CN112903804B - 代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法，包括：步骤(1)、称取适量的炭黑样品；步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；步骤(3)、将炭黑分散液与代谢酶溶液混合，将混合液置于涡旋振荡器混匀；步骤(4)、将混合液置于隔水式培养箱中孵育。本发明的方法通过互补的多重技术揭示了酶的作用，证明了它可以诱导炭黑颗粒的转化。根据典型的碳团簇质谱峰以及光谱中碳氧和碳氮键的变化，提出了炭黑颗粒在生物体内的转化机理。

Description

代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法
技术领域
本发明属于生物降解及其分析领域，更具体地涉及一种基于代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法。
背景技术
炭黑颗粒是碳氢化合物不完全燃烧或热分解的产物，因其成本低、导电性高、体积小而被广泛用作过滤器、弹性体、塑料、油漆以及轮胎的增强填料、燃料电池和电极材料中导电添加剂和催化剂载体。这些颗粒被大量排放到环境中也增加了人体的暴露风险。大量的流行病学的结果表明，炭黑具有极强的毒性和生物学效应，对人体健康有很大的影响。它的毒性要远高于其它的细颗粒物。炭黑的粒径小、比表面积大且活性强。基于炭黑颗粒的尺寸效应，它可以通过呼吸进入人体，甚至通过肺泡与毛细血管之间的屏障进入血液循环，从而引起人体氧化应激和炎症反应，导致呼吸系统和心血管系统损害。已有研究表明它们可以透过血睾屏障和胎盘屏障，从而诱发心血管疾病和生殖发育障碍。关于它们的致癌和致畸性也都有报道。
纳米颗粒的生物转化和分布对研究其生物安全性、健康效应和疾病诊断等方面具有重要作用。它通常有两种方式，包括其在生物体内的代谢和降解。代谢一般是基于酶引导的生物转化过程。在这些酶中，由于肝脏被认为是人体内最主要的解毒器官，因此肝脏中的一级和二级代谢酶(如细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶)也在解毒过程中具有重要的地位。多种研究表明，代谢酶在诱导、支配和控制生物体内物质转化和代谢方面具有重要的作用，如动物、植物中的蛋白质和氨基酸代谢、脂质代谢、糖转运和代谢。因此纳米材料在肝脏代谢酶作用下的生物转化和分布对评估纳米材料的毒性和健康效应具有重要的作用。但对于炭黑纳米颗粒来说，一般认为，它的化学性质较为惰性，难以被生物降解。这归因于炭黑主要是由元素碳结构组成的，具有极高的稳定性，从而抑制了其在生物体内的转化。到目前为止，还从未有过炭黑颗粒能被酶降解的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前认为炭黑的化学性质较为惰性，难以被生物降解的问题。在本研究中，本申请首次发现一种非常常见的代谢酶可以在温和条件下高效降解炭黑颗粒。本申请利用了多种互补的技术，特别是质谱技术，确认了代谢酶可以诱导炭黑颗粒的降解，并深入阐明炭黑颗粒生物降解的途径。
为实现上述目的，本发明提出以下技术方案：
一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与代谢酶溶液混合，保证代谢酶与炭黑混合的质量比范围为0.00000001-10000，将混合液置于涡旋振荡器混匀；其中，所述代谢酶包括细胞色素P450或谷胱甘肽S-转移酶；
步骤(4)、将混合液置于隔水式培养箱中孵育。
进一步地，孵育时间设置为0-14天。
进一步地，炭黑分散液浓度范围为0.0000001-1000μg/mL。
进一步地，步骤(3)中的细胞色素P450或谷胱甘肽S-转移酶来自动物或植物。
进一步地，步骤(4)中孵育环境适用于黑暗或光照环境，温度适用范围为15℃-37℃。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在500m/z以下的小分子区域。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
进一步地，步骤(4)孵育后得到炭黑颗粒的降解路径包括氧化路径和氮化路径。
进一步地，步骤(3)得到的混合液样品的表征方法包括：电子显微镜、质谱、能谱、光谱或核磁。
另一方面，本申请还请求保护一种前述之一所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法的产物分析方法，包括以下步骤：
步骤(5)、取孵育一定时间的混合液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过MALDI-TOF MS对所述炭黑样品直接进行质谱检测。
进一步地，步骤(1)中的炭黑样品的前处理过程如下：适量5M KOH与炭黑样品混合，在95℃下加热10-24h,10000rpm离心10-30min后弃上清；残留物用超纯水洗三次，然后与3M的HCl混合后离心弃上清；残渣与正己烷/丙酮(1:1-1:3,v/v)混合，进行超声清洗和离心；重复数次。
本发明提出的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法具有以下有益效果：
1.本发明基于代谢酶对炭黑的特殊降解能力，提出了一种新的去除炭黑污染的酶法。
2.本发明发现在温和的条件下，炭黑颗粒可以被代谢酶代谢转化。并通过质谱分析发现了多种降解产物。这些研究更新了现有技术对炭黑生物的认识。
3.本发明使用的炭黑颗粒本身就能够高效地吸收激光能量，从而促进自己的解吸与电离，因此使用本发明方法，在样品配置时不需要另外添加基质，就可以实现高灵敏度的质谱检测，从而简化了操作步骤、节省了样品准备时间且大大提高了检测效率。
4.本发明由于不需要额外的添加基质，减少了共结晶过程，也克服了传统基质中常遇到的热点问题，提高了分析的重现性，减少了成本。
5.本发明实现了复杂的植物和动物样品进行检测，实现了快速高通量的质谱检测。
6.本发明的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法体积极小，所需样品量极少，可以实现炭黑的高灵敏度质谱检测。
7.本发明的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法具有快速、高效、灵敏、信号稳定、高通量、准确的特点，并且具有对炭黑颗粒进行定量的可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对2μL炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果。
图2是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对加入细胞色素P450，置于黑暗环境37℃孵育7天后的2μL炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果。
图3是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对加入细胞色素P450，置于黑暗环境37℃孵育7天后的2μL炭黑样品的MALDI-FT-ICRMS检测结果。
图4是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对实际的飞灰样品经过前处理之后得到的2μL炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果。
图5是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对加入细胞色素P450后，2μL实际飞灰样品中的炭黑孵育12h的MALDI-TOF MS检测结果。
图6是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对加入细胞色素P450后，2μL实际的废水加标样品孵育7d的MALDI-TOF MS检测结果。
图7是采用本发明一实施例提出的代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法对加入谷胱甘肽转移酶后，2μL实际的废水加标样品孵育7d的MALDI-TOF MS检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请发明人在研究中发现：
(1)在温和的条件下，炭黑颗粒可以被代谢酶代谢转化。
(2)炭黑颗粒的降解产物在0-1000之间，尤其是在小于500的小分子区域。
(3)炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
(4)炭黑颗粒的降解途径包括氮化途径和氧化途径。
因此，本申请提出了一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与代谢酶溶液混合，保证代谢酶与炭黑混合的质量比范围为0.00000001-10000，将混合液置于涡旋振荡器混匀；其中，代谢酶包括细胞色素P450或谷胱甘肽S-转移酶；
步骤(4)、将混合液置于隔水式培养箱中孵育。
另一方面，本申请还提供一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物的分析方法的产物分析方法，包括：
步骤(5)、取孵育一定时间的混合液滴加在商业化的MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过MALDI-TOF MS对所述炭黑样品直接进行质谱检测。
进一步地，本申请发明人进行了相关实验验证：
(1)所述分析方法炭黑颗粒在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰，基于此发展了首个炭黑的质谱定量分析方法。
(2)炭黑颗粒的质谱指纹谱在0-1000之间，尤其是在小于500的小分子区域。
(3)所述分析方法配制的炭黑样品浓度范围为0.0000008-1000μg/mL，检测限在ppt水平甚至低于ppt水平。
(4)所述分析方法在正离子模式下，质谱的激光功率设置为5-60％，频率设置为100-200，shots设置为100-500；在负离子模式下，质谱的激光功率设置为15-55％，频率设置为100-200，shots设置为100-500。而在这两种模式下，Matrix Suppression Mode设置为Off，Detector Gain设置为4-8x，laser Attenuator范围为1-mini到5-ultra。
(5)所述分析方法的MALDI-TOF MS检测在反射模式下进行，并且在正离子模式和负离子模式下都适用。
(6)所述分析方法所述炭黑样品分散液配制成多份不同浓度的炭黑标液，将每份炭黑标液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
(7)所述分析方法的代谢酶适用于细胞色素P450和谷胱甘肽转移酶。
(8)所述分析方法的孵育环境适用于黑暗和光照环境，温度适用范围为15℃-37℃
(9)所述分析方法得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内，特别是在500m/z以下的小分子区域。
(10)所述分析方法得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
(11)所述分析方法所用样品体积极小，在1-10μL范围内即可。
(12)所述分析方法可对环境水样、复杂的植物样品或生物组织样本进行检测。
(13)所述分析方法的实际样品的前处理过程如下：适量5M KOH与样品混合，在95℃下加热10-24h,10000rpm离心10-30min后弃上清。残留物用超纯水洗三次，然后与3M的HCl混合后离心弃上清。残渣与正己烷/丙酮(1:1-1:3,v/v)混合，进行超声清洗和离心。重复数次。
(14)所述分析方法可用于表征得到的混合液样品，如电子显微镜、能谱、光谱、核磁。
实施例
配置一定浓度的炭黑颗粒的水分散液，将炭黑粒子与肝的代谢酶(细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶)混合，然后放入隔水式培养箱孵育。混合物连续培养14天。为了模拟生物环境，这些实验首先在37℃的黑暗环境中进行。在发现炭黑颗粒可以被代谢酶降解后，本申请还进行了光辐照实验，以测试该技术在废水净化中的应用潜力。光强维持在550W/m2，在一定时间间隔检测溶液，从而监测炭黑粒子的转化。所有实验重复三次(n＝3)。本申请这里把飞灰样品作为实际样品示例。实际样品的前处理过程如下：先将适量5M KOH与样品混合，在95℃下加热12h,10000rpm离心20min后弃上清，除去二氧化硅。残留物用超纯水洗三次，然后与3M的HCl混合，以去除碳酸盐颗粒和金属氧化物。上清液也被离心丢弃，残渣也用同样的方法洗涤。将残渣与正己烷/丙酮(1:1,v/v)混合，进行超声清洗和离心3次。最后都用MALDI-TOF MS对所述样品直接进行质谱检测。为了进行LDI-TOF质谱测量，将2μL炭黑分散液直接投到不锈钢MTP 384靶框III(Bruker Daltonics)上。然后将目标物放置在通风柜中，样品在空气中干燥，然后使用的仪器型号为Bruker DaltonicsAutoflex IIISmartbean MALDI-TOF质谱仪，使用频率为200Hz的355nm Nd:YAG，在负离子模式下，激光功率设置为35％，质谱检测范围为m/z0-2000；而在正离子模式下，激光功率设置为35％，质谱检测范围为m/z 1-1000。LDI-FT-ICR质谱是在配备15.0T超导磁体(Bruker Daltonics,GmbH,Bremen,Germany)的SolariX FT-ICR质谱仪和Apollo II双离子源上进行的，以获得超高分辨率质谱图。质谱范围设置为90-1000，4M 32位数据格式。质谱用10mmol/L甲酸钠溶液和内部参考质谱表校准，准确度优于0.5ppm。测量和理论计算的质谱误差控制在1ppm以内。MALDI-TOF质谱和MALDI-FT-ICR质谱的数据处理分别使用FlexAnalysis 3.4软件和data Analysis 4.0(Bruker Daltonics,version 2.0)软件进行。空白样品通过相同的方法进行检测。测定结果如图1-7所示，图1为炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果，图2为加入细胞色素P450后，炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育7天后的MALDI-TOF MS检测结果，图3加入细胞色素P450后，炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育7天后的MALDI-FT-ICR MS检测结果，图4实际的飞灰样品经过前处理之后得到的炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果，图5为加入细胞色素P450后，实际飞灰样品中的炭黑孵育12h的MALDI-TOF MS检测结果，图6为加入细胞色素P450后，实际的废水加标样品孵育7d的MALDI-TOF MS检测结果,图7为加入谷胱甘肽转移酶后，实际的废水加标样品孵育7d的MALDI-TOF MS检测结果。从图1可以看出，在无基质的情况下，炭黑在MALDI-TOFMS中有特征的分子峰团簇，证明本实施例的分析方法在样品配备时，无需加入基质，既可直接用于炭黑样品的分析。从图1-2可以看出，细胞色素P450使炭黑发生了代谢转化。转化产物主要分为两类，分别为氧化产物和氮化产物。从图3的高分辨的质谱图也验证了炭黑已经在细胞色素P450的诱导下被生物降解了。从图5可以看出，样品前处理方法可以成功的将炭黑从飞灰中提取出来。从图4-6该方法可适用于复杂样品的检测。该方法同样适用于对实际样品中的炭黑进行生物降解。通过不同时间的对比，本申请发现随着时间的延长，黑炭的代谢转化产物逐渐增加。从图7可以看出，其它的肝代谢酶，如谷胱甘肽转移酶也同样可以对炭黑颗粒进行生物降解。一系列产物揭示了黑炭颗粒的氧化、氮化等转化途径，为追踪生物转化过程提供了指纹图谱，为清除炭黑颗粒，降低其环境和生物持久性提供了可用的途径。
从以上实施例可以看出，虽然炭黑颗粒是一种碳氢化合物不完全燃烧或热分解的产物，传统上被认为是惰性的，可以抵抗生物消化或降解。但本申请的创新之处在于：提供了一种方法，在温和的条件下，炭黑颗粒可以被代谢酶降解。本申请还通过质谱分析发现了多种降解产物。这些研究更新了现有技术对炭黑生物命运的认识。这些研究表明炭黑颗粒在生物体内，甚至是人体内是能够被降解的。人体对炭黑颗粒具有一定的清除能力。此外，基于代谢酶对炭黑的特殊降解能力，本申请提出了一种新的去除炭黑污染的酶法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与代谢酶溶液混合，保证代谢酶与炭黑混合的质量比范围为0.00000001-10000，将混合液置于涡旋振荡器混匀；其中，所述代谢酶包括细胞色素P450或谷胱甘肽S-转移酶；
步骤(4)、将混合液置于隔水式培养箱中孵育。
2.根据权利要求1所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，孵育时间设置为0-14天。
3.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，炭黑分散液浓度范围为0.0000001-1000μg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(3)中的细胞色素P450或谷胱甘肽S-转移酶来自动物或植物。
5.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)中孵育环境适用于黑暗或光照环境，温度适用范围为15℃-37℃。
6.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)孵育后的炭黑颗粒的降解率为50％-100％。
7.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内。
8.根据权利要求7所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在500m/z以下的小分子区域。
9.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
10.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到炭黑颗粒的降解路径包括氧化路径和氮化路径。
11.根据权利要求1或2所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法，其特征在于，步骤(3)得到的混合液样品的表征方法包括：电子显微镜、质谱、能谱、光谱或核磁。
12.根据权利要求1-11之一所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法的产物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(5)、取孵育的混合液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪的靶托上，通过MALDI-TOF MS对所述炭黑样品直接进行质谱检测。
13.根据权利要求12所述的一种代谢酶诱导炭黑颗粒的生物降解方法的产物分析方法，其特征在于，步骤(1)中的炭黑样品的前处理过程如下：适量5M KOH与炭黑样品混合，在95℃下加热10-24h,10000rpm离心10-30min后弃上清；残留物用超纯水洗三次，然后与3M的HCl混合后离心弃上清；将体积比为1:1-1:3的残渣与正己烷/丙酮混合，进行超声清洗和离心；重复数次。
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