CN106478793A - 一种三联肽Cec Md3cs、制备方法及应用 - Google Patents

一种三联肽Cec Md3cs、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三联肽Cec Md3cs，用于编码所述三联肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用该三联肽Cec Md3cs制备的抗菌肽Cec Md对多种细菌具有抗菌活性、热稳定性好，且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，该三联肽Cec Md3cs在抗菌药物、食品抗菌剂、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。另外，本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs的制备方法。

Description

一种三联肽Cec Md3cs、制备方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种三联肽Cec Md3cs、制备方法及应用。
背景技术
抗菌肽是生物体抵御外界病原微生物入侵的有效屏障，具有广谱抗菌作用，而且具有不易产生耐药性的特点，在农业、医疗、食品、动物饲料等领域具有较好的应用前景。目前，已发现了上千种抗菌肽，但是能够应用于临床的抗菌肽种类依然有限。因此，人们希望通过分子设计和重新改造获得活性更好的新型抗菌肽。
由于抗菌肽属于小分子肽，其克隆、表达、分离、纯化和检测工序都相对繁琐，为了提高目的蛋白的回收效率，有效的保持抗菌肽活性、降低宿主细胞毒性、增加抗菌肽稳定性和表达量，通常采用串联表达的方式来表达抗菌肽。
天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(Cec Md)与天蚕素抗菌肽的同源性达81％，但Cec Md仍具有一定的溶血活性，且分离纯化步骤繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种三联肽Cec Md3cs、制备方法及应用，利用该三联肽CecMd3cs制备的抗菌肽Cec Md溶血性低、抗菌活性高，该制备方法分离纯化步骤简单。
本发明提供了一种三联肽Cec Md3cs，用于编码所述三联肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因；
步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的连接液；
步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs，得到重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs；
步骤4，将重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；
步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行三联肽Cec Md3cs的表达，并提取三联肽CecMd3cs，得到三联肽Cec Md3cs。
优选的，上述三联肽Cec Md3cs的制备方法中，步骤4的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs，在制备抗菌肽Cec Md中的应用。
本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs，在制备治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用。
本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs，在制备动物饲料添加剂中的应用。
本发明还一种利用所述三联肽Cec Md3cs制备抗菌肽Cec Md的方法，具体包括以下步骤：
步骤a，制备浓度为1U/μL的重组肠激酶溶液；
步骤b，将10×rEK Cleavage Buffer、三联肽Cec Md3cs、重组肠激酶和去离子水按照5mL:50mg:1mL:46mL的比例混合均匀，并于22℃反应16h，冷冻干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品；
步骤c，抗菌肽Cec Md的纯化
将抗菌肽Cec Md粗品经5000kDa膜分离，得到的分离液经G50层析柱纯化，得到抗菌肽Cec Md。
本发明提供的一种三联肽Cec Md3cs，并应用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达了该三联肽Cec Md3cs，经验证，利用该三联肽Cec Md3cs制备的抗菌肽Cec Md溶血性低、对多种细菌具有抗菌活性、热稳定性好，表达量高，且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，该三联肽Cec Md3cs在医药(抗菌药物)、食品(抗菌剂)、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR产物鉴定电泳图；
图2为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的双酶切产物鉴定电泳图；
图3为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的线性化产物鉴定电泳图；
图4为酵母转化子的菌落PCR鉴定电泳图；
图5为三联肽Cec Md3cs的Tricine-SDS-PAGE分析图谱；
图6为三联肽Cec Md3cs的高效液相色谱分析结果；
图7为三联肽Cec Md3cs的质谱分析结果。
其中，图1中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1、2号泳道均为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR产物(711bp)；图2中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1、2号泳道均为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的双酶切产物(408bp)；图3中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1号泳道为重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的线性化产物(3555bp)；图4中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1号泳道为酵母转化子的菌落PCR产物(789bp)；图5中M泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为三联肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2号泳道为抗菌肽Cec Md3js(13.36kDa)，3号泳道为Cec Md2cs(9.08kDa)，4号泳道为Cec Md2js(8.79kDa)，5号泳道为二联肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6号泳道为抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7号泳道为Cec Md3jn样品上清液，8号泳道为Cec Md3cn样品上清液，9号泳道为空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明提供了一种三联肽Cec Md3cs，用于编码所述三联肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种三联肽Cec Md3cs的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因。
需要说明的是，为了提高抗菌肽的表达量，采用串联设计，遵循毕赤酵母偏爱性原则，设计如SEQ ID NO.1所示的用于编码三联肽Cec Md3cs的核苷酸序列，并在该序列的5’端添加KpnⅠ的限制性酶切位点GGTACC和起始密码子ATG；并在该序列3’端添加XbaⅠ的限制性酶切位点TCTAGA和终止密码子TAA，得到如SEQ ID NO.3所示的目的基因。
步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因片段和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的连接液。具体包括以下步骤：
步骤2.1，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，酶切体系如表1所示，得到载体双酶切溶液；
取5μL载体双酶切溶液与1μL的6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下15μL的载体双酶切溶液按照DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，得到3147bp的载体片段。
表1载体pGAPZαA的双酶切体系
其中，双酶切的条件为：将表1所示双酶切体系中的各物质加入PCR管中混匀，于37℃水浴3h。
步骤2.2，将所述目的基因和所述载体片段连接，其连接体系如表2所示，连接的条件为16℃水浴2h，得到含有重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的连接液。
表2目的基因和载体片段的连接体系
步骤3，将步骤2.2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中(该步骤主要是为了将连接液中的重组载体pGAPZαA/Cec Md2ys转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中)，37℃振荡培养1h，涂布在含有25μg/mLZeocinTM(博莱霉素)的低盐LB培养基平板上，倒置在37℃恒温培养箱中，过夜培养(12-16h)直至形成单菌落，挑取单菌落进行PCR产物(711bp)鉴定，筛选出含有重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的阳性克隆子，并提取阳性克隆子中的重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs，得到重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs。所述低盐LB平板培养基的配方为：10g/L胰胨、5g/L酵母提取物、15g/L琼脂、5g/L氯化钠、余量为水，pH 7.5。所述PCR产物鉴定体系如表3所示。
表3重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR产物鉴定体系
其中，步骤3的PCR产物(711bp)鉴定采用的引物序列是：
ForwardPrimer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’
3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。
重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR产物鉴定结果如图1，711bp处有条带，说明重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs构建成功；重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物鉴定结果如图2所示，408bp处有条带，说明重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs构建成功。
步骤4，将重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs转化到宿主细胞(毕赤酵母GS115)中，得到表达工程菌。
步骤4.1，毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
步骤4.1.1，活化：取-80℃冻存的毕赤酵母GS115，采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到第一单克隆细胞的单菌落；
挑取第一单克隆细胞的单菌落，采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到第二单克隆细胞的单菌落；
挑取第二单克隆细胞的单菌落采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到毕赤酵母GS115的单菌落。
其中，步骤4.1.1所述采用YPD平板划线培养时可用保鲜膜包裹YPD平板。
步骤4.1.2，小量培养：挑取毕赤酵母GS115的单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，28-30℃，200r/min摇瓶培养16-18h(OD600值2.0左右)，得到毕赤酵母GS115菌悬液。
需要说明的是，步骤4.1.2中摇瓶培养一般过夜即可，不需测OD600值。
步骤4.1.3，放大培养：将5mL毕赤酵母GS115菌悬液接种到500mLYPD液体培养基中，并按1:100～200的体积比例接种，培养瓶采用2L的培养瓶，其中每1L培养瓶内装250mLYPD液体，以便于让毕赤酵母GS115充分吸收吸氧气，28-30℃，200r/min摇瓶培养16-18h(OD600值2.0左右)，得到毕赤酵母GS115培养菌液。
需要说明的是，步骤4.1.3中摇瓶培养一般过夜即可，不需测OD600值。
步骤4.1.4，将毕赤酵母GS115培养菌液冰浴10min，移入4℃预冷的离心管，然后4℃，1500×g离心5min，去上清，收集沉淀；并用500mL4℃预冷的无菌水重悬沉淀，得到第一酵母菌重悬液。
步骤4.1.5，将第一酵母菌重悬液于4℃，1500×g离心5min，去上清，收集第一酵母菌沉淀；并用250mL4℃预冷的无菌水重悬酵母菌沉淀，得到第二酵母菌重悬液。
步骤4.1.6，将第二酵母菌重悬液于4℃，1500×g离心5min，去上清，收集第二酵母菌沉淀；并用20mL4℃预冷的无菌1mol/L山梨醇重悬第二酵母菌沉淀，得到第一山梨醇重悬液。
步骤4.1.7，将第一山梨醇重悬液于4℃，1500×g离心5min，去上清，收集第三酵母菌沉淀；并用1mL4℃预冷的无菌1mol/L山梨醇重悬第三酵母菌沉淀，得到毕赤酵母GS115细胞。
步骤4.1.8，制备毕赤酵母GS115细胞的感受态，得到毕赤酵母GS115感受态细胞，冰浴保存，且当天制备当天使用，不可冻存。
步骤4.2，重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的线性化
将步骤3的重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs用限制性内切酶AvrⅡ进行线性化酶切，得到线性化产物溶液，其中线性化酶切的反应体系如4所示，反应条件为37℃水浴3h；
取5μL线性化产物溶液与1μL的6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下15μL的线性化产物溶液按照DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，得到线性化重组载体pGAPZαA/CecMd3cs。
其中，试剂盒方法进行胶回收的步骤如下：向线性化产物溶液中加入相当于线性化产物溶液1/10倍体积的NaAC(3mol/L)、相当于线性化产物溶液2.5倍体积无水乙醇，-80℃放置0.5h以上；12000r/min离心10min后弃上清；70％无水乙醇洗涤沉淀，真空干燥，得到线性化重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs，-80℃保存备用。
其中，线性化产物溶液中的重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的线性化产物的鉴定结果如图3所示，3555bp处有条带则说明，重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的线性化成功。
表4线性化酶切处理的反应体系
步骤4.3，将步骤4.2的线性化重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs电转化到步骤4.1.8的毕赤酵母GS115感受态细胞中，得到表达工程菌，具体包括:
将80μL毕赤酵母GS115感受态细胞与5-10μg或者5-10μL线性化重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs冰浴混匀，转入冰浴预冷的2mm电转杯中；继续冰浴5min；电击转化，其中电击转化条件与电击转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的条件相同，为：电压为1500V或2000V；电容为25μF；电阻为200欧，温度为0℃。
电击转化后，立即往2mm电转杯中加入1mL冰浴冷的1mol/L山梨醇，并将电击产物转移至一个15mL Conical无菌管中，然后将15mL Conical无菌管中的电击产物于30℃静置培养1-2h，得到电转化酵母。
取10μL、25μL、50μL、100μL、200μL的电转化酵母，分别涂布在5个不同的YPDS培养基平板(含100μg/mLZeocinTM)上(小密度的电转化酵母涂布更有利于ZeocinTM抗性选择)；于30℃培养3-10天，直至酵母单克隆菌落出现；挑取10-20个酵母单克隆菌落在YPDS培养基平板(含100μg/mL的博莱霉素ZeocinTM)上进行划线培养，得到酵母转化子的单菌落。
步骤4.4，筛选步骤4.3的酵母转化子的单菌落中的阳性转化子。
步骤4.4.1，PCR鉴定：
挑取步骤4.3的酵母转化子的单菌落接种于5mL含25μg/mL ZeocinTM的YPD液体培养基中，于30℃200r/min摇床培养15-16h(过夜)，得到酵母转化子菌悬液。
取500μL酵母转化子菌悬液离心，弃上清，开盖，在500W微波加热至煮沸，于液氮中放置5min，然后加入50μL无菌水，在500W微波加热至煮沸，离心，收集上清，并将上清作为PCR的酵母基因组DNA模板。
采用引物对Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’和3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’进行菌落PCR，鉴定重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs是否整合入毕赤酵母基因组中，其中菌落PCR的反应体系如表5所示，菌落PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；54.8℃退火30s；72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸7min。
待菌落PCR反应结束后，取3μLPCR产物在含有EB的2％琼脂糖凝胶电泳中进行检测，结果如图4所示，789bp处有条带，说明该酵母转化子为阳性克隆，该酵母转化子的菌液为阳性克隆菌液。
表5菌落PCR的反应体系
步骤4.4.2，测序鉴定
将步骤4.4.1的阳性克隆菌液与甘油按照5:1的体积比例混合均匀，送哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN与所设计的目的基因进行对比，若阳性克隆中确实含有所设计的目的基因，则该阳性克隆为表达工程菌，且该表达工程菌用于表达重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs中含有的目的基因片段。
步骤5，培养步骤4.4.2的表达工程菌，进行三联肽Cec Md3cs的表达，并提取三联肽Cec Md3cs，得到三联肽Cec Md3cs。
步骤5.1，三联肽Cec Md3cs的表达
在100μg/mLZeocinTM筛选下稳定性较好的表达工程菌，-80℃保存。
将表达工程菌接种至装有20mLYPD液体培养基的50mL锥形瓶中，于30℃、200r/min培养16-18h，得到表达工程菌菌悬液；
取1mL的表达工程菌菌悬液于已灭菌的100mLYPD液体培养基中，用8层灭菌脱脂纱布封口，于30℃、200r/min培养2-4d，得到菌液样品；
步骤5.2，三联肽Cec Md3cs蛋白的提取
取步骤5.1的菌液样品4mL，12000r/min离心5min，收集上清，然后将收集的上清进行浓缩，得到三联肽Cec Md3cs浓缩液，将三联肽Cec Md3cs浓缩液用20％乙醇洗脱除杂，然后用3kD的超速离心管超速离心，冷冻干燥，得到三联肽Cec Md3cs。
需要说明的是，步骤5.1和步骤5.2也可以采用下列处理方式过滤浓缩：将表达工程菌接种至YPD液体培养基中，30℃、240r/min培养72h，4000r/min离心20min，取上清液，0.45μm膜过滤，滤液采用TCA方法浓缩，冷冻干燥，得到三联肽Cec Md3cs。
步骤5.3，利用三联肽Cec Md3cs制备抗菌肽Cec Md(所述抗菌肽Cec Md的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)。
步骤5.3.1，用1×rEK DilutionBuffer稀释重组肠激酶(市售)，使其终浓度为1U/μL，得到浓度为1U/μL的重组肠激酶溶液，然后再1.5mL离心管中加入表6中的酶切体系成分，22℃反应16h后，将酶切产物浓缩，并冷冻干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品，-80℃保存备用。
表6酶切体系
步骤5.3.2，抗菌肽Cec Md的纯化
将三联肽Cec Md3cs的水解产物(抗菌肽Cec Md粗品)通过Mini超滤系统5000kDa膜分离，分离液过G50层析柱后上液相纯化，得到纯化的抗菌肽Cec Md，该纯化的抗菌肽CecMd可用于制备治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用，或者用于制备动物饲料添加剂。
图5为三联肽Cec Md3cs(13.91kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析图谱，其中M泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为三联肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2号泳道为三联肽Cec Md3js(13.36kDa)，3号泳道为Cec Md2cs(9.08kDa)，4号泳道为Cec Md2js(8.79kDa)，5号泳道为二联肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6号泳道为抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7号泳道为Cec Md3jn样品上清液，8号泳道为Cec Md3cn样品上清液，9号泳道为空白对照，其中2、3、4、5、7、8号泳道是为了使不同样品电泳图谱区分开来的辅助样品，是为了方便观察三联肽Cec Md3cs和抗菌肽Cec Md条带位置，并不涉及发明内容。
下面采用HPLC法检测三联肽Cec Md3cs制备而成的抗菌肽Cec Md的纯度，具体包括：
取3μL分析级HPLC分析，流动相是水和乙腈，进行30min的梯度洗脱。首先将HPLC用含95％的水和5％的乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入准备好的样品，反应时间为40min，收集从检测器中出来的样品。最后用25％的水和75％的乙腈混合液清洗30min，检测结果见图6和图7，结果表明，抗菌肽Cec Md具有较高的纯度。
将三联肽Cec Md3cs进行抗菌与溶血活性检测，具体包括：
最小杀菌浓度(MIC)采用96孔板法测定。将短乳杆菌、德氏乳杆菌、双歧杆菌、毕赤酵母GS115和停乳链球杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌于平板划线培养，并挑取单菌落与相应的液体培养基中培养。其中停乳链球杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌37℃，200r/min空气震荡培养过夜；短乳杆菌、德氏乳杆菌、双歧杆菌厌氧37℃，200r/min震荡培养过夜；毕赤酵母GS115于30℃，200r/min空气震荡培养48h。
将抗菌肽Cec Md用1×PBS分别稀释成2000μmol/L、1500μmol/L、750μmol/L、500μmol/L、375μmol/L、250μmol/L、187.5μmol/L、125μmol/L、93.75μmol/L、62.5μmol/L、46.875μmol/L、31.25μmol/L、23.475μmol/L和15.625μmol/L共计16个梯度。将培养后的菌液稀释至2×105-7×105CFU/mL，将稀释好的测试菌液分别滴加到3个96孔培养板中，每行的1-12孔，每孔60μL，然后每孔滴加20μL的抗菌肽，每孔加120μL培养基。每个样品设定3个重复，同时以不含测试菌作为阴性对照，培养48h。用肉眼观察有无浑浊，即为受试菌的最小抑菌浓度。
最低杀菌浓度采(MBC)用96孔板法测定。将MIC前所有孔的混合液取5μL移入相应新鲜培养基96孔板中，然后进行培养48h，观察结果，没有混浊可以当做99.5％的原始种入的细菌被杀死，即为该菌的最低杀菌浓度。结果如表7所示。
表7抗菌肽Cec MdMIC和MBC
注：“-”表示无明显抑菌浓度
通过SWISS-MODEL软件对串联肽水解产物预测，可看出，三联肽Cec Md3cs含有α-螺旋结构，三联肽Cec Md3cs所用连接序列分别为肠激酶(DDDDK)，肽链的连接中心中出现Pro会有较好的细胞的选择性毒性，其溶血活性降低，当Pro被Ala替代后，细胞的选择的有较大程度的降低，Asp是肠激酶的组成部分，具有解离的性质，对溶血活性影响不大。
通过测定血红素的释放量来探索抗菌肽的溶血活性。采取浓度为2％的新鲜绵羊血红细胞悬浮液，与0.1mL测试抗菌肽混合均匀。测试抗菌肽混匀后的浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL，混合均匀后在37℃恒温培养箱中温育1h，2000r/min离心10min。将上清液转移至96孔板，使用酶标仪在570nm下测定吸光值。使用无菌的生理盐水和0.1％(v/v)的Triton-100作为溶血百分比0％和100％的标准。阴性对照用PBS缓冲液，阳性对照用0.1％TritonX-100。每个样品设定3个平行，结果取其平均值。溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100％。三联肽CecMd3cs对绵羊红细胞溶血活性影响结果如表8所示，浓度为100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL时，三联肽Cec Md3cs和抗菌肽Cec Md的溶血活性显著低于家蝇天蚕素抗菌肽；浓度为12.5μg/mL时，三联肽Cec Md3cs的溶血活性为1.46，抗菌肽Cec Md的溶血活性为1.42，均较低。
表8不同多肽对绵羊红细胞溶血活性的影响
注：不同字母表示相同浓度不同抗菌肽之间有显著差异(P<0.05)；“—”代表未检测出结果。
毕赤酵母在发酵生产的过程中能够缩短菌种的培养周期、简化操作步骤、减少了资料的耗费且降低了发酵成本，具备真核细胞蛋白合成通路。乙醇氧化酶(AlocholOxidase，AOX1)基因启动子是毕赤酵母用来严格并启动调控源蛋白的表达的有力工具，在此基础上，对于外源蛋白的诱导、糖基化修饰、二硫键的修饰以及加工都具有一定的生物学功能。虽然酵母菌所需的培养基组成单一，但却是能在简单的培养条件下快速的高密度生长，对于重组质粒重组于毕赤酵母菌中遗传性质稳定，可较少地分泌自身蛋白，但整体细胞干重可达130g/L，由此可见酵母菌即是表达外源蛋白的最佳菌种。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种三联肽Cec Md3cs，其特征在于，用于编码所述三联肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述的三联肽Cec Md3cs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因；
步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs的连接液；
步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs，得到重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs；
步骤4，将重组载体pGAPZαA/Cec Md3cs转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；
步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行三联肽Cec Md3cs的表达，并提取三联肽CecMd3cs，得到三联肽Cec Md3cs。
3.根据权利要求2所述的三联肽Cec Md3cs的制备方法，其特征在于，步骤4的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
4.一种利用权利要求1所述的三联肽Cec Md3cs，在制备抗菌肽Cec Md中的应用。
5.一种权利要求1所述的三联肽Cec Md3cs，在制备治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用。
6.一种权利要求1所述的三联肽Cec Md3cs，在制备动物饲料添加剂中的应用。
7.一种利用权利要求1所述的三联肽Cec Md3cs制备抗菌肽Cec Md的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a，制备浓度为1U/μL的重组肠激酶溶液；
步骤b，将10×rEK Cleavage Buffer、三联肽Cec Md3cs、重组肠激酶和去离子水按照5mL:50mg:1mL:46mL的比例混合均匀，并于22℃反应16h，冷冻干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品；
步骤c，抗菌肽Cec Md的纯化
将抗菌肽Cec Md粗品经5000kDa膜分离，得到的分离液经G50层析柱纯化，得到抗菌肽Cec Md。
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