CN104513301A

CN104513301A - 获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN104513301A
Application number: CN201310455321.6A
Authority: CN
Inventors: 程功; 肖小平
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN104513301B

Abstract

本发明公开了一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。本发明进一步证实，AaCECN蛋白可以有效降低登革热病毒的感染能力。本发明具有广阔应用前景。

Description

获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。

背景技术

天蚕素（cecropins）是最早发现的昆虫抗菌肽，1980年，由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。

抗菌肽的作用机理分为两种，即膜结构破坏型机制和非膜结构破坏型机制。

（一）膜结构破坏型机制。

该机制被广泛认为是抗菌肽的主要作用机理，该机制认为带阳离子的抗菌肽具有膜结合活性，与负电性的脂多糖紧紧结合或者中和细胞壁上某一区域的电荷，导致细胞壁结构变形，抗菌肽可以穿过细胞壁，然后通过静电作用结合到细胞膜表面，随后抗菌肽疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，穿过细胞外膜，然后杀死细菌。

（二）非膜结构破坏型机制。

有些抗菌肽能够通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成，或是破坏细胞壁结构，从而杀死靶细胞，有些抗菌肽可以通过抑制细胞呼吸、抑制细胞外膜蛋白的合成杀死细菌。

据统计，因蚊子叮咬死亡的人数比其它任何动物导致的死亡人数更多，这是由于蚊子能够传播疟疾、登革热病毒等疾病。据世界健康组织统计，一只蚊子能够感染100多人，在非洲平均每45秒疟疾将导致一名儿童死亡。蚊子虽然能够传播病毒，但是其自身却不会发病，表明蚊子体内免疫系统限制了病毒或者其他病原微生物的生长。蚊子缺乏获得性免疫系统，只能依靠天然免疫系统消灭病原微生物，抗菌肽作为天然免疫系统的一部分可能扮演了重要的角色。

目前，耐药现象是使用抗生素过程中遇到的难题，随着超级耐药菌的出现，寻找新型抗生素就成为了一个迫在眉睫的问题。抗菌肽由于活性高，抗菌谱广，来源多样，而且由于其通过电荷吸附作用于病原微生物的膜上这一特殊机制，使得靶菌株不容易发生突变，因而在医药工业上认为有广阔的应用前景。昆虫只有天然免疫系统的保护，抗菌肽的作用是其免疫功能的重要部分，因此从昆虫分离得到的抗菌肽可能具有更强的抗病原微生物作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。

本发明提供了一种获自埃及伊蚊的天蚕素，将其命名为AaCECN蛋白，为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述AaCECN蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述AaCECN蛋白的基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）所述的DNA分子：（1）序列表的序列2自5’末端第58至186位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有编码所述AaCECN蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

具有所述AaCECN蛋白的融合蛋白（简称AaCECN融合蛋白）也属于本发明的保护范围。

所述AaCECN融合蛋白可为如下（d）或（e）或（f）：

（d）由序列表的序列6自N端第19至94位氨基酸残基组成的蛋白质；

（e）由序列表的序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（f）将（d）或（e）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述AaCECN融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述AaCECN融合蛋白的基因可为如下（5）或（6）或（7）或（8）所述的DNA分子：（5）序列表的序列7自5’末端第55至282位核苷酸所示的DNA分子；（6）序列表的序列7所示的DNA分子；（7）在严格条件下与（5）或（6）限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；（8）与（5）或（6）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有编码所述AaCECN融合蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种抑制微生物增殖和/或复制和/或感染的产品，包括所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白。所述微生物可为病毒，具体可为登革热病毒，更具体可为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明还保护所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革热病毒，更具体可为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明还保护所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白的应用；所述应用为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革热病毒，更具体可为登革热2型病毒，如New Guinea C株。

本发明在埃及伊蚊中鉴定出了新的天蚕素，实验结果显示该天蚕素可以有效降低病原体增殖的能力。天蚕素是一类高度保守的携带正电荷的极性多肽，属于抗菌肽家族，可非特异性的结合到病原体表面并破坏病原体的外膜结构，从而起到杀灭病原体的作用。本发明发现，AaCECN基因被登革热病毒感染诱导表达，在埃及伊蚊体内沉默AaCECN基因可以显著降低埃及伊蚊免疫系统对登革热病毒感染的阻抑作用，AaCECN蛋白可以有效降低登革热病毒的感染能力。本发明具有广阔应用前景。

附图说明

图1为实施例1的结果。

图2为实施例2的结果。

图3为实施例3中的Westernblot图谱。

图4为实施例3中，Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

埃及伊蚊（Aedes aegypti）：参考文献：Colpitts TM,Cox J,Vanlandingham DL,Feitosa FM,Cheng G,et al.(2011)Alterations in the Aedes aegyptiTranscriptome during Infection with West Nile,Dengue and Yellow Fever Viruses.PLoS Pathog7(9):e1002189.doi:10.1371/journal.ppat.1002189.。

实施例中所用的登革热2型病毒（dengue virus type-2，DENV-2）均为登革热2型病毒New Guinea C株；参考文献：Chao Y C,Huang C S,Lee C N,et al.Higherinfection of dengue virus serotype2in human monocytes of patients with G6PDdeficiency[J].PloS one,2008,3(2):e1557.。

质粒pMT/BiP/V5-HisA：Invitrogen公司，产品目录号V4130-20。S2细胞（果蝇S2细胞）：invitation，产品目录号R690-07。Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）：CCL-81^TM。

MID₅₀(50%mosquito Infectious dose)即半数蚊子感染剂量；MID₅₀的数值含义为通过胸腔注射病毒稀释液300nL使半数埃及伊蚊感染病毒的稀释倍数；1MID₅₀为将病毒原液稀释其MID₅₀数值倍数后，胸腔注射300nL可使半数埃及伊蚊感染。

发明人从埃及伊蚊中发现一种多肽，属于天蚕素，命名为AaCECN蛋白，如序列表的序列1所示（自N末端第1至19位氨基酸残基组成信号肽，第20至62位氨基酸残基组成AaCECN成熟肽），其编码基因命名为AaCECN基因，如序列表的序列3所示（其中开放阅读框如序列表的序列2所示）。AaCECN蛋白具有抗菌肽的功能，可以抑制登革热病毒的增殖和/或复制和/感染。

实施例1、DENV-2诱导埃及伊蚊体内AaCECN基因的表达

1、分组处理

实验组（24只埃及伊蚊）：给埃及伊蚊接种登革热2型病毒（每只埃及伊蚊通过胸腔注射剂量为10MID₅₀的DENV-2，注射体积为300nL）；

对照组（22只埃及伊蚊）：每只埃及伊蚊通过胸腔注射300nL PBS缓冲液。

2、完成步骤1的接种6h后，提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，利用荧光定量PCR（SYBR Green）检测埃及伊蚊体内AaCECN基因的表达情况（采用Actin基因为内参）。

用于鉴定AaCECN基因的引物如下：

上游引物：5’-CGGCAAGAAATTGGAAAAAGTC-3’；

下游引物：5’-GAATCGATCATCCTAGGGCC-3’。

用于鉴定Actin基因的引物如下：

上游引物：5’-GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3’；

下游引物：5’-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3’。

结果见图1。结果表明，注射登革热病毒后，埃及伊蚊体内AaCECN基因的表达明显上升。

实施例2、抑制AaCECN基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

一、制备dsRNA

1、设计用于制备抑制AaCECN基因表达的dsRNA的编码DNA的引物如下：

AaCECN-F：5’-GCGCTCCGTCGATCAAGTTC-3’；

AaCECN-R：5’-CAGTGTCTTTCACAATTTAAATCAG-3’。

上述引物中，方框标注的区域为T7启动子序列。

2、提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用AaCECN-F和AaCECN-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用Ambion MEGAscriptT7High YieldTranscription Kit（产品目录号为AM1334）并按试剂盒说明书进行体外转录，由于AaCECN-F和AaCECN-R都具有T7启动子，体外转录形成两条反向互补的单链RNA分子，该两条反向互补的单链RNA分子自发形成序列表的序列4所示的双链RNA分子（dsRNA-1）。

4、设计用于制备抑制GFP基因表达的dsRNA的编码DNA的引物如下：

GFP-F:5’-GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’；

GFP-R:5’-CATGATATAGACGTTGTGGCTGTT-3’；

上述引物中，方框标注的区域为T7启动子序列。

5、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子，以合成的双链DNA分子为模板，用GFP-F和GFP-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

6、取步骤5得到的PCR扩增产物，采用Ambion MEGAscriptT7High YieldTranscription Kit（产品目录号为AM1334）并按试剂盒说明书进行体外转录，由于GFP-F和GFP-R都具有T7启动子，体外转录形成两条反向互补的单链RNA分子，该两条反向互补的单链RNA分子自发形成双链RNA分子（dsRNA-2）。

二、抑制AaCECN基因表达的物质在促进登革热病毒复制中的应用

1、将埃及伊蚊分成两组，分别进行如下处理：

实验组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克dsRNA-1；

对照组：每只埃及伊蚊通过胸腔注射2微克dsRNA-2；

2、完成步骤1的注射3天后，给埃及伊蚊接种登革热2型病毒（每只埃及伊蚊通过胸腔注射剂量为10MID₅₀的DENV-2，注射体积为300nL）。

3、完成步骤2的接种6天后，提取埃及伊蚊的总RNA并反转录为cDNA，利用TaqmanRT-QPCR检测埃及伊蚊体内的登革热2型病毒量（采用Actin基因为内参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测Actin基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3’；

下游引物：5’-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3’。

用于检测Actin基因的探针如下：

5’-FAM-AGGCCCCGCTCAACCCGAAG-TRAMA-3’。

埃及伊蚊体内的登革热2型病毒的病毒量见图2（每个实心圆点代表一只埃及伊蚊）。

结果表明，导入用于抑制AaCECN基因表达的dsRNA-1后，埃及伊蚊体内的登革热2型病毒的病毒量出现明显上升，即抑制AaCECN基因表达可以促进登革热2型病毒在埃及伊蚊体内的复制，即AaCECN基因可以抑制登革热2型病毒在埃及伊蚊体内的复制。

实施例3、AaCECN蛋白在抑制病毒复制中的应用

一、重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA的构建

1、分别合成单链DNA分子甲和单链DNA分子乙，退火后得到双链DNA分子（单链DNA分子甲和单链DNA分子乙中，下划线标注限制性内切酶的识别序列中的部分，得到的双链DNA分子中，上游具有限制性内切酶BglII的粘性末端，下游具有限制性内切酶XhoI的粘性末端）。

单链DNA分子甲：

5’-GATCTCAGCAACAGTGCGGCGTGGAAGCGGCGCCCAGGTGGAAATTCGGCAAGAAATTGGAAAAAGTCGGGAAAAATGTGTTTAACGCTGCTAAGAAGGCACTGCCAGTCGTTGCCGGGTACAAGGCCCTAGGAC-3’

单链DNA分子乙：

5’-TCGAGTCCTAGGGCCTTGTACCCGGCAACGACTGGCAGTGCCTTCTTAGCAGCGTTAAACACATTTTTCCCGACTTTTTCCAATTTCTTGCCGAATTTCCACCTGGGCGCCGCTTCCACGCCGCACTGTTGCTGA-3’

2、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切质粒pMT/BiP/V5-HisA，回收约5000bp的载体骨架。

3、将步骤1得到的双链DNA分子和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA。根据测序结果，对重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA进行结构描述如下：在质粒pMT/BiP/V5-HisA的BglII和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第58至186位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒中，插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列7所示的融合基因，表达序列表的序列6所示的融合蛋白。

序列表的序列6中，自N末端第1至18位氨基酸残基为信号肽（成熟后被切除），第21至63位氨基酸残基为AaCECN成熟肽，第72至85位氨基酸残基组成V5标签，第89至94位氨基酸残基为6×His标签。序列表的序列6中，自N末端第19至94位氨基酸残基组成融合蛋白的成熟肽（由76个氨基酸残基组成，分子量约8.18KD）。

4、借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen,产品目录号为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA转入S2细胞，转染24h后用500mM浓度的Cu2+（以CuSO4的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养），收集上清液并采用Anti-V5鼠单克隆抗体（Anti-V5-tag mAb，购自MBL公司，产品目录号为M167-3）作为一抗进行Westernblot，图谱见图3，可以观察到检测到特异的阳性条带。

二、AaCECN蛋白在抑制病毒复制中的应用

1、实验组的处理

（1）借助转染试剂（Effectene Transfection Reagent,购自Qiagen，产品目录号为301425）并按说明书进行操作，将重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA转入S2细胞，转染24h后用500mM浓度的Cu²⁺（以CuSO₄的形式加入）诱导48h（即28℃静置培养），收集上清液。

（2）在步骤（1）得到的上清液中加入登革热2型病毒的病毒液，使登革热2型病毒的浓度为10⁴Pfu/mL，28℃静置孵育2h。

（3）将2×10⁶个细胞/mL的Vero细胞的细胞液铺6孔板，每孔2mL。

（4）将步骤（2）得到的溶液加入步骤（3）得到的6孔板，每孔1mL，37℃静置培养3h，然后更换DMEM完全培养基（购自Life Technology,产品目录号为11965-084）培养24h。

（5）完成步骤（4）后，吸弃上清，用pH7.4的PBS缓冲液清洗细胞一次，然后采用RNA抽提试剂盒（AxyPrep总RNA小量制备试剂盒，购自Axygen,产品目录号为AP-MN-MS-RNA-250）提取总RNA，然后采用逆转录试剂盒（iScript cDNA Synthesis Kit,购自Bio-Rad，产品目录号为170-8890）进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用Taqman RT-QPCR检测Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量（采用GADPH基因为内参）。

用于检测登革热2型病毒的引物对如下：

上游引物：5’-CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3’；

下游引物：5’-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3’。

用于检测登革热2型病毒的探针如下：

5’-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3’。

用于检测GADPH基因的引物对如下：

上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’；

下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

用于检测GADPH基因的探针如下：

5’-FAM-CCGACTCTTGCCCTTCGAAC-TRAMA-3’。

2、对照组的处理

用质粒pMT/BiP/V5-HisA代替重组质粒pMT-AaCECN-V5-HisA，其它同步骤1。

3、结果分析

实验组和对照组中，Vero细胞中登革热2型病毒的病毒量见图4（进行三次重复实验，每次重复实验中设置5个重复处理，结果取平均值）。结果表明，加入AaCECN蛋白后，Vero细胞内的登革热2型病毒的病毒量出现明显下降，即AaCECN蛋白可以抑制登革热2型病毒在Vero细胞中的复制。

Claims

1.AaCECN蛋白或具有所述AaCECN蛋白的融合蛋白；所述AaCECN蛋白为如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下（d）或（e）或（f）：

（e）由序列表的序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.编码权利要求1所述AaCECN蛋白的基因或编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：编码权利要求1所述AaCECN蛋白的基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）所述的DNA分子：

（1）序列表的序列2自5’末端第58至186位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表的序列2所示的DNA分子；

（3）序列表的序列3所示的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；

（5）与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。

5.如权利要求3所述的基因，其特征在于：编码权利要求1所述融合蛋白的基因为如下（6）或（7）或（8）或（9）所述的DNA分子：

（6）序列表的序列7自5’末端第55至282位核苷酸所示的DNA分子；

（7）序列表的序列7所示的DNA分子；

（8）在严格条件下与（6）或（7）限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；

（9）与（6）或（7）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。

6.含有权利要求3或4或5所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

7.一种抑制微生物增殖和/或复制和/或感染的产品，包括权利要求1所述AaCECN蛋白或权利要求1所述融合蛋白。

8.权利要求1所述AaCECN蛋白或权利要求1所述融合蛋白在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。

9.权利要求1所述AaCECN蛋白或权利要求1所述融合蛋白的应用；所述应用为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。