CN105497884A - 外膜蛋白Omp22作为鲍曼不动杆菌疫苗靶点的应用 - Google Patents

外膜蛋白Omp22作为鲍曼不动杆菌疫苗靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说，本发明提供了一种鲍曼不动杆菌的亚单位疫苗抗原蛋白与其应用方法。鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp22的基因核酸序列如序列表SEQ？IDNO:1所示，其编码的蛋白即为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列，如表SEQ？IDNO:2所示。其制备方法：构建Omp22疫苗抗原的原核表达质粒Omp22-pThioHisA，将其转化进入BL21(DE3)，诱导表达后回收并纯化Omp22重组蛋白，将该重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合，该混合液可以激发机体产生特异性抗体，对鲍曼不动杆菌的感染具有高效的免疫保护作用，可用于预防鲍曼不动杆菌的感染。

Description

外膜蛋白Omp22作为鲍曼不动杆菌疫苗靶点的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种免疫保护性亚单位疫苗及其应用。
背景技术
随着医药技术的飞速发展，特别是抗生素的广泛使用，使感染性疾病的救治水平得到不断的提高，但随之而来的是抗生素滥用现象的增多，在抗生素的强大压力下，产生了大量的耐药菌株，这些耐药菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。不动杆菌是近年来医院院内感染中分离率增长较快的菌种，其中鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,Ab）已成为临床最为常见的院内感染病原菌。
鲍曼感染可引发败血症、软组织或伤口感染、插管相关感染、尿路感染、菌血症、继发性脑膜炎等。鲍曼对危重患者威胁尤其严重，特别容易在重症监护病房（ICU）引起爆发流行，具有高的致死率。
鲍曼不动杆菌可引起严重临床危害的主要原因是：（1）鲍曼在医院环境中分布很广且可长期存活，主要存在人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，对湿热、紫外线、化学消毒剂有较强抵抗力，常规消毒剂只能抑制其生长而不能将其杀灭。（2）尤为重要的是，鲍曼耐药机制复杂，耐药性严重。近年来，许多省份均已出现鲍曼播散和流行。有研究表明：鲍曼主要是通过多种抗生素水解酶的表达、外膜通透屏障、药物主动外排泵等机制的协同作用而呈现多重耐药性。
鲍曼不动杆菌耐药性逐年增强，近年来甚至出现“全耐药”菌株，许多现有抗生素的治疗作用已不明显，给临床治疗带来了很大的难题。新的抗生素发展缓慢，且鲍曼耐药性适应迅速，因此，寻求新的解决方案显得极为重要。国内目前对鲍曼不动杆菌研究很大部分都集中于院内鲍曼耐药性的动态变化监测，或是耐药机制的研究。国外的研究主要从耐药机制，致病机理和耐药性的变化等方面入手，关于疫苗方面的研究主要集中在不动杆菌灭活的全菌，全外膜蛋白（OMPs）和外膜蛋白囊泡（OMVs）的免疫原性和保护性的研究上。MichaelJ.McConnell等人的研究结果表明，OMPs和OMVs免疫的小鼠能抵抗鲍曼的感染和侵袭，同时还证明小鼠接受抗血清被动免疫同样能抵抗鲍曼的感染和侵袭。
值得注意的是，鲍曼不动杆菌OMPs或OMVs由许多蛋白组成，而这些蛋白的分离和纯化是一个繁杂的过程，且产量很难得到提高，有效成分与大量无关蛋白及杂质混杂。虽然用OMPs或OMVs免疫相对于全菌免疫安全性上有所提高，但其中包含了菌体的很多外膜和细胞壁成分，包括LPS在内，仍会产生显著的毒副作用。
利用免疫信息学和反向遗传学，分析多重耐药不动杆菌外膜蛋白成分的抗原性及免疫原性，并进行基因克隆，蛋白表达、纯化，以及免疫学研究，筛选出有效的外膜蛋白成分，探讨鲍曼不动杆菌免疫控制策略的潜能，将提升疫苗的有效性和安全性，因而较之OMPs、OMVs或者全菌疫苗具有更加现实和诱人的应用前景。
发明内容
将鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978在LB培养基中培养，培养至对数期时收集菌体，以菌体为模板进行PCR扩增，获得鲍曼不动杆菌ATCC17978Omp22的核酸序列（SEQIDNO:1所示），双酶切后以基因工程手段连入原核表达载体，将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α后挑取阳性重组子，提取质粒进行测序鉴定。
将Omp22重组质粒转化进BL21(DE3)感受态细胞，以IPTG诱导表达重组Omp22蛋白（SEQIDNO:2所示），表达产物经超声波破碎后收集包涵体并将其溶解、重折叠。
将重折叠后的蛋白以HisTrapFF柱进行纯化后获得重组Omp22蛋白。
将该Omp22重组蛋白与氢氧化钠铝佐剂1:1混合后免疫小鼠，收集免疫后小鼠血清，进行ELISA检测抗Omp22的特异性抗体滴度，发现经Omp22免疫后小鼠体内产生了较高的特异性抗体水平；并以该抗Omp22血清进行Westernblot检测多株临床分离的鲍曼不动杆菌菌体蛋白，发现该抗体能特异性识别多株临床鲍曼不动杆菌菌体中的Omp22蛋白。
向小鼠腹腔注射临床分离的耐药鲍曼不动杆菌，连续观察一周，发现经Omp22免疫后的小鼠存活率为100%，对照组存活率仅为0，同时在小鼠外周血、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了104-106倍，且在血清中的炎症细胞因子水平显著降低，显示了该亚单位疫苗抗原具有较高的免疫保护性。
将Omp22免疫后小鼠的抗血清通过尾静脉注射进小鼠体内，再以临床分离的耐药鲍曼不动杆菌感染，发现被动免疫后的小鼠保持了100%的存活率，而对照组仅为0，在小鼠外周血、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了105-106倍，且在血清中炎症细胞因子水平显著降低，显示了针对Omp22的抗血清具有被动免疫保护效果，在体内具有有效的杀菌活性；且该抗血清反应出对多株不同来源的鲍曼不动杆菌都具有体内杀伤效应，体现出了Omp22作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗的广泛交叉保护性。
附图说明
图1显示了鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原Omp22的氨基酸在NCBI数据库中经生物信息学分析获得的保守性数据，结果显示有781株的Omp22蛋白具有100%的保守性。
图2显示了融合表达的Omp22在BL21（DE3）菌株中诱导表达前后的情况，及HisTrapFF柱纯化后的蛋白情况，图片为考马斯亮蓝染色后全菌及纯化蛋白的SDS-PAGE分析。
图3显示了经不同剂量的Omp22免疫两次及三次后7天或21天小鼠血清中Omp22特异性抗体的滴度水平（n=6）。
图4显示了以Westernblot检测Omp22抗血清特异性识别临床分离的鲍曼不动杆菌菌株的情况，以大肠杆菌DH5α菌体为阴性对照样品。
图5显示了经不同剂量（5,10,20,50ug）Omp22免疫三次后，感染了鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠存活率情况（n=6）。
图6显示了经50ugOmp22主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠各器官中的细菌载量情况，对照组为纯佐剂免疫对照（n=6）。
图7显示了经50ugOmp22主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠血液中的细菌载量情况，对照组为纯佐剂免疫对照（n=6）。
图8显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠存活率情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
图9显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠各器官中的细菌载量情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
图10显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠血液中的细菌载量情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
图11显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染来源不同的鲍曼不动杆菌Ab4的小鼠存活率情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
图12显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染来源不同的鲍曼不动杆菌Ab14的小鼠存活率情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
图13显示了经Omp22主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠血清中炎症细胞因子及趋化因子水平情况，对照组为纯佐剂免疫对照（n=6）。
图14显示了经抗Omp22血清被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌Ab1的小鼠血清中炎症细胞因子及趋化因子水平情况，对照组为纯佐剂免疫的血清对照（n=6）。
SEQIDNO:1为本发明中鲍曼不动杆菌外膜蛋白22（Omp22）的基因序列。
SEQIDNO:2为本发明中鲍曼不动杆菌外膜蛋白22（Omp22）的氨基酸序列。
具体实施方式
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。
实施例
实施例1：鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp22原核表达质粒的构建
将鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978在LB培养基中过夜培养，待菌体生长至对数期(OD600=0.4-0.6)，取菌液进行PCR扩增，PCR扩增引物为Omp22-F(5'GGATCCATGCGTGCATTAGTTATTT3')；Omp22-R(5'GAATTCTTATTGTTTAGCATAAATG3')；PCR体系具体为：菌液：2μL；Omp22-F：2μL；Omp22-R：2μL；dNTP：2μL；Taq酶：0.25μL；10×Taq酶buffer：2.5μL；水：14.25μL。PCR程序为：①94℃预变性5分钟；②变性94℃，30秒；退火56℃，30秒；延伸72℃，1分钟，循环35次；③最后延伸72℃，10分钟。将PCR产物进行胶回收（北京天根生物），回收产物以T-A连接至pMD19T-simple载体（Takara公司），连接体系具体为：pMD19T-simple载体：0.5μL；片段：4.4μL；T4连接酶：0.5μL；T4连接酶buffer：0.6μL。16℃连接过夜。将连接后的重组子转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆以T载体测序引物进行鉴定。将pThioHisA原核表达载体（Invitrogen公司）及阳性T载体重组质粒以限制性内切酶（Takara公司）BamHI及EcoRI进行双酶切，酶切体系为：载体/质粒：13μL；EcoRI酶：2μL；BamHI：2μL；10×buffer：3μL，37℃酶切3小时。胶回收酶切产物后加入DNA连接酶（Takara公司）进行连接，连接体系为：Omp22片段：4.7μL；pThioHisA载体：0.2μL；DNA连接酶：0.5μL；DNA连接酶buffer：0.6μL，16℃连接过夜。将DNA连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序鉴定。
实施例2：鲍曼不动杆菌Omp22重组蛋白的诱导表达
将重组质粒转化进入BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆进行诱导表达，具体方法为，将阳性克隆接种至已加入氨苄西林（100mg/mL）的LB培养基中，培养16小时后以1:5的比例转接菌液进入新的带氨苄西林的LB培养基中，待菌株生长至对数期时，加入IPTG（1mmol/L）进行诱导表达，控制诱导表达温度为37℃，诱导表达6个小时（图2）。
实施例3：Omp22亚单位疫苗抗原的制备及纯化
将诱导表达过夜后的样品以室温12000g离心10分钟，收集菌体，以PBS洗涤两次菌体后进行超声波破碎，破碎条件为10%最大功率，工作5秒，停5秒，持续10分钟。破碎后的样品以12000g离心10分钟，收集包涵体沉淀，将包涵体以Washbuffer(20mMtris-Hcl,pH8.8，1M尿素)洗涤3次后加入Solutionbuffer(20mMtris-Hcl,pH8.8，8M尿素)溶解，被溶解后的包涵体以Bindingbuffer(20mMtris-Hcl,pH8.8)透析4℃过夜进行重折叠，透析液以HisTrapFF(GEHealthcare)进行纯化，经Elutionbuffer(20mMtris-Hcl,pH8.8，1M咪唑)梯度洗脱后收集不同组分的纯化产物并以SDS-PAGE检测，收集Omp22蛋白所在组分（图2）。
实施例4：重组亚单位疫苗抗原Omp22的动物免疫
将重组的Omp22以不同剂量（5,10,20，50ug）与1mg氢氧化铝佐剂1:1混合，以混合液分别在0天、14天、28天进行三次皮下或肌肉免疫。小鼠饲养在SPF级别的环境中。第二次及第三次免疫后的7天或21天采血进行Omp22特异性抗体的ELISA检测，检测结果证实特异性抗体滴度超过1×104（图3）；以免疫后血清进行Westernblot检测，结果证明经Omp22免疫后的血清能特异性识别多株临床分离株中的Omp22蛋白（图4）。以此证明经鲍曼不动杆菌Omp22免疫后，小鼠产生了高水平的特异性抗体水平。
实施例5：重组亚单位疫苗抗原Omp22的体内主动免疫保护实验
经不同剂量的Omp22亚单位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，在最后一次免疫后三周进行临床分离的耐药鲍曼不动杆菌Ab1的腹腔感染，以1×106CFU浓度的鲍曼不动杆菌混合10%的猪粘液素（Sigma公司）通过腹腔感染小鼠，感染后的7天对小鼠进行连续观察，发现经50ug剂量Omp22免疫后的小鼠存活率为100%，对照组存活率为0（图5），同时在小鼠外周血（图7）、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了104-106倍（图6），且在血清中炎症细胞因子水平显著降低（图13），显示了该亚单位疫苗抗原具有较高的免疫保护性。
实施例6：重组亚单位疫苗抗原Omp22的被动免疫保护实验
经50ugOmp22亚单位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，取其抗血清，在进行鲍曼不动杆菌Ab1感染前1小时通过尾静脉注射进入小鼠体内，随后以1×106CFU浓度的鲍曼不动杆菌Ab1混合10%的猪粘液素通过腹腔感染小鼠，感染后的7天对小鼠进行连续观察，发现经被动免疫后的小鼠保持了100%的存活率，而对照组为0（图8），且在小鼠外周血（图10）、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了105-106倍（图9），且在血清中炎症细胞因子水平显著降低（图14），显示了针对Omp22的抗血清具有被动免疫效果，在体内具有有效的杀菌活性。
实施例7：抗Omp22血清的交叉保护性试验
经50ugOmp22亚单位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，取其抗血清，在细菌感染前1小时通过尾静脉注射进入小鼠体内，随后以不同医院分离的1×106CFU浓度的鲍曼不动杆菌Ab4和Ab14分别混合10%的猪粘液素通过腹腔感染小鼠，感染后的7天对小鼠进行连续观察，发现经被动免疫后的小鼠感染Ab4后仍保持了较高的存活率（图11），感染Ab14后保持了100%的存活率（图12），而对照组的存活率均为0。
SEQIDNO1：鲍曼不动杆菌外膜蛋白22（Omp22）的基因序列
ATGCGTGCATTAGTTATTTCAACAGTGGTAGGGGCAGCAGTAGTACTTTCTGGTTGTCAAACAACAGGTAATAACCTTGGTGGCGTTGAATACGATAAAGCCGCATTAGGTACTTTGATCGGCGCAGCAGCTGGCTACGGTATTTCTAAATCAAATGCAAACTCTAGCCGTCAAAACAACCGTGCTGCGGCAATTGGTGCAGTTCTTGGTGCAGCTGGCGGTTTATATCTTGACCAAAAAGAGAAAAAATTACGCGAACAAATGGCTGGTACTGGTGTAGAAGTAGGCCGTAACCCAGATGGTTCTGTTCAATTGATCATGCCTGGTAGCATTACTTTTGATACTAACAAATCAAACATCAAGCCAAACTTCTATGCAACTTTGGACAAAGTAGCTCAAACATTGGCTGAAGATAACAAGAGCGCGATTTTAGTTACTGGTTATACAGATAACACTGGTAATGACTCTATTAACATCCCATTATCTCAAGCGCGTGCTCAGTCAGTTAAAAACTATTTAGCTGGTAAAGGTGTTCCATCTAGCCGTATCGATGCACAAGGTTATGGTTCTTCTAACCCAATCGCAGACAACTCAACTGCTTCTGGTCGTGAACAAAACCGCCGTGTAGAAATCAGCATTTATGCTAAACAATAA
SEQIDNO2：鲍曼不动杆菌外膜蛋白22（Omp22）的氨基酸序列
MRALVISTVVGAAVVLSGCQTTGNNLGGVEYDKAALGTLIGAAAGYGISKSNANSSRQNNRAAAIGAVLGAAGGLYLDQKEKKLREQMAGTGVEVGRNPDGSVQLIMPGSITFDTNKSNIKPNFYATLDKVAQTLAEDNKSAILVTGYTDNTGNDSINIPLSQARAQSVKNYLAGKGVPSSRIDAQGYGSSNPIADNSTASGREQNRRVEISIYAKQ

Claims (3)

1.一种鲍曼不动杆菌亚单位疫苗，其特征在于：该亚单位疫苗的抗原即鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp22，其基因核酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其编码的蛋白即为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列SEQIDNO:2所示。
2.权利要求1中所述的鲍曼不动杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述的鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原蛋白Omp22具有激发机体产生特异性抗体，对鲍曼不动杆菌的感染具有高效的免疫保护作用。
3.权利要求2中所述的鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原(Omp22)的应用，其特征在于：将所述的Omp22蛋白按照50μg每剂的接种量，与1mg氢氧化铝佐剂按照体积比1:1进行混合，混合液进行皮下或肌肉三次接种。
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