JP2015517816A5 - - Google Patents
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Claims (20)
- ポリヌクレオチドコンストラクトの1又は2以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法であって、
a)組込みポリヌクレオチドコンストラクトにより形質転換された真菌宿主細胞を供給し、ここで該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドとを含み、ここで該第1ポリヌクレオチド、その5′未翻訳領域及び/又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に5又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み;
b)前記形質転換された真菌宿主細胞を、前記選択マーカーの発現を促進する条件下で培養し;そして
c)前記ポリヌクレオチドコンストラクトの1又は2以上のコピー;好ましくは2以上のコピー;さらにより好ましくは3以上のコピー、最も好ましくは4以上のコピーを、ゲノム内に組み込まれた状態で含む、組換え真菌宿主細胞を単離すること、
を含む、方法。 - 前記真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞;好ましくはアクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、ブジェルカンデラ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、コプリヌス(Coprinus)、コリオラス(Coriolus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオプソラ(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス(Neocallimastix)、ネウロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、フィレビア(Phlebia)、ピロミセス(Piromyces)、プレウロタス(Pleurotus)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロマイセス(Talaromyces)、サーモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)、又はトリコデルマ(Trichoderma)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(a)における真菌宿主細胞が成長不全を有し、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが前記宿主細胞のゲノム中に組込まれると、前記成長不全を補完し、好ましくは、前記段階(a)における真菌宿主細胞が、機能的硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、それぞれ機能的硝酸レダクターゼ、例えばniaDをコードする遺伝子、又は機能的亜硝酸レダクターゼ、例えばniiZをコードする遺伝子を含み;又は前記段階(a)における真菌宿主細胞が、機能的エノラーゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが機能的エノラーゼ、例えばacuNをコードする遺伝子を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、4個又はそれ以下のヌクレオチド;好ましくは3個又はそれ以下のヌクレオチド;より好ましくは2個又はそれ以下のヌクレオチド;さらにより好ましくは、1個のヌクレオチドを有し;さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも1つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、0個のヌクレオチドを有する、請求項1〜3の何れか1項記載の方法。
- 前記スピライセオソームイントロンが、配列番号24、 配列番号25、 配列番号26、 配列番号27、 配列番号28、 配列番号29、 配列番号30、 配列番号31、 配列番号32、 配列番号33、 配列番号34、 配列番号35、 配列番号36、 配列番号37、 配列番号38、 配列番号39 及び配列番号40から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜7の何れか1項記載の方法。
- 前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第1ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し;好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)におけるthiA又はnmtA遺伝子に由来する、請求項1〜5の何れか1項記載の方法。
- 前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第2ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素;好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項1〜6の何れか1項記載の方法。
- 真菌宿主細胞の形質転換及び前記細胞のゲノム中への組込みに適したポリヌクレオチドコンストラクトであって、
a)選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチド、ここで前記第1ポリヌクレオチド、その5′未翻訳領域及び/又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に5個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロン;及び
b)目的のポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチドコンストラクト。 - 機能的硝酸レダクターゼ、例えばniaDをコードする遺伝子、機能的亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は機能的エノラーゼ、例えばacuNをコードする遺伝子を含む、請求項8に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
- 前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に4個又はそれ以下のヌクレオチド;好ましくは3個又はそれ以下のヌクレオチド;より好ましくは2個又はそれ以下のヌクレオチド;さらにより好ましくは、1個のヌクレオチドを有し;さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも1つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、0個のヌクレオチドを有する、請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
- 前記スピライセオソームイントロンが、配列番号24、 配列番号25、 配列番号26、 配列番号27、 配列番号28、 配列番号29、 配列番号30、 配列番号31、 配列番号32、 配列番号33、 配列番号34、 配列番号35、 配列番号36、 配列番号37、 配列番号38、 配列番号39 及び配列番号40から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
- 前記第1ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し;好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)におけるthiA又はnmtA遺伝子に由来する、請求項8〜11の何れか1項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
- 前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第2ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素;好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項8〜12の何れか1項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
- ポリヌクレオチドコンストラクトの1又は2以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞であって、該コンストラクトが、
a)選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチド、ここで前記第1ポリヌクレオチド、その5′未翻訳領域及び/又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に5個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み;及び
b)目的のポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチド、
を含む、組換え真菌宿主細胞。 - 糸状菌宿主細胞;好ましくはアクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、ブジェルカンデラ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、コプリヌス(Coprinus)、コリオラス(Coriolus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオプソラ(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス(Neocallimastix)、ネウロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、フィレビア(Phlebia)、ピロミセス(Piromyces)、プレウロタス(Pleurotus)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロマイセス(Talaromyces)、サーモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)、又はトリコデルマ(Trichoderma)細胞である、請求項14に記載の組換え真菌宿主細胞。
- 前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に4個又はそれ以下のヌクレオチド;好ましくは3個又はそれ以下のヌクレオチド;より好ましくは2個又はそれ以下のヌクレオチド;さらにより好ましくは、1個のヌクレオチドを有し;さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも1つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、0個のヌクレオチドを有する、請求項14又は15に記載の組換え真菌宿主細胞。
- 前記スピライセオソームイントロンが、配列番号24、 配列番号25、 配列番号26、 配列番号27、 配列番号28、 配列番号29、 配列番号30、 配列番号31、 配列番号32、 配列番号33、 配列番号34、 配列番号35、 配列番号36、 配列番号37、 配列番号38、 配列番号39 及び配列番号40から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項14又は15に記載の組換え真菌宿主細胞。
- 前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第1ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し;好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)におけるthiA又はnmtA遺伝子に由来し;さらにより好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるthiA又はnmtA遺伝子のリボスイッチを含み;最も好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるthiA又はnmtA遺伝子のリボスイッチから成る、請求項14〜17の何れか1項に記載の組換え真菌宿主細胞。
- 前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第2ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素;好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項14〜18の何れか1項に記載の組換え真菌宿主細胞。
- 目的のポリペプチドの生成方法であって、
a)請求項14〜19の何れか1項に記載の組換え真菌宿主細胞を培養し;そして
b)ポリペプチドを回収する、方法。
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