),y su isómero enel doble enlace dimetilalil difosfato (DMAPP). Durante décadas secreyóqueelIPPse sintetizabaexclusivamenteapartirdeacetil coenzimaAmediantelarutadelmevalonato(MVA), yqueluegose convertíaen DMAPP mediante una IPP/DMAPP isomerasa (IDI).Sin embargo,a principiosdelosaños noventa del siglo pasado se descubrió que tanto el IPP como el DMAPP podían ser sintetizados simultáneamente a partir de piruvatoygliceraldehído3-fosfato mediante una ruta alternativa conocida actualmente como ruta del2-Cmetil-D-eritritol 4-fosfato (MEP), o también como la ruta no-mevalonato.

En estos momentos está bien establecido que la mayoría de organismos emplean tan sólo uno de las dos rutas de síntesisde isoprenoides.De este modo, arqueas (Archaebacteria), hongosyanimales sintetizan IPPa partirdeMVA, mientras que la mayoría de las bacterias (Eubacteria) sólo empleanla ruta MEP para la producción de precursores isoprenoides. Las plantas emplean ambas rutas, pero en diferentes compartimentos celulares: la ruta MVAsintetiza precursores isoprenoides citosólicos, mientras que la ruta MEP está localizada en los plástos.

Dado que la ruta MEP está ausente en los animales (incluidos los humanos) pero es esencial en un gran número de importantes patógenos bacterianos, se ha propuesto como una nueva diana prometedora para el desarrollo de nuevos agentes anti-infecciosos. Sin embargo, la información acerca de los posibles mecanismos de resistencia a un bloqueo de la ruta MEP es muy escasa. La resistencia a antibióticos puede ser originada por una exportación activa o un bloqueo en la entrada del fármaco, por su inactivación dentro de la célula, por modificación genética de su diana protéica,

o por el uso de una ruta alternativa no afectada por el inhibidor, por mencionar tan solo algunas posibilidades. El inhibidor mejor caracterizado de la ruta MEP es la fosmidomicina (FSM), identificada inicialmente como un antibiótico natural eficaz contra un amplio espectrode bacterias.La FSM es un inhibidor específicodela1-desoxi-D-xilulosa5fosfato (DXP) reductoisomerasa (DXR), la enzima que cataliza la producción de MEP a partir de DXP de un modo dependiente deNADPH, en lo que constituye el primer paso específico de la ruta. La entrada de FSM en las células bacterianasesun procesode transporteactivollevadoacaboporel transportadorde glicerol3-fosfato(GlpT)deun modo dependiente de cAMP. Un gen glpT deficiente en mutantes de Escherichia coli. o la ausencia de un homólogo de GlpT en otras bacterias como Mycobacterium tuberculosis conducea una resistenciaa FSM.La sobreexpresióndel gen fsr de E. coli.que codifica una proteína similar a las proteínas bacterianas de exportación de fármacos, también conduceala resistenciaa FSM, probablemente porque esta proteínafacilitalaexportación del inhibidor. Más aún,se ha visto que varias mutaciones independientes son capaces de rescatar la supervivencia de cepas de E. coli deficientes en los dos primeros enzimas de la ruta MEP, DXP sintasa (DXS)yDXR, lo que sugiere que la bacteria puede responder a un bloqueo de estas actividades mediante el uso de otras enzimas que producen DXP o MEP cuando sufren mutaciones.

Además del estudio de las enzimas de la ruta MEP como dianas para el desarrollo de agentes anti-infecciosos, es igualmente de interés estudiar estas enzimas para mejorar los procedimientos a nivel industrial para la síntesis de isoprenoides.Losisoprenoides,graciasasuampliadiversidad estructural,poseenmuchas aplicacionesenla industria, como por ejemplo, como fármacos, diluyentes, aromatizantes, biocombustibles, o insecticidas naturales. Algunos isoprenoides utilizadosenla industria sonlos aceites esenciales,los carotenoides,los tocoferoles,el taxol,yla artemisina. Unaalternativamuy prometedoraparasu producción industrialesla ingeniería metabólicade bacteriasyplantaspara ser utilizadas como biofactorías de isoprenoides de interés.

Hay un conocimiento muy limitado de las enzimas involucradas en la síntesis de isoprenoides en las diferentes es-pecies(bacterias,plantas,etc).Porlotanto,esdeseableampliaresteconocimientoyproporcionarnuevas herramientas paraavanzar enla síntesisyla aplicación industrialde estos compuestos.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente una nueva clase de enzimas oxidoreductasas que cataliza la conversión de DXP a MEP para la síntesis de isoprenoides a través de la ruta MEP en células procariotas.

Los inventores han detectado que los genomas completamente secuenciados de un número de bacterias, incluida la patógena Brucella abortus 2308. contienen los genes de la vía MEP con la única excepción de la que codifica para DXR. La presente invención se refiere pues a la clonación del gen que codifica la enzima que es utilizada en estos organismos para producir MEP, la demostración de su actividad bioquímica tanto in vivo como in vitro.y la determinación de su distribución filogenética.

En esta descripción se utilizará DRL para denominar a la nueva clase de enzima identificada. DRL proviene de DXR-Like.

La secuencia de aminoácidos de la proteína DRL de B. abortus 2308 clonada coincide con la secuencia descrita en el NCBI con referencia Swiss-Prot Q2YIM3, que corresponde a la secuencia de aminoácidos predicha a partir de la secuencia de nucleótidos BAB2 0264con GeneID 3827542. En la referencia Q2YIM3 se describe esta secuencia como “oxidoreductasa putativa”. Es decir, la definición de la posible función de la secuencia de aminoácidos se realizó automáticamenteapartirde una predicciónde función comparando secuenciasde basesde datos.Dela misma manera, en la referencia BAB2 0264se describen como funciones putativas “homoserina deshidrogenasa predicha”y“proteína de uniónaNAD(P)(+) con undominio Rossmann-fold”.

Lo anterior implica que la secuencia de nucleótidosyaminoácidos como tal está descrita, pero la actividad propuesta para la proteína es el resultado de una predicción; es decir, no seha clonado físicamentey se desconoce su auténtica función biológica.

Contrariamente,losinventoreshan clonadola secuenciade nucleótidosyhan encontradoquela proteína codificada (DRL) es una proteína funcional. Los inventores han encontrado que DRL es una enzima con actividad1-desoxiDxiluloxa5-fosfato reductoisomerasa que catalizala reacciónde producciónde MEPa partirde DXPde forma similar a la descrita para el enzima DXR.

La fosmidomicina, un inhibidor competitivo específico de DXR, inhibió el crecimientode células de B. abortus queexpresabanel transportadorGlpTde E. coli (requeridoparala entradade fosmidomicina), confirmandoqueexiste en estas bacterias una actividad similaraDXR in vivo (DRL).Se encontróquela proteínaDRLde B. abortus pertenece a unafamiliade proteínasno caracterizadasy similaresen secuenciaala homoserinadeshidrogenasa. Experimentos posteriores confirmaron queDRLyDXR catalizanla misma reacción bioquímica in vitro.

La enzima activa DRL de B. abortus se caracteriza por ser un homodímero con un peso molecular determinado por cromatografía de exclusión molecular de 80 kDa (aproximadamente el doble que el tamaño deducido de la secuencia proteica). DRL presenta una actividad máxima en unpH entre 7.5y8,y una temperatura óptima entre40y45ºC.La curva de parámetros enzimáticos de Lineweaver-Burk indica una Vmax = 0.083 µmolNADPH min−1 mg−1, una kcat =

0.065 s−1,y una Km(DXP) = 109 µMpara la enzima recombinante DRL.

Se realizóun análisis filogenéticoyfuncional entre diferentes especiesde bacteriasyse detectóqueotras bacterias además de B. abortus poseen proteínas homologas a DRL, que también complementan funcionalmente a la cepa EcAB4-10 de E. coli deficiente en DXR. Estas enzimas se agrupan dentro del mismo clado filogenético según se describe a continuación.

Como se describe detalladamente más adelante en el apartado de realizaciones particulares, las búsquedas con BLASTde posibles secuencias homologasaDRLsellevarona caboenla basede datos UniProt. Sólose consideraron significativos aquellos resultados que correspondíanavaloresdeE<10-3.

Los análisis filogenéticos se llevaron a cabo a partir de alineamientos de secuencias de proteínas obtenidos con CLUSTALW con los métodos de MáximaVerosimilitud (Maximum Likelihood, ML), Neighbor-Joining (NJ)yMáximaParsimonia (MaximumParsimony, MP). Los análisis porML fueron llevadosa cabo en PHYML v2.4.5, usando el modeloJTTdeevolucióndeproteínas.Los análisisporNJy MPseimplementaron en MEGA 4.0. usandolos parámetros por defecto.

Posteriormente se comprobó que diez de las secuencias identificadas procedentes de diferentes cepas bacterianas encontradas a partir de los análisis tenían actividad DRL (según se deduce de su capacidad para complementar la cepa mutante de E. coli EcAB4-10).

Además, por otra parte, se realizó un alineamiento de estas diez secuencias aminoacídicas para generar un perfil de HMM usando el programa HMMER (http://HMMER.janelia.org/). El perfil de HMM fue usado para modelar las DRLyen búsquedasde posibles homólogosdeDRLengrandes basesde datosde proteínas comoPfamo UNIPROT. El protocolo completo aparece detallado más adelante.El análisisa partir del perfil HMM esla forma más sensibley específica para identificar con seguridad a los homólogos funcionales de DRL.

Así,lainvención proporciona una enzimacon actividad1-desoxiD-xilulosa5-fosfato reductoisomerasaque cataliza la reacción de producción de MEP a partir de DXP, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

41.

Parasabersiuna secuencia aminoacídicanueva (“secuencia incógnita”) correspondeaunaDRL funcionalobiensi se quierenbuscar en basesde datos nuevas enzimas DRL no identificadas hastaahora, primero se realiza un BLASTp a partir de una secuencia query seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41-50ylos parámetros para el BLAST indicadosa continuación en una basede datosde proteínas.Si se obtiene unvalordeE<10-3, la secuencia incógnita sería homologaalasDRLdeSEQIDNO: 41-50.

En particular, (a) se lanza un BLASTp contra una base de datos de proteínas con los parámetros por defecto: umbral esperado = 10 (en inglés “expect threshold”), tamaño de palabra = 3 (“word size”), matriz = BLOSUM62 (“matrix”) coste de hueco = existencia:11 extensión:1 (“gap cost = existence:11 extension:1”), y utilizando como secuencia pregunta (“query”) una de las secuencias SEQ ID NO: 41-50;y se seleccionan las secuencias obtenidas que tienen unvalor esperadoE<10-3;y (b) se hace un análisis filogenético de las secuencias obtenidas en el paso

(a) mediante alineamiento de las secuencias con CLUSTALW con los métodos de MáximaVerosimilitud, Neighbor-Joining y/o MáximaParsimonia;y se seleccionan las secuencias que pertenecen al mismo clado filogenético al que pertenecen las secuenciasSEQID NO: 41-50.

Como alternativa, puede comprobarse si la secuencia incógnita se ajusta al perfil de HMM con el programa “hmmsearch” del paquetede aplicaciones HMMER,v. 2.3.3.Si se obtiene unvalorE<10-3, se ajusta al perfil.

El siguiente paso es comprobar si esta secuencia agrupa dentro del clado filogenético DRL, que es el que agrupa alas DRL funcionales(es decir, aquellas capacesde sintetizar MEPa partirde DXP).Para ello se hace un análisis filogenético de las secuencias obtenidas a partir del BLAST o del perfil de HMM, mediante alineamiento de las secuencias con CLUSTALW con los métodos de MáximaVerosimilitud, Neighbor-Joining y/o MáximaParsimonia; yse seleccionan las secuencias que pertenecen al mismo clado filogenético al que pertenecen las secuencias SEQ ID NO: 41-50.

En una realización particular, adicionalmente, se confirma la función in vivo de la secuencia incógnita identificadaexpresándolaenunacepa defectivaenDXR(comoporejemplolacepade E. coli EcAB4-10). Si es capaz de complementar la pérdida de función de DXR en la cepa mutante, la enzima con secuencia incógnita es unaDRL. Alternativamente, se puede confirmar la función de la secuencia incógnita identificada in vitro utilizando la correspondiente proteína purificada para ensayosde actividad enzimáticaen presenciade DXP, MgCl2, DTTyNADPH.Se seleccionan aquellas secuencias que son capaces de oxidar elNADPHyproducir MEP en estas condiciones. Estos procedimientos se describen en detalle más adelante en el apartado de realizaciones particulares.

En una realizacióndelainvención,lasenzimas, cuyas secuencias están descritas actualmenteenlas basesde datos de proteína, que cumplen con las características antes indicadasyque por lo tanto son DRL funcionales, son lasque tienen una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41-50.

En otra realización particular, la enzima tiene la secuencia SEQ ID NO: 41.

En otra realización particular, la enzima DRL es de B. abortus.ymás particularmente de la cepa B. abortus 2308. En otra realización particular, la enzima activa es un homodímero que tiene un peso molecular de 80 kDa y una actividad óptimaa unpHdeentre 7.5-8y a una temperaturade entre 40-45ºC.

Otro aspectodelainvención se refierea unvectordeexpresión que comprendela secuenciadeDNAque codifica para las enzimas DRL antesexplicadasyque permitelaexpresióndela enzima DRL funcionalmente activa.Particularmente, la secuencia de DNAque codifica la enzima DRL es la secuencia del gen BAB2 0264(SEQ ID NO: 51). El vector de expresión es normalmente un plásmido o un cassette que se inserta en una célula hospedadora para la expresióndela enzima.Para permitirlaexpresióndela enzimaDRL,la secuenciadeDNAquela condificase une operativamente a una secuencia promotora que es capaz de dirigir la expresión en la célula hospedadora deseada. El término “unido operativamente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una secuencia es afectada por la otra. Un promotor está unido operativamentea una secuencia codificante cuando es capazde efectuarlaexpresiónde esa secuencia codificante. Además,el vector puede comprender otros elementos genéticospara conseguir con éxito, la transformación, selecciónypropagación de las células hospedadoras que contienen la secuencia de interés. En una realización preferida el vector es el plásmido pET23byla célula hospedadora es E. coli BL21 (DE3)pLys.

La enzima DRL se obtiene por un método que comprende (a) transformar establemente célulashospedadoras con la construccióndeexpresiónque comprendela secuenciaque codificaparala enzimaDRL;y(b)cultivarlas células en condicionesque permitanlaexpresióndela enzima.Apartirde aquí, puede utilizarseel cultivo parala producción de isoprenoides.

Opcionalmente,a partir del cultivo celular puede aislarseypurificarla enzima para ser utilizada posteriormente para procedimientos industriales de síntesis de isoprenoides basados en la disponibilidad de una fuente abundante de enzima purificada. Al contrario que DXR, cuya acumulación está altamente regulada, la no existencia de homólogos de DRL en muchas eubacteriasyen plantas permite su sobreproducción industrialaniveles elevados.

Otro aspectodelainvención se refiereal usodela enzima DRL parala síntesisde isoprenoidesyparticularmente para la síntesis de MEP.

Así, otro aspecto se relaciona con un método de obtención de MEP que comprende: (a) expresar la enzima activa enun sistema celular;y(b) cultivarel sistema celulardelpaso(a)bajo condicionesy enunmedioque permitenla produccióny acumulación de MEP; por ejemplo, en cepas deficientes en actividad MEP citidililtransferasa que son incapaces de metabolizar elMEP.

También puede obtenerse MEP (a) proporcionando un sistema celular que permita la expresión de la enzima;(b) cultivandoel sistema celulardelpaso(a)bajo condicionesque permitenla produccióndela enzima;y(c) cultivandoel sistema celularbajo condicionesyenun medioque permitenla producciónyacumulacióndeMEPo bien purificando el enzimayutilizarlo en un sistema in vitro bajocondicionesyenunmedioque permitenla obtencióndeMEP,donde elmediocomprendeun sustrato seleccionadodelgrupoque consisteenDXPyunamezcladepiruvatoygliceraldehído 3-fosfato.Si se utilizala mezclade piruvatoygliceraldehído3-fosfato,el sistema in vitro comprende además enzima DXS purificada que permita elprimer paso a DXP.

Otro aspecto de la presente invención es utilizar la nueva enzima DRL como target para identificar/diseñar inhibidoresque puedan ser útiles como antibióticos contradiversosmicroorganismos.Así,lainvenciónse relaciona también con un método de cribado para identificar potenciales agentes inhibidores de la enzima DRL, que comprende poner en contactoDRLconel potencialagenteyanalizarsihay inhibición.Por ejemplo,un métodoparaevaluarsiunagente tiene la capacidad de inhibir la enzima, comprende los pasos de (a) obtener la enzima purificada o no; (b) tratar la enzima DRL con el agente potencial inhibidor; (c) comparar la actividad de la DRL tratada con la actividad de una DRL no tratada, seleccionando los compuestos que tienenactividadinhibitoria. DRL llevaa cabola conversiónde DXP en MEP con consumo concomitantedeNADPH.La caídadela concentracióndeNADPH reflejaelnivelde actividadde DRL,ypuede ser seguida fácilmente mediante métodos ópticos, midiendola absorbanciaa 340 nm.Este método podría ser fácilmente escalable para realizar un cribado de alto rendimiento (“high-throughput screening”, HTS).

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otrascaracterísticas técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones preferidasse proporcionanamododeilustración,y nose pretendeque sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particularesypreferidas aquíindicadas.

Descripción de los dibujos

LaFig.1muestraunesquemadelarutaMEPen bacterias.DXP,1-desoxi-D-xilulosa5-fosfato;MEP,2-C-metilD-eritritol 4-fosfato; CDP-ME, citidina difosfometileritritol; IPP, isopentenil difosfato; DMAPP, dimetilalil difosfato; Pir, piruvato; G3P, gliceraldehído3-fosfato;B6/B12, vitaminasB6/B12;Is, isoprenoides. Las enzimas están indicadas en negrita: DXS, DXP sintasa (EC 2.2.1.7); DXR, DXP reductoisomerasa (EC 1.1.1.267); MCT, MEP citidililtransferasa (EC 2.7.7.60). El paso inhibido por fosmidomicina (FSM) está señalado. Las flechas interrumpidas cerradas representan varios pasos. Las cepas de E. coli deficientes en las actividades DXS (EcAB4-2), DXR (EcAB4-10) o MCT (EcAB4-7) usadas aquí fueron construidas para utilizar MVA aportado exógenamente para la síntesis de IPP (representado con una flecha interrumpida abierta). La flecha puntuada cerrada marca la reacción catalizada por la enzima “DXR-like” (DRL).

La Fig. 2 muestra la complementación de cepas de E. coli deficientes en actividad DXR (EcAB4-10), DXS (EcAB4-2) o MCT(EcAB4-7) con un plásmido que expresa el gen BAB2 0264(pET-DRL). Los experimentos control fueron hechos con plásmidos que expresan los genes de E. coli que codifican DXR, DXSo MCT,ytambién los vectoresvacíos(Ø).La capacidaddelgen clonadopara rescatarel crecimientodelas correspondientes cepas mutantes (es decir, su capacidad de complementación) fue establecida mediantela siembra por estría de colonias individuales en placasde cultivo suplementadas(+)ono(-) con1mMMVA como aparece indicado.

LaFig.3(A) muestralos cromatogramasdeseguimientode reacciones múltiples (“Multiple-reaction monitoring”, MRM)de una mezclade reacción que contiene MgCl2, DTT,NADPH,yDXP antes(0h)y2hdespuésde añadir DRL recombinante.Elpanel inferior muestrael resultado despuésdela incubación durante2hen ausenciade enzima,

oconDXR purificadaenlugardeDRL.Elpico1correspondeaDXP(m/z213/97,tiempode retenciónca.9.15min). El pico2 corresponde a MEP (m/z 215/97, tiempode retención ca. 9.90 min), como se demuestra comparandosu espectro de masas con el del patrón de MEP (B). “a MEP” significa “MEP auténtico”. (C) Cambios en los niveles de NADPH monitorizados por absorbancia a 340 nm en mezclas de reacción como las descritas en (B) después de añadir DRL recombinante (círculos). El inhibidor deDXR FSM se incorporó en las mezclas a la concentración indicada (µM).Se muestra también un control sin DXP (cuadrados blancos).“RNADPHL” es “nivelesdeNADPH relativos”. “P2” es “pico2”y“In” es “Intensidad”.

La Fig.4muestrael análisis filogenéticode los supuestos homólogosde DRL.Se construyó un árbol filogenético tras el análisis de Máxima Verosimilitud de las relaciones evolutivas entre los supuestos homólogos de DRL que se obtuvieron de las búsquedas BLAST con DRL de B. abortus como interrogante (Tabla 3). Los resultados están representados como un árbol circular sin raíz, dibujado a escala, con la longitud de las ramas proporcional al tiempo deevolución.Las secuenciasque complementanlacepade E. coli EcAB4-10 aparecen indicadas con un círculo negro, mientras que aquéllas que no complementan al mutante están indicadas con un círculo blanco. La letra dentro de los círculos indica si la secuencia pertenece a un organismo que carece (A) o no (B) de DXR. El clado DRL que agrupa a todas las DRLs activas aparece resaltado.

LaFig.5muestrala determinacióndelvalordela concentración mínima inhibitoria (“Minimum Inhibitory Concentration”, MIC) de FSM en B. abortus 2308. Diluciones consecutivas de FSM en medio BB fueron inoculadas con 105 bacterias/ml,e incubadas durante24h a 37ºC.Se incluyó un tubo control sin FSM.Enla fila superior se muestra el resultado obtenido con la cepa silvestre B. abortus 2308: en la fila inferior, la misma cepa transformada con el plásmido pFJS251 que porta elgen glpT de E. coli.

La Fig. 6 muestra el mapa de las regiones genómicas de B. abortus clonadas en los plásmidos señalados que rescataron el crecimiento de las células de E. coli deficientes en DXR. Las regiones codificantes están representadas por flechas. La flecha correspondiente al gen BAB2 0264(que codifica DRL) está coloreada en gris.

LaFig.7muestra(A)elanálisispor SDS-PAGEdelasobreexpresiónypurificacióndela proteínaDRLde B. abortus fusionada a una cola de polihistidinas. Las calles corresponden a extractos celulares de E. coli BL21(DE3)pLys llevando la construcción pET-DRL antes (-)ydespués (+) de la inducción con IPTG;P, fracción precipitada (insoluble); S, fracción sobrenadante (soluble); E, fracción eluída con 150 mM de imidazoldespués de una cromatografía de afinidad en columnas de níquel. La posición de los marcadores de peso molecular se indica a la izquierda. (B) Determinación del peso molecular de DRL de B. abortus mediante cromatografíadeexclusiónpor tamaños.DRL fusionada a una cola de histidinasyproducida en E. coli. fue purificada, cargada en una columna de Superdex 200 HL 16/60, yeluída con 100 mMTris-HCl pH=7.5, 300 mM NaCl,1mM DTT,y2mM MgCl2 a1ml/min. El cromatograma muestraelpicodeDRLqueeluyea76.5min.(C) Gráficode calibración usandolos siguientes estándares: ribonucleasaA(13.7kDa), anhidrasa carbónica(29kDa),ovoalbúmina(44kDa), conalbúmina(75kDa), aldolasa(158kDa),y ferritina (440kDa). El peso molecular del pico de DRL se estimó ca. 80 kDa mediante análisis de regresión linear de los tiempos de retención frente al peso molecular. “Ret t” es “tiempo de retención”.

LaFig.8 muestrael cálculodepHytemperatura óptimosdeDRLde B. abortus. La actividad fue monitorizada en mezclas de reacción (100 µl)que contienen100mMTris,1.5mMMgCl2,1 mMDTT,0.15mMDXP,0.2mM NADPHy40µgde enzima recombinante purificada, bien a 37ºC en un rango de pH (A) o a diferentes temperaturas a un pH fijo de 7.5 (B). La actividad enzimática se dedujo de la disminución en la absorbancia a 340 nm conforme el NADPHfue oxidado,yrepresentadade modo relativoalvalormás alto.Se muestranla mediayel error estándarde tres (n=3) ensayos. (C) Cálculo de las constantes de Michaelis-Menten. Los ensayos de actividad se llevaron a cabo a 40ºC en 100 µlde una mezclade reacciónque contiene100mMTrispH7.5,1.5mMMgCl2,1mMDTT,0.2mM NADPH (preparado fresco)yvariando las concentracionesde DXP(25-500 µM) en presencia de 60 µgde DRL de

B. abortus recombinante purificada.Lavelocidad fue calculada comodisminución en unidadesde absorbanciaa 340 nm por minuto en un rango linear. La curva recíproca doble (Lineweaver-Burk) se hizo con los valores medios de experimentos triplicados (n=3).

LaFig.9muestrala complementaciónde células E. coli deficientesenDXRconlas secuenciasdeDRLyDXRde bacteriasde claseB. Las secuencias indicadasde DRLyDXRde Roseobacter litoralis Och 149, Bacillus halodurans C-125.y Listeria monocytogenes F2365 fueron amplificadasporPCRa partirdeDNAgenómico conlos conjuntosde primeros descritosenlaTabla1yclonadosen pJET1.2.Las correspondientes construccionesyelvectorvacío control (∅)se utilizaron para transformar células EcAB4-10. La habilidad del gen clonado para rescatar el crecimiento de las cepas deficientes en DXR se averiguó siguiendo el crecimiento en placas suplementadas (+) o no (-) con 1mM MVA como se indica.

Exposición detallada de realizaciones particulares

Cepas bacterianas, mediosy reactivos

La cepa B. abortus 2308 (NCBI taxonomy ID 359391) fue crecida en caldo Brucella (Brucella broth, BB) o placas de agar Brucella (Brucella agar,BA) (Pronadisa). Las cepas de E. coli fueron crecidas en caldo o placas de medio Luria-Bertani (LB). Cuando era requerido, los medios fueron suplementados con los siguientes antibióticos: 25 µg/ml kanamicina, 100 µg/ml ampicilina,20 µg/ml cloranfenicol. Cuando se indicó, el medio de cultivo fue también suplementado con diferentes concentraciones de FSM (Molecular Probes) o 1 mM MVA preparado a partir de un concentrado de mevalonato como está descrito (cf. M. Rodríguez-Concepción et al., “Genetic evidence of branching in the isoprenoid pathway for the production of isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate in Escherichia coli” FEBS Lett 2000. vol. 473, pp. 328-332). A menos que se indique de otra manera, los producto químicos y reactivos fueronobtenidosdeSigma-Aldrich.Las enzimasde restricciónyde modificacióndeDNAfueron compradas de Promega.Los oligonucleótidos fueron sintetizadospor Sigma-Aldrich,yaparecenmostradosenlaTabla1.

TABLA1

Oligonucleótidos utilizados

Clonado delgen glpT

El gen glpT fue aisladoa partirde E. coli DH5α mediante oligonucleótidos específicos del gen,ypolimerasaVent. Un fragmentodeDNAdeltamaño esperadofue obtenidoyclonadoenpJET.2 (Fermentas)ysu secuencia nucleotídica determinada para descartar posibles mutaciones introducidas porla reacciónde PCR.Para suexpresión en célulasde

B. abortus. la secuencia de glpT fue subclonada en pBBR1 MCS.

Construcciónycribadode una libreríade B. abortus 2308

El DNAgenómico fue extraído de células B. abortus 2308 conforme estaba descrito previamente (cf. FJ Sangari et al., “Identification of Brucella abortus B19vaccine strainbythe detectionofDNApolymorphismattheery locus” Vaccine1994.vol.12,pp.435-438).Trasla digestión parcial con Sau3A. se purificaron a partir del gelfragmentos de entre3y6kb,queseligaronapUC19previamente digeridocon BamHIydefosforilado (Fermentas). Conla mezcla de ligación se transformó a E. coli DH5α,y se plaqueó en medio LB con ampicilina a una densidad de 500 ufc por placapara amplificarla librería.Seextrajo plásmidoapartirdelas células raspadasdelasplacasymezcladas.Para el cribado,1 µgde esteDNAseelectroporó enla cepa deficiente en DXR EcAB4-10,y se seleccionaron los transformantes en placas de LB suplementadas con cloranfenicol (para seleccionar la interrupción del gen dxr), kanamicina (para seleccionarla presenciadeloperónMVA)yampicilina(para seleccionarla incorporacióndelosplásmidosde la librería). Los plásmidos aislados de transformantes que eran capaces de formar colonias fueron secuenciados para comprobar la identidad de los insertos.

Clonadode las secuenciasDRLyensayosde complementación

ElDNAgenómicode bacterias que contenían posibles secuenciasDRL fue amplificado con los paresde oligonucleótidos descritos en laTabla 1. Fragmentos de DNAdel tamaño esperado se purificarony se analizaron mediante digestióncon enzimasde restricciónparaconfirmarsu identidad.Losfragmentospositivos fueron clonadosenpJET1.2 (Fermentas). El DNAplasmídico de dos clones independientesde cada construcción se usó para transformar células

E. coli EcAB4-10. Se consideró que los fragmentos clonados codificaban enzimas DRL funcionales cuando permitieron el crecimiento de las células EcAB4-10 en ausencia de MVA. Cuando se indicó, las cepas de E. coli EcAB4-2y EcAB4-7 fueron también usadas en ensayos de complementación como se describió previamente (cf. S. Sauret-Güeto et al., “Amutantpyruvate dehydrogenaseE1 subunit allows survivalof Escherichia coli strains defectivein1-deoxyD-xylulose 5-phosphate synthase” FEBS Lett 2006, vol. 580, pp. 736-740).

Producción de proteína DRL recombinante de B. abortus

Los oligonucleótidos conSEQIDNO:3-4(Tabla1)fueron usadospara amplificar BAB2 0264 sin el codón de parada a partir de DNAgenómico de B. abortus 2308. El fragmento amplificado se clonó en el vector de expresión pET23b (Novagen) después de digerirlo con NdeIyXhoI. Después de la transformación de células de E. coli BL21 (DE3)pLys conla construcción resultante (pET-DRL),la producciónde una proteína DRL quimérica con unacolade seis residuosde histidinaenelextremoC-terminalfue inducida mediantela adiciónde0.4mM IPTGa cultivoscon unaDO600=0.5.Despuésde14hde crecimientoa28ºC,las células bacterianas fueron recogidaspor centrifugación,y las células sedimentadas fueron resuspendidasenTampónA(40mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,1mMDTT) suplementado con1mg/mlde lisozima, 0.5mM EDTAy una pastillade cóctel completode inhibidoresde proteasas (Roche) por cada10mlde tampón. Las células resuspendidas se incubaron a 4ºC durante10 miny tras unabreve sonicación(4 pulsosde30 seca30W)ellisado celularfue centrifugadoa 19.000xg durante20 min.El sobrenadante se incubó durante10mina4ºCcon1/7volúmenesdesulfatode protaminaal1%(p/v)enaguay centrifugadoa

37.000xg durante45 min.Siempre en una cámara fría,el sobrenadante limpio fue incubado durante2h con2 ml deagarosaNi-NTA (Qiagen)yla mezcla se cargó en una columnade cromatografía vacía “poly-prep” (Bio-Rad). Después de añadir10 ml de tampónAy5 ml de tampón de lavado (tampónA con 25 mM imidazol), la proteína DRL recombinante se eluyó con alícuotasde 0.75mlde tampónde elución (tampónAsuplementado con 150mM imidazol). Las fraccionesque contenían DRL se juntaronyguardarona -20ºC en glicerolal 50%.

Caracterización bioquímica de la enzima DRL de B. abortus

La proteína recombinante DRL purificada se utilizó para realizar ensayos de actividad DXR en mezclasde reacción con 15 µgde proteína purificadaenTris-HCl100mMpH7.5,MgCl21,5mM,DTT1mM,DXP0.78mM (Echelon)y NADPH1mM.Seprepararon reacciones control con15µgde proteína DXR deE. coli recombinanteo con agua.Tras incubarlas reaccionesa37ºC durante2h,se diluyeronconaguaen proporción2:1yla mezcla resultanteseanalizó por cromatografía líquida de altísimo rendimiento (“ultra-performance liquid chromatography”, UPLC) acoplada a espectrometría de masas (“mass spectrometry”, MS). La separación por UPLC se llevó a cabo en una columna Nucleodex β-OH200x4 mm (MachereyNagel)aunflujode0.75ml/minconundivisordeflujopost-columnade1:3. Se utilizóunequipoAcquityUPLCSystem(Waters)provistodeunabomba binariacon acetonitrilo comosolvente Ay acetato amónico10mMpH 6.5 como solventeB en un gradiente A:Bde 9:1a 4:6de0 a15 miny unflujo isocrático de 9:1 hasta el minuto 20. Los análisis de MSyMS/MS se realizaron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupoloAPI3000 (AppliedBiosystems) usandola fuentede turbonebulizaciónenmododeiónnegativocon los siguientesvalores: -3500Vdevoltaje capilar,8unidades arbitrariasdegasnebulizador(N2),8unidades arbitrarias degas cortina (N2),4unidades arbitrarias degas de colisión (N2), -30Vde potencial de desolvatación, potencial de enfoquede -200V, potencialdeentradade -10V,y energíade colisiónde -30.Se realizó una adquisiciónde datos en modo de barrido completo desde m/z 50a m/z 800 usandountiempodeciclode2segundos,un tamañodepasode m/z 0,1yunapausaentrebarridosde5milisegundos.Las moléculasDXPyMEPse identificaronenmodode reacciónde monitorización múltiple (“múltiple reaction monitoring”, MRM) usando las transiciones 213/97 para DXPy215/97 paraMEPenQ1yQ3, respectivamente, con una resoluciónde unidadyuna pausa entre barridosde5milisegundosen ambos casos.Para obtener los espectrosde masade cada pico, se llevóa cabo un barridode iones hijos seleccionando la masa parentalenQ1yaplicando distintas energíasde colisiónparacada compuestoenQ3(rampa linealde-20a -30 para DXPyde -20a -35 para MEP).

Parael ensayode inhibiciónconFSMylas estimacionesdelos parámetros cinéticos,laactividadDXRse cuantificó apartirdel cambiode absorbanciaa340nmdelamuestrade reaccióncomo consecuenciadelaoxidacióndelNADPH.

Análisisdela secuenciayanálisis filogenético

Losgenes codificantesde enzimasde biosíntesisdeisoprenoidesse obtuvieron medianteBLASTgenómicoapartir delabasededatosdelNCBI.LasbúsquedasconBLASTdeposibles secuenciashomologasaDRLsellevaronacabo enla basededatos UniProt. Sólo se consideraron significativos aquellos resultados que correspondían avaloresde E<10-3.Los análisis filogenéticossellevaronacaboapartirde alineamientosde secuenciasde proteínas obtenidoscon CLUSTALW(cf. JD Thompson et al., “The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for múltiple sequence alignment aidedbyquality analysis tools”, Nucleic Acids Res 1997,vol.25,pp. 4876-4882) conlos métodosde MáximaVerosimilitud (Maximum Likelihood, ML), Neighbor-Joining (NJ)yMáximaParsimonia (MaximumParsimony, MP). Los análisis por ML fueron llevados a cabo en PHYML v2.4.5, usando el modelo JTT de evolución de proteínas (cf. D.T. Jones DT et al., “The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences” Comput Appl Biosci 1992,vol8,pp. 275-282;andS . et al., “Asimple,fast, and accurate algorithm to estimate largephylogeniesby máximum likelihood” Syst Biol 2003.vol.52,pp.696-704).Los análisisporNJyMPse implementaronenMEGA

4.0. usando los parámetros por defecto (cf. K.Tamura et al., “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software versión 4.0.” Mol Biol Evol 2007. vol. 24, pp. 1596-1599). Para dotar de confianza estadística a la topología obtenida, se hizo un análisis de remuestreo (bootstrap analysis) con 1000replicas en cada caso.

Células de B. abortus que expresan GlpT se vuelven sensibles a FSM

El genoma de B. abortus está completamente secuenciado,y carece de un gen codificante de DXR, pero síque contieneun homólogodeDXS(la enzimaque sintetizaDXP,el substratoparaDXR)así comogenes codificantesde la MEP citidililtransferasa (MCT)ydel resto de enzimas de la ruta MEP requeridas para transformar MEP en IPPy DMAPP (Fig. 1). Esto sugiere que una proteína de B. abortus que no presenta homología en conjunto a DXR podría ser la responsable de la transformación de DXP en MEP. Sin embargo, el crecimiento de células de B. abortus no fue inhibido por concentracionesde FSMde hasta1mg/ml. Este resultado sugiere quela enzima similara DXR(“DXRlike”, DRL) podría no ser inhibida por FSM o, de modo alternativo, que el inhibidor era degradado, expulsado, o no incorporado por las células vivas. Consistente con esta última posibilidad, el genoma de B. abortus no contiene ningún homólogoal transportadorGlpT,quehasido implicadoenla incorporacióndeFSMal interior celular.Parainvestigar si una incorporación deficientede FSM erala causa del fenotipode resistenciade esta bacteria,el gen codificantedel transportador GlpT de E. coli fueexpresadoen célulasde B. abortus.Comose muestraenlaFig.5,los transformantes se hicieron sensiblesaFSMconuna concentración mínima inhibitoria(MIC)de4 µg/ml, confirmando que el fenotipo resistente de las células silvestres era resultado de tan sólo la ausencia de un mecanismo de entrada apropiado. Estos datos también sugieren que la actividad dela posible proteína DRL de B. abortus era de hecho inhibida por FSM, consistente con la hipótesis de que el mecanismo bioquímico usado por esta enzima alternativa para producir MEP a partir de DXP pudiera ser similar al usado por DXR.

La complementaciónde una cepade E. coli deficiente en DXR conduceala identificaciónde DRL

Para identificar el gen codificante de DRL en B. abortus. se construyó una librería genómica de esta bacteria y se usó para complementar a un mutante de E. coli deficiente en DXR. El genoma de la cepa E. coli EcAB410 contiene una deleción del gen dxr y un operónMVA sintético que permitela producciónde IPPy DMAPP(y por lo tanto la supervivencia de las células) cuando se aporta MVA al medio de cultivo. Células competentes de EcAB4-10 se transformaron con la librería genómica de B. abortus yfueron plaqueadas en ausencia de MVA. Los plásmidos de transformantes positivos que crecieron sin MVA exógeno fueron secuenciadosy mostraron contener fragmentos genómicos de B. abortus solapados que contenían los genes BAB2 0264yBAB2 0265(Fig. 6). BAB2 0265 codifica para una hidrolasadelafamilia HAD, mientras que BAB2 0264codifica para una proteína anotada como una oxidoreductasa putativay fue seleccionado paraexperimentos posteriores.La transformaciónde células EcAB4-10 con unvector que contenía tan sólo BAB2 0264diolugara una complementación completadela auxotrofía paraMVA (Fig. 2),lo que sugiere que la proteína codificada (Q2YIM3) era la enzima DRL de B. abortus predicha. La misma construcciónfue usadaenexperimentosde complementación conlas cepasde E. coli EcAB4-2yEcAB4-7, deficientes en las actividades DXSyMCT respectivamente. Una proteína que catalice la misma reacción bioquímica que DXR no debería rescatar el crecimiento de las cepas EcAB4-2(porque requeriría DXP, el producto de la actividad DXS) ni EcAB4-7 (ya que produciría MEP que necesita ser convertido en intermediarios posteriores de la ruta por la actividad MCT). Por el contrario, una proteína que usara un sustrato diferente de DXP para producir MEP o un intermediario posterior rescataría el crecimiento de la cepa EcAB4-2, deficiente en DXS, mientras que una proteína que produjera un intermediario de la ruta posterior a MEP a partir de DXP u otro sustrato rescataría el crecimiento de la cepa EcAB4-7, deficiente en MCT. Como se muestra en la Fig. 2, la expresión de BAB2 0264en estas cepas no rescata su auxotrofía paraMVA. Estos resultados son una importanteevidencia in vivo de que este gen codifica DRL, una enzima distintadeDXRque necesitael productodeDXSpara sintetizarun productorequeridoporlaactividadMCT(i.e.usa DXP o un metabolito derivado para producir MEP o un precursor que podría ser transformado en MEP por E. coli).

DRLyDXR catalizanla mismareacción bioquímica

La secuencia identificada de la proteína DRL de B. abortus no muestra homología general con secuencias de DXR sino con enzimas del tipo homoserina deshidrogenasas (HD). Una búsqueda de dominios funcionales detectó laexistenciadeun dominioN-terminalde uniónaNAD(P) conunplegamientotipo Rossman modificado, similar al que se encuentra en muchas deshidrogenasas. Esto, unido a los resultados in vivo (Fig2yFig. 3A), sugería que DRL podría usarNADPHpara catalizar una reacciónmuy similar(o incluso idéntica)ala catalizadapor DXR.Para verificar esta posibilidad, se produjo en E. coli una versión recombinante de la proteína DRL de B. abortus fusionada a unacolade histidinasy se purificó(Fig.3A)para ser usadaen ensayos in vitro de actividad DXR. Ensayos control se realizaron con proteína recombinante purificada DXR de E. coli.ylos productos de reacción se identificaron por UPLC-MS(/MS).Se encontróquelas muestrasque conteníanoDRLoDXR producíanMEPapartirdeDXPde forma similar (Fig. 3A). La identidad del producto de reacción en las muestras con DRL se confirmó comparando su patrónde fragmentaciónconeldeunpatróndeMEP(Fig.3B).Cuandose prepararon mezclasdereacciónsinenzima

osinNAPDHsolose detectaron picos paraDXP (Fig.3A). Además,se observóquela actividaddela enzimaDRL recombinante era sensible a la inhibición con FSM (Fig. 3C).

Experimentos de cromatrografía de exclusión molecular mostraron que la enzima DRL activa es un homodímero (Fig.7), comoDXR(cf.PJ Proteau, “1-Deoxy-D-xylulose5-phosphatereductoisomerase:anoverview” BioorgChem 2004.vol.32,pp.483-493).Tambiéndeforma similaraDXR,laactividadDRLtieneunpHóptimode7.5a8y una temperaturaóptimade40a45ºC(Fig.8).La representacióntipoLineweaver-Burkparael cálculodelos parámetros cinéticos (Fig. 8) mostró una Vmax = 0.083 µmolNADPH min-1 mg-1, una kcat = 0.065 s-1,y una Km(DXP) = 109 µMpara la proteína DRL recombinante. En las mismas condiciones experimentales, para DXR deE. coli se observó una Km(DXP) = 211 µM, del mismo orden que los valores reportados en la literatura para distintas enzimas DXR (CF. PJ Proteau, supra).En contraste,losvaloresdekcatparaDXR(CF.PJ Proteau, supra)son entre2y3órdenesde magnitud mayores que los calculados para laDRL recombinante de B. abortus. En conjunto, DRL define una nueva clase de enzimas dependientes deNADPH relacionadas con oxidorreductasas tipo HD que catalizan la formación de MEPapartirdeDXPdeformacasi idénticaaDXR,aunquelatasadeconversiónpareceser menorenelcasodeDRL.

La distribuciónde secuencias DRLyDXR no es mutuamenteexcluyente en todos los organismos

La búsqueda de secuencias de proteínas similares a la de DRL de B. abortus (Q2YIM3) en las bases de datos de UNIPROT con el algoritmo BLAST identificó un total de 185 secuencias (Tabla 3). La mayoría de las bacterias solo mostraron1secuenciaconhomologíaaDRL,pero17cepas mostraron2y3cepas mostraron3(Tabla4).Cuandose comparóladistribuciónde secuenciasDRL putativas conlade enzimasdela rutadelMEP,se establecieron3clases de organismos (Tabla 4).

La primera (clase A) estaba formada por bacterias con secuencias de DRL en lugar de DXR en sus genomas. La mayoría de estas secuencias DRL (incluyendo la proteína de B. abortus identificada) eran de alfa-proteobacterias, pero tambiénse encontraronalgunasen firmicutes.En particular,las secuencias únicasdeDRL encontradasenlos genomas de la alfa-proteobacteria Bartonella henselae (Q6G2D9) o la firmicute Finegoldia magna(B0S038) fueron activas en experimentos de complementación de la cepa EcAB4-10(Tabla 2). El mismo abordaje confirmó la actividad de las secuencias duplicadas de DRL presentes en el genoma de las alfa-proteobacterias Ochrobactrum anthropi (A6WYQ0 yA6X6G6)yMesorhizobium loti (Q98FT2yQ989B6).

La segunda (claseB)estaba formada por bacterias con secuencias codificantes tanto para DRL como para DXR(Tabla 4). De estas, las secuencias DRL de las alfa-proteobacterias Agrobacterium tumefaciens (A9CES2)y Candidatus Pelagibacter ubique(Q1V2P9), la beta-proteobacteria Burkholderia cepacia (B4EB12), la actinobacteria Mycobacterium smeqmatis (A0QQV9),ylas cianobacterias Nostoc punctiforme (B2IVC2)y Anabaena variabilis (Q3ME48) no rescataron la pérdida de actividad DXR en células de E. coli (Tabla 2). En contraste, las secuencias de la alfa-proteobacteria Roseobacter litoralis (A9HDV1)ylas firmicutes Listeria monocytogenes (Q723A4)y Bacillus halodurans (Q9KES5)fueronactivasen ensayosdecomplementación(Tabla2),loquesugeríaqueestosorganismospodríantener enzimas redundantes catalizando la producción de MEP. Sin embargo, únicamente las secuencias homologas a DXR de L. monocytogenes (Q720A5)y B. halodurans (Q9KA69) fueron capaces de complementar el mutante EcAB410(Tabla2yFig.9).Porel contrario,la secuenciaDXRde R. litoralis (A9GU34) era inactiva(Tabla2yFig. 9), probablemente porque presenta muchos cambios de aminoácidos en posiciones que están altamente conservadas en enzimas DXR funcionales de otras bacteriasyplantas. Estos resultados indican que algunos organismos de claseB son funcionalmente equivalentesa losdela claseA en términosdela ruta MEP (i.e. tienen una enzima DRL activa pero carecen de una enzima DXR).

La tercera (clase C) estaba formada por bacterias con DRL pero sin enzimas de la ruta MEP. Este grupo incluye arqueobacteriasybacteriasqueno usanlarutadelMEPparala biosíntesisdeisoprenoides(Tabla4).

LaTabla2 muestra los resultados de la complementación de la cepa EcAB4-10 de E. coli. que carece de DXR, con las secuencias indicadas. Los valores de “identidad” (%) se indican relativos a la proteínas DRL de B. abortus (Q2YIM3). La columna “clase” indica la presencia de homólogos de DRL, DXR y/o otras enzimas de la ruta del MEP enelmismoorganismo:A(+DRL,-DXR,+MEP),B(+DRL,+DXR,+MEP),C(+DRL,-DXR,-MEP).La columna “C-DRL” indicasilas correspondientes secuenciasDRL complementan(+)ono(-)la cepa EcAB4-10.La columna “C-DXR” indica si las correspondientes secuencias DXR complementan (+) o no (-) la cepa EcAB4-10 (Fig. 9); np, secuencia DXR no presente enel genoma; nt, secuencia DXR no ensayada enexperimentosde complementación.La secuencias estándivididas entre las que pertenecenal clado DRL que se muestra enla Fig.4,ylas que no pertenecen al clado (“No clado”).

Los homólogos de DRL se agrupan en un grupo monofilogenético (clado)

Cuando las secuencias aminoacídicas de DRL putativas identificadas en búsquedas con el algoritmo BLAST fueron sometidas a un análisis filogenético tipo “Maximum Likelihood” (ML), todas las secuencias de DRL activas en experimentosde complementación se agruparon en un único clado (Fig.4yTabla3).La identidadde secuenciade las proteínas de este clado oscila entre del 33% al 100% (Tabla 3). El clado DRL está respaldado por valores de “bootstrap” relativamente bajos (64), pero se obtuvo consistentemente empleando otros dos métodos independientes de reconstrucción filogenética (“Neighbour Joininig”y “MaximumParsimony”).Todos los organismos de claseA tienenalmenos una secuenciadeDRLen este clado(Tabla4).Laúnicaexcepcióneslaproteína B5J045delacepa 307 de la alfa-proteobacteria Octadecabacter antarcticus. aunque en el genoma de la cepa 238 existe una secuencia DRL incluidaenel clado (B5K941)(Tabla4).El únicoorganismode claseC con unasecuenciaDRLenel cladoes Chloroflexus aurantiacus (Tabla4).El restode secuenciasdel clado sondeorganismosdeclaseB(i.e.,que presentan una secuenciaDXRensus genomas,aunqueno necesariamenteactiva enzimáticamente;Tabla2).Lamayoríadeestos organismos eran firmicutes pero también están incluidas en el clado secuencias de la alfa-proteobacteria Roseobacter litoralis, la beta-proteobacteria Verminephrobacter eiseniaeyla actinobacteria marina PHSC20C1 (Fig.4yTabla 4).Todaslassecuenciasde organismosde claseB excluidas del clado DRL que se ensayaron enexperimentosde complementación resultaron ser inactivas (Tabla 2), lo que indica que no eran enzimas DRL auténticas.

Generación de un perfil HMM a partir del análisis de las diez secuencias

Además,por otraparte, se realizó un alineamientode las diez secuencias aminoacídicas verificadas como DRL activas(Tabla2)para generarunperfildeHMM usandoel programaHMMER (http://HMMER.janelia.org/).Elperfil de HMM fue usado para modelar las DRLy en búsquedasde posibles homólogosde DRL en grandes basesde datos de proteínas comoPfamo UNIPROT(cf.R.Apweiler et al., “UniProt: the Universal Protein knowledgebase”, Nucleic Acids Res 2004. vol. 32, pp. 115-119). El protocolo completo aparece detallado a continuación:

(i) Alineamiento múltiple de secuencias de proteínas DRL. Las secuencias fueron alineadas con el programa CLUSTALWusando los parámetros por defecto (cf. J.D. Thompson et al.,“CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specificgap penalties and weight matrix choice” Nucleic Acids Res 1994,vol.22,pp. 4673-4680).Los porcentajesde identidadanivelde secuencia con respecto a la proteína DRLde B. abortus (Q2YIM3) eran altamente variables, oscilando entre un 90% (A6WYQ0; O. anthropi)yun 33% (B0S038;F. magna). Estos datosproporcionan una estimacióndela distancia genéticayevolutiva entre las secuencias alineadas, revelandola elevadadivergenciaevolutiva entre lasDRL funcionales.

(ii) Construcción de un perfil de HMM usando el programa hmmbuild del paquete de aplicaciones HMMER, v.

2.3.3.El programa hmmbuild lee un fichero en formatoFASTAconel alineamientode secuenciasDRL, construye un perfilde HMMylo graba enun ficherode salida.

(iii) Calibración del perfil de HMM usando “hmmcalibrate” del paquete de aplicaciones HMMER, v. 2.3.3.

(iv) Examen de la especificidady sensibilidad del perfil de HMM en búsquedas de secuencias DRL: El perfil de HMM, una vez calibrado, fue usado como “query” para buscar secuencias DRL. Se usó para ello el programa “hmmsearch” del paquete de aplicaciones HMMER, v. 2.3.3. El programa “hmmsearch” lee un fichero HMMER con un perfilde HMM,busca en una basede datos secuenciasde proteínascon similitudes significativasydevuelveun listado de las secuencias resultantes ordenadas. La base de datos utilizada fue UNIPROT. Entre los mejores resultados aparecían las diez secuencias de DRL funcionales usadas para generar el perfil, con puntuaciones/valores-Ede 860/0 (Q2YIM3; B. abortus)a 267/2.00E-69 (B0S038; F. magna). Sin embargo, seis secuencias adicionales que también mostraban puntuaciones/valores-E significativos, desde 50/3E-04 (B4EB12, B. cepacia)a 243/2E-62 (B2IVC2, N. punctiforme). no consiguieron complementar el mutante de E. coli dxr defectivo EcAB4-10, lo que indicaba que no poseían actividad enzimática DRL.El programa “hmmsearch” fue también usado parabuscar entre las secuenciasde proteína incluidas en las bases de datos Pfram no encontrándose ninguna con puntuaciones/valores-E significativos.

Estos resultados indicanque(i)lasDRLs funcionales comparten similitudanivelde secuencia significativa;(ii)los perfilesdeHMMmuestrangransensibilidadpara identificarconseguridadalos homólogosdeDRLfuncionalesenlas búsquedasen INTERPRO;y(iii)elperfildeHMMmuestra suficiente especificidadpara descartar aquellas secuencias previamente clasificadas en las familias de proteínas de Pfam. En conclusión, aunque el perfil de HMM funciona bien para identificar hipotéticos homólogos de DRL, algunas de las secuencias identificadas parecen corresponder a homólogos divergidos funcionalmente para los que la actividad enzimática DRL se ha perdido o bien no ha sido adquirida a través de la evolución.

Para refinar la definición de DRL, se sometió a todas las secuencias con homología con DRL (Tabla 3) a un análisis filogenético a partir de alineamientos de secuencia de proteína obtenidos mediante CLUSTALW. Se usaron tres métodos de reconstrucción filogenética: máxima verosimilitud, máxima parsimonia y “neighbor-joining”. Los análisis de verosimilitud fueron llevados a cabo con elprograma PHYML v2.4.5, usando el modelo JTT de evolución de proteínas (cf. D.T. Jones et al., supra: S. Guindon and O. Gascuel, supra). Los análisis de “neighbor-joining”y máxima parsimonia se realizaron en MEGA4.0,usandola configuraciónpor defectoencada caso(cf.K.Tamuraet al., supra).Para dotarde confianza estadísticaala topología del árbol obtenido, se llevóa caboun análisisde “bootstrap” con 1000 replicaciones (cf. J. Felsenstein, “Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap” Evolution 1985. vol. 39, pp. 783-791).

Cuandolas secuencias aminoacídicas identificadasapartirdelperfildeHMM generadooapartirdelBLASTpfueron sujetas a análisis filogenéticos por el método de máxima verosimilitud, se observó que todas las secuencias DRL que habían mostrado ser funcionales en los ensayos de complementación agrupaban en un grupo monofilético o clado (Fig. 4). Dicho clado mostraba valores de “boostratp” relativamente bajos, pero era sistemáticamente obtenido por los dos métodos alternativos de reconstrucción filogenética que fueron empleados. De acuerdo a la teoría filogenética, las secuenciasque agrupanenunclado son homologasy,porlo tanto, compartiríanun ancestro común. Coherentemente, todaslas secuencias fueradel cladoDRLque fueronexaminadasexperimentalmenteno fueron capacesdecomplementar el mutante EcAB4-10 (Tabla 2). Estos resultados indican que (i) las secuencias que agrupan dentro del clado DRL pertenecenalafamiliaDRLycompartenactividad enzimáticaDRLy(ii)las secuenciasque muestran identidad de secuencia significativa con las DRL pero agrupan fuera del clado DRL no serían enzimas DRL funcionales.

TABLA3

La columna “clase” indica la clasificación de las cepas bacterianas según la distribución de secuencias con homo-logíaaDRL,DXRy/ootras enzimasdelavíaMEPenlamismacepa:A(+DRL,-DXR,+MEP),B(+DRL,+DXR, +MEP),C(+DRL, -DXR, -MEP). (a)únicamente se indican los hits anotados como DXS. (b)indica enzima bifuncional MCT/MDS (IspD/IspF). La columna “DRL clado” indica las secuencias que pertenecen (+) o no (-) al clado DRL mostradoenlaFig.4Las secuenciasDRL múltiplesenlamismacepa están separadaspor barras.La columna“CDRL” indicalas secuenciasque complementan(+)ono(-)el mutantedxr E. coli. Las cepas de las que se ha analizado experimentalmente su secuencia están marcadas en negrita.

TABLA4

Los “E-value” son relativos a la proteína DRL de B. abortus (Q2YIM3). La columna “DRL clado” indica las secuenciasque pertenecen(+)ono(-)al cladoDRL mostradoenlaFig.4.La columna “C-DRL” indicalas secuencias que complementan(+)ono(-)el mutante deficienteenDXRde E. coli (ver tambiénTabla2).Las secuencias probadas ylas correspondientes cepas se marcan en negrita. La columna “clase” indica la clasificación de las cepas bacterianas segúnla distribucióndelas secuencias con homologíaaDRL,DXRy/o otras enzimasdelavíaMEPenla misma cepa:A(+DRL, -DXR, +MEP),B(+DRL, +DXR, +MEP),C(+DRL, -DXR, -MEP).

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Enzima con actividad1-desoxi-D-xilulosa5-fosfato reductoisomerasa que cataliza la reacción de producción de2-C-metil-D-eritritol4-fosfato (MEP)a partirde1-desoxi-D-xilulosa5-fosfato (DXP),que tienela secuenciade aminoácidos SEQ ID NO: 41.

2. 2.

   Enzima según la reivindicación 1, que es de Brucella abortus.

3. 3.

   Enzima según la reivindicación 2, que es de Brucella abortus 2308.

4. 4.Vectordeexpresión que permitelaexpresión en bacteriasdela enzima definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3 activa, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 51.

5. 5.

   Usode una enzima según sedefine en cualquierade las reivindicaciones 1-3, paralasíntesisde isoprenoides.

6. 6.

   Uso según la reivindicación 5, para la síntesis de MEP.

7. 7.

   Método de obtención de MEP que comprende:

   (a)expresarla enzima activa definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3 en unsistema celular;y

   (b)

   cultivarel sistema celulardelpaso(a)bajo condicionesy enun medioque permitenla producciónyacumulación de MEP.

8. 8. Método de obtención de MEP que comprende:

   (a)

   proporcionar un sistema celular que permitalaexpresióndela enzima definida en cualquierade las reivindicaciones 1-3;

   (b)

   cultivarel sistema celulardelpaso(a)bajo condicionesque permitenla produccióndela enzima;y

   (c)

   cultivarel sistema celular bajo condicionesy en un medio que permitenla producciónyacumulaciónde MEP

   o bien purificarel enzimayutilizarlo en un sistema in vitro bajo condicionesyenun medioque permitenla obtención deMEP,dondeelmediocomprendeun sustrato seleccionadodelgrupoqueconsisteenDXPyunamezcladepiruvato ygliceraldehído 3-fosfato.