JP2019520845A - アシル転移酵素の活性を有する微生物及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】本願は、新規アシル転移酵素のポリペプチドまたはこれを含む微生物；前記ポリペプチドまたは微生物を含むＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造用組成物；前記ポリペプチドまたは微生物を用いたＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造方法を提供する。また、本願は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。【解決手段】アシル転移酵素の活性が強化された新規アシル転移酵素を含む微生物を使用して、Ｌ−メチオニンをアセチル化させてＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産する。【選択図】なし

Description

本願は、アシル転移酵素活性を有するポリペプチドまたはこれを含む微生物；前記ポリペプチドまたは微生物を含むＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造用組成物；前記ポリペプチドまたは微生物を用いたＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造方法に関する。
また、本願は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。

Ｎ−アセチルメチオニンはメチオニンの誘導体であり、メチオニンと効能は類似するが、メチオニン特有の香りが減少し、食品への添加時に、メチオニンに比べて多量の添加が可能である。
また、反すう胃を有する動物の場合、メチオニンを飼料添加物として使用する場合には、反すう胃微生物により先に利用されて動物に吸収されないのに対し、Ｎ−アセチルメチオニンの場合は、反すう胃を通過して腸に到達した後に吸収される保護アミノ酸（rumen-protected amino acid）である。Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンの反すう胃における分解抵抗性は公知となっている（Amos et al., Journal of Animal Science, 1974, 39(3), pp. 612-617（非特許文献１））。したがって、Ｎ−アセチルメチオニンの生産は産業的な価値を有し、特に飼料添加物として使われる場合、吸収速度が速く、生体内利用率が高いＬ型のアミノ酸を提供することが望ましいため、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの研究開発が求められている。
メチオニンをＮ−アセチルメチオニンに転換することが報告された既存の酵素としては、大腸菌のＹｎｃＡが唯一である（US 8,143,031 B2（特許文献１））。前記文献の場合、ＹｎｃＡの比活性を測定するために、ＤＴＮＢ分析法を通じて間接的にアセチル補酵素Ａ（acetyl-coA）を使用することを確認したことに過ぎず、実際にはＮ−アセチルメチオニンの生産を確認していなかった。また、ＹｎｃＡにより形質転換された形質転換体により、実際にＮ−アセチルメチオニンを生成したかどうかも確認されていない。

US 8,143,031 B2 韓国公開特許第10-2004-0107215号公報 韓国登録特許第10-1577134号公報

Amos et al., Journal of Animal Science, 1974, 39(3), pp. 612-617 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) FEMS Microbiology Letters Volume 199, Issue 1, pages 97-102, May 2001

本発明者らは、微生物の発酵や酵素反応を通じたＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産しようとする継続的な努力により、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能のある微生物を探索し、新規で６種のアシル転移酵素を発掘し、本発明の新規アシル転移酵素またはそれを発現する微生物を利用して、公知となったアシル転移酵素に比べてＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを高濃度及び経済的に生産することができることを確認し、本発明を完成した。

本願の一つの目的は、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、アシル転移酵素の活性を有する微生物を提供することにある。

本願の他の目的は、Ｌ−メチオニンにアセチル転移活性を有する、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドを提供することにある。

本願の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

本願の他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。

本願の他の目的は、（ｉ）前記微生物またはその培養物；（ｉｉ）前記ポリペプチド；またはこれらの組み合わせを有効成分として含む、Ｌ−メチオニンからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造用組成物を提供することにある。

本願の他の目的は、（ｉ）前記微生物またはその培養物；（ｉｉ）前記ポリペプチド；またはこれらの組み合わせを用いてＬ−メチオニンをアセチル化する段階を含む、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造方法を提供することにある。

本願の新規アシル転移酵素を含む微生物は、アシル転移酵素の活性が強化されるところ、本願の微生物は、Ｌ−メチオニンをアセチル化させてＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産するのに効率的に使用することができる。

前記目的を達成するため、本願は一態様として、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、アシル転移酵素活性を有する微生物を提供する。

本願で使用される用語「アシル転移酵素（acyltransferase）」とは、ドナーからアシル基（acyl group）を受容体に伝達する活性を有する酵素を意味する。
本願において、前記ドナーはアシル基を受容体に提供し得る限り制限されないが、具体的には、アセチル補酵素Ａ（acetyl-coA）であってもよい。
また、本願において、前記受容体は、ドナーからアシル基を受けることができる限り制限されないが、具体的には、Ｌ−メチオニンであってもよい。

具体的には、前記アシル転移酵素は、シュードモナス属、バチルス属、エンテロバクター属、シュードビブリオ属、ヤロウィア属、またはコリネバクテリウム属由来であってもよく、より具体的には、シュードモナス・プチダ、バチルス・サブチリス、エンテロバクターｓｐ．６３８、シュードビブリオｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１、ヤロウィア・リポリティカ、またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。

具体的には、前記アシル転移酵素は、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。また、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有し、実質的に配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列と同一または相応にアシル転移酵素活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。またはこのような相同性を有する配列であり、実質的に配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列と同一または相応にアシル転移酵素活性を有するアミノ酸配列において、一部配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列であってもよく、その場合も、本願のカテゴリに含まれることは自明である。

本願で使用される用語「相同性」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子のアミノ酸配列または塩基配列において、特定の比較領域で両配列を最大限に一致するように整列（align）させた後、配列間の塩基またはアミノ酸残基が同一である程度を意味する。相同性が十分に高い場合は、その遺伝子の発現産物は、同一または類似した活性を有し得る。前記配列同一性のパーセントは、公知となった配列比較プログラムを使用して決定することができ、一例として、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）などを挙げることができる。

本願で使用される用語「アシル転移酵素活性を有する微生物」とは、生物体内及び／または生物体外にアシル転移酵素を生産する微生物を意味する。
具体的には、本願の微生物は、前記配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでおり、アシル転移酵素の活性を有するところ、受容体にアシル基を伝達することができる。具体的には、本願の微生物は、Ｌ−メチオニンにアセチル基を転移する活性を有し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産することができる。本願においてＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンとＮ−アセチルメチオニンは混用される。

また、本願の微生物は、前記配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを内在的に含む微生物だけでなく、前記ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された微生物も含む。すなわち、アシル転移酵素の生産能力は、天然または人為的突然変異または種の改良により付与され、または増進させることができる。
本願で使用される用語ポリペプチド活性の「強化」とは、微生物が保有するポリペプチドの活性状態を向上させることを意味する。ポリペプチドの活性の強化は、目的とするポリペプチドの活性の強化と同様に、各ポリペプチドの活性を、天然の自然状態または当該ポリペプチドの非変異状態より強化させることができる限り、限定されない。
その例として、ｉ）各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するような発現調節配列の変形、ｉｉｉ）各ポリペプチドの活性が強化されるような、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及びｉｖ）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行うことができる。
具体的には、各ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、各ポリペプチドをコードする塩基配列の上流に、改良された活性を示すプロモーターを導入したり、プロモーターに変異を与えた各ポリペプチドを導入する方法、５’−ＵＴＲ領域の塩基配列を変形させる方法及び各ポリペプチドをコードする塩基配列の変異体を導入する方法で行われた群から選択される方法により実行されるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

また、本願においてアシル転移酵素活性を有する微生物は、アシル転移酵素活性を有する限り、微生物の由来に関係なくすべて含むことができる。
一例として、エスケリチア属（Escherichia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、またはヤロウィア属（Yarrowia sp.）であってもよく、より具体的には、大腸菌（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）であってもよいが、これらに限定されない。

また、本願において、アシル転移酵素活性を有する微生物は、ドナー及び／または受容体の細胞膜透過性を高めた微生物であってもよい。細胞膜の透過性を向上させる方法は、従来の公知となった方法を利用することができ、具体的には、微生物を凍結及び解凍させる段階を繰り返して行うことができるが、これに限定されない。

また、本願において、アシル転移酵素活性を有する微生物は、培地にアシル基のドナーの代わりに、ブドウ糖など微生物でドナーの生合成経路に関与する基質を添加してアシル基が転移された産物を生産することができる。
具体的には、本願の微生物を、アセチル補酵素Ａの代わりにブドウ糖が添加された培地で培養し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産することができる。

また、本願において、アシル転移酵素活性を有する微生物は、ドナーからアシル基が伝達される受容体を生合成することができるが、これに限定されない。
具体的には本願の微生物は、アシル基の受容体であるＬ−メチオニン生産能を有し、Ｌ−メチオニンが添加されていない培地で培養されても、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産することができる。

また、本願においてアシル転移酵素活性を有する微生物は、前記アシル転移酵素とは別に、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能を増進させるために、生合成関連経路や基質排出能力に関連するメカニズムなどに対し、従来の公知となった変異がさらに導入された変異微生物であってもよい。

本願は一態様として、アシル転移酵素の活性を有する、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列、又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドを提供する。
具体的には、前記アシル転移酵素の活性は、Ｌ−メチオニンのアセチル転移活性であってもよい。
前記ポリペプチドは、前述した通りである。

本願は一態様として、アシル転移酵素の活性を有する、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列、又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記ポリペプチドは、前述した通りである。

例えば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号７〜配列番号１２のいずれか一つの塩基配列であってもよいが、これらに限定されない。また、前記ポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同一アミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本願に含まれる。たとえば、使用される微生物に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。

具体的には、前記塩基配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有し、実質的に前記塩基配列と同一または相応にアシル転移酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよい。
または公知となった遺伝子配列から調製することができるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳しい条件下でハイブリッド化し、アシル転移酵素の活性を有するポリペプチドを暗号化する配列であってもよい。「厳しい条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示すと、相同性が高い遺伝子同士、例えば、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士がハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件を列挙することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)（非特許文献２））。

前記ハイブリッド化に使用されたプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。このようなプローブは、公知となった配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、このような塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲにより作製することができる。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を使用することができる。
より具体的にはプローブとして、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を使用する場合には、ハイブリッド化の洗浄条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳが列挙される。

本願で使用される遺伝子、これらがコードするポリペプチド配列及びプロモーター配列などは、公知となったデータベースから取得することができ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得ることができるが、これに限定されない。

本願は一態様として、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

本願のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現することができる発現ベクターであり、ポリヌクレオチド挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須調節要素を含むポリヌクレオチド作製物をいう。前記製造された組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）または形質感染（transfection）させることにより、目的とするタンパク質を得ることになる。

本願で提供されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、及びＹＣｐ５０）、及びアグロバクテリウム媒介形質転換に使用できるＴｉプラスミドを含む。
ファージＤＮＡの具体的な例としては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、及びλＺＡＰ）が挙げられる。
また、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）またはワクチニアウイルス（vaccinia virus）のような動物ウイルス、バキュロウイルス（baculovirus）のような昆虫ウイルス、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）、一本鎖ウイルスまたはジェミニウイルス由来のウイルスベクターも使用することができる。

なお、本発明のベクターとして、核酸発現活性化タンパク質（例えば、Ｂ４２）が連結された融合プラスミド（fusion plasmid、例えば、ｐＪＧ４−５）が使用されてもよい。
また、本発明において回収される目的タンパク質の精製を容易にするために、プラスミドベクターは、必要に応じて他の配列をさらに含むことができる。このような融合プラスミドにおいてはＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどをタグ（tag）に含めることができるが、前記例により本発明の融合プラスミドが限定されるものではない。

また、前記融合タンパク質の製造において、クロマトグラフィー工程を含むことができ、前記融合タンパク質は、特に親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合した場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを利用することができ、ヘキサヒスチジンが使用された場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンカラム（Novagen、USA）を利用して、希望の目的タンパク質を容易に回収することができる。

本願のポリヌクレオチドをベクターに挿入するために、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断して、適当なベクターＤＮＡの制限部位またはクローニング部位に挿入する方法が使用されてもよい。

本願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに作動可能に連結されてもよい。本願のベクターは、プロモーター及び本願の核酸以外に、エンハンサー（enhancer）のようなシス要素（cis element）、スプライシング・シグナル（splicing signal）、ポリＡ追加シグナル（poly A addition signal）、選択マーカー（selection marker）、リボソーム結合配列（ribosome binding sequence、SD sequence）などをさらに含むことができる。
選択マーカーの例として、クロラムフェニコール抵抗核酸、アンピシリン抵抗核酸、ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase）、ネオマイシン抵抗核酸などが使用されてもよいが、前記例により作動可能なように連結される追加の構成要素が制限されるものではない。
本発明において、用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体の因子として、または染色体統合完成により複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入し、人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。

前記形質転換により、本願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたは前記発現ベクターの一部を宿主細胞内に導入することができるが、ここで、前記発現ベクターの一部とは、宿主細胞内に前記アシル転移酵素活性を付与することができるように、本願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド部分を含む発現ベクターの部分を意味する。例えば、アグロバクテリア媒介形質転換法において宿主細胞内に伝達されるＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。

本願の形質転換方法としては、任意の形質転換方法が使用されてもよく、当業界の通常の方法により容易に行うこともできる。一般的に、形質転換の方法には、ＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）という還元物質を使用することにより、効率を高めたＨａｎａｈａｎ法、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などがある。
本願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界において一般的に使用される形質転換または形質感染方法を制限なく使用することができる。

本願において形質転換体の製造に使用することができる宿主細胞の種類は、本願のポリヌクレオチドを発現させる限り、特に限定されない。本発明に使用することができる宿主の特定の例としては、大腸菌（E. coli）のようなエスケリチア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞がある。
本発明に使用することができる大腸菌菌株の具体的な例としては、ＣＬ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１、またはＨＢ１０１が、バチルス・サブチリス菌株の具体的な例としては、ＷＢ７００またはＬＫＳ８７がある。

本願のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体は、形質転換細胞または生物の形態であってもよい。

本願においてプロモーターとしては、本願のポリヌクレオチドを宿主で発現させる限り、いかなるプロモーターも使用することができる。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、またはＰＲプロモーターのような大腸菌またはファージ由来プロモーター；Ｔ７プロモーターのような大腸菌感染ファージ由来プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＭＡＳまたはヒストンプロモーター、ｃｊ７プロモーター（韓国公開公報第１０−２００４−０１０７２１５号（特許文献２））が使用されてもよい。また、ｔａｃプロモーターのような人工的に変形されたプロモーターも使用することができる。

本願は一態様として、（ｉ）本願の微生物またはその培養物；（ｉｉ）本願のポリペプチド；またはこれらの組み合わせを用いて、Ｌ−メチオニンをアセチル化する段階を含む、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造方法を提供する。

具体的には、前記製造方法は、（ｉ）本願の微生物またはその培養物；（ｉｉ）本願のポリペプチド；またはこれらの組み合わせを用いてＬ−メチオニンをアセチル化する段階；及び前記アセチル化されたＬ−メチオニンである、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを回収する段階を含むことができる。

本願において「培養」とは、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は、当業界において公知となっている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は選択された菌株に応じて、当業者が容易に調整して使用することができる。前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。本願の微生物の培養に使用される培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特別な制限なくいずれも使用することができるが、具体的には本願の微生物を、適切な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／またはビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

本願において、前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどのような炭水化物；糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのようなアルコール、有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのようなアミノ酸などが含まれるが、これらに限定されない。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を使用することができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適正量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用したり、２種以上を組み合わせて使用することができる。

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源を使用することができる。これらの窒素源は、単独で使用したり、２種以上を組み合わせて使用することができるが、これらに限定されない。

前記リン源としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、またはこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれてもよい。
無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン、及び／または適切な前駆体などが含まれてもよいが、これらに限定されない。
これら培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加することができるが、これに限定されない。

本願においては、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。
また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。
また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。

培養物の温度は、本願の微生物によって異なり、具体的には２０℃〜５０℃、より具体的には２５℃〜４０℃であってもよいが、これらに限定されない。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで継続されてもよく、具体的には１０時間〜１００時間であってもよいが、これに限定されない。

また、本願において、用語「培養物」とは、本願の微生物を培養した後に得られた産物を意味する。前記培養物は、微生物を含む形態、及び前記微生物を含む培養液から遠心分離などで微生物を除去した形態をすべて含む概念である。

また、本願において、Ｌ−メチオニンは、本願の微生物が生産するか、または培地に添加されたものであってもよい。

また、本願において、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを回収する段階では、本願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて、培養液から目的とするＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを回収することができる。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよく、また、当該分野において公知となった適切な方法を組み合わせて使用することができる。

前記回収段階は、分離工程及び／または精製工程を含むことができる。

本願は一態様として、（ｉ）本願の微生物またはその培養物；（ｉｉ）本願のポリペプチド；またはこれらの組み合わせを有効成分として含む、Ｌ−メチオニンからのＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造用の組成物を提供する。前記微生物、培養物、ポリペプチド及びＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンは前述した通りである。

以下、本願を下記の実施例により詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本願を例示するためのものに過ぎず、下記実施例により、本願の範囲が制限されるものではない。

実施例１．Ｎ−アセチルメチオニン生産新規酵素の選別
実施例１−１．Ｎ−アセチルＬ−メチオニン生産微生物の選別
Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物として、ランダムに選別された６種の微生物培養液（シュードモナス・プチダ、バチルス・サブチリス、エンテロバクターｓｐ．６３８、シュードビブリオｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１、ヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ−２６１３（商標））、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２）からの生成物である、Ｎ−アセチルメチオニンスポット（ｓｐｏｔ）を確認した。

具体的には、シュードモナス・プチダ、バチルス・サブチリス、エンテロバクターｓｐ．６３８、ヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆの場合、ＹＰＤ（１％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２％ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ）液体培地３ｍｌを含有する１４ｍｌの使い捨て培養チューブに接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。メチオニン０．５％（５ｇ／Ｌ）を含むＹＰＤ液体培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。

また、シュードビブリオｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１の場合、ＢＡＣＴＯ Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ（Difco 2216）液体培地３ｍｌを含有する１４ｍｌの使い捨て培養チューブに接種し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。メチオニン０．５％（５ｇ／Ｌ）を含むＢＡＣＴＯ Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ液体培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。

また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２の場合、専用の複合液体培地（成分は下記表示）３ｍｌを含有する１４ｍｌの使い捨て培養チューブに接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。メチオニン０．５％（５ｇ／Ｌ）を含む複合液体培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。

＜複合液体培地＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）

培養を終了した後、５０℃のオーブンで一晩静置して培養液を濃縮し、濃縮された培養液１μｌを、薄層クロマトグラフィーを用いて分析した。対照群として１０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン試薬（Sigma Aldrich 01310）の１μｌを使用した。前記６種の微生物の培養液濃縮液で対照群と同じスポットを確認した。

前記結果から、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能を有する６種の微生物は、Ｌ−メチオニンを基質とするアシル転移酵素を有すると予測された。

実施例１−２．新規アシル転移酵素配列の確認
実施例１−１で選別された微生物６種のメチオニンアシル転移酵素を選別した。選別されたタンパク質は、既存のメチオニンアシル転移酵素として公知となったＹｎｃＡのアミノ酸配列に基づいて、前記微生物の種にデータベースを制限し、それぞれ異種相同性検索を行った。その結果、検出された６種の酵素は、すべてＹｎｃＡアミノ酸配列との相同性が低い方であり、最も高いエンテロバクターｓｐ．６３８由来のアシル転移酵素において、配列の相同性が８２％であった。各酵素のＹｎｃＡとの相同性を表１に記載した。

かかる結果は、前記６種のポリペプチドは、従来のアシル転移酵素との相同性が低い、新規なアシル転移酵素活性を有するポリペプチドであり、これを含む微生物も、従来知られていない新規なアシル転移酵素活性を有する微生物であることを示唆するものである。

実施例２．新規なアシル転移酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素転換方法によるＮ−アセチルメチオニンの生産
実施例２−１．新規アシル転移酵素遺伝子導入大腸菌の製作
シュードモナス由来、バチルス由来、エンテロバクター由来、シュードビブリオ由来の新規アシル転移酵素遺伝子（配列番号７、８、９、１０）は、各酵素のアミノ酸配列（配列番号１、２、３、４）に基づいて大腸菌に最適化されたコドンとして合成された。

ヤロウィア由来の新規アシル転移酵素遺伝子を獲得するために、ヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ−２６１３（商標））のｇＤＮＡを抽出した。前記ｇＤＮＡを鋳型とし、プライマー１と２を用いた連鎖重合反応を実施して、目的とするサイズの遺伝子（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号５）を得た。

コリネバクテリウム由来の新規アシル転移酵素遺伝子を獲得するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ １３０３２を固体培地に画線で塗抹した後、一晩培養してコロニーを得た。一つのコロニーを鋳型とし、プライマー３と４を用いたＰＣＲ（連鎖重合反応）法を行い、０．５Ｋｂ程度の大きさの遺伝子（配列番号１２）及びアミノ酸配列（配列番号６）を得た。このとき、ＰＣＲ法は、９４℃で５分間変性後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて実施した。

前記６種のＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｂａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理されたｐＵＣｔｋベクターにライゲーションした。前記製作された組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに４２℃、９０秒熱衝撃を加えて形質転換した後、これをカナマイシン含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。前記培養で得られたコロニー一つをカナマイシン含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキット（Bioneer、Korea）を利用して組換えプラスミドを回収した。回収した組換えプラスミドの配列情報をシーケンス（Macrogen、Korea）を通じて確認し、それぞれｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔ、ｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔ、ｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔ、ｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔ、ｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔ、ｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔと命名した。

前記組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に熱衝撃法を用いて導入し、カナマイシン含有ＬＢ固体培地に塗抹した後、生き残ったコロニーを形質転換体として選択した。選択された形質転換体を、それぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔ（または、E. coli CC03-9001）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔ（または、E. coli CC03-9002）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔ（または、E. coli CC03-9003）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔ（または、E. coli CC03-9004）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔ（または、E. coli CC03-9005）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔ（または、E. coli CC03-9006）と命名した。また、前記形質転換体を、ブダペスト条約の下で２０１６年７月１５日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託し、前記記載の順に応じてそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１８６３Ｐ、ＫＣＣＭ１１８６４Ｐ、ＫＣＣＭ１１８６５Ｐ、ＫＣＣＭ１１８６６Ｐ、ＫＣＣＭ１１８６７Ｐ、ＫＣＣＭ１１８６８Ｐが与えられた。

選択された形質転換大腸菌のＮ−アセチルメチオニン生産能力を事前調査するために、コロニー一つをカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖０．２％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種し、３７℃で５時間培養後、メチオニンを２％（ｗ／ｖ）になるように添加して３時間さらに培養した。前記培養液１μｌを使用して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析により、Ｎ−アセチルメチオニンを生産するかどうかを事前に調査した。前記培養液の全部でＮ−アセチルメチオニンと推定されるスポットが発見され、スポットの濃さは、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔの順であった。

実施例２−２．新規アシル転移酵素を用いたＮ−アセチルメチオニン生産能の確認
前記実施例２−１で作製した形質転換大腸菌のコロニー一つをカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖０．２％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種し、３７℃で８時間培養した後、同じ培地５０ｍｌに接種して一晩培養した。前記培養液を遠心分離してペレットを得、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸バッファー５ｍｌに懸濁した後、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを利用して細胞を破砕した。細胞ｄｅｂｒｉｓは１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去し、上澄み液を得た。新規アシル転移酵素のサイズがすべて１９ｋＤａ付近であることを勘案し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Milipore、Ireland）３０−ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅを通過した濾過液を、１０−ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅに通してフィルタの上に残った濃縮液を得た。前記濃縮液をＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅが充填されたＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（ＧＥ、ＵＳＡ）に充填し、ＮａＣｌ濃度ｇｒａｄｉｅｎｔ（８０、１００、１５０、２００、３００、５００ｍＭの順）を利用して、新規アシル転移酵素を純粋に分離した。希釈した酵素を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０−ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅに通して再濃縮した。新規アシル転移酵素の過発現程度と精製程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。

前記精製された新規アシル転移酵素の活性度を分析するために、２０ｍＭのアセチル補酵素Ａ、２０ｍＭメチオニンを含有するｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸バッファーに、酵素濃縮液を入れて３７℃で１０分間反応させた後、生成されたＮ−アセチルメチオニンの量をＨＰＬＣ（Shimadzu、system controller CBM-20A、及びその他のアクセサリー）を用いて測定した。また、前記精製された新規アシル転移酵素の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析法により測定した後、生成されたＮ−アセチルメチオニン値を酵素の濃度で除して酵素の比活性を比較した（表３）。

精製された新規アシル転移酵素中、シュードモナス・プチダ由来の酵素が３．８Ｕ／ｍｇと最も高い比活性を示したが、これは、文献上のＹｎｃＡの比活性が０．７４５Ｕ／ｍｇであることと比較すると（US 8143031 B2（特許文献１）、Table 3）、５倍も高い活性である。その他、バチルス・サブチリス由来の酵素とエンテロバクターｓｐ．６３８由来の酵素は、それぞれ１．６Ｕ／ｍｇ、１．７Ｕ／ｍｇの比活性を示し、これもＹｎｃＡ比２倍以上の活性である。シュードビブリオｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１、ヤロウィア・リポリティカ、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の新規アシル転移酵素の比活性は、１Ｕ／ｍｇ未満と低かったが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の発現量が少なくなく、宿主内における発現量の程度に応じて、形質転換体のＮ−アセチルメチオニン生産能の向上を期待することができる（表３）。

実施例３．シュードモナス・プチダ由来の新規アシル転移酵素を用いたＮ−アセチルメチオニンの転換反応
実施例３−１．シュードモナス・プチダ由来の精製された新規アシル転移酵素を用いたＮ−アセチルメチオニンの転換反応
前記実施例２において、比活性が最も高かったシュードモナス・プチダの精製酵素１ｍｇを用いて、メチオニン転換反応を行った。反応液として、２０ｍＭのメチオニンと２０ｍＭのアセチル補酵素Ａを含有するｐＨ７．０の５０ｍＭのリン酸バッファー３ｍｌを使用した。３７℃、１５０ｒｐｍの条件で３時間反応後、反応液をＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）で分析したとき、３．１ｇ／ＬのＮ−アセチルメチオニンの生成を確認することができた。これは、反応液中のメチオニンとアセチル補酵素Ａを７５％以上転換した値である。

実施例３−２．シュードモナス・プチダ由来のアシル転移酵素を導入した細胞の細胞膜透過性の増加によるＮ−アセチルメチオニンの転換反応
実施例２で製造されたシュードモナス・プチダ由来の新規アシル転移酵素遺伝子を導入して作成された形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔのコロニー一つを、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖１％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種し、３７℃で８時間培養した後、培養液５００μｌをカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖０．２％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地５０ｍｌに接種して一晩培養した。培養液から遠心分離を用いて細胞ペレットを得、零下２０℃の冷凍庫で冷凍した。完全に凍結した細胞ペレットを室温で再び溶かし、冷凍する過程を３回繰り返して細胞膜に高透過性を付加した。ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸バッファーを加え、合計体積が５ｍｌになるように再懸濁して培養液を濃縮した。
１５ｍｌ試験管にメチオニン２％（ｗ／ｖ）を含有する５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１．８ｍｌ；メチオニン２％（ｗ／ｖ）、アセチル補酵素Ａ２０ｍＭを含有する５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１．８ｍｌ；及びメチオニン２％（ｗ／ｖ）、ブドウ糖２％（ｗ／ｖ）を含有する５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１．８ｍｌをそれぞれ入れ、前記過程を経て得られた細胞膜透過性が増加した酵素菌２００μＬずつを混合し、それぞれ合計２ｍｌになるように調製した後、３７℃、１５０ｒｐｍで１０時間反応させた。前記反応液にブドウ糖を添加する目的は、反応過程で不足し得るアセチル補酵素Ａの生成量を増加させるためのもので、大腸菌の生存のためのものではない。反応液をＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）で分析した結果を表４に記載した。
発酵のときからアセチル補酵素Ａを添加したとき、添加していないときよりモル転換率が増加する結果を示した。また、アセチル補酵素Ａの代わりに、ブドウ糖のみを添加してもモル転換率が増加していることから見て、ブドウ糖の添加により、アセチル補酵素Ａの増加分が生成されると推定された。高透過性膜を有する菌株を用いた結果、Ｎ−アセチルメチオニンの高濃度生産が可能になり、アセチル補酵素Ａの代わりに、ブドウ糖のみを培地に添加しても、Ｎ−アセチルメチオニンが高濃度で生産された。

実施例４．新規アシル転移酵素を導入した形質転換体の発酵によるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産
実施例４−１．新規アシル転移酵素を導入した大腸菌によるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産
実施例２で作製した形質転換体６種の各コロニー一つを、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖１％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種し、３７℃で８時間培養した後、培養液５００μｌをカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖０．２％（ｗ／ｖ）、メチオニン２％（ｗ／ｖ）を含有するＬＢ液体培地５０ｍｌに接種して、一晩培養した。その時、対照群としてｐＵＣｔｋ空ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して使用した。培養液内の細胞を遠心分離で除去し、ＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）を用いて、生成されたＮ−アセチルメチオニンを分析した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔの場合、最も高い３．０３ｇ／Ｌの濃度でＮ−アセチルメチオニンを生産し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔが２．２３ｇ／Ｌで２番目に高いＮ−アセチルメチオニン濃度を示した。空ベクターの場合も微量のＮ−アセチルメチオニンが検出されたが、これは、大腸菌が保有しているＹｎｃＡ酵素の役割によると推定される（表５）。

実施例４−２．新規アシル転移酵素を導入したコリネバクテリウムによるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの生産
４−２−１．コリネバクテリウム属微生物導入用アシル転移酵素過発現ベクターの製作
前記実施例１で確認された新規アシル転移酵素（配列番号１、２、３、４、５、６）のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産効果をコリネバクテリウム属微生物で確認するために、当該遺伝子を過発現するためのベクターを作製した。塩基配列７、８、９、１０、１１、１２に基づいて５’末端にＥｃｏＲＶ制限酵素部位を挿入したプライマーと、３’末端にＰｓｔＩ部位を挿入したプライマーを合成した。

塩基配列７に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔを鋳型とし、プライマー５と６を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列８に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔを鋳型とし、プライマー７と８を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列９に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔを鋳型とし、プライマー９と１０を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１０に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔを鋳型とし、プライマー１１と１２を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１１に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔを鋳型とし、プライマー１３と１４を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１２に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔを鋳型とし、プライマー１５と１６を用いたＰＣＲ法により重合された。

アシル転移酵素のプロモーターとしては、ｃｊ７プロモーター（韓国公開公報第１０−２００４−０１０７２１５号（特許文献２））を使用した。プロモーターｃｊ７ ＤＮＡ断片を取得するために、５’末端にＫｐｎＩ制限酵素を挿入したプライマーと、３’末端にＥｃｏＲＶ部位を挿入したプライマーを合成し、ｐ１１７−ｃｊ１−ｇｆｐを鋳型としたＰＣＲ法によりｃｊ７プロモーターを増幅した（韓国公開特許第１０−２００４−０１０７２１５号（特許文献２））。このとき、ＰＣＲ法は、９４℃で５分間変性後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて実施した。

増幅された６種のアシル転移酵素ポリヌクレオチドを制限酵素ＰｓｔＩで処理してＤＮＡ切片を獲得し、プロモーターｃｊ７ポリヌクレオチドは、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで処理してＤＮＡ切片を獲得した。６つのＤＮＡ切片を獲得した後、エスケリチアとコリネバクテリウムのシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７ベクターのＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ部位に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより、遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常、公知となったプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得し、それぞれｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｐｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｂｓｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｅｎｔｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｖｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｙｌｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｃｇｍａｔと命名した。

４−２−２．新規アシル転移酵素過発現ベクターの導入菌株製作及びＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能の確認
前記実施例４−２−１で製造したベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｐｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｂｓｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｅｎｔｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｖｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｙｌｍａｔ、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｃｇｍａｔと実験対照群のｐＥＣＣＧ１１７ベクターを、それぞれ電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入した後、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含む複合平板培地に塗抹し、３０℃で２４時間培養してコロニーを獲得した。獲得した菌株は、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｐｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｂｓｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｅｎｔｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｖｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｙｌｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｃｇｍａｔ、１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７と命名した。
形質転換体のＮ−アセチルメチオニン生産能を確認するために、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含む複合液体培地３ｍｌを含有する１４ｍｌの使い捨て培養チューブに前記菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）とメチオニン２％（２０ｇ／Ｌ）を含む複合液体培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養を終了した後、ＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）を利用してＮ−アセチルメチオニン濃度を分析した（表６）。

対照群として製作した形質転換体１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７の場合、１．０７ｇ／ＬのＮ−アセチルメチオニンが生産されたが、これは、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムが保有するアシル転移酵素の能力によると見られ、６種の新規アシル転移酵素を過発現させた結果、元来の能力よりもさらに多くのＮ−アセチルメチオニンが生産されることを確認することができた。

＜複合平板培地＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水１Ｌ基準）

＜複合液体培地＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水１Ｌ基準）

実施例４−３．新規アシル転移酵素が導入されたサッカロマイセスによるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産
４−３−１．サッカロマイセス用アシル転移酵素過発現ベクターの製作
前記実施例１にて確認された新規アシル転移酵素（配列番号１、２、３、４、５、６）のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産効果をサッカロマイセスで確認するために、その遺伝子を過発現するためのベクターを製作した。塩基配列７、８、９、１０、１１、１２に基づいて５’末端にＳｐｅＩ制限酵素部位を挿入したプライマーと、３’末端にＸｈｏＩ部位を挿入したプライマーを合成した。

塩基配列７に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔを鋳型とし、プライマー１７と１８を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列８に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔを鋳型とし、プライマー１９と２０を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列９に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔを鋳型とし、プライマー２１と２２を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１０に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔを鋳型とし、プライマー２３と２４を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１１に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔを鋳型とし、プライマー２５と２６を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１２に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔを鋳型とし、プライマー２７と２８を用いたＰＣＲ法により重合された。このとき、ＰＣＲ法は、９４℃で５分間変性後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて実施した。

増幅された６種のアシル転移酵素ポリヌクレオチドを、制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩで処理してＤＮＡ切片を獲得した。６つのＤＮＡ切片を獲得した後、エスケリチアとサッカロマイセスシャトルベクターであるｐ４１４ＡＤＨのＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ部位に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより、遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミドミニプレップキット（Bioneer、Korea）を利用してプラスミドを獲得し、それぞれｐ４１４ＡＤＨ−ｐｐｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｂｓｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｅｎｔｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｐｖｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｙｌｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｃｇｍａｔと命名した。

４−３−２．アシル転移酵素過発現ベクターを導入した菌株の製作及びＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能の確認
前記実施例４−３−１で製造したベクターｐ４１４ＡＤＨ−ｐｐｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｂｓｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｅｎｔｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｐｖｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｙｌｍａｔ、ｐ４１４ＡＤＨ−ｃｇｍａｔと実験対照群のｐ４１４ＡＤＨベクターそれぞれを、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから分譲を受けた野生型酵母中、代表的なサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ（韓国登録特許第１０−１５７７１３４（特許文献３））に、酵母形質転換法を用いて導入した。サッカロマイセス・セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄに導入した後、ＹＰＤ（１％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２％ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ）平板培地に塗抹して、３０℃で２４時間培養してコロニーを獲得した。獲得した菌株は、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｐｐｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｂｓｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｅｎｔｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｐｖｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｙｌｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨ−ｃｇｍａｔ、ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨと命名した。
形質転換体のＮ−アセチルメチオニン生産能を確認するために、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＹＰＤ液体培地３ｍｌを含有する１４ｍｌの使い捨て培養チューブに前記菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。メチオニン０．５％（５ｇ／Ｌ）を含むＹＰＤ液体培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養を終了した後、ＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）を利用して、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン濃度を分析した（表７）。

形質転換体ＳｃＣＥＮ／ｐ４１４ＡＤＨについて示されるように、サッカロマイセス・セレビシエは自主的にＮ−アセチルメチオニンを生産していないと認められるが、６種の新規アシル転移酵素が過発現された菌株の場合、Ｎ−アセチルメチオニン生産能を有することが確認された。

実施例４−４．新規アシル転移酵素が導入されたヤロウィアによるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの生産
実施例４−４−１．ヤロウィア用アシル転移酵素過発現ベクターの製作
前記実施例１にて確認された新規アシル転移酵素（配列番号１、２、３、４、５、６）のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産効果をヤロウィアで確認するために、それらの遺伝子を過発現するためのベクターを製作した。塩基配列７、８、９、１０、１１、１２に基づいて５’末端と３’末端にＫｐｎＩ制限酵素部位を挿入したプライマーを合成した。

塩基配列７に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｐｍａｔを鋳型とし、プライマー２９と３０を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列８に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｂｓｍａｔを鋳型とし、プライマー３１と３２を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列９に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｅｎｔｍａｔを鋳型とし、プライマー３３と３４を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１０に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｐｖｍａｔを鋳型とし、プライマー３５と３６を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１１に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｙｌｍａｔを鋳型とし、プライマー３７と３８を用いたＰＣＲ法により重合された。塩基配列１２に基づく遺伝子は、前記実施例１のベクターｐＵＣｔｋ−ｃｇｍａｔを鋳型とし、プライマー３９と４０を用いたＰＣＲ法により重合された。このとき、ＰＣＲ法は、９４℃で５分間変性後、９４℃／３０秒の変性、５６℃／３０秒のアニーリング、７２℃／１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて実施した。

増幅された６種のアシル転移酵素ポリヌクレオチドを、制限酵素ＫｐｎＩで処理してＤＮＡ切片を獲得した。６つのＤＮＡ切片を獲得した後、エスケリチアとヤロウィアシャトルベクターｐＩＭＲ５３＿ＡＵＸ（FEMS Microbiology Letters, Volume 199, Issue 1, pages 97-102, May 2001（非特許文献３））のＫｐｎＩ部位に連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ法により、遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミドミニプレップキット（Bioneer、Korea）を利用してプラスミドを獲得し、それぞれｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｐｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｂｓｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｅｎｔｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｖｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｙｌｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｃｇｍａｔと命名した。

４−４−２．アシル転移酵素過発現ベクターを導入した菌株の製作及びＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン生産能の確認
前記実施例４−４−１で製造したベクターｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｐｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｂｓｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｅｎｔｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｖｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｙｌｍａｔ、ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｃｇｍａｔと、実験対照群のｐＩＭＲ５３＿ＡＵＸベクターのそれぞれを、米国生物資源センター（American type Culture Collection）から購入したヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ−２６１３（商標））に、酵母形質転換法を用いて導入した。ヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆに導入した後、ＹＰＤ（１％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２％ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ）平板培地に塗抹して、３０℃で２４時間培養してコロニーを獲得した。獲得した菌株は、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｐｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｂｓｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｅｎｔｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｐｖｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｙｌｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕ−ｃｇｍａｔ、Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３Ｕと命名した。
形質転換体のＮ−アセチルメチオニン生産能を確認するために、ＹＰＤ液体培地３ｍｌを含有する１４ｍｌ使い捨て培養チューブに前記菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養して種培養液を確保した。メチオニン０．５％（５ｇ／Ｌ）を含むＹＰＤｍ液体培地（ブドウ糖１０ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ３．２８ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ３．２２ｇ、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ ５０ｇ／１Ｌ基準）２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに前記種培養液１ｍｌを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養を終了した後、ＨＰＬＣ（SHIMADZU、SYSTEM CONTROLLER CBM-20A、及びその他のアクセサリー）を利用して、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン濃度を分析した（表８）。

ヤロウィア・リポリティカの野生型が保有するアシル転移酵素の効果により、形質転換体Ｙｌ／ｐＩＭＲ５３ＵもＮ−アセチルメチオニンを生産したようであるが、６種の新規アシル転移酵素が過発現された菌株の場合、より良いＮ−アセチルメチオニンの生産を確認することができた。

前記のような結果は、本発明で新たに開発されたアシル転移酵素及びこれを含む微生物が、既知のアシル転移酵素であるＹｎｃＡよりも、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの生産能に優れることを示唆している。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解できるであろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。
本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (9)

1. 配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、アシル転移酵素活性を有する微生物。
2. 前記微生物は、エスケリチア属（Escherichia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）及びヤロウィア属（Yarrowiasp.)からなる群から選択される、請求項１に記載の微生物。
3. 前記微生物は、Ｌ−メチオニンへのアセチル転移活性を有し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生産する、請求項１に記載の微生物。
4. Ｌ−メチオニンへのアセチル転移活性を有する、配列番号１〜配列番号６のいずれか一つのアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
5. 請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
7. （ｉ）請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の微生物またはその培養物；（ｉｉ）請求項４に記載のポリペプチド；またはこれらの組み合わせを有効成分として含む、Ｌ−メチオニンからのＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造用の組成物。
8. （ｉ）請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の微生物またはその培養物；（ｉｉ）請求項４に記載のポリペプチド；またはこれらの組み合わせを用いてＬ−メチオニンをアセチル化する段階を含む、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造方法。
9. 前記アセチル化されたＬ−メチオニンであるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを回収する段階をさらに含む、請求項８に記載の製造方法。