CN105779471A - 具核梭杆菌AhpC蛋白的克隆表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物工程类产品及其应用。具体说是具核梭杆菌AhpC蛋白的克隆和体外表达以及在诊断和药物疫苗等研究中的用途。根据已公开的具核梭杆菌AhpC基因序列，设计针对AhpC蛋白基因的特异引物，通过PCR扩增并克隆具核梭杆菌AhpC蛋白基因，经原核系统表达获得了具核梭杆菌AhpC蛋白。表达的具核梭杆菌AhpC蛋白可以作为抗原应用于ELISA和蛋白质芯片等结直肠癌、食管癌诊断检测技术研究和开发，也可应用于结直肠癌、食管癌药物和疫苗研究和开发。

Description

具核梭杆菌AhpC蛋白的克隆表达及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及具核梭杆菌AhpC蛋白的克隆表达及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)为常见多发的消化道恶性肿瘤，是一种发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，位于全世界常见恶性肿瘤的第3位。在中国，近年结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，目前在我国消化系统恶性肿瘤中列第2位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，而中、晚期患者5年生存率仅10％左右，临床诊断的结肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率无明显改善的关键因素之一，故结肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。

结直肠癌的微环境是一个复杂的体系，包括基因组改变了癌细胞、非肿瘤细胞以及很多不同的微生物。所有的这些组成部分都会引起癌症的发生和发展。美国学者Meyerson等对9对肿瘤/正常对照的结肠癌菌群进行全基因组测序，发现梭杆菌序列非常丰富，该结果经过对95对肿瘤/正常对照进行定量聚合酶链反应法(PCR)和16SrDNA测序得以证实。研究者还通过荧光原位杂交(FISH)在结直肠肿瘤内看见梭杆菌。

RobertHolt研究团队，来自于加拿大温哥华的不列颠哥伦比亚癌症机构，揭示了一个令人深感意外的结果：为了找到结直肠癌组织中存在的病原微生物，他们利用宏基因组学技术对结直肠癌切缘组织进行研究，结果发现具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)在癌组织中大量存在。肿瘤组织中的所有病原体中，有超过95％是细菌。研究者报道，癌组织中的病毒包括HBV、HCV等常见病毒，但具核梭杆菌的大量存在却是一个新发现，与健康组织相比，具核梭杆菌在癌组织中的差别表达范围从0.1至256倍不等，平均为79倍。大样本结肠癌标本研究显示，具核梭杆菌丰度更高-与健康组织相比，高达415倍，提示具核梭杆菌可能可以作为结肠癌发生发展的标志物，发展成为血清肿瘤标记物。

2011年10月，在第19届欧洲消化疾病周(UEGW)上，法国Sobhani教授认为结直肠癌是肠道微生态相关性疾病，首次发现结直肠癌可能与肠道细菌的显著改变相关。结肠癌患者粪便中的菌群成分与健康人显着不同，当这些细菌被转入健康小鼠时，可能刺激小肠细胞增殖和分化，以及增加在化学致癌物作用下的结肠癌前病变，提示结直肠癌患者的菌群可促进结直肠癌的发生，肠道茵群异常是结直肠癌发生的关键性因素之一。

人类肠道菌群日渐被认知与结直肠癌有相关性，有文献报道，Fn与结直肠癌的前体结直肠腺癌有相关性，实验中在67名正常的直肠黏膜和48名有腺癌的直肠黏膜上评估Fn的富集性，将两者的均值作T检验，结果显示具有结直肠腺癌的患者Fn显著地富集(P＝0.01)，还观察到IL-10和TNF-α的表达和Fn的富集成正相关。

具核梭杆菌通常被当作口腔致病菌，结直肠癌组织中梭杆菌的富集，可能提示这些微生物有助于肿瘤的发生，也有可能梭杆菌只是积聚在肿瘤的微生环境中，并不参与肿瘤的发展。Meyerson和RobertHolt两个研究小组发布了几乎相同的报告，指出一种平时很少出现在人体肠道内的梭杆菌在结直肠癌细胞中异常活跃，并且似乎与肿瘤的恶性程度存在相关性。

同为消化道肿瘤的食管癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)血清中具核梭杆菌抗体是否会高度富集呢？具核梭杆菌可能是潜在的血液肿瘤标志物，为能早期检出食管癌和结直肠癌提供更多的信息，故有必要对Fn在食管癌和结直肠癌患者血清中的抗体滴度进行研究。

AhpC为具核梭杆菌烷基过氧化氢物还原酶，属于过氧化物酶家族，编码的蛋白质分子量为23kD。由于在分解过氧化氢和相关的过氧化氢衍生物过程中起到非常关键的作用，AhpC基因主要催化生物体内有机过氧化物分解成成乙醇，因此受到极大关注。

发明内容

本发明的目的是根据已公开的具核梭杆菌AhpC蛋白基因序列，设计针对AhpC蛋白基因的特异引物，通过PCR扩增并克隆具核梭杆菌AhpC蛋白基因，经原核系统表达获得了具核梭杆菌AhpC蛋白。表达的具核梭杆菌AhpC蛋白可以作为抗原，应用于ELISA和蛋白质芯片等结直肠癌诊断检测技术研究和开发，也可应用于结直肠癌药物和疫苗研究，对结直肠癌的防治药物和疫苗以及诊断技术研究具有重要意义。

本发明采取的技术方案是：

1.具核梭杆菌AhpC蛋白基因克隆、表达和纯化

根据已经报道的具核梭杆菌AhpC蛋白全基因组序列，设计了AhpC蛋白的引物。以Fn基因组DNA位模板设计的AhpC蛋白引物和高保真地DNA聚合酶PCR扩增AhpC蛋白基因。扩增得到了AhpC蛋白全长基因，回收目的基因，经NdeI和BamHI双酶切并回收后和经同样酶切的PET28a大肠杆菌表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布到加有卡那霉素的LB平板上，37℃温箱培养12小时。待长出肉眼可见菌落后，挑取茵落进行菌落PCR，挑选阳性克隆并抽出质粒。所抽质粒一部分以T7引物进行测序，测序结果和国外报道的序列一至。另取部分质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。待长出菌落后，挑取单菌落进行摇瓶诱导表达。当摇瓶中细菌长到OD600＝0.5时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃诱导16小时。取少量菌液进行SDS-PAGE分析，结果发现AhpC蛋白获得了高表达。摇瓶获得的菌液经离心收集茵体，菌体用PBS充分悬浮，经超声破碎，离心去沉淀，使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白。经两步纯化后，得到了纯度超过90％的蛋白样品。

2.具核梭杆菌AhpC蛋白作为抗原的ELISA检测技术建立

基因重组表达的具核梭杆菌AhpC蛋白为抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG，以间接酶联法原理(ELISA)检测结直肠癌病人血清样本中抗体，对结直肠癌、食管癌病人进行诊断。检测结果发现，100份结直肠癌病人血清时0D450为0.47±0.05，100份正常人血清时0D450为0.213±0.04，P/N2.21，说明特异性好。100份食管癌病人血清时0D450为0.49±0.05，100份正常人血清时0D450为0.233±0.03，P/N2.10，说明特异性好。

附图说明

图1为具核梭杆菌AhpC蛋白表达载体构建示意图。

图2为重组质粒转化BL21后，菌落PCR检测。

图3为具核梭杆菌AhpC蛋白的表达纯化。

图4为具核梭杆菌AhpC蛋白作为抗原以ELISA检测结直肠癌、食管癌病人血清样本中抗体。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例：

一、具核梭杆菌AhpC蛋白基因克隆、表达和纯化

1.具核梭杆菌基因组DNA的提取

刮取经48h培养的具核梭杆菌培养板上的Fn，以10000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP302)操作方法提取具核梭杆菌DNA。

2.具核梭杆菌AhpC编码基因的扩增

根据GenBank上公布的FnAhpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计AhpC基因的引物P1和P2，在引物中分别引入了NdeI和BamHI酶切位点。P1引物序列：5’-CAGTACGCATATGTCATTAATAGGAAG-3’；P2引物序列：5’-AGCGGATCCTTATAATTCTAATTAAATC-3’。以Fn基因组DNA为模板，P1和P2引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5minPCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收PCR扩增产物。

3.重组载体的构建

回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pMD18-T载体1μL、PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经抗卡那霉素筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-28a用NdeI和BamHI双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22℃进行连接，pET-28a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET28a-ahpC再经NdeI和BamHI双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4.重组质粒的转化及鉴定

将重组载体pET28a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)(采用天根生化科技有限公司的感受态试剂盒)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养12～16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。挑取菌落用PCR扩增鉴定，DNA电泳，结果正确。并进行DNA测序，测序引物为T7引物，DNA分析表明，序列与报道的完全一致。DNA及氨基酸序列如下所示。

DNA序列：ATGTCATTAATAGGAAGAAAAGTTCCTGAATTTAAAGCAACAGCTTTCAAAAAAGGTGAAAA

GGATTTTGTTACAGTTACAGATAAAGATTTATTAGGAAAATGGTCAGTATTTGTATTTTACCCAGCAGAT

TTTACATTTGTATGTCCTACTGAATTAGAAGATTTACAGGATAACTATGAAGCATTCAAAAAAGAAGGAG

CAGAAGTTTACTCAGTTTCTTGTGATACTGCATTTGTTCATAAAGCTTGGGCAGATCATTCAGAAAGAAT

TAAAAAAGTTACTTATCCAATGGTAGCTGACCCTACTGGATTCTTAGCAAGAGCTTTTGAAGTTATGATA

GAAGAAGAAGGATTAGCATTAAGAGGAAGTTTTGTAATCAATCCAGAAGGAAAAATCGTTGCTTATGAAG

TACATGACAATGGAATTGGAAGAGAAGCAAAAGAATTATTAAGAAAACTTCAAGGAGCAAAATTTGTTGC

TGAACACGGAGAAGTATGTCCAGCTAAATGGCAACCTGGAAGCGAAACTTTAAAACCTAGCTTAGATTTA

ATTGGAGAATTATAA

氨基酸序列：1msligrkvpefkatafkkgekdfvtvtdkdllgkwsvfvfypadftfvcpteledlqdny

61eafkkegaevysvscdtafvhkawadhserikkvtypmvadptgflarafevmieeegla

121lrgsfvinpegkivayevhdngigreakellrklqgakfvaehgevcpakwqpgsetlkp

181sldligel

5.重组载体在E.coli中的表达

取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600达到0.5时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG在25℃条件下诱导16h，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照，采用SDS-PAGE电泳分析重组Ahp℃的表达。优化诱导表达条件，用UVP凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。

6.纯化具核梭杆菌AhpC蛋白

将大量诱导的细菌4℃5000g离心收集细菌，PBS洗菌1次，重悬于PBS中超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化效果。

二、具核梭杆菌AhpC蛋白作为抗原的ELISA检测技术建立

由上述的基因重组表达具核梭杆菌AhpC蛋白作为抗原包被微孔板、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG，以间接酶联法原理(ELISA)检测结直肠癌、食管癌病人血清样本中抗体。

1.试剂盒组成

本试剂盒包括下列主要成分：

2.操作方法

(1)取出试剂，15-30℃放置20分钟；每孔加100μl样品稀释液，然后再加入10μl待测样品；包被板均需留空白孔，阴、阳性对照双孔。空白孔加入100μl样品稀释液。直接加入100μl阴、阳性对照血清各双孔，混匀后37℃水浴震荡30分钟。

(2)用1∶20稀释后的洗涤液洗板4次，最后一次拍干。

(3)每孔加100μl酶结合物37℃水浴20分钟，剩余酶结合物4℃保存。

(4)洗板同2。

(5)先加入显色剂A液50μl再加入显色剂B液50μl，37℃水浴避光显色10-15分钟。

(6)每孔加50μl终止液。

3.结果判定

(1)测定：以酶联仪450nm测定各孔OD值(减去空白对照计算)。阳性对照每孔OD＞1.0，阴性对照每孔OD＜0.06试剂盒有效，终止后10分钟内测OD值。

(2)临界值：阴性对照平均OD值+0.05。若阴性对照OD值0.06时，按0.06计算；若＞0.06，按实际OD值计算。

4.注意事项

(1)浓缩洗涤液使用前，用蒸馏水稀释20倍使用。

(2)不同批号试剂不可混合使用。

(3)必须严格控制培育反应板的温度和时间。

(4)记过判定以仪器为准，不能肉眼观察。

(5)样品中血脂、黄胆、血红蛋白对本品检测结果基本不影响。

(6)保存条件2-8℃保存，有效期暂定为12个月，在有效期内使用。

(7)试剂规格为96人份。

Claims (5)

1.本发明涉及具核梭杆菌AhpC蛋白基因克隆及其产物，其特征在于，通过PCR技术克隆具核梭杆菌AhpC蛋白基因，并实现了表达，分离纯化获得具核梭杆菌AhpC蛋白，并在研究开发结直肠癌、食管癌检测诊断技术中的应用。

2.根据权利要求1所述，具核梭杆菌AhpC蛋白是在体外通过PCR技术克隆具核梭杆菌AhpC蛋白基因，经过Ni²⁺亲合柱纯化后获得。

3.根据权利要求1所述具核梭杆菌AhpC蛋白在结直肠癌、食管癌诊断检测技术研究和开发中的用途。

4.权利要求1所述，具核梭杆菌AhpC蛋白在结直肠癌、食管癌防治药物和疫苗研究与开发中的用途。

5.根据权利要求2所述，体外表达纯化的具核梭杆菌AhpC蛋白作为抗原在具核梭杆菌ELISA和蛋白质芯片等免疫学为基础的诊断检测技术研究和开发中的应用。