CN109825551B

CN109825551B - 一种评价组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法

Info

Publication number: CN109825551B
Application number: CN201910130057.6A
Authority: CN
Inventors: 文赫; 朱卫国; 刘向宇
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-02-21
Also published as: CN109825551A

Abstract

本发明公开一种评价组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，本发明利用同位素标记的α‑酮戊二酸和核磁共振光谱仪在生物混合物中选择性的实时监测含有Jumonji‑C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α‑酮戊二酸和产物琥珀酸的变化，以评价组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性。本方法可测定酶活性以及可以应用到酶抑制剂的开发。

Description

一种评价组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法

技术领域

本发明涉及酶活性检测技术领域，尤其涉及一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法。

背景技术

组蛋白尾部可以发生不同类型的翻译后修饰，包括乙酰化、磷酸化、泛素化和甲基化，这些修饰的组合决定着染色质结构以及基因转录调控。其中，组蛋白的异常甲基化已经在多种肿瘤中被观察到，发现与肿瘤细胞的转化、快速增长有着密切的联系。组蛋白赖氨酸甲基化受两类具有相反活性的酶调节：组蛋白甲基转移酶（KMT）和组蛋白去甲基转移酶（KDM）。根据结构不同，组蛋白去甲基转移酶可以分为俩类，其中含Jumonji-C（JmjC）结构域的KDMs通过羟基化反应发挥其活性，且依赖于Fe(II)、α-酮戊二酸（a-ketoglutarate, 以下简称α-KG）、氧作为在去甲基化反应中的辅助因子。临床上发现，此类KDMs的表达水平或活性与许多种癌症、炎症以及X染色体连锁智力缺陷有关。因此，发明一种可实时监测含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，有助于大量发现调节酶活性的小分子化合物，发展成为抗癌药物，最终在临床治疗上带来诸多好处。

迄今为止，几种不同的高通量筛选（HTS）方法已经被开发用于寻找KDMs的小分子抑制剂。FDH偶联测定法通过检测由甲醛脱氢酶（FDH）把含JmjC 结构域的KDMs产生的甲醛还原形成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）来测定KDMs的活性。因为，检测的NADH不是KDM酶的直接产物，所以需要排除由偶联酶反应引起的假阳性和假阴性。放射性分析法是通过被KDMs去甲基化的生物素上，再利用甲基转移酶（KMT）转移由放射性标记的[3H]-SAM带来的甲基进行检测，此方法的问题是由KMT带来的假阳性和假阴性，且不能排除放射性带来的危险。另外，利用LC–MS定量KDMs的直接产物琥珀酸的方法，在保存时间（retentiontime）上有着变化，为了判断是否琥珀酸，每次都得利用琥珀酸标准品进行判断。并且，以上三种方法都需要预处理样品再进行检测，无法实时监测酶反应。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，旨在利用碳13标记的α-KG和核磁共振光谱仪在如细胞裂解液等复杂生物混合物中可以选择性的实时监测含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α-KG和产物琥珀酸(succinate，SUC)的变化评价此类酶活性的方法。本方法可测定酶活性以及可以应用到酶抑制剂的开发。

本发明的技术方案如下：

一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其中，利用碳13标记的α-KG和核磁共振光谱仪对含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α-KG和产物琥珀酸进行检测，测定出组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的活性。

所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其中，包括步骤：

将细胞裂解液或组织裂解液与酸提的组蛋白和碳13标记的α-KG混合；

加入重组蛋白KDMs（组蛋白赖氨酸去甲基转移酶）进行混匀；

将混匀后的样品置于核磁共振光谱仪中进行检测，得到光谱；

通过光谱数据分析确认样品里是否含有底物α-KG和产物琥珀酸；

连续对底物α-KG和产物琥珀酸进行检测，测定出组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的活性。

有益效果：本发明利用碳13标记的α-酮戊二酸和核磁共振光谱仪在如细胞裂解液等复杂生物混合物中可以选择性的实时监测含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α-KG和产物琥珀酸的变化，以评价此类酶活性的方法。本方法可测定酶活性以及可以应用到酶抑制剂的开发。

附图说明

图1为KDMs的反应原理和检测KDMs活性的HCACO旋转系统图。

图2为KDM4A介导反应的光谱图。

图3为KDM4A的产物(a)和底物(b)随着时间的变化增减的结果示意图。

图4为酶抑制测定结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其中，利用碳13标记的α-KG和核磁共振光谱仪在生物混合物（如细胞裂解液等）中选择性的实时监测含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α-KG和产物琥珀酸的变化，以评价组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性。本方法可测定酶活性以及可以应用到酶抑制剂的开发。

在一种优选的实施方式中，所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其中，包括步骤：

缓冲液、细胞裂解液或组织裂解液与酸提的组蛋白和碳13标记的α-KG混合的阶段；加入重组蛋白KDMs混匀，并进行酶反应的阶段；上述混合样品在核磁共振光谱仪得到光谱（spectrum）的阶段；通过光谱数据分析确认样品里是否含有α-KG和琥珀酸的阶段；随时间的推移，连续监测底物α-KG和产物琥珀酸的变化，从而测定KDM酶活性的方法；比较加入小分子化合物后的琥珀酸峰值与未加入小分子化合物的琥珀酸峰值，从而判断该小分子化合物的抑制效果的阶段。

上述方法具体说明如下：

1、细胞或组织可以是来自人或者动物。组织可以是血清、血浆或者皮肤组织、脑组织、肺组织、肝组织等不同部位。利用细胞破碎仪或者组织研磨仪裂解得到细胞裂解液或组织裂解液。

2、在缓冲液或细胞裂解液或组织裂解液里加入酸提的组蛋白和碳13标记的α-KG。这里，α-KG的5个碳中有3个或者4个或者5个是碳13标记的（图1）。每1毫升样品里加入的α-KG的量可以是0.001mg至50mg。同时上述混合液里加入抗坏血酸维生素C（ascorbic acid）和Fe²⁺离子；其中所述酸提的组蛋白为经过酸（如浓硫酸）提纯后的组蛋白。组蛋白赖氨酸去甲基转移酶作用于组蛋白，修饰组蛋白的去甲基化。

3、然后加入重组蛋白KDMs。这里重组蛋白KDMs可以是从细胞或者细菌中提纯的蛋白，也可以是附带标签的蛋白质。

4、将混合好的样品进行酶反应的阶段。酶反应的温度可以是25度至45度之间，也可以是37度；酶反应可以在水浴锅或者摇床等条件下进行；也可以选择把核磁共振仪器调至适合温度后，一边酶反应一边测试的方法。

5、利用核磁共振光谱仪从包含α-KG的样品中得到HCACO光谱。所述核磁共振是“Nuclear Magnetic Resonance”，也叫“NMR，是一种给予样品特定的脉冲（pulse）后，根据物质的化学结构不同测定物质化学位移的仪器。利用核磁共振光谱仪的3维-HCACO脉冲序列检测得到1维-HCACO(correlation between ¹HA, ¹³CA and ¹³CO chemical shifts)谱图；1维-HCACO的基本原理是脂肪族¹³C (¹³CA)和酮¹³C (¹³CO)由共价键结合的化合物中，以脂肪族¹³C (¹³CA)和酮¹³C(¹³CO)固有的化学位移值为脉冲值，给予脉冲后检测，可以选择性的得到与脂肪族¹³C (¹³CA)共价键结合的氢原子(H)的谱图。α-KG和琥珀酸分别拥有自己固有的H-CA-CO化学位移，根据此化学位移给予脂肪族¹³C和酮¹³C脉冲后，可以选择性的得到相应物质的氢原子谱图（信号）（图1）。

6、最后通过分析上述谱图，确认样品是否含有α-KG和琥珀酸。根据α-KG固有的H-CA-CO化学位移给予脉冲后，在2.5ppm和3.5ppm之间存在¹H信号，可以判断样品里含有碳13标记的α-KG；根据琥珀酸固有的H-CA-CO化学位移给予脉冲后，在2.1ppm和3.1ppm之间存在¹H信号，可以判断样品里含有碳13标记的琥珀酸（图2）。

7、随时间的推移，连续监测底物α-KG和产物琥珀酸的变化，从而测定KDM酶活性的方法，具体如下：步骤3里得到的混合液，直接移到核磁共振管，且核磁共振仪器调至适合温度，酶反应直接在核磁共振管里进行。调好α-KG和琥珀酸的H-CA-CO的化学位移后，交替测试获得α-KG和琥珀酸的谱图。随着时间推移底物α-KG的浓度递减（图3b），产物琥珀酸浓度递增（图3a）。交替测试8.3小时。测试时间也可以是10分钟至24小时。产物琥珀酸的浓度变化是从无到有。再利用不同浓度碳13标记的琥珀酸标准物和测试出来的相应¹H波峰的面积构建标准曲线（图3c），解出琥珀酸的浓度。再根据解酶活性方程式最终可获得KDM酶的活性（图3d）。

8、比较加入小分子化合物后的琥珀酸¹H信号与未加入小分子化合物的琥珀酸¹H信号，从而判断该小分子化合物是否有抑制效果的阶段，具体如下：先得到步骤3里提到的混合液。阴性参照样品不加抑制剂，阳性参照样品里加入已知的KDMs抑制剂ML324。其他样品分别加入多巴胺（dopamine）(a), 诺考达唑（nocodazole）(b), 桦木酸（betulinic acid）(c), 蒿属香豆素（scoparone）(d), 色胺（tryptamine）(e), and 大豆苷元（daidzein）(f)；加入的化学物质不仅仅局限于上述几种化合物，任何物质都可用。处理浓度可以是0.001微摩尔至1毫摩尔。

9、将混合好的样品进行酶反应的阶段。酶反应的温度可以是25度至45度之间，也可以是37度；酶反应可以在水浴锅或者摇床等条件下进行。

10、利用核磁共振光谱仪得到琥珀酸的HCACO光谱。利用核磁共振光谱仪的3维-HCACO脉冲序列检测得到1维-HCACO光谱。利用琥珀酸固有的H-CA-CO化学位移给予脂肪族¹³C和酮¹³C脉冲后，得到琥珀酸的氢原子谱图。根据琥珀酸固有的H-CA-CO化学位移给予脉冲后，在2.1ppm和3.1ppm之间存在¹H信号，可以判断样品里含有碳13标记的琥珀酸。与阴性参照样品对比，琥珀酸的¹H信号小或无时，可以判断此小分子化合物有KDMs酶抑制效果。如阳性参照样品里就几乎没有琥珀酸的¹H信号，说明ML324可以完全抑制KDMs酶活性。小分子化合物的KDMs酶抑制效果能达到或者接近阳性参照水平时，可用于KDMs酶抑制剂或其先导化合物。

下面通过具体实施例对本发明实施例作进一步说明。

本发明具体实施例提供利用核磁共振光谱仪选择性的检测α-酮戊二酸和产物琥珀酸的方法。

1、样品准备

稳定同位素碳13标记的α-KG（1,2,3,4-¹³C₄,99％）和琥珀酸购自CambridgeIsotope Labratories（Andover，MA，USA）。人源KDM4A（从全长人KDM4A质粒转染的HEK293细胞获得的重组蛋白）购自Origene（Rockville，MD，USA）。 KDM4A抑制剂，ML324，购自SelleckChemicals（Houston，TX，USA）。

2、细胞系和培养条件

HeLa细胞购自American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，VA），并在加入10％热灭活的胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（100U / ml）的DMEM培养基中生长。将HeLa细胞培养在37℃、5％CO₂、90%湿度的培养箱中。

3、NMR光谱的样品制备

反应在缓冲体系（150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.5）和细胞裂解物中进行。细胞裂解物从10⁶个HeLa细胞的培养物中获得。将计数的细胞在1000rmp的转速离心5分钟后，获得细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次，并用200µl细胞裂解缓冲液（150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.5）重悬。将重悬细胞样品进行10次超声处理（在冰上3秒脉冲和休息1秒）。转速15000g的条件下，将上述样品在4℃离心机离心20分钟，然后将上清液移入新的离心管中。在酶反应之前，向缓冲液或细胞裂解物中加入重组蛋白KDM4A（KDMs）1微克，¹³C标记的α-KG（0.1mg），抗坏血酸（1mM），50 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂，酸提的组蛋白10微克。在NMR测量之前，将混合物在37℃温育过夜。对于α-KG测量，在温育前测得光谱。测核磁共振前，需在样品中加入5%的D₂O，用于测定锁定信号(lock signal detection)。

4、NMR测量

NMR光谱在配备有低温探针的Bruker ASCEND 600MHz NMR磁体系统（Bruker，Fallanden，Switzerland）上进行测量。所有的1维-HCACO光谱均来自3维-HCACO 核磁共振脉冲序列。羰基碳和α碳的化学位移设定为185和37ppm用于检测琥珀酸的氢原子，检测后琥珀酸的氢原子在2.6ppm附近出现单个峰值；设定为208和38ppm用于检测α-KG的氢原子，检测后α-KG的氢原子在3.0ppm附近出现单个峰值。α-KG和琥珀酸混合在同一溶液时也可以分别测出。并且，每5分钟左右交替测试α-KG和琥珀酸（每交替测试一次视为1 cycle），可以观察到琥珀酸和α-KG的增减变化，可实时监测KDM酶的活性（图3）。通过琥珀酸的浓度最终可算出，KDM4A的酶活值是0.18 milliunit/mL。

5、抑制剂筛查

看此方法是否可以用于抑制剂的筛查，首先准备了已知的KDMs抑制剂ML324，购自Selleck Chemicals（Houston，TX，USA）。另外准备6种小分子化合物（结构可参考图4）。

为了酶抑制实验，首先获得8管10⁶HeLa细胞，离心获得细胞沉淀，再用PBS缓冲液洗涤3次，并用200ul细胞裂解缓冲液（150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.5）重悬，将重悬细胞样品进行10次超声处理（在冰上3秒脉冲和休息1秒），然后在转速15000g的条件下，将上述样品在4℃离心机离心20分钟，将上清液移入新的离心管中。

上述8管样品中，分别加入重组蛋白KDM4A 1微克，¹³C标记的α-KG（0.1mg），抗坏血酸（1mM），50 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂，酸提的组蛋白10微克。第1管不加抑制剂，第2管加终浓度10微摩尔的ML324，第3管至第8管分别加入终浓度10微摩尔的多巴胺（a）、诺考达唑（b）、桦木酸（ c）、蒿属香豆素（d）、色胺（e）和大豆苷元（f）。将混合物在37℃温育过夜后，利用核磁共振针对8管样品分别得到1维-HCACO的琥珀酸氢原子谱图。

如图4所示，未处理抑制剂的样品里，α-KG转化成琥珀酸。处理已知的KDMs抑制剂后，几乎没有琥珀酸。第3管至第8管之间琥珀酸¹H峰值有差异且小于第一管，但未达到第2管的抑制效果。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其特征在于，利用碳13标记的α-KG和核磁共振光谱仪对含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的底物α-KG和产物琥珀酸进行检测，测定出组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的活性；

所述评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，包括步骤：

加入重组蛋白KDMs进行混匀；

连续对底物α-KG和产物琥珀酸进行检测，测定出组蛋白赖氨酸去甲基转移酶的活性；

所述细胞裂解液从HeLa细胞中提取得到；

利用核磁共振光谱仪的3维-HCACO脉冲序列检测得到1维-HCACO谱图，所述1维-HCACO谱图是脂肪族¹³C和酮¹³C由共价键结合的化合物中，以脂肪族¹³C和酮¹³C固有的化学位移值为脉冲值，给予脉冲后检测，选择性的得到与脂肪族¹³C共价键结合的氢原子的谱图。

2.根据权利要求1所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述碳13标记的α-KG的5个碳中有3个、4个或者5个是碳13标记的。

3.根据权利要求1所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其特征在于，每1mL细胞裂解液或组织裂解液中加入的碳13标记的α-KG的量为0.001mg-50mg。

4.根据权利要求1所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述加入重组蛋白KDMs进行混匀；将混匀后的样品置于核磁共振光谱仪中进行检测，得到光谱的步骤包括：加入重组蛋白KDMs进行混匀；将混匀后的样品在水浴锅或者摇床条件下进行酶反应，反应后置于核磁共振光谱仪中进行检测，得到光谱；

或者，加入重组蛋白KDMs进行混匀；将混匀后的样品置于核磁共振光谱仪中进行酶反应并检测，得到光谱。

5.根据权利要求4所述的评价含有Jumonji-C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述酶反应的温度为25℃至45℃之间。