CN1323166C - 一种鲎素的基因及表达其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种旨在提高其抗菌活性的鲎素基因的设计、人工合成及在表达系统中高效表达方法。改良后的鲎素Tal较天然鲎素对许多有害细菌、真菌均有更高的抗菌效率，尤其是对许多饲料有害微生物。在重组酵母中Tal的表达量可达到0.2mg/mL发酵液。此鲎素可广泛应用于饲料、医药卫生和植物病害防治等领域。

Description

一种鲎素的基因及表达其的方法

技术领域

本发明涉及一种抗菌活性更高的改良鲎素的基因及高效表达的方法。

背景技术

鲎是海洋里的一种节肢动物，被称为动物界具有独特进化地位的“活化石”，在其神奇的蓝色血液中含有多种生物活性肽，其中就包括一类抗菌多肽—鲎素。自1988年Nakamura T.、Furunaka H.等在鲎的血细胞中找到第一种鲎素，迄今为止已发现了5种，它们组成鲎素家族(Nakamura T.JBiol Chem 1988，263：16709-13；Miyata T.JBiochem 1989，106：663-8)。这类抗菌多肽氨基酸序列较为保守，抗菌谱广，不仅可以抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对真菌生长一样有抑制作用，而且近年来发现其对肿瘤和HIV等也具有一定的作用效果，故日益被研究者所关注。

天然鲎素是有17-18个氨基酸的阳离子多肽，本身带有6-7个碱性氨基酸，其氨基端和羧基端都是碱性氨基酸，羧基端还具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。四个Cys形成二个二硫键维持鲎素折叠成发夹结构。五种鲎素的大部分氨基酸替代发生在Arg和Lys之间，其一级结构如下(Muta T.JBiochem，108：261-6)：

TachyplesinI     K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH₂

TachyplesinII    R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH₂

TachyplesinIII   K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH₂

PolyphemusinI  R-R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH₂

PolyphemusinII R-R-W-C-F-R-V-C-Y-K-G-F-C-Y-R-K-C-R-NH₂

鲎素的前体有77个氨基酸残基，经体内蛋白酶和酰胺化酶作用后，再与其他物质结合形成血细胞的小颗粒。虽然大多数抗菌蛋白C末端都有酰胺化氨基酸，但在鲎素中酰胺化对其抗菌活性并无决定作用，许多化学合成的人工鲎素及其类似物未对C端的Arg酰胺化，但活性并无影响(Oishi O.Peptide Res，1991，4：95-101；Shieh T.C.，FBES Lett，1989，252：121-124)。实际上其他的一些抗菌蛋白如Nisin，酰胺基对其抗菌活性也是可有可无，可能酰胺化维持多肽在体内的稳定，免于被羧基蛋白酶降解。另外早期的研究认为鲎素的二硫键对抗菌活性很重要，因为它维持着β-折叠(Tamamura H.，Chem Pharm Bull 1993，41：978-80；Park N.G.，Biochemistry，1992，31：12241-7)。但后来发现这些结论比较片面，当用甲基乙酰氨基团修饰或用Ala、Asp替代Cys，的确会引起线形多肽形成无规则卷曲，从而导致活性的降低，但用其他氨基酸替代Cys时情况则不同，抗菌活性变化不大甚至可能比原多肽还高，如芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸，特别是用Tyr替代时结构上最接近天然状态(Tam J.P.，BiochemBiophys Res Commun 2000，267：783-90；Matsuzaki K.，Biochemistry，1997，36：9799-806)。但二硫键除了稳定结构外，可能还有其他作用。

鲎素是带正电荷的两亲性多肽，其结构由二硫键形成环状的反平行β-折叠。Ohta等发现TachyplesinI能在40分钟内不可逆地抑制细菌的生长。抗多粘菌素的细菌仍然对鲎素敏感，这说明鲎素更易于作用外膜结构而不仅仅是脂多糖。在体外实验中，发现鲎素先是通过Trp等与双层脂膜平行结合，此过程中对膜结构的影响不大。然后一部分多肽相互集结，在膜上形成了大小不一的阴离子选择通道。离子通道的形成破坏了膜电位，造成细胞内外的物质相互渗漏。但这种通道并不永久维持，逐渐地这些通道会消失，因为抗菌蛋白会转移到膜的另一面，并与之平行结合(Matsuzaki K.Biochim Biophys Acta，1999，1462：1-10)。实际上许多种类的抗菌蛋白，无论是α-螺旋，还是β-折叠结构上都具有二个特点：带正电荷和双亲性，而且都会在脂膜上形成离子通道，只不过是形成的过程和方式有所差别(Matsuzaki K.Yakugaku Zasshi，1997，117：253-64；Ohta M.Antimicrob Agents Chemother，1992，36：1460-5；Lear J.D.Science，1988，240：1177-81)。

在鲎体内发现鲎素不仅直接地还可通过另一种方式间接地参与抗菌活性。在昆虫和甲壳动物中，酚氧化酶激活系统是宿主重要的防御病虫害系统，特别是在感染初期，细菌细胞壁的脂多糖、肽聚糖、葡聚糖可引发酚氧化酶激活系统的一连串级联放大反应。血蓝蛋白本身与甲壳素并无亲和性，但鲎素包裹了甲壳素后，可与之结合，然后血蓝蛋白被诱导转变成为酚氧化酶，经过各种反应后，促进了外骨骼的伤愈。实验发现，如果对鲎素的Trp和Tyr化学修饰，多肽与血蓝蛋白的亲和力急剧下降，说明他们的结合位点处于鲎素的疏水区域(Nagai T.J Biol Chem，2001，276：27166-70)。鲎素也是一类抗脂多糖结合因子，相对磷脂，鲎素与LPS的亲和力提高了280倍。LPS可诱导C因子活化，从而促进凝血过程，还可引起过敏反应，造成败血脓肿等甚至死亡。利用鲎素可特异性阻止LPS介导的凝血过程，减轻临床病症(Hirakura Y.Biochim Biophys Acta，2002，1562：32-6)。

早在1992年人们就利用DNaseI保护，硫酸二甲脂法等脚印技术发现鲎素的反平行β-折叠结构能与DNA的小沟结合，如果用二硫苏糖醇处理或Ala替代Cys，影响β-折叠，则这种与DNA的结合能力就会丧失。这说明鲎素在体内可能会影响转录和翻译，从而影响细菌、细胞的生理活动。而后不断有实验证明鲎素促进细胞分化，抑制肿瘤细胞的生长(LiQ.F.World J Gastroenterol，2003，9：454-8)。

鲎素结构简单，分子量小，可在其氨基酸序列的基础上进行不同的增加、删减，替代和修饰得到新的多肽，然后对比它们之间结构和生物活性的不同。

在研究鲎素抗病毒活性时发现，Trp对抑制病毒复制很重要，替代它后，活性明显丧失，从氨基端起第一个Tyr也很重要，它能提供能量到Trp。有人在polyphemusin I的Gly₁₁和Phe₁₂之间插入一个Arg，增加多肽的正电荷的同时也使环结构变大；为了使β-折叠两端的电荷和疏水性更加明显，把Tyr-Arg换成Arg-Tyr，这些改变对抗菌活性影响不大，但略有降低(Zhang L.Biochemistry，2000，39：14504-14)。在Cys的替代上发现，Ala和Asp会使抗菌活性下降很多，甚至失活。但芳香族氨基酸Phe、Tyr和脂肪族氨基酸Leu的取代抗菌活性不仅没丧失，对有些菌株还有所提高，特别是Tyr作用明显。有研究表明在设计抗菌蛋白的过程中，用Lys代替Arg时，会引起对某些菌株抗性的降低，如抗大肠杆菌、沙门氏菌等，并且在高盐环境下，这种活性的丧失可能会更严重。Arg看起来比Lys更适合用于设计β-折叠的小多肽，因为它能增强抗大肠杆菌的活性，并且在高盐环境下维持稳定(Muhle S A.Biochemistry，2001，40：5777-85)。

Tam J.P.等在Tachyplesin I的基础上设计了头尾相连在一起的18个氨基酸的环形多肽，内部有三个二硫键，它与Tachyplesin I相比对人红血球更无毒性。而且在高盐环境下，生物活性比低盐环境还高(Tam J.P.Biochem Biophys Res Commun，2000，267：783-90)。Tamamura H等人根据polyphemusinII人工合成了T22([Tyr5，12，Lys7]-polyphemusin II)，具有很高的抗HIV活性和低的细胞毒性，此后又在T22的基础上除去部分氨基酸，得到只有14个氨基酸的多肽T134和T140，它们表现出更强的抗病毒活性和更低的细胞毒性(Xu Y.AIDS Res Hum Retroviruses 1999，15：419-27)。Tam J.P.和Tamamura H等人成功地改造鲎素说明有必要对鲎素的结构和作用机理进行更深一步的研究，这样可以针对鲎素在不同方面的用途设计出更合理的抗菌蛋白。

发明内容

本发明总的目的是通过基因工程的方法，人工合成一种TachyplesinII的类似物编码基因，其编码的氨基酸与TachyplesinII(以下简称Ta0)相比有3个氨基酸的差异，使其杀菌/抑菌活性较TachyplesinII更高，尤其是对多种饲料有害微生物。进一步，利用生物反应器毕赤酵母(Pichiapastoris)高效表达此基因，以解决此抗菌肽在原始天然生物中产量太低、难以获得大量生产的问题。

本发明的目的之一是根据鲎素作用的分子机理，对鲎素Ta0进行分子改良，提高它的杀菌/抑菌活性。改良的鲎素(定名为Ta1)，与原鲎素Ta0相比，有3个氨基酸的差异，分别由原来的F(+4)、G(+10)和K(+15)变为R。此改良的鲎素对许多细菌和真菌，尤其是饲料有害微生物具有更高的杀菌/抑菌活性，如大肠杆菌(Escherichia coli)K12、沙门氏菌(Salmonellasp.)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄曲霉(Aspergillus flavo)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)等。

本发明的目的之二是人工合成改良鲎素Ta1的编码基因ta1，为此基因在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。Ta1基因全长54个核苷酸，编码17个氨基酸。

本发明的目的之三是提供一种针对各表达系统的不同特点，对Ta1的编码基因加以改造以使它能在特定的表达系统中高效表达的方法。依据分子生物学最新理论知识，综合影响外源基因转录、翻译及影响mRNA稳定性等各种因素，对ta1进行改造，是大幅度提高其在表达系统中表达水平的有效手段。例如在基因密码子使用频率上，无论是原核生物还是真核生物中，同一氨基酸的不同密码子的选择偏向都是不同的，密码子选择偏向与蛋白的表达水平相关联，特别是在一些大量表达的蛋白上，这一点尤为突出。密码子选择偏向可增强翻译和维持mRNA的稳定性。基因的改造可利用PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。本发明中，为了使Ta1的编码基因ta1能在毕赤酵母中高效表达，我们在分子水平上对基因的密码子进行了改造。将其密码子全部按酵母高频使用的密码子进行设计和基因合成(Sharp，P.M.et al.，NeucleicAcids Res.14：5125-5142，1986)，优化后的tac-m基因插入到带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上，经转化酵母细胞后，稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母经发酵培养后，表达的鲎素蛋白在信号肽的引导下分泌到培养基中。经测定，鲎素表达量达到0.2mg/mL。

本发明的目的之四是提供使优化后的ta1基因在表达系统中高效表达的方法。包括整套重组表达载体的构建、受体菌的遗传转化方法、重组子的筛选与分子鉴定方法以及重组子中Ta1表达方法。本发明采用毕赤酵母(P.pastoris)做为ta1基因的表达受体，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产Ta1奠定了基础。

本发明设计、合成了一种抗菌活性更高的Tachyplesin II类似物的编码基因(ta1)，并提供了一种在真核表达系统中高效表达此基因的方法。

本发明的技术途径如下：

1.基因合成  将设计的基因序列的2条链分成4个单链片段，分别合成后，各片段等摩尔数混合退火成完整的基因，具体方法参见文献(姚斌等.昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因的改造、人工合成及序列分析.农业生物技术学报，Vol.3，No.3，86～92，1995)。

2.ta1基因克隆  按常规方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecularcloning.New York：Cold Spring harbor laboratory，1982)。将退火后的基因克隆到酵母表达载体pPIC9上，同样的方法也可克隆到大肠杆菌克隆载体或表达载体上，如pPUC18、pPGEM等，转化大肠杆菌，获得重组子，并进一步对此基因进行全序列分析。

3.重组高效表达体系的构建  选择高效表达系统一毕赤酵母作为表达ta1基因的生物反应器。通过体内重组使ta1基因整合到酵母的基因组上，筛选出阳性重组子。别的真核表达系统如杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等也适应于此ta1基因的高效表达。

5.ta1基因的表达研究  在摇床水平上重组酵母经培养24小时后加入甲醇进行诱导，取培养液进行SDS-PAGE及初步的杀菌活性测定，结果表明tac-m基因在重组酵母中得到了高效表达。

6.表达的改良鲎素ta1的抗菌谱测定和抗菌效率的比较  比较不同细菌之间对表达产物的敏感程度的不同。受试细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌、乙酸钙不动杆菌等，抗菌活性的比较方法采用滤纸片比较法、活菌记数比较法、培养比较法等。受试真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄曲霉(Aspergillus flavo)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、腐质霉(Pythium dissotocum)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、蚕蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)等。

附图说明

图1鲎素tac0与改良后的鲎素ta1基因的核苷酸序列，划框部分为不一致的碱基，将导致翻译后编码不同的氨基酸。

图2鲎素tac0与改良后的鲎素ta1基因编码的氨基酸序列，划框部分为Ta1中改变了的氨基酸。

图3鲎素tac0与改良后的鲎素ta1基因的克隆，(1)为退火，(2)为退火基因与经XhoI和EcoRI酶切处理载体pPIC9的连接，(3)为重组载体的筛选。

图4表达的鲎素Ta1对细菌的抗菌活性

图5表达的鲎素Ta1对真菌孢子萌发抑制

A.黑曲霉；B.烟曲霉；C.构巢曲霉；D.黄曲霉；E.棒曲霉

照片中上半部分为对照，下上半部分为Ta1处理

具体实施方式

1.菌株与载体  大肠杆菌菌株巨E.coli DH_5a、质粒pUC18等自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His^-Mut⁺)购自Invitrogen公司、质粒pPIC9的图谱见图3。大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌、乙酸钙不动杆菌、黑曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、溜曲霉、棒曲霉、烟曲霉、绿色木霉、米曲霉、宇佐美曲霉、腐质霉、日本根霉、少根根霉、蚕蛹虫草、禾谷镰孢、灰绿曲霉、杂色曲霉等均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.酶与试剂盒  限制性内切酶、连接酶、Taq酶为Boehringer公司产品。PCR Kit均购于Promega公司。

3.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen BaseW/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖)]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。真菌生长培养基为PDA(20％马铃薯、2％蔗糖、2％琼脂)

实施例1

本实施例说明鲎素ta1编码基因的设计、合成与克隆程序。

Ta1是在天然鲎素TachyplesinII(简称Ta0)基础上，对其一些氨基酸替换，把原序列氨基酸K、G、F替换成R，目的是增加其正电荷，尤其是形成β折叠后两端的正电荷，从而提高其杀菌/抑菌活性，合成后的核苷酸序列见SEQ ID No：1，氨基酸序列见SEQ ID No：2。为适合连接到酵母表达载体pPIC9并整合到酵母染色体上进行分泌表达，在其前面添加了一段序列 L-E-K-R ^* E-A-E-A。酵母KEX 2基因的产物能识别 E-K-R ^* E-A- E-A，并在*处切割。 E-A重复对KEX 2基因产物的切割并不是必须的，但能显著提高其效率，随后 E-A重复可被STE13基因的产物进一步切割掉，从而得到正确的Ta1。 L-E的碱基是CTCGAG，这是Xho I限制性内切酶的识别切割位点，另外在基因终止密码子后添加EcoR I识别位点，通过这两个限制性内切酶，可方便地连接到载体pPIC9上。为了进行活性比较，原鲎素Ta0也按此设计并在酵母中表达。进一步的克隆程序见图3。把ta0和ta1基因单链进行化学合成。将合成的单链核苷酸片段分别磷酸化，退火后利用设计的酶切位点，分别克隆到载体pPIC9上，将重组质粒转化大肠杆菌JM109(Promega公司)，涂布LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养。挑选单菌落进行振荡培养，提取培养物的质粒，进行酶切、电泳检测。进一步进行序列测定，证实克隆的基因与设计的完全一致。这些重组质粒分别命名为PITa0、PITa1。

实施例2

本实施例是说明酵母转化及筛选重组酵母株系的过程。质粒PITa0、PITa1的DNA经电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外。

首先用2～3倍过量的内切酶BglII分别消化质粒PITa0、PITa1的DNA(经PEG法纯化)，电泳检测酶切是否完全，使之线性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。

酵母菌株GS115接种于5mLYPD中30℃培养过夜，取0.5mL接种于500mLYPD中30℃培养使O.D.₆₀₀＝1.3～1.5，1500×g离心5分钟，用500mL冰预冷的无菌水洗涤沉淀，如上离心，以20mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀，如上离心，以0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀。取40μl酵母细胞液加入线性化DNA1～5μg，转移到冰预冷的无菌电击杯中冰浴5分钟。在电击仪Micropulser^TM(BioRad公司)上进行电击转化酵母受体菌hisGS115，电击参数为0.8kv，11.5μF。电击后立即向电击杯中加入0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇，然后将电击杯中的溶液转移到无菌的Eppendorf管中在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，将培养皿倒置30℃培养至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含His)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut^-)。

用无菌牙签从转化平板上挑取His⁺重组子，首先接种到MM固体培养基上，再接种到MD固体培养基上，如此挑取His⁺重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中鲎素的表达情况。将His⁺Mut^-转化子首先在BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(以甲醇作为诱导物)，在诱导培养36小时后取上清液进行抗菌活性测定。抗菌活性测定以大肠杆菌为指示菌，采用滤纸片法。大肠杆菌活化培养后，稀释菌液至数量级为10⁷/ml，吸取100μL稀释液，均匀涂布平板。取30μL培养液让无菌滤纸小圆片吸收，干燥后，贴于平板表面，37℃下培养16h，测抑菌圈直径。挑选活性最高的菌株，命名为YS-PHPT0(含有ta0基因)、YS-PHPT1(含有改良后的ta1基因)。

实施例3

本实施例是说明重组酵母表达的鲎素抗菌活谱的测定程序。重组酵母30℃诱导培养(酵母诱导培养基BMGY)36小时后，取5～10μL上清液进行测定。主要目的是检测Ta0和Ta1对一些常见畜禽致病细菌、病原真菌、霉腐真菌的抗菌活性，然后又针对一些生产用菌和有益菌测定。

鲎素对细菌的抗菌活性的测定主要用打孔法，在培养基平板上打孔，在孔中加入5～10μL发酵液，37℃或28℃培养16～24小时，测抑菌圈直径。分别对一些革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌进行抗菌测定。其中革兰氏阴性菌有：大肠杆菌(Escherichia coli)JM109和K12、沙门氏菌(Salmonella sp.)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。革兰氏阳性菌有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚实芽孢杆菌(Bacillus firmus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，这些菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。结果(图4)表明改良后的Ta1对这些菌株均有较好的抗菌活性。

鲎素对酵母菌的抗菌活性所用方法也是打孔法，受试菌株有热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地酶(Geotrichum candidum)、白球拟酵母(Torulopsis candida)、阿舒多囊霉(Crebrothecium ashbyii)、另外对几种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)包括面包酵母、啤酒酵母、生香酵母都做了测定。以上这些受试菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。发现Ta1对酵母菌无抗菌作用。

在对丝状真菌的抗菌活性测定上，对产孢能力强并且容易收集孢子的丝状真菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄曲霉(Aspergillus flavo)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、采用孢子抑制法，收集真菌孢子，制成悬浮液。取该悬浮液10μL与20μL发酵液，50μL液体PDA培养基混合，27-30℃培养24到48h，观察孢子萌发情况。检测抗菌活性。而对不易产生孢子或者刨子不易收集的如米曲霉(Aspergillus oryzae)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、腐质霉(Pythiumdissotocum)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、蚕蛹虫草(Cordyceps militaris)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、杂色曲霉(Aspergillusversicolor)采用生长抑制法，在PDA固体培养基凝固前，取500μL与500μL发酵液混合，做成斜面或平板。接种真菌到此斜面上，观察生长情况。检测抗菌活性。另外放线菌中的橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivaceoviridis)，采用的方法也与不易产生孢子或者刨子不易收集的真菌一样。以上这些受试菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。结果表明，Ta1对以上其他的真菌都有较强的抗菌活性(图5)。

实施例4

本实施例是说明重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产鲎素的程序。重组酵母在BMGY培养基中30℃摇床培养24小时，然后按5-10％接种于发酵培养基中开始发酵。具体方法如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基接种前先加如28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也做为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24小时，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重将达到110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加50％甘油(包含12mL/LPTM1)，流加量为18.15/hr/L，培养4小时。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此时菌体湿重将达到220g/L。3)诱导表达阶段。加如甲醇(含12mL/L PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。通过此方法发酵后，鲎素Ta1的表达量达到0.2mg/mL发酵液。

实施例5

本实施例说明原鲎素Ta0与改良后的鲎素Ta1抗菌活性比较的测定程序。通过上述发酵得到的鲎素Ta0和Ta1，通过电泳进行定量，然后分别测定他们抗菌所需的半杀菌/孢子半抑制浓度。对细菌的测定采用活菌记数法：调整菌液浓度，按10⁶CFU/mL把细菌与生理盐水混合，分成分十管，每管1mL，分别加1～100μg的不同量的鲎素。37℃孵育2h，进行活菌计数。计算出细菌死亡50％时鲎素的浓度。对真菌的测定采用孢子抑制法，收集真菌孢子，制成悬浮液。取该悬浮液10μL与0.01～1μg的不同量的鲎素及50μL PDA液体培养基混合，27-30℃培养24到48h，计算萌发的孢子数，最后计算出50％孢子不能萌发时鲎素的浓度。结果(表1，表2)表明，在细菌方面，除大肠杆菌与枯草芽孢杆菌，Ta0与Ta1抗菌效率相当外，对别的菌株，Ta1的抗菌效率较Ta0有较大幅度的提高，其中对沙门氏菌、副溶血弧菌的抗菌效率提高了近一倍。在真菌方面，除黑曲霉外，对别的菌株，Ta1的抗菌效率显著高于Ta0，其中对黄曲霉和棒曲霉，Ta1的抗菌效率较Ta0提高了一倍左右。这些结果证明，我们设计改良的鲎素Ta1较天然鲎素有更强的抗菌活性。

表1.对细菌抗菌活性的比较

表2.对真菌抗菌活性的比较

                                SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种抗菌活性更高的改良鲎素的基因及高效表达的方法

<130>I030589

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>54

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cgttggtgtc gtcgtgtttg ctacagacgt atctgttaca gacgttgtcg ttaa            54

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Arg Trp Cys Arg Arg Val Cys Tyr Arg Arg Ile Cys Tyr Arg Arg Cys

1               5                   10                  15

Arg

Claims (15)

1.一种鲎素的基因，其特征在于，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种蛋白质，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的基因。

4.权利要求3所述的表达载体，它是包含权利要求1所述基因的PITa1。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它包含权利要求3所述的表达载体。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它是包含权利要求4所述表达载体的毕赤酵母GS115。

7.  权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它是包含权利要求4所述表达载体的大肠杆菌JM109。

8.一种利用毕赤酵母GS115表达权利要求1所述基因的方法，其包括：

a.培养菌株

b.饲喂碳源

c.诱导表达。

9.权利要求8所述的方法，其中在培养菌株阶段，接种菌株前将发酵培养基的pH调至5.0，并添加4.37ml/L培养基的PTM1。

10.权利要求9所述的方法，其中所述的PTM1包含0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸。

11.权利要求8所述的方法，其中在饲喂碳源阶段，流加含12mL/L权利要求10所述的PTM1的50％甘油，并调整通气量使溶氧量始终大于20％。

12.权利要求8所述的方法，其中在诱导表达阶段，使含12mL/L权利要求10所述的PTM1的甲醇的终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。

13.权利要求2所述的蛋白质在制备抗细菌和抗真菌药物中的应用。

14.权利要求13所述的应用，其中所述细菌包括大肠杆菌，沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，普通变形菌，副溶血弧菌，乙酸钙不动杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，坚实芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

15.权利要求13所述的应用，其中所述真菌包括黑曲霉，构巢曲霉，黄曲霉，溜曲霉，棒曲霉，烟曲霉，绿色木霉，米曲霉，宇佐美曲霉，腐质霉，日本根霉，少根根霉，蚕蛹虫草，禾谷镰孢，灰绿曲霉，杂色曲霉和橄榄绿链霉菌。

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