CN101851280A - 假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白、编码该蛋白的基因以及含有编码该蛋白的DNA序列的表达载体。本发明还涉及一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的方法，该方法包括如下步骤：利用含有编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的DNA序列的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。得到的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白具有生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。

Description

假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白及其制备方法。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指一类由12～100个氨基酸组成、带有净正电荷、表现两亲性的且具有抗菌活性的小分子多肽。有关抗菌肽的研究已经有50多年的历史，迄今为止，已鉴定各种不同宿主来源的抗菌肽约有880种(Brogden K.A.，2005)。抗菌肽由于其广谱的抗菌活性(包括针对革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌、甚至病毒等)而受到许多研究者的关注。特别是近年来，随着抗生素的滥用而导致带有抗生素抗性的致病菌的不断出现，急需开发出新一代的抗菌药物。许多研究者认为，抗菌肽巨大的药用潜力将有望成为抗生素的替代品之一。因此，近年来有关抗菌肽的各种研究进展都非常迅速，其中包括从抗菌肽的纯化、表征、基因克隆及重组表达到晶体结构的解析、分子结构与功能关系的研究，人们对抗菌肽的了解将更加广泛和深入。

2003年，Mygind等人(Mygind P.H.，et al.，2005)首次报道从丝状真菌—假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)中鉴定和纯化出一种defensin家族的抗菌肽—假黑盘菌素(plectasin)，并解析了该多肽的三维结构(PDB ID：1ZFU)。假黑盘菌素的氨基酸序列和结构分析表明：它具有哺乳动物抗菌肽defensins家族的特征，但它的二硫键排列方式又不同于任何一种亚家族，而与昆虫来源的一些defensins相同。通过体外抑菌实验，发现假黑盘菌素对多种常见的人类革兰氏阳性病原细菌—包括抗生素敏感型及其耐药菌株都具有较强的抗菌作用(如表1所示)，而且其抑菌浓度与杀菌浓度没有显著性差异。

表1.假黑盘菌素可作用于多种革兰氏阳性病原细菌

链球菌属(Streptococcus)	葡萄球菌属(Staphylococcus)	肠道球菌属(Enterococcus)	棒状杆菌属(Corynebacterium)	芽孢杆菌属(Bacillus)
					S.pneumoniae	S.aureus	E.faecalis	C.diphtheriae	B.cereus
S.pneumoniae PRSP(青霉素抗性)	S.aureus MRSA(二甲氧基苯青霉素抗性)	E.faecium	C.jeikeium	B.thuringiensis
					S.pyogenes	S.epidermidis			Misc.Bacillus
S.pyogenes ERSP(红霉素抗性)	S.epidermidis MRSE(二甲氧基苯青霉素抗性)	E.faecium VREF(万古霉素抗性)
					Misc.(Group B，C，G)	Misc.(Staphylococci)

利用生物工程的方法构建转基因工程菌来生产抗菌肽正逐渐成为研究热点，Mygind等人曾将假黑盘菌素基因导入米曲霉或黑曲霉中得到重组表达，其中米曲霉的表达量较高，达到了10～50mg/L。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲醇营养型酵母中的一种，它能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长。甲醇营养型酵母还包括汉逊酵母、假丝酵母和球拟酵母等(熊向华，2006)，而毕赤酵母是最为成熟的外源蛋白表达系统之一，目前已有上百种外源蛋白在毕赤酵母中获得表达。外源基因在毕赤酵母中的表达需要有几个基本条件：一是需要有高效的启动子和终止子；二是要有同源序列以便外源基因能够有效地整合到毕赤酵母基因组中；三是要有高通量的筛选方法。另外，影响外源基因在毕赤酵母中表达的还有培养条件、密码子的偏好性以及蛋白质的三级结构等等。

目前，已经研究发现有一些启动子和终止子可应用于毕赤酵母表达系统，其中应用最为广泛的诱导型启动子是毕赤酵母乙醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)启动子，在毕赤酵母中，有两个不同的基因编码乙醇氧化酶：分别是AOX1和AOX2，二者之间有97％的氨基酸序列同源性。在毕赤酵母细胞中，基因AOX1的表达对乙醇氧化酶活性起主要作用。甲醇代谢的第一步是甲醇氧化，生成甲醛和氢过氧化物。为避免细胞氢过氧化物中毒，甲醇代谢在过氧化物酶体中进行。AOX1基因的表达受到严格的调控，而且受甲醇诱导时可以达到很高的水平，典型的是当毕赤酵母细胞在含甲醇的培养基中生长时，AOX1表达产物可占总可溶性蛋白的30％以上。

目前外源蛋白在毕赤酵母中的表达一般是通过外源基因整合到毕赤酵母染色体基因组中的方式，虽然也有一些携带外源基因的表达质粒(如2μ)在毕赤酵母中能够独立复制并表达外源蛋白的报道，但这种非整合型的表达方式存在着质粒不稳定和易丢失等缺点，目前已很少有人应用。外源基因整合到毕赤酵母染色体基因组中需要有同源序列，即外源基因若要整合到酵母基因组中，载体中需要包含一段核苷酸序列，它们与酵母基因组中某段DNA序列完全相同或基本一致，常用的同源序列有毕赤酵母来源的某个启动子或终止子等。有了同源序列还不够，外源质粒的状态也会极大的影响整合的效率，线性质粒的整合效率远远高于环形质粒，而线性化的位点在不破坏外源基因的条件下，外源基因的整合既可以发生在同源序列的内部，也可以在外部，都不影响整合的效率。

高通量的筛选方法对获得高效表达外源基因的重组菌株来说也是十分重要的。通常用于表达外源蛋白的毕赤酵母菌株都是基因缺陷型菌株，例如本实验中所使用的GS115菌株就是组氨酸基因缺陷型的，当携带有组氨酸合成酶基因的外源质粒整合到该酵母基因组中时，恢复了GS115合成组氨酸合成酶的能力，使只有整合了外源质粒的重组菌才能够在组氨酸缺陷的培养基中生长。除了使用缺陷型酵母菌株作为筛选标记外，外源质粒上还应携带有某种抗性基因以便使重组菌株产生相应的抗生素抗性，例如G418抗性或Zeocin抗性等，根据重组菌株对抗生素抵抗能力的不同，可对外源基因整合的拷贝数进行粗略的筛选。拷贝数的多少对外源蛋白表达量的影响还需实验确定。质粒载体转化酵母后，可以先利用缺陷型培养基进行初筛，能够生长的重组菌株再转接到含有不同浓度抗生素的培养基进行拷贝数多寡的的筛选，也可以将转化后的菌液直接涂布在抗生素筛选平板上，由于抗生素抗性物质的积累需要一定时间，会使重组菌株的生长略为缓慢。

毕赤酵母作为外源蛋白表达系统有诸多的优点，它属于低等真核生物，兼具真核生物和原核生物的特点。毕赤酵母是单细胞生物，遗传背景的研究相对透彻，其生理生化特性已较为清楚，相对于植物或动物细胞来说，对于它的基因工程操作更加简便和快捷，同时，它作为真核生物又具备了原核生物所没有的特性，如蛋白的翻译后加工和修饰，包括二硫键的形成、糖基化和脂酰化等。对于有细胞毒性的外源重组蛋白，可以将它定位于毕赤酵母的过氧化物酶体中，既可以保证宿主细胞不被毒性蛋白所伤害，又可以防止蛋白酶对外源蛋白的降解。而对于胞外表达的蛋白来说，由于毕赤酵母本身的分泌蛋白很少，因此，利于外源重组蛋白的分离和纯化。毕赤酵母菌株及其代谢产物对于任何哺乳动物均没有毒性，而且它能够进行高密度发酵，培养成本低廉，操作简单，极适合于工业化的大规模发酵生产。

多肽由于其分子量比较小，在酵母细胞中表达时一般表达量非常低或根本就不表达，为此，可采用融合蛋白的形式、增大分子量以防止其被酵母细胞内的蛋白酶所降解(Faber K.N.，et al.，1996)，而且融合蛋白由于分子量增大也更加易于采用常规方法(如SDS-PAGE等)对其表达量和纯度进行检测。根据研究目的和方法的不同，蛋白融合的方式也会有所不同。如在目的蛋白的N端或C端融合一段标签序列(如His-Tag、GST等)以便于后续的外源蛋白纯化操作、或在融合蛋白之间插入一蛋白酶切割序列，以便于下游体外加工时目标蛋白多肽的释放。而在某些情况下，为了使融合后的两个相同或不同的蛋白仍能保持其各自的生物学活性，则需在它们之间插入一段连接序列，这段连接序列多为一段短肽，它的设计对于保持融合蛋白的生物活性是十分重要的。连接序列需要保持一定的柔性，使位于其两端的蛋白可以灵活的运动。其长度要根据具体的情况实验确定，若连接序列过短，易造成空间位阻，影响其两端蛋白正确三维结构的形成；若过长，则可能由于蛋白的相互作用从而影响其各自的活性和功能。目前已有许多成功采用连接序列重组表达融合蛋白的报道，如凋亡抑制蛋白家族成员Survivin突变体与自杀基因胞嘧啶脱氨酶融合蛋白在胃癌细胞中的瞬时表达，使用的连接序列是8个串联起来的甘氨酸(Gly)(孙萍胡等，2009)。猫来源的干扰素ω3与胸腺肽α1融合表达，其连接序列为(GGGGS)₃序列(许无恨等，2009)。黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶与葡萄糖淀粉酶融合，使用的连接序列为(Gly-Ser)₅(Ya-Feng Zhou，etal.，2001)，该序列也被用于连接大肠杆菌碱性磷酸酶和链霉素识别肽(Wen-Hai Shao，et al.，2000)，经SPDBV预测，该连接序列倾向于形成一个α-螺旋结构，Gly无侧链，而丝氨酸(Ser)侧链较小且只含有一个羟基，这样使它既能够减小空间位阻，又具有一定的柔性，从而使融合蛋白保持了天然的生物活性。

目前，还没有关于对假黑盘菌素成熟多肽基因进行优化并人工合成假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的报道，而且对于通过特定方式融合的假黑盘菌素成熟多肽二聚体蛋白是否仍具有生物活性，以及将该融合蛋白基因导入毕赤酵母能否进行诱导性表达和高密度发酵生产也未见报道。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题包括优化假黑盘菌素成熟多肽基因、人工合成假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因、检测以特定方式融合的假黑盘菌素成熟多肽二聚体蛋白的生物活性，以及使假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白在毕赤酵母中获得高效表达和高密度发酵生产的方法。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明首先公开一种假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还公开编码所述假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因。优选地，所述基因的DNA序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，本发明公开一种含有编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的DNA序列的表达载体，其包括酵母诱导型启动子，位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及所述编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因，所述编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA。

优选地，所述酵母诱导型启动子为酵母醇氧化酶启动子；

优选地，所述表达载体的出发载体为pPIC9K。

本发明还公开一种基因工程菌，其为含有前述表达载体的宿主；优选地，所述宿主为毕赤酵母；更优选地，所述宿主为毕赤酵母GS115。

本发明还公开前述基因工程菌的培养和表达方法，该方法包括如下步骤：

1)菌体培养：在基础发酵培养基中发酵培养，接种前用氨水调节培养基的pH值为5.7～6.0，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL PTM1溶液；按体积比10％的比例接入种子液，28～30℃、372～380转/分通气搅拌培养22～24小时；

2)饲喂碳源：通过蠕动泵向步骤1)得到的发酵液中流加含有12mL PTM1/L发酵液的50％甘油，流加量为17～18mL/h/L发酵液，28～30℃通气搅拌培养4～5小时，在培养过程中加入氨水调节pH值为5.7～6.0，调整通气量使溶氧量大于20％；

3)诱导表达：向步骤2)得到的发酵液中流加含有12mL PTM1/L发酵液的甲醇，使甲醇的浓度为0.2～0.3％，调整通气量使溶氧量大于20％，28～30℃通气搅拌培养120～144小时。

其中，所述基础发酵培养基为10×Basal Salts+4％甘油；所述PTM1含有0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素和0.5％硫酸。

本发明更进一步公开前述基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括离心除菌、过滤和分子筛柱层析的步骤。

本发明还公开一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的方法，该方法包括如下步骤：利用前述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。

本发明另外公开假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白在制备杀灭病原性细菌和耐药性菌株的药物中的应用。

本发明利用毕赤酵母表达系统以诱导型方式表达和生产假黑盘菌素成熟多肽二聚体重组融合蛋白，该重组融合蛋白具有与天然多肽相类似的生物活性，即能够抑制或杀灭多种革兰氏阳性病原细菌，甚至对某些具有抗生素抗性的致病菌也能产生抑制作用。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了将两个假黑盘菌素成熟多肽基因串联成二聚体融合蛋白基因的方法，首先将一个编码假黑盘菌素成熟多肽单体的基因按照毕赤酵母所偏爱的密码子进行优化，继而在两个编码假黑盘菌素成熟多肽单体的核苷酸序列之间插入一个能编码6个甘氨酸(Gly)残基的短核苷酸序列，由此形成一个新的融合蛋白基因。

在另一个优选的实施方案中，用上述获得的融合蛋白基因转化酵母，随着重组酵母菌体的生长，假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因能够得到高效表达。

在另一个优选的实施方案中，将上述获得的融合蛋白基因插入到一个诱导型酵母表达质粒载体上，在被整合到毕赤酵母基因组中后，对转化后的酵母菌株进行G418抗性筛选和发酵液抑菌活性测定，得到的重组酵母工程菌株可以高效表达假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白并将其分泌到细胞外，利用发酵液上清进行抑菌实验，证明该重组融合蛋白具有与天然多肽相类似的抑菌活性。

在一个优选的实施方案中，提供了有关重组毕赤酵母工程菌的最适的生长培养条件和外源蛋白表达条件，如培养基的成分、接种量、pH值、溶氧量和培养时间等，由此使该重组酵母工程菌的生长量和重组蛋白的分泌量都尽可能地达到最大化。通过离心除菌、中空纤维过滤、分子筛等快速分离和纯化步骤从发酵液中得到高纯度的外源重组蛋白，以便为这种重组酵母的大规模工业化生产、低成本发酵和纯化奠定基础。

本发明利用毕赤酵母表达系统以诱导型方式表达和生产假黑盘菌素成熟多肽二聚体重组融合蛋白，在一个优选的实施方案中，该重组融合蛋白具有抑菌和杀菌能力；或更确切地说，本发明所指的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白与源自丝状真菌假黑盘菌的天然蛋白或其他常规表达系统生产的该重组蛋白相类似，作为抑菌剂或杀菌剂可以广泛地应用到医疗、食品、饲料和科研等领域。例如，在医药研究领域，本发明的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白可以替代某些常用的抗生素，如青霉素或万古霉素等，不仅可以用于杀灭某些病原性细菌、甚至耐药菌株，而且可以降低抗生素的使用量，减少耐药性病原菌的出现。

本发明所指的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白是在毕赤酵母中以诱导型方式表达和生产的，首先是编码假黑盘菌素成熟多肽单体的基因被按照毕赤酵母所偏爱的密码子进行优化，然后采用人工合成的方法，两个编码假黑盘菌素成熟多肽的单体基因被一个编码6个Gly短肽的核苷酸序列再串联起来，然后，该融合蛋白基因被插入到一个带有α-因子分泌信号肽编码序列的酵母表达载体上。α-因子分泌信号肽的作用是操纵所谓外源的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白向毕赤酵母胞外的分泌。在该质粒载体上，还含有一个诱导型启动子，该启动子位于α-因子分泌信号肽与假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的上游，它操纵二聚体融合蛋白基因在毕赤酵母细胞中的高效表达。该质粒表达载体经线性化后，可通过电融合法或氯化锂等方法被导入到毕赤酵母细胞中，进而通过同源重组稳定整合到酵母染色体基因组上，此重组酵母在发酵培养过程中，经甲醇诱导，可高效表达的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白，并在α-因子分泌信号肽的引导下得以分泌到胞外的培养基中。

本发明所指的重组蛋白可以是假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的全部，然而，在某些具体的实施方案中，所表达的外源基因也可能只是该二聚体融合蛋白基因的一部分。有时，假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白可再与另外一个具有不同生物学功能的蛋白基因以独立或融合方式同时在一个酵母细胞内表达，目的是为了方便提纯或提高其生物活性。可以采用本领域普通技术人员熟知的技术进行蛋白融合，例如通过蛋白翻译后加工或共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前相互拼接在一起。

发酵产品中假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的纯度直接关系到该重组蛋白的应用范围及所生产相关产品成本的高低，在一个优选的实施方案中，为了快速纯化大量的假黑盘菌素成熟多肽二聚体重组融合蛋白，可以先使用不同截流分子量的过滤装置对酵母发酵液上清液进行预处理，然后再使用分子筛柱层析，在纯化过程中的每一个环节，都可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，通过上述方法可获得纯度达到99％的重组融合蛋白。

本发明的方法中极为重要的环节是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的毕赤酵母细胞及其重组产物的加工应用中起重要作用。用于转化酵母细胞的质粒载体包含由编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因或其衍生物的DNA序列和操纵该基因或其衍生物的DNA序列在所说的酵母细胞中表达的一个诱导型启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择性或标记基因，主要用于重组毕赤酵母细胞的筛选和检测。在某些具体实施方案中，本发明的诱导型启动子是酵母醇氧化酶启动子(AOX1)。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体可用于转化毕赤酵母，它所编码的外源蛋白是假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。

本发明也提供了毕赤酵母细胞遗传转化以及酵母重组子筛选的方法，它包括以下步骤：1)按照毕赤酵母所偏爱的密码子，对假黑盘菌素成熟多肽基因进行优化；2)假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的人工合成、其中涉及到将一段短核苷酸连接序列插入在两个成熟多肽单体核苷酸编码序列的中间，由此使表达出的两个多肽单体都能够保持一定的柔性和灵活性，并使它们都能够保持正确的三维结构从而发挥其各自的生物活性；3)构建一个质粒表达载体，其中含有编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因或其衍生物的基因(包括连接序列的改变或连接方式的改变等)；4)通过电融合法或其他方法，用上述线性化后的质粒表达载体DNA转化酵母细胞，并将转化后的毕赤酵母细胞涂布于RDB固体平板选择培养基上，能够在此培养基上生长的酵母单菌落就是含有外源基因的酵母重组子；5)挑选再生出的酵母细胞单菌落，逐一分别接种到含有不同浓度G418的YPD固体平板培养基上(浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL)，那些能够在高浓度G418平板上生长的酵母单菌落具有较高的外源基因拷贝数，有可能具有较高的外源蛋白表达水平。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了经过优化的重组毕赤酵母培养生长条件以及重组蛋白的快速纯化方法，它包括以下四个阶段：1)菌体培养，以10％的接种量接种酵母工程菌后，经过22～24小时的培养，酵母菌体湿重将达到95～100g/L左右；2)饲喂碳源，在培养4小时后，酵母菌体的湿重将达到190～200g/L左右；3)诱导表达，加入甲醇，诱导酵母细胞高效表达假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白并将其分泌到培养基中；4)目标蛋白的纯化，发酵液经过离心和三次不同规格的滤膜过滤处理，再经过一次分子筛柱层析，重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体的纯度可达99％以上。

本发明在详细介绍酵母表达系统时仅提到了毕赤酵母，然而，正如本领域普通技术人员早已熟知的那样，许多种酵母表达系统都可以利用本发明所提供的方法进行遗传转化、表达和生产。因此，所有这些酵母表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。

正如下面实施例中详细描述的那样，本发明描述的酵母转化方法中所用的质粒载体是一个整合型的质粒表达系统，在一个优选的实施方案中，本发明所使用的质粒表达载体的出发载体是pPIC9K。

本发明包括以下几个组成部分：1)按照毕赤酵母所偏爱的密码子，对编码假黑盘菌素成熟多肽的基因进行优化；2)假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的人工合成，其中包括将一段DNA连接序列的5′端与一个去掉了终止密码子的假黑盘菌素成熟多肽基因序列的3′端连接，而该段DNA连接序列的3′端同时再与另外一个假黑盘菌素成熟多肽基因的5′端连接起来，由此串联形成了一个新的融合蛋白基因，将该DNA编码序列插入到pEASY-T1质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入外源基因的正确性和完整性；3)通过常规的分子生物学技术，如内切酶和连接酶处理，将该融合蛋白基因定向插入到pPIC9K质粒中的Xho I和Not I位点之间，从而构成了一个诱导型酵母高效表达载体；4)高表达酵母重组子的筛选，经过电融合或其他转化方法，将上述重组后并线性化的酵母表达载体导入酵母受体细胞，在RDB固体平板选择培养基上培养，待酵母单菌落出现后，再将其逐一转接到含不同浓度G418的YPD固体平板培养基上，能够抵抗高浓度G418的酵母重组子由于具有较高的外源基因基因拷贝数，因而有可能具有较高的外源蛋白表达水平，因此，挑选能够在最高浓度G418的YPD固体平板培养基上生长的酵母重组子进行后续操作；5)提供重组毕赤酵母最适生长培养和表达的条件。重组毕赤酵母的高密度发酵可分为菌体培养、饲喂碳源和诱导表达三个阶段，在每个阶段均给予最适的培养时间和环境条件。发酵液分别经离心除菌、过滤和分子筛柱层析等步骤后，可得到纯度达99％以上的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。

(三)有益效果

(1)本发明首次利用毕赤酵母表达系统成功地以诱导型方式表达和生产假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白；

(2)本发明采用密码子优化后的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因，以提高其在毕赤酵母细胞中的转录和表达效率；

(3)本发明采用酵母醇氧化酶启动子调控假黑盘菌成熟多肽二聚体融合蛋白基因，在毕赤酵母中以诱导型方式高效和稳定地表达；

(4)选择假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白在毕赤酵母中以诱导型方式表达和生产是因为该融合蛋白比单体更加稳定、能更加高效地在酵母细胞中表达、生物产量高且仍具有广谱和高效的杀菌活性；

(5)本发明特别优化了毕赤酵母工程菌发酵生长条件以提高假黑盘菌成熟多肽二聚体融合蛋白的生物产量，以及从发酵上清液中快速提纯该重组蛋白的方法，纯化工艺简单易行，适用于工业上规模化生产假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白，最终制备的假黑盘菌成熟多肽二聚体融合蛋白具生物活性，该重组融合蛋白可作为抑菌剂或杀菌剂广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。

附图说明

图1假黑盘菌素成熟多肽基因密码子优化前后对比，N代表密码子优化前的基因序列；M代表密码子优化后的基因序列；

图2假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的克隆及其诱导型酵母表达载体plp-9k的构建过程；

图3利用抑菌圈法，检测重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白对溶壁微球菌的抑菌效果：A、B、C、D和E分别为加入重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的样品孔，浓度依次为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL和12.5ug/mL；CK-为阴性对照，添加蒸馏水；

图4利用抑菌圈法，检测重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白对肺炎链球菌的抑菌效果：1、2和3为加入鸡溶菌酶，浓度分别为4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL；4、5和6为加入重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白，浓度分别为50ug/mL、100ug/mL和200ug/mL；CK-为阴性对照，添加蒸馏水；

图5利用抑菌圈法，检测毕赤酵母菌株plp-p不同发酵培养时间后的上清液抑菌圈形成情况：CK-为阴性对照，添加不含外源基因的酵母培养144小时后的发酵上清液；24h～144h分别为添加含有假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因重组菌株plp-p不同培养时间发酵上清液；

图6SDS-PAGE(16％分离胶浓度)电泳检测纯化后的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白：1为蛋白标准分子量10～160KDa(美国MBI Fermentas产品)；2为纯化后重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的人工合成

根据已知的假黑盘菌素全基因序列(GenBank：AJ964941)，按照毕赤酵母所偏爱的密码子，在不改变其氨基酸序列的前提下，对编码假黑盘菌素成熟多肽的基因进行密码子优化。优化后的假黑盘菌素成熟多肽基因与优化前相比，改变了其中的19个核苷酸碱基，总共涉及到19个密码子，G+C含量由原来的45％变为46％，假黑盘菌素成熟多肽基因密码子优化前后对比见图1，经过优化的假黑盘菌素成熟多肽基因仍编码相同的40个氨基酸残基(见SEQ ID NO：1)，分子量约为4.4KDa。

在人工合成假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因时，首先去掉了第一个假黑盘菌素成熟多肽单体核苷酸编码序列3′端的终止密码子TAA，然后与连接序列(编码6个甘氨酸短肽)的核苷酸编码序列的5′端连接，最后将该短肽(连接序列)核苷酸编码序列的3′端再与第二个假黑盘菌素成熟多肽单体核苷酸编码序列的5′端连接，由此串联形成一个全新的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因。新合成的融合蛋白基因全长为261bp(包括终止密码子)，共编码86个氨基酸残基，其氨基酸序列见SEQ ID NO：2，分子量约为9.14KDa。此外，在人工合成该融合蛋白基因过程中，在其5’端第一个密码子GGT前添加了限制性内切酶酶切位点Xho I(CTCGAG)及酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA(其作用是在融合蛋白分泌到酵母细胞外的过程中，可将α-因子分泌信号肽切割掉)，在其3′端终止密码子TAA后添加了限制性内切酶酶切位点Not I(GCGGCCGC)(基因人工合成工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成)。人工合成的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因及其两端的附属序列见SEQ IDNO：3。

实施例2：假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因的克隆

将上述人工合成的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因plpDNA片段直接插入到pEASY-T1(购自北京TransGenic公司)质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有质粒载体plp-T的细菌克隆。通过DNA测序分析，确定其所含的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因plp是正确和完整的(DNA测序由北京标凯科技有限公司完成)。

实施例3：酵母表达载体plp-9k的构建

用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，将连接在中间质粒载体plp-T中的假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白基因plp切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该二聚体融合蛋白基因片段。用同样的限制性内切酶处理质粒pPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的pPIC9K质粒DNA。将上述两个DNA片段混合后用连接酶连接在一起，得到毕赤酵母高效表达载体plp-9k(见图2)。然后用该质粒表达载体转化大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)以便进行质粒的复制和保存。

质粒载体pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个酵母诱导型表达质粒载体，它含有一个高效的诱导型启动子-醇氧化酶启动子(AOX1)，在甲醇的诱导下，可调控下游插入外源基因的高效表达。在该表达载体多克隆位点前含有编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列，在与外源基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母细胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽序列可以被酵母自身的Kex2或Ste13基因表达产物切割下来，而不会改变重组外源蛋白的N端序列。

实施例4：plp-9k质粒DNA的制备

采用碱裂解法(参见分子克隆实验指南，第三版)从上述大肠杆菌细胞DH5α中制备提取plp-9k质粒DNA，然后用1～2倍过量的限制性内切酶Sal I酶切，使之完全线性化，利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。用苯酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，弃上清，收集沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20℃保存备用。

实施例5：酵母细胞的遗传转化

将-72℃保存的毕赤酵母菌株GS115(购自美国Invitrogen公司)接种到5mL YPD液体培养基中(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)，28℃震荡培养1天后进行活化。将培养好的菌液以1％接种量重新接种于100mL YPD液体培养基中，28℃震荡过夜培养(8h)至OD_600nm＝1.3～1.5，4000转/分离心5分钟，倒掉上清；将沉淀的酵母细胞重新悬浮在200mL冰预冷的灭菌去离子水中，缓慢重悬菌体，4℃4000转/分离心5分钟，倒掉上清；将沉淀的酵母细胞重新悬浮在200mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，4℃ 4000转/分离心5分钟，倒掉上清；将沉淀的酵母细胞重新悬浮在40mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，4℃ 4000转/分离心5分钟，倒掉上清；将沉淀的酵母细胞重新悬浮在1mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，吸取80uL于1.5mL离心管中，与上述线性化表达载体plp-9k质粒DNA(4～5ug)进行充分混匀，然后转移到冰浴后的0.2cm无菌电击杯中，利用电击仪PrecisionPulse^TM(美国BTX公司产品)将线性化的表达载体plp-9k质粒DNA导入酵母感受态细胞中，所使用的电击参数为电压1.5kV，电容50uF，电阻200Ω。电击完成后，立即向电击杯中加入1mL室温的YPD培养基，充分混匀后，28℃静置1小时，然后均匀涂布于RDB选择培养基平板上(1.34％YNB，1M山梨醇，1％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂粉)，倒置于28℃恒温培养箱中培养2～3天，至出现酵母转化子单菌落。

实施例6：高表达重组酵母菌株的筛选

将在RDB培养基上生长的酵母单菌落(转化子)用无菌牙签逐一挑取到含有梯度G418的YPD培养基(浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL G418)固体平板上，将平板倒置于28℃恒温培养箱中放置1～2天。随着携带有G418抗性基因的外源质粒整合到酵母基因组中拷贝数的增加，转化子对G418的抗性也不断增强。挑取能够在含有2mg/mL G418的YPD平板上生长的转化子，重新接种于100mLBMGY培养基[1％酵母提取物，2％酪蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(v/v)]中，28℃震荡培养4天，发酵液10000转/分离心5分钟，收集含有重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的上清液，该上清液可直接用于抑菌活性的测定。

采用抑菌圈法测定重组蛋白的抑菌活性，所用的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，菌种编号分别为CGMCC1.0634和CGMCC 1.1692。

将溶壁微球菌接种于5mL LB液体培养基中(每升培养基中含有蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0)，37℃震荡培养至OD₆₀₀nm约为1.0，吸取1uL培养物于45℃的尚未凝固的固体LB培养基中，迅速混匀，倒置固体平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打出直径约5mm的圆孔，将20uL不同浓度的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白样品加入到孔中，37℃静置过夜。抑菌圈如图3所示。

将肺炎链球菌接种于5mL血琼脂培养基中(每升培养基中含牛肉浸膏10g，NaCl 5g，蛋白胨10g，脱纤维羊血50mL，pH7.2～7.4，固体中加入20g琼脂)，37℃震荡培养至OD₆₀₀nm约为1.0，吸取1uL培养物于45℃的尚未凝固的血琼脂培养基中，迅速混匀，倒置固体平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打出直径约5mm的圆孔，将20uL不同浓度的重组假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白样品和不同浓度的鸡溶菌酶分别加入到孔中，37℃静置过夜。抑菌圈如图4所示。

具有抑菌活性的发酵液将会使圆孔周围出现透明圈，根据抑菌圈半径的大小可以判断发酵液抑菌活性的强弱。

随机挑取10株能够在2mg/mL G418的YPD平板上生长的转化子，发酵培养，取发酵液上清进行抑菌活性测定。测定结果发现所有能够在2mg/mL G418的YPD平板上生长的转化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性强弱差别不明显。

挑选出一株能够在溶壁微球菌和肺炎链球菌平板上都能产生抑菌圈的重组子，作为基因工程菌加以保存，并将其命名为plp-p。

实施例7：重组酵母菌的高密度发酵

1.种子液的制备

将重组酵母菌株plp-p接种于10mL BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，以10％的接种量转接于100mL BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，再以10％的接种量转接于1L BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，将其接种到4L BMGY培养基中，28℃震荡培养2天，作为高密度发酵的种子液。

2.重组酵母在50L发酵罐中的高密度发酵

1)菌体培养：在50L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)中盛放30L基础发酵培养基[10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾)+4％甘油]，在接种前先加入氨水使该培养基的pH值维持在6.0左右(氨水同时也可作为酵母菌体生长的氮源)，然后按下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.002％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按体积比10％的比例接种此前制备好的种子液，28℃通气搅拌培养24小时左右(转速自始至终维持在372转/分)。在培养过程中，随着酵母菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体的湿重将达90～95g/L；

2)饲喂碳源：通过蠕动泵向步骤1)得到的发酵液中流加补料液，补料液为50％甘油(其中含有12mL PTM1/L发酵液)，流加量为18mL/h/L。28℃通气搅拌培养4小时，随着菌体的生长，pH值逐渐降低，用氨水维持pH值在6.0左右。同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20％以上。此时菌体湿重将达到190～200g/L左右；

3)诱导表达：向步骤2)得到的发酵液中流加甲醇(其中含有12mLPTM1/L发酵液)，使甲醇浓度始终维持在0.3％左右，溶氧量始终大于20％，28℃通气搅拌培养144小时，每隔24小时取数毫升发酵液经5000rpm 4℃下离心10分钟，取30uL发酵液上清液进行SDS-PAGE检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为9KDa，与推测中的假黑盘菌素成熟多肽二聚体重组融合蛋白的分子量相吻合。

此外，从抑菌圈活性检测中发现，在诱导培养120小时后，重组蛋白的表达量达到最高峰(见图5)。

实施例8：重组蛋白的纯化

待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5％)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布于YPD固体平板上，并从中任意挑取10个酵母单菌落，快速提取其基因组(蔡传奇等，2001)DNA，进行PCR检测。结果发现，菌体的生物量、生长速度以及重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定；另外，PCR的检测结果也证实重组毕赤酵母菌株具有很好的遗传稳定性(见表2)。

表2.plp-p菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定

PCR阳性	生长24小时的菌体湿重(g/L)	诱导120小时重组融合蛋白表达量(mg/L)
			100％	87	138
100％	90	165
			100％	88	153

在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液用于重组蛋白的纯化。发酵液经5000rpm 4℃离心10分钟，留取上清。将发酵液上清用截流分子量为50KDa的中空纤维滤柱(天津膜天膜工程技术有限公司，产品型号：MOF-503，使用方法见该公司说明)过滤，收集透过液，澄清的透过液再用截流分子量为10KDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号：2426538，使用方法见该公司说明)处理，保留分子量小于10KDa的透过液，将透过液再用截流分子量为2.5KDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号：2405515)处理，保留分子量大于2.5KDa的回流液，回流液终体积约为700mL。将此回流液进行脱盐处理，向700mL回流液中加入6.3L蒸馏水，即将回流液稀释10倍，然后将稀释液再次通过上述2.5KDa的纳滤膜处理，此时得到的回流液中盐离子浓度也相应稀释10倍，如此重复操作5次，即回流液中盐离子浓度稀释10⁵倍，最终得到700mL回流液，将此回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的重组蛋白冻干粉。该样品经分子筛柱层析进一步分离提纯，分子筛柱层析条件为：柱填充料为Sephadex G75(美国GE公司产品)，柱高35cm，直径16mm，流速1mL/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸钾缓冲液pH6.2，样品上样量为500uL(含冻干粉50mg)，每1mL流出液收集一管，将收集液取少量进行抑菌圈实验和SDS-PAGE电泳，收集抑菌圈较大且在聚丙烯酰胺凝胶上显示单一条带的收集液作为最终制得的重组蛋白纯品。上述纯化流程中每个操作步骤之后都留取少量样品进行总蛋白量、纯度和回收率的测定(见表3)。

最终制得的重组蛋白纯品进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色和脱色后，电泳图经LabWork软件(美国UVP公司产品)分析，结果显示重组蛋白浓度达到99％以上(见图6)，重组蛋白的表达量约为0.15g/L。

表3.假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的纯化

步骤	总体积(L)	浓缩倍数	总蛋白量(g)	纯度(％)	回收率(％)
						发酵液上清	40	1	17	36％	100％
50kDa中空纤维滤膜	39	1.026	15	40％	98.04％
						10kDa纳滤膜	38.3	1.044	11	45％	80.88％
2.5kDa纳滤膜	0.7	57.143	9	53％	77.94％
						分子筛柱层析	0.675	59.26	4	99％	65.36％

显然，通过本发明的方法，假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白能够在毕赤酵母中获得高效表达。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所，中牧实业股份有限公司

 

<120>假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白及其制备方法

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>40

<212>PRT

<213>假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)

 

<400>1

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His

1               5                   10                  15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

            20                  25                  30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

        35                  40

 

<210>2

<211>86

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>2

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His

1               5                   10                  15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

            20                  25                  30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe

        35                  40                  45

Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His

    50                  55                  60

Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Cys Lys Cys Tyr

                85

<210>3

<211>281

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(270)

 

<400>3

CTC GAG AAA AGA GGT TTC GGT TGT AAC GGT CCA TGG GAC GAG GAC GAC ATG CAA TGT 57

Leu Glu Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys

1               5                   10                  15

CAC TGT AAC CAC AAG TCT ATT AAG GGT TAC AAG GGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT 114

His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly

20                  25                  30                  35

TTC GTT TGT AAG TGT TAC GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT TTC GGT TGT AAC GGT CCA 171

Phe Val Cys Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro

    40                  45                  50                  55

TGG GAC GAG GAC GAC ATG CAA TGT CAC TGT AAC CAC AAG TCT ATT AAG GGT TAC AAG 228

Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys

        60                  65                  70                  75

GGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT TTC GTT TGT AAG TGT TAC TAA GCG GCC GC      281

Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

            80                  85                  90

Claims (10)

1.一种假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的DNA序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种含有编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的DNA序列的表达载体，其包括酵母诱导型启动子，位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及权利要求2或3所述编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因，所述编码假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的基因的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述酵母诱导型启动子为酵母醇氧化酶启动子。

6.根据权利要求4或5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pPIC9K。

7.一种基因工程菌，其为含有权利要求4-6任一项所述表达载体的宿主；优选地，所述宿主为毕赤酵母；更优选地，所述宿主为毕赤酵母GS115。

8.权利要求7所述基因工程菌的培养和表达方法，该方法包括如下步骤：

1)菌体培养：在基础发酵培养基中发酵培养，接种前用氨水调节培养基的pH值为5.7～6.0，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL PTM1溶液；按体积比10％的比例接入种子液，28～30℃、372～380转/分通气搅拌培养22～24小时；

2)饲喂碳源：通过蠕动泵向步骤1)得到的发酵液中流加含有12mL PTM1/L发酵液的50％甘油，流加量为17～18mL/h/L发酵液，28～30℃通气搅拌培养4～5小时，在培养过程中加入氨水调节pH值为5.7～6.0，调整通气量使溶氧量大于20％；

3)诱导表达：向步骤2)得到的发酵液中流加含有12mL PTM1/L发酵液的甲醇，使甲醇的浓度为0.2～0.3％，调整通气量使溶氧量大于20％，28～30℃通气搅拌培养120～144小时；

其中，所述基础发酵培养基为10×Basal Salts+4％甘油；所述PTM1含有0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素和0.5％硫酸。

9.一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白的方法，该方法包括如下步骤：利用权利要求4-6任一项所述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白。

10.假黑盘菌素成熟多肽二聚体融合蛋白在制备杀灭病原性细菌和耐药性菌株的药物中的应用。

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