CN106459880A - 细胞色素p450还原酶的稳定化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组微生物，其能够表达细胞色素P450还原酶(CPR)和任选地细胞色素P450酶(CYP)，并且其能够过表达包含在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或与其具有至少50％序列一致性的序列的Ice2p。本发明进一步涉及Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶在重组微生物中的表达的用途。

Description

细胞色素P450还原酶的稳定化
技术领域
本发明涉及其中的细胞色素P450还原酶的表达被稳定化的重组宿主细胞。本发明进一步涉及用于在重组宿主细胞中产生感兴趣的化合物的方法，并且涉及用于在生物催化反应中产生感兴趣的化合物的方法。本发明还涉及蛋白质用于稳定化细胞色素P450还原酶的用途。
背景技术
细胞色素P450单加氧酶超家族(正式缩写为CYP)是催化有机物质的氧化的一组庞大而多样的酶。CYP酶的底物包括代谢中间物如脂质和类固醇激素，以及异生物质如药物和其他有毒化学品。CYP是在药物代谢和生物活化作用中涉及的主要酶，占不同代谢反应的总数的约75％。
CYP酶已经在所有领域的生命中被鉴定出——动物、植物、真菌、原生生物、细菌、古细菌以及甚至在病毒中。然而，在E.coli中尚未发现这些酶。已知多于18,000种不同的CYP蛋白。
大部分CYP需要蛋白配偶体来递送一个或多个电子，以便还原铁(并且最终还原分子氧)。基于电子传递蛋白的性质，CYP可以被分为几组。在微粒体P450系统中，电子经由细胞色素P450还原酶(不同地CPR、POR、或CYPOR)被从NADPH中传递出。
鉴于细胞色素P450还原酶是在初级和次级代谢物生物合成中涉及的多种P450的最必要的氧化还原配偶体，异源P450系统的表达在构建重组宿主细胞中的新代谢途径的尝试以及在新生物催化剂的产生中至关重要。
然而，膜锚定细胞色素P450酶(CYP)在应用于生物催化过程的微生物宿主中的异源表达仍具挑战性。CYP活性不可逆转地和NADPH辅因子再循环的精细平衡系统、氧供应、血红素铁正确地整合到CYP的活性位点中相关联，以及当然和与它们对应的(作为电子供体发挥作用的)细胞色素P450还原酶(CPR)的完美相互作用有关。
发明内容
本发明是基于以下发现，即细胞色素P450还原酶(CPR)在Δice2敲除酵母菌株中容易降解。过表达Ice2p在静息细胞测定中将HPO/CPR介导的(+)-朱栾倍半萜的生物转换增加至高达1.4倍。
通过将分析扩展到替代性CYP/CPR组合以及扩展到作为表达宿主的S.cerevisiae和P.Pastoris两者，证明了ICE2过表达在稳定化CYP/CPR活性用于生物催化应用和发酵生产中的一般适用性。整个过程都检测到了CPR稳定化。
生物催化应用典型地是指使用CYP/CPR通过酶促反应将一种化合物转换为另一种化合物，而发酵生产典型地是指将C-源转换为希望的产物。
因此，本发明涉及重组宿主细胞，其能够表达细胞色素P450还原酶(CPR)和任选地细胞色素P450酶(CYP)，并且其能够过表达包含在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或与其具有至少50％序列一致性的序列的Ice2p。
本发明还涉及：
-用于在重组宿主细胞中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据权利要求中任一项所述的能够表达感兴趣的化合物的重组宿主细胞；
在适于产生该感兴趣的化合物的条件下培养该重组宿主细胞；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物；以及
-用于在生物催化反应中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述权利要求中任一项所述的能够产生感兴趣的CYP和CPR的重组宿主细胞；
在适于产生CYP和CPR的条件下培养该重组宿主细胞；
通过使适合的底物与该重组宿主细胞或由其衍生的生物催化剂制剂接触将该底物转换成感兴趣的化合物；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
本发明进一步提供了Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶在重组宿主细胞中的表达的用途。
附图说明
图1列出了在S.cerevisiae中重组表达的CYP/CPR活性对(+)-朱栾倍半萜(1)的生物羟基化。通过细胞色素P450酶形成的反式-益智醇(nootkatol)(2)可以通过未鉴定的面包酵母内在活性被进一步氧化成(+)-圆柚酮(3)(A)。用理论上可重复提取量(TRA)的817ng(+)-朱栾倍半萜/μL乙酸乙酯，通过静息细胞测定对S.cerevisiae中的HPO/CPR活性的效应物进行筛选(B)。BY4742(evc)指示在20h测定内的底物损失。用pYES-HPO-CPR转化BY4742和在相同背景下和被破坏的单敲除菌株，以待测定(+)-朱栾倍半萜转换。结果作为静息细胞测定的平均值和标准差给出，所述静息细胞测定在两个生物重复的技术性四分试样(quadruplicate)中进行。进行蛋白质印迹分析，以便揭示6h半乳糖诱导之后的HPO/CPR水平(C)。
图2列出了参比标准品(A)和通过静息细胞测定产生的萜类(B)的GC-MS色谱图；1，(+)-朱栾倍半萜；2，顺式-益智醇；3，反式-益智醇；4，(+)-圆柚酮。针对参比标准品(C，E)和具有静息细胞的生物转化产物(D，F)示出了反式-益智醇和(+)-圆柚酮的质谱。
图3列出了对经调节的ICE2表达水平对HPO/CPR介导的(+)-朱栾倍半萜转换的作用的评价。实时定量PCR分析(A)。对照菌株W303和对照菌株以及共表达来自pYES2载体的HPO和CPR的PGAL1-ICE2菌株。根据将表达水平相对于管家基因CDC73进行标准化的方法确定mRNA水平。将相同的菌株分别以三个生物副本和四个技术副本进行静息细胞活性测定(B)。
图4列出了共表达ValS、tHMG1、HPO和CPR的细胞(2)以及另外具有ice2缺失的菌株(3)或自PGAL1启动子过表达ICE2的菌株(4)中的(+)-朱栾倍半萜的体内产生和生物转化。将菌株与对照菌株W303(1)进行比较。针对多于三个独立实验，一式三份地进行转换并且一致地进行重复。
图5列出了参比菌株W303 tHMG1 ValS HPO CPR和过表达ICE2的菌株的萜类的体内产生的时间依赖性分析(A)。通过Fiji程序对来自在时间点24h、48h和72h采取的样品的蛋白质印迹信号进行量化。从针对每个菌株和时间点加载的四个样品计算中间带强度(以百分比计)(B)。在相同的时间点，从内源启动子或从PGAL1-启动子追踪Ice2p-His6的表达(分别加载了1个和2个OD600单位)(C)。用对照菌株W303 tHMG1 ValS HPO CPR和过表达ICE2-His6的菌株进行细胞色素c还原酶活性测定。减去菌株W303MATa和W303 MATa PGal1-ICE2-His6的背景还原酶活性。用从两个不同培养采取的样品一式四份地进行测量(D)。
图6列出了S.cerevisiae菌株的电子显微照片。以不同颜色追踪亚细胞区室，以便更好地可视化。核膜，浅灰色(N，细胞核)；外周ER，深灰色。示出了共表达和不共表达HPO和CPR的野生型菌株W303(A)、(B)以及过表达ICE2的菌株(C)。
图7列出了针对过表达ICE2的S.cerevisiae和P.pastoris菌株中的底物转化所测试的替代性CYP/CPR系统。针对(-)-柠檬烯(PM17/CPR)(A)和丁呋洛尔(CYP2D6/hCPR)(B)的转换的S.cerevisiae静息细胞测定。进行了表达替代对的CYP和还原酶的S.cerevisiae菌株的蛋白质印迹分析(C)。作为替代性表达宿主，针对(-)-柠檬烯(D)和丁呋洛尔(E)两者的转换对P.pastoris进行了测试。通过蛋白质印迹分析菌株的HPO和CPR表达(F)。
图8列出了使用P.pastoris菌株HCV(表达ValS、HPO和CPR)和HCV-PpIce2(另外共表达PpIce2)进行的双相(+)-朱栾倍半萜全细胞羟基化测定的结果(A)。HCV和HCV-PpIce2菌株中的HPO-flag和CPR-myc蛋白的免疫学检测。
序列表描述
SEQ ID NO：1列出了来自Saccharomyces cerevisiae S288c的ICE2基因的mRNA序列(NM_001179438)。
SEQ ID NO：2列出了来自Saccharomyces cerevisiae S288c的Ice2p蛋白的氨基酸序列(NP_012176)。
SEQ ID NO：3至35列出了在表2中描述的引物的序列。
具体实施方式
本发明涉及Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶的用途。细胞色素P450酶(CYP)与细胞色素P450还原酶(CPR)一起构成了可以在体内(例如在代谢工程策略中)使用的或可以本身被用作生物催化剂(即与化合物接触，以将其转换成感兴趣的另外化合物)的重要生物催化剂。
然而，CYP和CPR的表达并不是直接的。在本文，证明了来自S.cerevisiae的ICE2基因的过表达可稳定化CPR的表达。这可以允许产生更好的工程化的代谢途径和/或产生更好的生物催化剂。
因此，本发明涉及重组宿主细胞，其能够过表达或其过表达包含在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或与之具有至少50％的氨基酸序列的Ice2p。
本发明的这样一种重组宿主细胞典型地还能够表达CYP和/或CPR。
在本文，细胞色素P450是催化有机物质氧化的细胞色素P450单加氧酶超家族(正式缩写为CYP)的任何成员。
由CYP催化的最常见的反应是单加氧酶反应，例如将一个氧原子插入到有机底物(RH)的脂肪族位置中，同时另一个氧原子被还原成水：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+
在本文，细胞色素P450还原酶是任何细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4；亦称NADPH：含铁血红素蛋白氧化还原酶、NADPH：血红素蛋白氧化还原酶、NADPH：P450氧化还原酶、P450还原酶、POR、CPR、CYPOR)，一种将电子从含FAD和FMN的酶NADPH：细胞色素P450还原酶(POR；EC1.6.2.4)传递到真核细胞内质网中的细胞色素P450所需的膜结合酶。
Ice2p是一种具有八个预测跨膜结构域且在芽殖酵母中的ER分布、定位和遗传中具有必要作用的III型膜蛋白。来自S.cerevisiae的Ice2p蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。ICE2基因的mRNA序列在SEQ ID NO：1中列出。
可以使用来自不同于S.cerevisiae的来源的Ice2p/ICE2，例如P.pastoris或一些其他适合的来源。
可在本发明的重组宿主细胞中过表达的Ice2p可以是包含在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的任何蛋白质或包含与SEQ ID NO：2具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的蛋白质。可替代地，在本发明的重组宿主细胞中过表达的Ice2p可以包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性(或基本上与SEQ IDNO：2的氨基酸序列相同)的氨基酸序列。
在本发明的重组宿主细胞中过表达的任何Ice2p蛋白或变体Ice2p蛋白都将保留Ice2p活性。出于本发明的目的，在本发明的重组宿主中过表达的Ice2p蛋白或变体Ice2p蛋白是保留Ice2p蛋白的至少一种活性或特性的蛋白，例如具有在SEQ ID NO：2中列出的序列的Ice2p蛋白。因此，在本发明的重组宿主中过表达的Ice2p蛋白或变体Ice2p蛋白将典型地是III型膜蛋白，例如具有八个预测的跨膜蛋白的蛋白。这样一种蛋白可以是ER定位的膜内在蛋白。
本发明的宿主细胞是重组宿主细胞。在这个意义上，“重组”意指该宿主细胞是非天然存在的宿主细胞，例如使用重组技术通过引入一种或多种核酸进行修饰。用于修饰宿主细胞以达到本发明的重组宿主细胞的核酸可以是天然存在的核酸或非天然存在的核酸。因此，当关于本发明的宿主细胞使用时，“重组”指示该细胞已经通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质进行修饰，或者该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在该细胞的天然(非重组)形式内未发现的Ice2p蛋白，或者可以被修饰以便以大于在该细胞的天然“非重组”形式内发生的程度表达编码Ice2蛋白的天然基因。术语“重组”与“基因修饰的”同义。
本发明的宿主细胞因此至少关于Ice2p蛋白的过表达是典型地重组的。例如，本发明的重组宿主细胞可以包含编码Ice2p蛋白的异源核酸——该异源核酸可以编码对于该细胞的非重组形式而言非天然或天然的Ice2p蛋白。也就是说，可以通过引入非天然Ice2p基因的一个或多个拷贝或者天然Ice2p基因的一个或多个另外的拷贝或其组合来实现Ice2p蛋白的过表达。可替代地或另外地，本发明的重组宿主细胞可以在天然基因内包含修饰从而使得该基因以大于该细胞的非重组形式中的程度被表达，和/或被修饰使得所得Ice2p蛋白具有比在该细胞的非重组形式中更高的活性。
在本发明的宿主细胞中，Ice2p蛋白被过表达。在本文，“被过表达(overexpressed)”、“过表达(overexpression)”等意味着该重组宿主细胞比对应的不过表达Ice2p蛋白的细胞表达更多的Ice2p蛋白，或者可替代地，Ice2p蛋白在典型地不表达该蛋白的细胞中被表达。可替代地，可以通过表达具有较高比活性的变体Ice2p蛋白来实现过表达。
Ice2p蛋白的过表达可以等同地被称为ICE2基因的过表达。
在根据本发明的重组宿主细胞中，CYP可以是来自Hyoscymaus muticus的豆腐柴螺二烯(premnaspirodiene)加氧酶CYP71D55(HPO)(任选地已经在其中进行了突变V482I和A484I)、来自Mentha piperita的(-)-柠檬烯-3-羟化酶(PM17)或人细胞色素P450 2D6(CYP2D6)。
在本发明的重组宿主细胞中，CPR可以是来自A.thaliana的细胞色素P450还原酶或人还原酶。CPY可以是具有在WO 2013/110673的SEQ ID NO：54、56、58或78的任一项中列出的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶。
本发明的重组宿主细胞典型地能够产生感兴趣的化合物。感兴趣的化合物可以全部或部分地由一种或多种重组多核苷酸(即通过重组手段被引入到重组宿主细胞中的多核苷酸)编码。此类多核苷酸可以是导致感兴趣的化合物产生的途径的一部分。然而，感兴趣的化合物可以是CYP和/或CPR。并且，感兴趣的化合物可以是生物质本身，即宿主细胞。
因此，感兴趣的化合物可以是任何生物化合物。生物化合物可以是生物质或生物聚合物或代谢物。生物化合物可以由构成生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码，或者可以是单个多核苷酸产物或一系列多核苷酸产物的直接结果。生物化合物对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。
术语“异源生物化合物”在本文被定义为对于该细胞而言非天然的生物化合物；或在其中已经进行结构修饰以改变该天然生物化合物的天然生物化合物。
典型地，感兴趣的化合物将是在其中涉及一种或多种CYP和/或CPR的活性的化合物。
在本发明的重组宿主细胞中，感兴趣的化合物可以是固醇(例如7-脱氢胆固醇或25-羟基7-脱氢胆固醇)、维生素(例如维生素D3)、反式-益智醇、圆柚酮或甜菊糖苷(例如甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M、甜茶苷或杜克苷A)。
因此，本发明涉及Ice2p在7-脱氢胆固醇或25-羟基7-脱氢胆固醇、维生素(例如维生素D3)、反式-益智醇圆柚酮或甜菊糖苷(例如甜菊单苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M、甜茶苷或杜克苷A)的产生中的用途。此类产生可以是发酵的(即通过本发明的重组宿主细胞产生)或生物催化的(即通过使适合的底物与本发明的重组宿主细胞或与衍生自这样一种重组宿主细胞的生物催化剂接触)。
本发明还涉及Ice2p用于在朱栾倍半萜向反式-圆柚酮的转换中和/或在反式-圆柚酮向圆柚酮的转换中稳定化CPR的用途。
因此，本发明的重组宿主细胞可以是已经被修饰以便产生上面提及的感兴趣的产物之一的重组宿主细胞。
Ice2p可以在如WO 2013/110673中(在甜菊糖苷产生的背景下)描述的重组微生物中或在如WO 2011/067144中(在固醇产生的背景下)描述的酵母中被过表达。
在本发明的背景下，根据本发明的“宿主细胞”或所述宿主细胞的亲本可以是任何类型的宿主细胞。根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
宿主细胞可以是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性微生物。适合的细菌可以选自例如Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自下组，该组由以下各项组成：B.Subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobactert crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Pseudomonas fluorescens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobiummelioti以及Rhizobium radiobacter。
在本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，优选细菌细胞，更优选属于Bacillus、Escherichia(如Escherichia coli)、Pseudomonas、Lactobacillus属的细菌细胞。
适合的细菌宿主细胞可以另外含有修饰，例如该细菌宿主细胞可以在对感兴趣的化合物的产生、回收和/或应用不利的基因中有缺陷，例如感兴趣的化合物是多肽，例如酶。在优选方面中，细菌宿主细胞是蛋白酶缺陷宿主细胞，更优选地它是在编码胞外碱性蛋白酶的基因aprE中有缺陷且在编码胞外中性金属蛋白酶的基因nprE中有缺陷的Bacillus宿主细胞。在另一个优选方面中，Bacillus宿主细胞在由选自下组的基因编码的一种或多种蛋白酶中进一步有缺陷，该组由以下各项组成：nprB、vpr、epr、wprA、mpr、bpr。在另一个优选方面中，细菌宿主细胞不产生孢子和或在孢子形成相关基因(例如像spoOA、spoIISA、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIIIJ)中有缺陷。在又另一个优选方面中，Bacillus宿主细胞在编码α-淀粉酶的基因amyE中有缺陷。在又另一个优选方面中，Bacillus宿主细胞、更优选Bacillus subtilis宿主细胞在aprE、nprE、amyE中有缺陷且并不产生孢子。在更优选的实施方案中，Bacillus宿主细胞是BS154、CBS136327或其衍生物。
根据本发明的宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌、或藻细胞，如Schizochitrium。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞、以及杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf21细胞及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞。
优选的酵母宿主细胞可以来自Candida、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia或Zygosaccharomyces属。更优选地，酵母宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140、Kluyveromycesmarxianus、Kluyveromyces thermotolerans、Candida krusei、Candida sonorensis、Candida glabrata、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D、Schizosaccharomyces pombe、Hansenula polymorpha、Issatchenkia orientalis、Yarrowia lipolytica、Yarrowia lipolytica CLIB122、Yarrowia lipolytica ML324(保藏为ATCC 18943)、Pichia stipidis以及Pichia pastoris。
宿主细胞可以是丝状真菌细胞。如在本文定义的丝状真菌包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby′sDictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中定义的)。丝状真菌宿主细胞可以是发菌科分类群的任何丝状形式的细胞(如由Houbraken和Samson在Studies in Mycology 70：1-51.2011中定义的)。在另一个优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞可以是曲霉菌科、嗜热子囊菌科(Thermoascaceae)和发菌科三个科中任一的任何丝状形式的细胞，这三个科被归在发菌科分类群中。丝状真菌由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖构成的菌丝体壁表征。营养生长通过菌丝延伸进行，而碳分解代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mortierella、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、以及Trichoderma的菌株。
优选的丝状真菌细胞属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma属的种，并且最优选Aspergillus niger、Acrernonium alabamense、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Rasamsonia emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense，Fusarium oxysporum、Myceliophthora thermophila、Trichoderma reesei、Thielavia terrestris或Penicillium chrysogenum的种。更优选的丝状真菌宿主细胞属于Aspergillus属，更优选地宿主细胞属于Aspergillus niger种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS 513.88、CBS124.903或其衍生物。
若干微生物菌株在许多培养物保藏中心可容易地为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center，NRRL)、以及俄罗斯莫斯科的全俄罗斯科学院微生物保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy ofSciences，俄语缩写-VKM，英语缩写-RCM)。在本发明的背景下有用的菌株可以是Aspergillus niger CBS 513.88、CBS124.903、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO4177、ATCC 1011、CBS205.R9、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、P.chrysogenum Wisconsin54-1255(ATCC28089)、Penicillium citrinum ATCC38065、Penicillium chrysogenum P2、Thielaviaterrestris NRRL8126、Talaromyces emersonii CBS 124.902、Acremonium chrysogenumATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Myceliophthora thermophila C1、Garg27K、VKM-F3500D、Chrysosporium lucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500 D、ATCC44006及其衍生物。
本发明还涉及用于在重组宿主细胞中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据权利要求中任一项所述的能够表达感兴趣的化合物的重组宿主细胞；
在适于产生该感兴趣的化合物的条件下培养该重组宿主细胞；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
本发明进一步涉及用于在生物催化反应中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述权利要求中任一项所述的能够产生感兴趣的CYP和CPR的重组宿主细胞；
在适于产生CYP和CPR的条件下培养该重组宿主细胞；
通过使适合的底物与该重组宿主细胞或由其衍生的生物催化剂制剂接触将该底物转化成感兴趣的化合物；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
这些方法中的任一种都可以应用来将朱栾倍半萜转换成反式-圆柚酮和/或应用于反式-圆柚酮向圆柚酮的转换中。为此下面示出了反应方案：
也就是说，本发明还涉及Ice2p用于在朱栾倍半萜向反式-圆柚酮的转换中和/或在反式-圆柚酮向圆柚酮的转换中稳定化CPR的用途。通过使用重组细胞自身或者通过使用衍生自该重组细胞的生物催化剂，本发明的重组宿主细胞可以在用于将朱栾倍半萜转换成反式-圆柚酮的方法中和/或在反式-圆柚酮向圆柚酮的转换中使用。
本发明还提供了Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶在重组宿主细胞中的表达的用途。具体而言，Ice2p的过表达可以用于稳定化CPR在宿主细胞中的表达。
本发明的用于制备感兴趣的化合物的方法包括在适当条件下在适合的发酵培养基的存在下培养(即发酵)如在本文描述的重组细胞。适合的发酵培养基是本领域技术人员已知的。重组细胞的发酵可以在导致产生感兴趣的化合物的条件下进行。本发明的方法可以在存在或不存在氧的情况下进行。也就是说，该方法在厌氧条件下进行。
出于本发明的目的，厌氧发酵方法可以在本文被定义为在不存在氧的情况下运行或其中基本上没有氧消耗(优选地小于5、2.5或1mmol/L/h)的，并且其中有机分子既充当电子供体又充当电子受体的发酵方法。根据本发明的发酵方法也可以首先在需氧条件下运行并且随后在厌氧条件下运行。厌氧条件典型地在生产阶段(感兴趣的化合物的产生)中使用。
本发明的发酵方法也可以在限氧或微需氧条件下运行，出于本发明的目的，所述发酵方法被认为是厌氧方法。可替代地，发酵方法可以首先在需氧条件下运行并且随后在限氧条件下运行。限氧发酵方法是这样一种方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧传递的限制。氧限制程度由进入气流的量和组成以及所使用的发酵设备的实际混合/质量转移特性决定。
根据本发明的用于产生感兴趣的化合物的方法可以在1与9之间的任何适合的pH下进行。优选地，发酵液中的pH在2与7之间。
可以进行根据本发明的方法的适合的温度在5℃与60℃之间，优选地在10℃与50℃之间，更优选地在15℃与35℃之间，更优选地在18℃与30℃之间。本领域技术人员知晓哪些适宜温度适于发酵特定重组细胞。
在本发明的用于产生感兴趣的化合物的方法中，该感兴趣的化合物可以被分泌到发酵液中和/或存在于在本发明中使用的重组细胞中。因此，本发明还提供了包含通过根据本发明的方法可获得的感兴趣的化合物的发酵液。发酵液可以包含：已经从重组细胞中分泌出的感兴趣的化合物；被包含在本发明的重组细胞内的感兴趣的化合物；在对细胞进行导致细胞破坏并且释放感兴趣的化合物的处理以后已经从重组细胞中释放出的感兴趣的化合物；或其任何项的混合物。
优选地，在本发明的方法中，通过本领域已知的适合方法(例如通过萃取或结晶)从发酵液中回收感兴趣的化合物。本发明的重组细胞需要被破坏以允许释放感兴趣的化合物。
在本发明的背景下，术语“稳定化”意指与不过表达Oce2p蛋白的宿主细胞形式相比，细胞色素P450还原酶的表达被例如增加和/或延长。以感兴趣的化合物的产量增加来看，这可以是明显的。
术语“序列一致性”或“序列同源性”在本文可互换地使用。出于本发明的目的，在这里定义到为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列一致性或序列同源性百分比，出于最佳比较目的将序列进行比对。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的这两个序列的任一序列中引入空位。此类比对可以在正在进行比较的序列的全长上进行。可替代地，比对可以在较短长度上进行，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上。序列一致性是在报告的比对区域上两个序列之间的相同匹配的百分比。
序列的比较以及两个序列之间的序列一致性百分比的确定可以使用数学算法来完成。本领域技术人员应意识到以下事实，即若干不同计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的一致性(Kruskal，J.B.(1983)An overview of sequence comparison在D.Sankoff和J.B.Kruskal(编)，Time warps，string edits and macromolecules：thetheory and practice of sequence comparison，第1-44页Addison Wesley)。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的百分比序列一致性可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列两者均可以通过该算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中实施。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(2000)Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，将EBLOSUM62用作取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。本领域技术人员应意识到，所有这些不同参数将产生略有不同的结果，但是当使用不同算法时两个序列的总体百分比一致性并不会显著改变。
通过如上面描述的程序NEEDLE比对之后，如下计算查询序列与本发明序列之间的序列一致性百分比：在减去比对中的空位总数之后，将在两个序列中都示出相同的氨基酸或相同的核苷酸的比对中的对应位置的数目除以比对总长度。如在本文定义的一致性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得并且在该程序的输出中被标记为“最长一致性(longest-identity)”。
在本文提及的蛋白质序列和核酸序列可以进一步被用作“查询序列”，以针对公共数据库进行检索，例如以便鉴定其他族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的带有空位的比对，可以利用如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的首页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
标准遗传技术(如酶在宿主细胞中的过表达、宿主细胞的遗传修饰、或杂交技术)是本领域的已知方法，如描述于Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，或F.Ausubel等人编，“Current protocols in molecular biology”，Green Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。用于真菌宿主细胞的转化、遗传修饰等的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574以及US 6,265,186已知。因此，适于在本发明中使用的重组细胞的制备是本领域技术人员公知的。
本发明的实施方案：
1.一种重组宿主细胞，其能够表达细胞色素P450酶(CYP)和细胞色素P450还原酶(CPR)并且其能够过表达包含SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或与其具有至少50％序列一致性的序列的Ice2p。
2.根据实施方案1所述的重组宿主细胞，其中该CYP是来自Hyoscymaus muticus的豆腐柴螺二烯加氧酶CYP71D55(HPO)，任选地已经在其中进行了突变V482I和A484I、来自Mentha piperita的(-)-柠檬烯-3-羟化酶(PM17)或人细胞色素P4502D6(CYP2D6)。
3.根据实施方案1或2所述的重组宿主细胞，其中该CRP是来自A.thaliana的细胞色素P450还原酶或人还原酶。
4.根据前述实施方案中任一项所述的重组宿主细胞，其能够产生感兴趣的化合物。
5.根据实施方案4所述的重组宿主细胞，其中该感兴趣的化合物是固醇、甜菊糖苷、反式-益智醇或圆柚酮。
6.根据前述实施方案中任一项所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
7.根据实施方案6所述的重组宿主细胞，其是真核细胞，优选真菌细胞，更优选选自下组的酵母细胞，该组由以下各项组成：Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、或Yarrowia菌株，或选自下组的丝状真菌细胞，该组由属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma的种的丝状真菌细胞组成。
8.根据实施方案6所述的重组宿主细胞，其是原核细胞，优选细菌细胞，更优选属于Bacillus、Escherichia、Pseudomonas、Lactobacillus属的细菌细胞。
9.一种用于在重组宿主细胞中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述实施方案中任一项所述的能够表达感兴趣的化合物的重组宿主细胞；
在适于产生该感兴趣的化合物的条件下培养该重组宿主细胞；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
10.一种用于在生物催化反应中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述实施方案中任一项所述的能够产生感兴趣的CYP和CPR的重组宿主细胞；
在适于产生CYP和CPR的条件下培养该重组宿主细胞；
通过使适合的底物与该重组宿主细胞或由其衍生的生物催化剂制剂接触将该底物转换成感兴趣的化合物；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
11.根据实施方案9或10所述的方法，用于将朱栾倍半萜转换成反式-圆柚酮和/或用于在反式-圆柚酮向圆柚酮的转换中。
12.Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶在重组宿主细胞中的表达的用途。
贯穿本说明书和所附权利要求书，措辞“包含(comprise)”、“包括("include)”和“具有(having)”以及变型(如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”)应包含地解释。也就是说，这些措辞旨在传达可能包含没有具体叙述的其他元素或整数，在上下文允许的情况下。
本文未明确提及数量(使用冠词“a”和“an”修饰)时表示该冠词语法对象为一个或多于一个(即一个或至少一个)。例如，“元素”可以意指一种元素或多于一种元素。
在本文中对专利文献或作为现有技术给定的其他材料的引用不应被认为承认该文献或材料是已知的或它包含的信息属于任何这些权利要求的优先权日里的公知常识的一部分。
在本文阐述的每个参考文献的披露通过引用以其全文并入本文。
通过以下实施例进一步说明本发明：
实施例
材料与方法
化学品
除非另有说明，否则标准实验室试剂以可获得的最高纯度得自(斯德海姆，德国)或Call Roth GmbH&Co.KG(卡尔斯鲁厄，德国)。pYES2表达载体购自Invitrogen(卡尔斯巴德，美国)。pESC-URA表达载体得自安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)(圣克拉拉，美国)。限制酶获取自赛默科技公司(Thermo Scientific)(圣莱昂腐，德国)。DifcoTM酵母氮源w/o氨基酸(YNB)、BactoTM胰蛋白胨和BactoTM酵母提取物得自BD公司(Becton Dickinson and Company)(施韦夏特，奥地利)。硫酸遗传霉素(G418)、潮霉素B和单硫酸卡那霉素订购自FormediumTM(诺福克，英国)。ZeocinTM购自InvivoGen(Eubio)(维也纳，奥地利)。无菌水购自费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)(格拉茨，奥地利)。萜类标准品由帝斯曼创新合成公司(DSM Innovative Synthesis B.V.)(赫伦，荷兰)供应。
1.1微生物，质粒和培养基
针对所有克隆步骤和质粒复制，使用来自生命技术公司(life technologies)(维也纳，奥地利)的E.coli Top10 F’(F′[lacIq Tn10(tetR)]mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)△lacX74 deoR nupG recA1 araD139(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endA1 λ-)。在BY4742(MATα、his3-1、leu2-0、lys2-0、ura3-0)或者在W303(MA Ta和MATα、ade2-1、trp1-1、can1-100、leu2-3，112、his3-11，15、ura3-1、GALs+)背景下构建S.cerevisiae菌株。BY4742及其单基因敲除菌株获得自EUROSCARF保藏中心(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/)。
在合成限定培养基(6.7g酵母氮基w/o氨基酸；1g由等量的腺嘌呤、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、亮氨酸和色氨酸组成的营养缺陷(drop-out)粉；2％葡萄糖)中培养S.cerevisiae菌株。将含有2％半乳糖和0.7％棉子糖取代2％葡萄糖的合成限定诱导培养基用于诱导。
使P.pastoris培养物在YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％葡萄糖)或者缓冲复合甘油培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾(pH 6.0)、1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甘油)中生长。BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾(pH 6.0)、1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甲醇)被用作诱导培养基。
表达载体的克隆和酵母菌株产生
在此项研究期间产生的菌株列表在表1中给出。将标准分子克隆技术用于菌株产生(Ausubel等人，2003)。针对基因扩增，根据推荐的PCR方案利用HighFidelity DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)，圣莱昂腐，德国)。手动设计HPO(H.muticus豆腐柴螺二烯加氧酶)、CPR(A.thaliana细胞色素P450还原酶)、和ValS(C.Nootkatensis萜烯合酶)的密码子经优化的基因变体并且购自(Wriessnegger等人，修订手稿)。
Saccharomyces cerevisiae
针对产生基于pYES2的共表达构建体，使用引物Fw_CPR_HindIII和Rv_CPR-myc_BamHI(表2)扩增CPR基因，用于HindIII/BamHI克隆进pYES2中。通过使用引物pYES2_AscI_fw和pYES2_BglII_rev引入BglII和AscI的限制位点对所得质粒进行修饰，并且通过与HPO-Flag表达盒连接进行再环化。后者如下构建：将用Fw_HPOSc_HindIII和Rv_HPO-Flag_Sc扩增的HPO-Flag片段HindIII/BamHI克隆进pYES2中，并且随后使用引物BglII_Gal1_fw和AscI_CYC1_rev扩增整个表达盒。通过整合用F1(ICE2)和R1(ICE2)引物从pFA6a-KanMX(Longtine等人，1998)扩增的kanMX盒实现ICE2的敲除。针对染色体His标记的Ice2p的表达，使用引物Fw(ICE2_XhoI)和Rv(ICE2-6His_XbaI)将ICE2(GenBank编号：NM_001179438.1)从S.cerevisiae W303的基因组DNA中扩增并XhoI/XbaI克隆进pYES2中。使用BglII_Gal1_fw和AscI_CYC1_rev引物扩增置于PGal1启动子和CYC1终止序列控制下的ICE2基因，并且经由BglII/AscI限制位点插入到pFA6a-TRP1(Longtine等人，1998)中。这个构建体充当模板，用于使用引物F1(ICE2start)和R1(ICE2)产生从内源启动子表达ICE2-His6的盒，或用于使用引物F1(ICE2)和R1(ICE2)产生从PGal1启动子过表达ICE2-His6的盒。两个表达盒都被整合到基因组ICE2基因座中。经由EcoRI和BamHI限制位点将密码子经优化的(+)-朱栾倍半萜合酶基因从递送载体亚克隆到pYES2中。将ValS整合盒用BglII_Gal1_fw和AscI_CYC1_rev引物进行扩增并BglII/AscI克隆到载体pFA6a-HIS3kanMX6(Longtine等人，1998)中。然后，使用引物F1(trp1)和R1(trp1)扩增ValS表达盒，并转化到酵母中。针对从PPGK1启动子过表达截短的HMG1，使用Fw(PPGK1_XmaI)和Rv(PPGK1_BamHI)引物从S.cerevisiae W303的基因组DNA扩增有待经由XmaI和BamHI限制位点插入到pFL36-LEU2(Bonneaud等人，1991)中的PGK1启动子区。使用引物Fw(tHMG1_PstI)和Rv(tHMG1_HindIII)从S.cerevisiae的基因组DNA中进行扩增缺乏其固醇感测结构域的截短的HMG1(GenBank编号：NM_001182434.1)，并经由PstI和HindlII位点克隆到pFL36-LEU2-PPGK1中。应用引物Fw(ex_leu2_tHMG1)和Rv(ex_leu2_tHMG1)扩增tHMG1表达盒，所述表达盒包括PPGK1启动子和用于整合到W303 leu2基因座中的LEU2选择标记物。遵循乙酸锂方法(Gietz和Schiestl，1995)进行质粒以及DNA盒的转化。在缺乏组氨酸、尿嘧啶或亮氨酸的合成限定板上或在含有300mg L-1遗传霉素的YPD板上对转化体进行选择(Botstein，D.，1982)。常规地通过菌落PCR确认盒正确地整合到特定基因座中(Kwiatkowski等人，1990)。针对产生三重敲入/敲除突变体，使菌株W303 MATa PPGK1-tHMG1 PGAL1-ValS与单突变体W303MATα 和W303MATα PGAL1-ICE2-6His配对，以产生孢子并解剖找到具有所有三个基因的单个孢子(Amberg等人，2006)。
通过应用Pichia pastoris密码子选择，手动设计以下基因的密码子经优化的基因变体：柠檬烯-3-羟化酶(PM17同种型，CYP71D13，天然基因的GenBank编号：AF124816)、人细胞色素P4502D6(天然基因的GenBank编号：NM_000106)和人细胞色素P450还原酶(天然基因的GenBank编号：NM_000941)(补充表1)。
通过将合成基因直接从递送的载体上切下，将经优化的hCPR用EcoRI和NotI克隆到pESC-URA中。之后，将CYP2D6用HindIII和BamHI克隆到pESC-URA-hCPR中。为了构建PM17和CPR的共表达载体，将CPR用Fw(CPR_NotI)和Rv(CPRmyc_BglII)进行扩增并克隆到pESC-URA中。将PM17用BamHI和HindIII从合成载体上切下并与pESC-URA-CPR连接。
Pichia pastoris
P.pastoris菌株CBS7435 his4(等人，2012)被用作分别构建菌株PpPM17/CPR和Pp2D6/hCPR的宿主菌株。菌株PpHCV的产生最近由Wriessnegger等人进行了详细描述(修订手稿)。
具有希望的用于克隆的EcoRI/NotI限制位点，并且在CYP450和CPR上分别具有C-末端FLAG-和myc-标签的、密码子经优化的PM17、2D6、CPR和hCPR基因购自(补充表S1)。针对产生P.pastoris PM17/AtCPR共表达载体，将AtCPR和PM17基因亚克隆到经EcoRI和NotI消化的表达载体pPpB1中，所述表达载体含有AOX1启动子的合成变体和用于选择的ZeocinTM抗性标记盒。将产生的pPpB1[CPR]载体用BglII和BamHI切割，以获得侧翼为AOX1启动子和终止子区的AtCPR基因。将经纯化的片段连接到经BamHI消化的载体pPpB1[PM17]中，以获得pPpB1[PM17/AtCPR]共表达载体。应用相同的策略来产生pPpB1[2D6/hCPR]共表达载体。通过对表达盒进行测序来检查表达载体，并且将其用BglII线性化，以便整合到P.pastoris的基因组中。
通过针对P.pastoris GS115基因组数据库对ScIce2蛋白序列进行blast来鉴定PpICE2(PAS_chr2-2_0195)。使用分别含有限制位点EcoRI和NotI的引物对FwPpICE2和RvPpICE2，从P.pastoris CBS7435的基因组DNA中扩增PpICE2，以便克隆到具有AOX1启动子和卡那霉素/遗传霉素选择盒的pPpKan表达载体中(表2)。用BglII将表达载体pPpKan[PpICE2]线性化之后，用于分别转化到共表达CYP/CPR的P.pastoris菌株PpHCV、PpPM17/AtCPR和Pp2D6/hCPR的基因组中。常规地，根据Lin-Cereghino的方案，用约2μg的线性化质粒转化感受态P.pastoris细胞。转化之后，将等分试样在含有100mg/L ZeocinTM或400mg/L遗传霉素的YPD板上铺板。
表1：在此项研究中使用的菌株
表2：在此项研究中使用的引物(限制位点已加下划线)
重组蛋白的表达
针对在S.cerevisiae中表达重组蛋白，将含有50mL合成限定生长培养基(6.7g酵母氮基w/o氨基酸；1g由等量的腺嘌呤、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、亮氨酸和色氨酸组成的营养缺陷粉；2％葡萄糖)的300mL带挡板摇瓶接种到OD600为0.1。将细胞悬浮液在130rpm和30℃下振荡48h。在1,062x g下离心5min之后，将细胞沉淀重悬于含有2％半乳糖和0.7％棉子糖代替2％葡萄糖的50mL合成限定诱导培养基中。在130rpm和30℃下进行6h诱导。
如先前描述的(Weis等人，2004)，在96-DWP中筛选随机选择的P.pastoris转化体。简言之，将细胞在28℃、320rpm和80％湿度下在250μL的BMGY培养基中培养24h。通过添加250μL的BMMY(2％甲醇)使诱导开始。每12h添加甲醇至最终浓度为1％，直到48h的诱导。将来自DWP的经培养的转化体印到含有多达2mg mL-1Zeocin TM的板上，用于筛选潜在的CYP/CPR多拷贝基因整合事件。挑选在高Zeocin浓度下生长的转化体，用于进一步的蛋白质印迹分析，以便检测Flag标记的CYP和myc标记的CPR蛋白。使用抗C-末端6xHis-标签(His6)抗体通过蛋白质印迹分析确定PpICE2的过表达。
SDS-PAGE/蛋白质印迹法(Fiii量化)
根据(Riezman等人，1983)收获并制备五个OD600单位的经诱导的S.cerevisiae或P.pastoris细胞用于SDS-PAGE。在NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen)上在还原条件下分离10μL的所得上清液，然后将其转移到湿印迹系统中的硝酸纤维素膜(GE医疗公司(GE Healthcare)，查尔方特圣吉尔斯，英国)上。通过对膜进行丽春红S染色来评价蛋白质加载。用可商购的兔抗-Flag、抗-myc或抗-多聚HIS一级抗体(赛默科技公司，圣莱昂腐，德国)，并用购自(斯德海姆，德国)的连接到马辣根过氧化物酶上的抗-兔(针对myc)或抗-小鼠(针对Flag和HIS)二级抗体进行免疫检测。通过Super Signal WestPico化学发光底物(赛默科技公司，圣莱昂腐，德国)使蛋白质印迹显影，并且使用G：BOXChemi HR16生物成像系统(Syngene，剑桥，英国)检测蛋白带。
用Fiji作为生物图像分析平台进行蛋白质印迹信号强度的量化(Schindelin等人，2012)。一式三份地加载样品，并且将对照菌株的HPO和CPR的平均信号强度设为100％。将其他信号强度相对于对照菌株的信号强度进行标准化。
定量RT-PCR
将300μL的经半乳糖诱导的细胞培养物收获在台式离心机中并按供应商(生命技术公司，维也纳，奥地利)推荐的量重悬于中。使用ZR Fungal/Bacterial RNAMiniPrepTM试剂盒(ZymoResearch，德国，弗赖堡)制备经纯化的RNA提取物。经由NanoDropNd2000(赛默科技公司，圣莱昂腐，德国)和溴化乙锭凝胶电泳确定RNA的质量和浓度。以2步程序进行qRT-PCR。如在反转录(RT)手册中描述的，将来自赛默科技公司(圣莱昂腐，德国)的Revert Aid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit施加到600ng的总RNA上。将反应混合物在25℃下孵育10min、在50℃下孵育15min，并且通过在85℃下加热5min使RT终止。针对定量PCR步骤，使用来自赛默科技公司(圣莱昂腐，德国)的Maxima SYBR Green PCR MM(2x)。然后，将2.5μL的cDNA模板溶液与12.5μL的Maxima SYBR Green qPCR Mix(2x，添加了ROX)混合，随后添加1μL的对应的正向和反向引物(qRT-标记的引物；表2)。已经在包括推荐指南的Primer3程序(frodo.wi.mit.edu)(Koressaar和Remm，2007；Untergasser等人，2012)的帮助下构建了引物。用无核酸酶水填充反应混合物至最终体积为25μL。进行无模板对照和减去反转录酶(RT-)的对照，并且其被测试为是杂质或污染物DNA阴性的。遵循两步循环方案，首先使混合物在95℃下变性10min，随后是在95℃下变性15s并在60℃下退火/延伸60s的40个循环。通过将观察值相对于管家基因CDC73进行标准化，基于ΔCt方法评估结果(Reed等人，1988)。
针对(+)-朱栾倍半萜、(-)-柠檬烯和丁呋洛尔转换的静息细胞测定
㈩-朱栾倍半萜和(-)-柠檬烯羟基化测定
针对用S.cerevisiae进行的生物转换，收获六百个OD600单位的经半乳糖诱导的细胞并将其重悬于2mL的50mM KPi缓冲液(pH 7.4)中。将细胞悬浮液在Pyrex管中分成两个相等的等分试样，并分别添加20μL的DMSO中的100mM(+)-朱栾倍半萜或300mM(-)-柠檬烯，以及1％的X-100(Amresco，索伦市，俄亥俄州)。将Pyrex管仅用螺丝帽松散地密封，以达到细胞空气供应与底物挥发之间的平衡。在170rpm和30℃下进行16h转换。在室温和最大速度下使用VXR basic(施陶芬，德国)用500μL的乙酸乙酯提取萜类持续30min。通过在2,720x g下离心15min分相之后，经由GC-MS验证有机层并且经由GC-FID量化有机层。
如所描述的(但是不添加正十二烷)，在摇瓶中培养共表达PM17/CPR/PpIce2的预选择的Pichia pastoris转化体。48h诱导之后，确定细胞培养物的OD600，并且将对应于300个OD600单位的培养物体积转移到无菌管中。使细胞在Eppendorf5810R离心机中以3220x g沉淀5min并弃去上清液。向细胞悬浮液中添加柠檬烯底物溶液(DMSO中的300mM(-)-柠檬烯、1％Triton X-100)至最终浓度为6mM。使反应在28℃下以170rpm进行24h。用500ul乙酸乙酯提取单萜，并通过GC-FID进行分析。
丁呋洛尔1’-羟基化测定
针对S.cerevisiae，完全如Geier等人(2012)描述的进行丁呋洛尔转换测定。
针对P.pastoris，如所描述的在96-DWP中培养转化体。48h诱导之后，在以3,220xg将DWP离心5min之后确定每个孔中培养物的OD600值。弃去上清液，并且将细胞沉淀重悬于100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中。向上清液中添加作为内标的泼尼松龙至最终浓度为50ng/μl。根据由(Geier等人，2012)描述的方法通过HPLC-MS测量反应混合物。
双相(+)-朱栾倍半萜合成和生物转化测定
修改Cankar等人(2011)的方案，以0.1的OD600开始，在100mL摇瓶中的50mL合成限定生长培养基中培养共表达HPO、CPR和ValS的S.cerevisiae细胞。在30℃和170rpm下振荡24h之后，向细胞悬浮液中添加1mL的诱导溶液(20％半乳糖和7％棉子糖)和1mL的补充溶液(即溶解于无菌ddH2O中的0.167g酵母氮基和25mg营养缺陷粉)。直接向烧瓶中添加五mL的正十二烷，以形成第二有机相。像之前一样将细胞培养24h，随后第二次添加各1mL的诱导和补充溶液。诱导细胞长达72h后，使正十二烷相经受GC-MS和GC-FID分析。将表达与PpIce2组合的ValS和HPO/CPR的P.pastoris菌株的培养在摇瓶中放大到50ml总体积。因此，使25mLBMGY培养基中的预培养物在28℃、140rpm下生长48h，随后以10％的最终浓度添加25ml含有2％甲醇和正十二烷的诱导培养基BMMY。如针对DWP培养所述进行诱导。48h诱导之后，将培养物转移到50mL塑料管中，以3220x g旋转5min，并且将有机层转移到GC小瓶中用于GC-FID分析。
细胞色素c还原酶测定
通过其还原牛心脏细胞色素c的能力估计CPR活性(Phillips和Langdon，1962)。
根据“Pichia Expression Kit”手册(生命技术公司，维也纳，奥地利)稍作修改，通过玻璃珠裂解制备P.pastoris和S.cerevisiae细胞裂解物。简言之，将细胞沉淀分别在含200μL的破碎缓冲液(50mM NaH2PO4(pH 7.4)、1mM PMSF、1mM EDTA、5％甘油)的1.5mL反应管中用相等体积的玻璃珠进行破坏。将细胞悬浮液间歇涡旋30s并在冰上孵育30s，将其重复10个循环。细胞破坏之后，将总细胞裂解物在台式离心机中以1500x g离心，以去除未破碎的细胞和细胞碎片。用牛血清白蛋白作为标准品，使用Bio-Rad(Bradford)蛋白质测定对细胞裂解物中的蛋白量进行量化。
将二十五μL的上清液与125μL的300μM细胞色素c溶液混合，并且以50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)补足至最终体积为650μL。向酵母制剂中添加五十μL的50mM KCN溶液(pH7.7)，以掩盖内源氧化酶活性。通过添加50μL的1.5mM NADPH使酶促反应开始。使用UV/VisDU800分光光度计(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，布雷亚，加利福尼亚)将550nm下的吸收增加记录2min。基于21mM-1cm-1的摩尔消光系数针对还原的细胞色素c计算还原酶活性(Phillips和Langdon，1962)。
通过GC-MS和GC-FID进行的产物分析
首先通过GC-MS分析有机溶剂(即乙酸乙酯以及正十二烷)中的萜类提取物，以便使用参比标准品并比较衍生的裂解质谱(derived mass fragmentation spectra)来鉴定化合物。在配备有5972系列质量选择检测器(MSD)的Hewlett-Packard 5890Series IIplus GC上使用30m HP柱(0.25mm x 0.25μm)。以32cm/s的恒定流速，用氦作为载气，在220℃注射器和280℃检测器温度下，以分流模式(分流比20∶1)注射1uL的样品等分试样。烘箱温度程序如下：70℃持续1min，以10℃/min斜升至200℃，并且以30℃/min斜升至290℃(2min)。以3.5次扫描/s并且在1635V的电子倍增器电压下在40-250amu的质量范围中操作MSD。
开发了GC-FID方法用于萜类样品的常规分析。因此，我们在配备有火焰离子化检测器(FID)的Hewlett-Packard 6890 GC上使用HP-5柱(交联5％Ph-Me硅氧烷；10m x0.10mm x 0.10 μm)。用氢作为载气并且将流速设为恒流模式(49cm/s线速度)0.4mL/min，在250℃注射器温度和320℃检测器温度下，以分流模式(分流比30∶1)注射1μL的样品等分试样。针对分析(+)-朱栾倍半萜及其产物，烘箱温度程序如下：100℃持续1min，以20℃/min斜升至250℃，并且以45℃/min斜升至280℃(0.5min)。使用高速/高分辨柱将总运行时间降至9min/样品，而没有色谱分离度的任何损失(Wriessnegger等人，修订手稿)。
针对分析(-)-柠檬烯和异薄荷烯醇，使用以下烘箱温度：40℃持续1min，以4℃/min斜升至90℃并且以30℃/min斜升至280℃(0.5min)。可以将总运行时间优化至22min/样品。
电子显微镜检查
如针对异源蛋白质的表达所描述的培养S.cerevisiae菌株。用半乳糖诱导6h之后，将细胞在Eppendorf5810R离心机中以2,500rpm收获5min，并且将细胞沉淀用蒸馏水洗涤。将细胞在室温下在1％水性KMnO4中固定5min，用蒸馏水洗涤，并在1％水性KMnO4中固定20min。将经固定的细胞在蒸馏水中洗涤四次，并且在4℃下在0.5％水性乙酸双氧铀中孵育过夜。将样品在分级系列的乙醇(50％、70％、90％、和100％)中各脱水20min。然后用环氧丙烷交换纯乙醇，并且将标本逐渐用递增浓度(30％、50％、70％和100％)的与环氧丙烷混合的Agar 100环氧树脂浸润，每个步骤持续最少3h。将样品包埋在纯的、新鲜的Agar 100环氧树脂中，并在60℃下聚合48h。将80nm的超薄切片用柠檬酸铅染色3min并用Philips CM 10透射电子显微镜进行观察。
实施例1：在重组S.cerevisiae菌株中筛选CYP/CPR功能的效应物
(+)-朱栾倍半萜是橙汁生产的副产物并且具有低商业意义。然而，对通过各种生物催化途径将(+)-朱栾倍半萜转换成具吸引力的风味和香味化合物(+)-圆柚酮进行了许多尝试(由(Fraatz等人，2009)进行综述)。作为高度立体选择性和区域选择性催化剂，已经对可溶且膜附着的细胞色素P450酶(CYP)进行了测试来进行该反应(Cankar等人，2011；Gavira等人，2013；Girhard等人，2009；Takahashi等人，2007)。有坚实的数据强调，CYP的确羟基化(+)-朱栾倍半萜以产生益智醇(图1)，但是后一化合物向圆柚酮的氧化通过S.cerevisiae(Gavira等人，2013)或Pichia pastoris(Wriessnegger等人，修订手稿)的内源活性进行。CYP的重要特征是它们对再生有催化活性的CYP的细胞色素P450还原酶(CPR)活性的需要。有报道表明，在异源表达此类CYP/CPR对时，膜相关CYP和CPR的相互稳定化需要平衡的化学计量(由(Gonzalez和Korzekwa，1995)(Murakami等人，1986)(Geier等人，2012)进行综述)。检索CYP/CPR功能的蛋白效应物，在S.cerevisiae中从多拷贝载体(pYES2-HPO-CPR)功能性地共表达Hyoscyamus muticus豆腐柴螺二烯加氧酶(HPO)变体V482I A484I(Takahashi等人，2007)和Arabidopsis thaliana细胞色素P450还原酶(CPR)。如从文献中的数据所预期的，重组酵母菌株进行(+)-朱栾倍半萜羟基化(图1B)。通过GC-MS验证化合物(图2)。从单个载体共表达HPO/CPR使得我们能够针对HPO/CPR水平和活性的效应蛋白来筛选可用的酵母保藏。将所选择的EUROSCARF保藏的单敲除突变体用pYES2-HPO-CPR质粒进行转化并且在静息细胞测定中针对改变的(+)-朱栾倍半萜转换对其进行测试。大部分转化体显示出与参比菌株BY4742pYES2-HPO-CPR不可区别的转换率(数据未示出)。在静息细胞测定中外加(+)-朱栾倍半萜的巨大缺陷是(+)-朱栾倍半萜在水性环境中的高挥发性。20h转换之后，仅有20％的最初添加的(+)-朱栾倍半萜可从具有空pYES2载体的对照细胞中提取出(图1B)。因为在GC-MS中未检测到(+)-朱栾倍半萜羟基化的副产物，损失归因于蒸发。在等效实验中，在30℃下振荡20h内仅有30％的添加的反式-益智醇蒸发(数据未示出)。常规地通过蛋白质印迹法检查经半乳糖诱导的细胞的等分试样的HPO(53kDa)和CPR(72kDa)水平。因此，观察到CPR-myc在BY4742Δice2中似乎被部分地降解，这在所评估的大部分其他单敲除菌株中并未观察到(图1C并且数据未示出)。然而，与参比菌株相比，在BY4742Δice2中借助HPO/CPR活性的反式-益智醇形成并不显著不同(图1B)。
实施例2：ICE2在S.cerevisiae W303中的过表达
在用于CYP/CPR表达和CYP介导的生物转换的各种S.cerevisiae宿主菌株中，特别是W303菌株被证明是最适用的宿主(Loeper等人，1998；Pompon等人，1996；Truan等人，1993；Urban等人，1994)。S.cerevisiae的许多标准品实验室菌株而非W303菌株在HAP1基因中携带缺失。Haplp是转录因子，负责响应于可用氧水平的变化调节控制胞内血红素丰度的基因(B.S.J.Davies和Jasper Rine，2006；Ihrig等人，2010)。据称Δhap1基因型菌株对CYP表达和功能不太有利，因为这些菌株强烈依赖于最佳血红素和氧供应。为了测试宿主菌株效应，在具有pYES-HPO-CPR的BY4742和W303酵母菌株中平行地进行HPO/CPR介导的静息细胞(+)-朱栾倍半萜转换。如所预期的，与200ng反式-益智醇/μL乙酸乙酯的BY4742菌株背景中的相比(图1B)，在W303菌株背景中(+)-朱栾倍半萜转换水平明显更高-产生400ng反式-益智醇/μL乙酸乙酯(图3B)。在两个菌株背景中，与对应的参比菌株相比，Δice2的敲除并不显著影响(+)-朱栾倍半萜向反式-益智醇的转换。由于(+)-朱栾倍半萜转换在W303菌株背景中实质上更有效，所以进一步的努力集中在此宿主菌株上。
被Δice2敲除菌株中观察到的CPR-myc的降解产物(图1C)所触发，产生从插入到ICE2之前的PGAL1启动子表达ICE2的菌株，并且使用该工程化的菌株，针对HPO/CPR表达和(+)-朱栾倍半萜转换进行测试，所述HPO/CPR表达和(+)-朱栾倍半萜转换理想地受控于相同的启动子元件。有趣地，从PGAL1表达ICE2使得(+)-朱栾倍半萜转换独立于宿主菌株背景改进了1.4倍(图1B和图3B)。Ice2表达水平的操纵并不显著影响细胞生长特性，因为在没有用半乳糖/棉子糖诱导和在用半乳糖/棉子糖诱导时所有菌株生长至几乎相同的光密度(数据未示出)。为了在mRNA水平上量化HPO、CPR和ICE2的表达，在具有经调节的Ice2表达的所有菌株上进行实时定量PCR。6h半乳糖/棉子糖诱导之后提取RNA，并且相对于每个样品中的管家基因CDC73进行标准化。ICE2在野生型细胞中似乎以低水平被表达(图3A)，这与认定在YPD中606个Ice2p分子/细胞的总数以指数方式生长的先前研究一致(Ghaemmaghami等人，2003)。在同一研究中，在相同的培养条件下预测到538个CDC73分子，并且为了给出与另一ER-跨膜蛋白的比较，发现了24,800个Sec61p分子。与具有在其自身启动子控制下的ICE2的菌株相比，从PGAL1启动子表达ICE2使得该基因上调100倍(图3A)。有趣地，HPO和CPR的mRNA水平在很大程度上独立于Ice2调节。因此，针对W303PGAL1-ICE2 pYES2-HPO-CPR菌株观察到的增强的(+)-朱栾倍半萜生物羟基化可能确实是由升高的Ice2表达对HPO/CPR蛋白水平和/或活性的转录后效应引起的。
实施例3：(+)-朱栾倍半萜在S.cerevisiae中的体内生物转换
在静息细胞中评价HPO/CPR驱动的(+)-朱栾倍半萜羟基化并量化PGAL1-ICE2表达对它的作用受制于一个重要的不确定因素，即(+)-朱栾倍半萜底物的可获得性。不仅需要将萜烯在水性环境中的蒸发考虑在内(图1B和图3B)，还需要将进出S.cerevisiae细胞的不同转运过程考虑在内。对于纯的碳氢化合物如(+)-朱栾倍半萜，酵母的质膜不应设置进入酵母细胞的严格屏障。然而，针对S.cerevisiae描述了大量输出机制，其从细胞内部有效地排出疏水化合物，例如各种的ABC转运体(Nishida等人，2013)(由(Wawrzycka，2011)进行综述)、Pry蛋白(Choudhary和Schneiter，2012)(由(Jacquier和Schneiter，2012)进行综述)等。因此，静息细胞测定中的胞内(+)-朱栾倍半萜浓度(即HPO/CPR介导的生物转化的底物池)受到可能超出实验者控制的多种因素的影响。这种情况显然会导致在静息细胞测定中相对较高的标准差(图1B和图3B)。此外，细胞工程(例如像ICE2的过表达)可能对跨酵母质膜的(+)-朱栾倍半萜转运平衡有影响，并且因此对该化合物的胞内可获得性有影响。为了避免这些不确定性，产生了从FPP胞内地产生(+)-朱栾倍半萜的菌株。与公开的著作(Beekwilder等人，2013)相反，在S.cerevisiae中从C.nootkatensis表达序列经优化的朱栾倍半萜合酶(ValS)需要共表达截短的Hmg1。表达ValS而不伴随tHMG1的过表达的菌株生长极慢，这可能由于大量的FPP从麦角固醇生物合成中退出(Parks等人，1995；Song，2003)。首先根据由Cankar等人(2011)描述的方案培养共表达ValS、tHMG1、HPO和CPR的细胞，但是这些条件下的细胞生长相当差。将条件调整为在50mL含葡萄糖的培养基中将细胞预培养24h，随后经由向摇瓶中直接添加半乳糖/棉子糖诱导24-72h。与诱导同时用10％正十二烷覆盖细胞培养液截留了在生物转化期间形成的所有萜类。因此，W303 tHMG1 ValS pYES2-HPO-CPR菌株大致产生了20mg的反式-益智醇/升的培养液(图4)。值得注意地，当从PGAL1启动子表达Ice2p-His6时反式-益智醇的产生增加了约50％，对W303 tHMG1 ValS PGAL1-ICE2pYES2-HPO-CPR菌株而言在72h诱导之后的最大生产力为30mg反式-益智醇/升细胞培养物。另一方面，与参比菌株相比，敲除ICE2并不影响形成的萜类的量(图4)。因此，ICE2表达的调节对外加底物的静息细胞中的(图3)和在体内产生该底物的细胞中的(图4)HPO/CPR介导的(+)-朱栾倍半萜羟基化的确具有等同的作用。这些结果强调，Ice2过表达对HPO/CPR功能的有益作用不是由于改变了(+)-朱栾倍半萜底物的生物利用度，而是更可能由于改变了HPO/CPR酶活性。
实施例4：ICE2过表达稳定化CPR水平和活性
在更详细地表征ICE2过表达作用的尝试中，产生从其内源启动子或从PGAL1表达Ice2p-His6且共表达HPO/CPR、ValS和tHMG1的菌株。使这些菌株经受时程生物转化研究，除通过GC量化萜类形成之外还通过蛋白质印迹法比较HPO-Flag、CPR-myc和Ice2p-His6水平(图5)。取自半乳糖/棉子糖诱导24h、48h和72h之后的正十二烷相的样品揭示到，对于前48h的生物转换而言，在不同之处为Ice2p-His6表达的菌株之间仅存在很小的反式-益智醇生产力差异(≤10％)(图5A)。然而，72h生物转换之后，从半乳糖诱导型启动子表达Ice2p-His6的菌株形成了300ng反式-益智醇μL-1正十二烷(相当于30mg L-1的酵母培养物)，比由从其天然启动子表达Ice2p-His6的菌株产生的220ng反式-益智醇μL-1正十二烷多约40％。蛋白质印迹分析显示，在每个时间点PGAL1驱动的ICE2过表达不仅在mRNA水平上可检测到(图3A)，并且还被翻译成更高的蛋白质水平(图5C)。在天然启动子控制下的Ice2-His6信号在24h样品中几乎检测不到，并且在稍后的时间点进一步减少。然而，当从半乳糖诱导型启动子表达该蛋白质时，Ice2p-His6水平高得多，在72h样品中略有下降。最有趣地，在表达较高水平的Ice2p-His6的菌株中的72h生物转换后，HPO-Flag特别是CPR-myc蛋白水平明显更稳定(图5B)。可合理地假设，PGAL1驱动的Ice2p-His6表达通过稳定化CPR水平来增强(+)-朱栾倍半萜生物转换，因为HPO作用需要CPR来再生。因此，具有升高水平的Ice2p-His6和可检测量的CPR-myc的菌株将具有进一步羟基化的(+)-朱栾倍半萜直至转换72h，与在最后时间点基本上缺少CPR-myc蛋白的菌株相反。用Fiii程序通过光密度扫描来量化HPO/CPR蛋白水平(Schindelin等人，2012)。然而，HPO/CPR蛋白水平可能并不代表(+)-朱栾倍半萜的特异性羟基化所需的HPO/CPR活性。遗憾地，由于在全细胞和细胞匀浆中的信号强度较低，HPO的活性级分无法通过CO-差分光谱法表征(Omura，T.，Sato，1964)。然而，使用细胞色素c还原酶测定，在生物转换的不同时间点量化了细胞色素P450还原酶的活性。CPR活性的评估是基于被氧化的细胞色素c的还原以及在550nm下检测被还原的细胞色素(Phillips和Langdon，1962)。相对于W303和PGAL1-ICE2-6His菌株，发现不共表达HPO和CPR的参比菌株(即菌株PICE2-ICE2-His6(evc)和PGAL1-ICE2-His6(evc))分别具有0.030±0.004U/mg总蛋白和0.042±0.007U/mg总蛋白的背景还原酶活性(图5D)。这很好地符合针对W303菌株所报告的值(Geier等人，2012)。在减去背景活性值后，意识到在24h的萜类生物转换实验时CPR活性几乎独立于ICE2表达，但是48h半乳糖/棉子糖诱导之后在低Ice2p水平下强烈下降。虽然从诱导型启动子过表达Ice2在72h的测定时间中稳定化了≥75％的CPR活性，但是在从其天然启动子表达ICE2的菌株中检测不到CPR活性(图5D)。这些值非常好地对应于通过蛋白质印迹法检测到的CPR-myc水平(图5C)。因此，这提出ICE2过表达对基于HPO/CPR的(+)-朱栾倍半萜羟基化的正面影响(至少在很大程度上)是由体内萜类形成期间CPR活性的稳定化介导的。
在报道ice2被破坏的S.cerevisiae细胞中细胞ER膜分布改变的先前研究(Estrada De Martin，Du，Novick&Ferro-Novick，2005；Tavassoli等人，2013)的基础上，生成了工程化菌株的电子显微镜检查图片(图6)。通常，膜蛋白的过表达导致分级ER-膜(又称karmellae)的形成(Wright等人，1988)。针对过表达HPO和CPR的W303野生型、Δice2和PGAL1-ICE2菌株观察到了相同的效应(图6)。如所预期的，ice2的敲除的确略微减少外周ER膜的量(图6B)，尽管这种效应不如Tavassoli等人(2013)所示出的明显，后者呈现了ice2scs2双敲除突变体的电子显微镜检查图片。有趣地，ICE2的过表达的确导致了与酵母质膜靠近的ER膜中的显著增加(图6C)。
实施例5：ICE2过表达对CPR稳定性的普遍作用
为了测试CPR水平和/或活性的稳定化是否是ICE2过表达在S.cerevisiae和其他酵母表达宿主中的普遍作用，将分析扩展到作为表达宿主的S.cerevisiae和P.pastoris中的替代性CYP/CPR组合。
作为替代性CYP/CPR组合，我们选择了来自Mentha piperita的(-)-柠檬烯-3-羟化酶(PM17)与CPR以及人细胞色素P450 2D6(CYP2D6)与人还原酶(hCPR)。PM17和CPR催化单萜(-)-柠檬烯向(-)-反式-异薄荷烯醇的转换(Karp等人，1990；Lupien等人，1995)。CYP2D6和hCPR在人类肝脏中作为药物的主要解毒剂起作用(Zhuge等人，2004)，并且因此将模式底物丁呋洛尔羟基化成1-羟基丁呋洛尔(Geier等人，2012)。
在S.cerevisiae中，无法通过过表达ICE2来增加(-)-柠檬烯转换(图8A)，然而丁呋洛尔的转换可以被改进1.5倍(图8B)。蛋白质印迹分析并未揭示HPO和CPR水平的任何菌株依赖性改变(图8C)。相比之下，Ice2共表达菌株中的CPR活性分析示出了对更长诱导时间内的稳定性的巨大作用(表3)。6h诱导之后，如果在Ice2共表达菌株中被表达，还原酶显示出持续更高的活性。如果细胞被诱导长达24h，这种作用甚至更显著，其中在具有Ice2p的菌株中还原酶活性可以被稳定化多达4倍(表3)。
表3：S.cerevisiae和P.pastoris中的CYP/CPR对的还原酶活性(以Umg-1总蛋白 计)。S.cerevisiae静息细胞被诱导6h，这是静息细胞测定建立时的时间点。将诱导延长至 24h用于分析还原酶活性。P.pastoris菌株被诱导48h并且取样用于细胞色素c还原酶活性 测定。
通过Wriessnegger等人(修订手稿)构建产生(+)-朱栾倍半萜、反式-益智醇和(+)-圆柚酮的P.pastoris菌株。PpICE2的共表达既无法改进萜类的产量(图7A)，又无法检测对CPR和HPO水平的作用(图7B)。
Pichia pastoris在转换(-)-柠檬烯中有一些麻烦，尽管PM17和CPR表达得非常好(图8D和F)。有不同研究已经描述了(-)-柠檬烯的毒效应(Brennan等人，2013；Liu等人，2013)。我们假设，P.pastoris可能比S.cerevisiae具有更有效的机制来处理有毒物质如单萜(自有的未公开的结果)。然而，如果共表达PpICE2，仅检测到(-)-柠檬烯的转换(图8D)。PpIce2p可以将丁呋洛尔的转换改进2.5倍(图8E)。有趣地，48h诱导之后，我们在所有三个P.pastoris共表达系统中都观察到了较高的还原酶活性(表3)。通过两种不同的酵母表达宿主S.cerevisiae和P.pastoris，我们可以证明ICE2的过表达改进了每种菌株的三分之二底物的转换。在测试的所有系统中，细胞色素P450还原酶的显著稳定化可以被证实，证明了Ice2p对还原酶稳定化的普遍有效性。
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atg acc agt ttg tcc aaa agc ttc atg cag agt gga cga atc tgc gca 48
Met Thr Ser Leu Ser Lys Ser Phe Met Gln Ser Gly Arg Ile Cys Ala
1 5 10 15
gca tgt ttc tat ctg tta ttc aca cta ctt tca att cca atc tcg ttt 96
Ala Cys Phe Tyr Leu Leu Phe Thr Leu Leu Ser Ile Pro Ile Ser Phe
20 25 30
aaa gtt ggt ggt ttg gaa tgc ggg ctt tcc ttc acg gtg aca ctg ttc 144
Lys Val Gly Gly Leu Glu Cys Gly Leu Ser Phe Thr Val Thr Leu Phe
35 40 45
act tta tat ttc ata act acg act ctt aac gtg ttg gca aga cga cat 192
Thr Leu Tyr Phe Ile Thr Thr Thr Leu Asn Val Leu Ala Arg Arg His
50 55 60
gga gga aga cta tac att ttt ttt acc aac tgt ctg tat tac tca caa 240
Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Phe Phe Thr Asn Cys Leu Tyr Tyr Ser Gln
65 70 75 80
cat ttt atc att gca tct ttg cta tac ctg ttt ttg tct gga ttt tct 288
His Phe Ile Ile Ala Ser Leu Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Gly Phe Ser
85 90 95
aat gat gag ttg gga aac gtt ctg aaa aat aaa tat aat gag tcg gag 336
Asn Asp Glu Leu Gly Asn Val Leu Lys Asn Lys Tyr Asn Glu Ser Glu
100 105 110
tcg ttc ctg gaa gct ttg aaa aat agc ttg aat tcc aat caa att aac 384
Ser Phe Leu Glu Ala Leu Lys Asn Ser Leu Asn Ser Asn Gln Ile Asn
115 120 125
tac gtc tta tat tat tac tac tat cga ttt gtt gta caa ccg tgg caa 432
Tyr Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Phe Val Val Gln Pro Trp Gln
130 135 140
ttc gtg ctt acc aag tcc aca cct ttt ttt act cta tcg gaa ggt ttt 480
Phe Val Leu Thr Lys Ser Thr Pro Phe Phe Thr Leu Ser Glu Gly Phe
145 150 155 160
ttc act att tta gcc att cag gcc gtc ggg gaa act aat aga tgg tta 528
Phe Thr Ile Leu Ala Ile Gln Ala Val Gly Glu Thr Asn Arg Trp Leu
165 170 175
tca aat gac ttg aat tca aac acg tgg att att tcc tca ttg tta acc 576
Ser Asn Asp Leu Asn Ser Asn Thr Trp Ile Ile Ser Ser Leu Leu Thr
180 185 190
tcc gga ggt gtg att acc gca tcg ctg tac tat ttg tat cgg att tat 624
Ser Gly Gly Val Ile Thr Ala Ser Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Ile Tyr
195 200 205
gtc acc ccc ata tgg ccg tta tcc atc caa acg gcg tcc tta tta gga 672
Val Thr Pro Ile Trp Pro Leu Ser Ile Gln Thr Ala Ser Leu Leu Gly
210 215 220
ctt gtt ttg tct atg gta tgt gga ctg ggg ttg tat ggt att gtg agt 720
Leu Val Leu Ser Met Val Cys Gly Leu Gly Leu Tyr Gly Ile Val Ser
225 230 235 240
caa aaa gga tcc gtc ata gag agc tct tta ttt ttt gcg tat att gtt 768
Gln Lys Gly Ser Val Ile Glu Ser Ser Leu Phe Phe Ala Tyr Ile Val
245 250 255
cgt tgt att tat gaa att tcc ccc aaa tta gct act acc gcg act gat 816
Arg Cys Ile Tyr Glu Ile Ser Pro Lys Leu Ala Thr Thr Ala Thr Asp
260 265 270
gaa att tta aat ttg ttc aaa gac gtc tgg cag aaa cat caa aga aat 864
Glu Ile Leu Asn Leu Phe Lys Asp Val Trp Gln Lys His Gln Arg Asn
275 280 285
ctg ccc aca gct gac aat ctt ttg tgc tac ttt cat aat gtc ata ttg 912
Leu Pro Thr Ala Asp Asn Leu Leu Cys Tyr Phe His Asn Val Ile Leu
290 295 300
aaa aat gca gag gtg tta tgg ggg tcc ttt att cct aga gga aga aag 960
Lys Asn Ala Glu Val Leu Trp Gly Ser Phe Ile Pro Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
aaa acc ggt gat ttt cat gat aaa ctc att agc att cta tca ttc gaa 1008
Lys Thr Gly Asp Phe His Asp Lys Leu Ile Ser Ile Leu Ser Phe Glu
325 330 335
aaa gta tcc ttg ata tct aaa cca ttt tgg aaa ttt ttc aag aat ttc 1056
Lys Val Ser Leu Ile Ser Lys Pro Phe Trp Lys Phe Phe Lys Asn Phe
340 345 350
acc ttt agt gtt ccg cta tcc att aat gaa ttt tgt caa gtt aca att 1104
Thr Phe Ser Val Pro Leu Ser Ile Asn Glu Phe Cys Gln Val Thr Ile
355 360 365
aag atg gca agc gaa tca gtt tcc cca gct ata gta atc aat tta tgc 1152
Lys Met Ala Ser Glu Ser Val Ser Pro Ala Ile Val Ile Asn Leu Cys
370 375 380
ttt aga gtt ctg atg ttt tac tcg gca acg agg att att cca gca tta 1200
Phe Arg Val Leu Met Phe Tyr Ser Ala Thr Arg Ile Ile Pro Ala Leu
385 390 395 400
caa aga aaa aat gac aaa cag ttg cgc aag agt cgc agg atc atg aag 1248
Gln Arg Lys Asn Asp Lys Gln Leu Arg Lys Ser Arg Arg Ile Met Lys
405 410 415
gga ttg tat tgg tac agt cct tgc ata tta att gct atg tat act cac 1296
Gly Leu Tyr Trp Tyr Ser Pro Cys Ile Leu Ile Ala Met Tyr Thr His
420 425 430
ctg att tta caa tat tca ggt gag cta aag aaa gac ctg tgc ata tgg 1344
Leu Ile Leu Gln Tyr Ser Gly Glu Leu Lys Lys Asp Leu Cys Ile Trp
435 440 445
ggt tgc agt gaa aag tgg ttt ggc gta gat caa cca gaa att ata gta 1392
Gly Cys Ser Glu Lys Trp Phe Gly Val Asp Gln Pro Glu Ile Ile Val
450 455 460
gat tca tgg gga ttt tgg aac tgg tgc aac att ttc tgt act att ttg 1440
Asp Ser Trp Gly Phe Trp Asn Trp Cys Asn Ile Phe Cys Thr Ile Leu
465 470 475 480
gta tac gct aca gaa tta ata ggt tct ggt agt tga 1476
Val Tyr Ala Thr Glu Leu Ile Gly Ser Gly Ser
485 490
<210> 2
<211> 491
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
Met Thr Ser Leu Ser Lys Ser Phe Met Gln Ser Gly Arg Ile Cys Ala
1 5 10 15
Ala Cys Phe Tyr Leu Leu Phe Thr Leu Leu Ser Ile Pro Ile Ser Phe
20 25 30
Lys Val Gly Gly Leu Glu Cys Gly Leu Ser Phe Thr Val Thr Leu Phe
35 40 45
Thr Leu Tyr Phe Ile Thr Thr Thr Leu Asn Val Leu Ala Arg Arg His
50 55 60
Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Phe Phe Thr Asn Cys Leu Tyr Tyr Ser Gln
65 70 75 80
His Phe Ile Ile Ala Ser Leu Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Gly Phe Ser
85 90 95
Asn Asp Glu Leu Gly Asn Val Leu Lys Asn Lys Tyr Asn Glu Ser Glu
100 105 110
Ser Phe Leu Glu Ala Leu Lys Asn Ser Leu Asn Ser Asn Gln Ile Asn
115 120 125
Tyr Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Phe Val Val Gln Pro Trp Gln
130 135 140
Phe Val Leu Thr Lys Ser Thr Pro Phe Phe Thr Leu Ser Glu Gly Phe
145 150 155 160
Phe Thr Ile Leu Ala Ile Gln Ala Val Gly Glu Thr Asn Arg Trp Leu
165 170 175
Ser Asn Asp Leu Asn Ser Asn Thr Trp Ile Ile Ser Ser Leu Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Gly Val Ile Thr Ala Ser Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Ile Tyr
195 200 205
Val Thr Pro Ile Trp Pro Leu Ser Ile Gln Thr Ala Ser Leu Leu Gly
210 215 220
Leu Val Leu Ser Met Val Cys Gly Leu Gly Leu Tyr Gly Ile Val Ser
225 230 235 240
Gln Lys Gly Ser Val Ile Glu Ser Ser Leu Phe Phe Ala Tyr Ile Val
245 250 255
Arg Cys Ile Tyr Glu Ile Ser Pro Lys Leu Ala Thr Thr Ala Thr Asp
260 265 270
Glu Ile Leu Asn Leu Phe Lys Asp Val Trp Gln Lys His Gln Arg Asn
275 280 285
Leu Pro Thr Ala Asp Asn Leu Leu Cys Tyr Phe His Asn Val Ile Leu
290 295 300
Lys Asn Ala Glu Val Leu Trp Gly Ser Phe Ile Pro Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Thr Gly Asp Phe His Asp Lys Leu Ile Ser Ile Leu Ser Phe Glu
325 330 335
Lys Val Ser Leu Ile Ser Lys Pro Phe Trp Lys Phe Phe Lys Asn Phe
340 345 350
Thr Phe Ser Val Pro Leu Ser Ile Asn Glu Phe Cys Gln Val Thr Ile
355 360 365
Lys Met Ala Ser Glu Ser Val Ser Pro Ala Ile Val Ile Asn Leu Cys
370 375 380
Phe Arg Val Leu Met Phe Tyr Ser Ala Thr Arg Ile Ile Pro Ala Leu
385 390 395 400
Gln Arg Lys Asn Asp Lys Gln Leu Arg Lys Ser Arg Arg Ile Met Lys
405 410 415
Gly Leu Tyr Trp Tyr Ser Pro Cys Ile Leu Ile Ala Met Tyr Thr His
420 425 430
Leu Ile Leu Gln Tyr Ser Gly Glu Leu Lys Lys Asp Leu Cys Ile Trp
435 440 445
Gly Cys Ser Glu Lys Trp Phe Gly Val Asp Gln Pro Glu Ile Ile Val
450 455 460
Asp Ser Trp Gly Phe Trp Asn Trp Cys Asn Ile Phe Cys Thr Ile Leu
465 470 475 480
Val Tyr Ala Thr Glu Leu Ile Gly Ser Gly Ser
485 490
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw_CPR_HindIII
<400> 3
cccaagcttc gaaacgcata tgacttctg 29
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv_CPR-myc_BamHI
<400> 4
cgcggatcct tattacaaat cctcttcaga aatcaatttt tgttcccaga catctctcaa 60
gtatctacc 69
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: pYES2_AscI_fw
<400> 5
ttggcgcgcc ttaattaaac ggattagaag ccgccgag 38
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: pYES2_BglII_rev
<400> 6
ttagatctgg cgcgcccgat tcattaatgc agggcc 36
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw_HPOSc_HindIII
<400> 7
cccaagcttc gaaacgcata tgcaattct 29
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv_HPO-Flag_Sc
<400> 8
cgcggatccc tcgagttatt acttatcgtc gtcatccttg taatcctctc gggaaggttg 60
gtaa 64
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: BglII_Gal1_fw
<400> 9
ttggcgcgcc ttaattaaac ggattagaag ccgccgag 38
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: AscI_CYC1_rev
<400> 10
ttagatctgg cgcgcccgat tcattaatgc agggcc 36
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: F1(trp1)
<400> 11
gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt cggatccccg ggttaattaa 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: R1(trp1)
<400> 12
tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac gaattcgagc tcgtttaaac 60
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(PPGK1_XmaI)
<400> 13
gtacccgggg attattttag attcctgact tc 32
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物:Rv(PPGK1_BamHI)
<400> 14
tatggatcct cttgttttta tatttgttgt aaa 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(tHMG1_PstI)
<400> 15
gacctgcagg caccctgcag accaattggt gaaaactg 38
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(tHMG1_ HindIII)
<400> 16
tgcaagcttg gcctaacaca tggtgctgtt gtgctt 36
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(ex_leu2_tHMG1)
<400> 17
agcaatatat atatatatat ttcaaggata taccattcta tgtaaaacga cggccagt 58
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(ex_leu2_tHMG1)
<400> 18
taaagtttat gtacaaatat cataaaaaaa gagaatcttt ccgattcatt aatgcagc 58
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: F4 (ICE2)
<400> 19
cgtaaagtgt tggtggatct tatagtattc gtgaagaatt cgagctcgtt taaac 55
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: R2 (ICE2)
<400> 20
ctgcatgaag cttttggaca aactggtcat tttgagatcc gggtttt 47
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: F1 (ICE2)
<400> 21
gtggccgatc acgctaaaga ttaggcaacg cggatccccg ggttaattaa 50
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: R1 (ICE2)
<400> 22
gtatttcacc ttcctttttg tcttcgcgta tttggcaaag gaattcgagc tcgtttaaac 60
<210> 23
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: F1 (ICE2start)
<400> 23
agagaggtgc tgtttgtggc cgatcacgct aaagattagg caacgatgac cagtttgtcc 60
aaaag 65
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(CDC73_qRT)
<400> 24
gaaaggcgag acatccgata 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(CDC73_qRT)
<400> 25
ttgtttccac cacaactgga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(HPO_qRT)
<400> 26
acattgcgtt ttgcccttac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(HPO_qRT)
<400> 27
gcaacacttc atcgcgtcta 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(CPR_qRT)
<400> 28
ggttgctggt ttcgttgtct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(CPR_qRT)
<400> 29
acccaagtcc aagtcgtcat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(ICE2_qRT)
<400> 30
cgtctggcag aaacatcaaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(ICE2_qRT)
<400> 31
aaggaccccc ataacacctc 20
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Fw(CPR_NotI)
<400> 32
cctcactaaa gggcggccgc aacaaaatga cttctgcttt gtacgc 46
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: Rv(CPRmyc_BglII)
<400> 33
ttaattaaga gctcagatct ttattaccag acatctctca 40
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: FwIce2Pp
<400> 34
cggaattccg aaacgatgcc caagatacgc tcc 33
<210> 35
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物: RvIce2Pp
<400> 35
ataagaatgc ggccgcttag tgatggtgat ggtggtgtgt ctcccaatta ctagtcaaat 60
tatc 64

Claims (12)

1.一种重组宿主细胞，其能够表达细胞色素P450酶(CYP)和细胞色素P450还原酶(CPR)并且其能够过表达包含SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或与其具有至少50％序列一致性的序列的Ice2p。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中该CYP是来自Hyoscymaus muticus的豆腐柴螺二烯加氧酶CYP71D55(HPO)，任选地已经在其中进行了突变V482I和A484I，来自Menthapiperita的(-)-柠檬烯-3-羟化酶(PM17)或人细胞色素P4502D6(CYP2D6)。
3.根据权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中该CRP是来自A.thaliana的细胞色素P450还原酶或人还原酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其能够产生感兴趣的化合物。
5.根据权利要求4所述的重组宿主细胞，其中该感兴趣的化合物是固醇、甜菊糖苷、反式-益智醇或圆柚酮。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其是真核细胞，优选真菌细胞，更优选选自下组的酵母细胞，该组由以下各项组成：Candida、Hansenula、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、或Yarrowia菌株，或选自下组的丝状真菌细胞，该组由属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma的种的丝状真菌细胞组成。
8.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其是原核细胞，优选细菌细胞，更优选属于Bacillus、Escherichia、Pseudomonas、Lactobacillus属的细菌细胞。
9.一种用于在重组宿主细胞中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述权利要求中任一项所述的能够表达感兴趣的化合物的重组宿主细胞；
在适于产生该感兴趣的化合物的条件下培养该重组宿主细胞；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
10.一种用于在生物催化反应中产生感兴趣的化合物的方法，该方法包括：
提供根据前述权利要求中任一项所述的能够产生感兴趣的CYP和CPR的重组宿主细胞；
在适于产生CYP和CPR的条件下培养该重组宿主细胞；
通过使适合的底物与该重组宿主细胞或由其衍生的生物催化剂制剂接触将该底物转换成感兴趣的化合物；并且，任选地
回收该感兴趣的化合物。
11.根据权利要求9或10所述的方法，用于将朱栾倍半萜转换成反式-圆柚酮和/或用于在反式-圆柚酮向圆柚酮的转化中。
12.Ice2p用于稳定化细胞色素P450还原酶在重组宿主细胞中的表达的用途。
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