TWI465240B

TWI465240B - 洛德乳酸桿菌br101之用途

Info

Publication number: TWI465240B
Application number: TW100134355A
Authority: TW
Inventors: Ching Hsiang Hsu; Chun Mei Lu; Hsin Hua Lee; Ying Yu Wang; Ju Ting Hsueh; Ding Ying Lai
Original assignee: Bio Ray Biotech Co Ltd
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2014-12-21
Also published as: CN103224895A; CN103224895B; TW201313240A

Description

洛德乳酸桿菌BR101之用途

本發明為一種新穎菌株分離株BR101，源自於新生兒糞便檢體，經16S rDNA基因片段序列進行比對鑑定為洛德乳酸桿菌菌種，並與其他洛德乳酸桿菌標準菌株作比對，顯示該菌株BR101與其他標準菌株有顯著差異，並具有刺激細胞產生較高的抗發炎激素，降低自體免疫的發炎反應，達到改善自體免疫疾病。

免疫系統對於生物體的生存扮演關鍵性的角色，它幫助我們對抗各種感染性的微生物，包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲等。當病源性微生物入侵人體，免疫系統就會產生一連串的免疫反應，包括細胞免疫與體液免疫。細胞免疫利用吞噬細胞或是毒殺型T細胞殺滅入侵的微生物；體液免疫就是產生抗體等物質對付病原菌。在這樣嚴密的保護下，人體可說是固若金湯，難以攻克的城池。自體免疫疾病就是自己的免疫系統失控，如脫韁野馬攻擊自己的組織或器官。如果攻擊自己的關節軟骨就稱為類風濕性關節炎，攻擊自身的脊椎就是僵直性脊椎炎，攻擊胰臟會造成第一型糖尿病，攻擊眼球就是虹彩炎，攻擊全身的血管就是紅斑性狼瘡。這些疾病雖然目前病因不明，症狀也各不相同，但是致病的機轉都是免疫系統的失調，因此治療方法都是以調節免疫系統為目標。

自體免疫疾病(Autoimmune disease)是一種免疫系統攻擊自己身體正常細胞的疾病，人體的免疫系統中具有抗體可抵抗外來的抗原，如細菌或病毒，或體內不正常的細胞，如腫瘤細胞等進行攻擊與清除，這樣的行為是一種保護身體的生理機制。但自體免疫疾病是免疫系統自行產生出會對抗自己身體體內正常細胞的抗體，造成不正常的發炎反應或組織傷害，進而影響身體健康的疾病。這些抗體稱為自體免疫抗體(Autoantibody)，有時還會透過細胞激素(Cytokine)造成免疫系統的失調。

自體免疫疾病最常見原因是感染，特別是細菌或病毒的傳染。某些病原體的結構與宿主的抗原相似，免疫系統為了清除這些外來的病原體，因此攻擊自己的正常細胞。如引起紅斑性狼瘡的EB病毒的分子結構和身體內的DNA結構相似，EB病毒感染人體後，免疫系統為了防禦EB病毒的入侵，同時也攻擊正常的體內細胞，就產生紅斑性狼瘡的症狀。另引起僵直性脊椎炎KB病毒的某個片段，和脊椎關節細胞分子相似，在正常免疫系統的誤認下，產生了僵直性脊椎炎的症狀。這些病原體暴露出的抗原分子會被免疫系統認為是自身的抗原，以避免攻擊。當免疫系統對病原體做出反應時，也會對那些被病原體真正自身抗原所在的細胞與器官進行攻擊。目前廣為人知的疾病包括第二型腺病毒造成的腦炎所引發的多發性硬化或鏈球菌感染引發的風濕熱(rheumatic fever)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)及有些種類病毒引發的糖尿病等。

第二種原因是體內正常且隱藏性的抗原被釋放出來，被免疫系統視為外來的病原體進而攻擊。人體免疫系統對自身具有辨識保護機制，稱為免疫耐受性(Tolerance)，例如母體內的胎兒不會被正常的母體免疫系統所排斥，或在眼睛、心臟和男性生殖系統等處發生的自體免疫疾病。第三種原因則是具有調節免疫系統正常運作的調節性T細胞(Regulator T cell，T reg)出現功能異常，無法正常調節免疫系統所致。其他的原因有MHC基因的影響，亦即遺傳，例如僵直性脊椎炎和HLA-B27有關。紅斑性狼瘡的遺傳性約佔了10%左右；或某些淋巴瘤細胞因不明原因發生改變後，製造及釋出抗自身組織的抗體。當免疫耐受性被破壞，原本該隱藏的抗原暴露，免疫系統以為是外來抗原而攻擊。最常見的例子是紅斑性狼瘡的臉部紅斑，當照射紫外線時，過量的紫外線破壞表皮細胞，使表皮細胞隱藏的抗原暴露釋出，產生臉部紅斑(Malarash)。

常見的自體免疫疾病有：系統性紅斑性狼瘡(SLE)，類風濕性關節炎(RA)、僵直性脊椎炎(AS)、乾癬、乾燥症、硬皮病、皮肌炎、血管炎等。類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)，為造成關節破壞最嚴重的關節炎，其好發於手部MCP、PIP或Wrist等關節。主要症狀為全身關節痛，通常早期病人合併有早上起床手指僵硬(Morning stiffness)超過一個小時。晚期可見手變形嚴重(Swan-neck deformity；Z-shape deformity)，各式各樣的變形均有可能，更嚴重將導致行動不便，終生坐輪椅。RA也可能引發關節外的症狀(因免疫為全身性)，最常見的症狀為乾眼症(乾燥症候群Sjogren’syndrome)，眼睛乾澀，常常需點眼藥水；嘴巴乾，需常常喝水；第二常見症狀為類風濕肺(Rheumatoid lung)，指的是下肺葉的纖維化，肺功能變差。有些病人會合併血管炎，主要發生於皮膚表淺處，特別是腳部。更有些病人會併發眼睛發炎或血管循環不好，常常感到手腳冰冷；系統性紅斑性狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus)，其主要症狀為關節痛、嚴重掉髮、皮膚光敏感(Photosensitivity)甚至嚴重者臉部出現蝴蝶斑(Malar rash)，早期只有淡淡的臉部紅斑，好發於年輕女性，女男比十比一。系統性紅斑狼瘡是一種多器官的自身免疫性疾病，乃因B細胞活動過度，導致產生過多的自身抗體。系統性紅斑狼瘡患者器官組織的損傷是由炎症反應的免疫複合物沉積所致，患者容易有嘴乾、眼乾、反覆性嘴巴破皮(Oral ulcers)；皮肌炎/多發性肌炎(Dermatomyositis/Polymyositis)，皮肌炎症狀為肌肉無力、肌肉痛，且是近端肌肉無力(Proximal muscle weakness)，有些患者蹲下去無法站起來或無法坐起來。好發於年輕女性，常見症狀為整個臉上有紅斑，甚至連眼皮都有紅斑，紅斑也會出現在手上，因為皮的發炎，手的皺摺最多為指節，所以指節常見紅斑(Gottron's sign)。若僅是肌肉無力，但皮膚沒有症狀則稱為多發性肌炎。重症肌無力症是一種會導致肌肉無力、易疲勞的疾病，主要是因為神經無法有效的把其訊號傳至肌肉，它會影響到許多不同的肌肉，例如控制眼球的肌肉，控制臉上表情、咀嚼、說話、吞嚥的肌肉以及四肢。由於每個人受影響的肌肉不同，臨床症狀也就不盡相同。肌肉要運動，就要靠運動神經釋於一種化學物質稱為乙醯膽素，乙醯膽素與其接受體結合後，才能產生足夠的電位變化來引起肌肉運動。乙醯膽素分解脢則將它分解，使電位恢復。肌無力症的病人，因為體內產生了一種乙醯膽素接受體的抗體，進而導致接受體的破壞與數目的減少，使神經與肌肉間的傳導功能受損；硬皮症(scleroderma syndrome)，於患病的早期臉部或前胸後背皮膚都很緊而且僵硬，晚期甚至是手指頭都緊且僵硬，稱為硬指症(Sclerodactyly)，從近端到遠端開始僵硬，有些病人更會併發肺的纖維化(Pulmonary fibrosis)。硬皮症最特殊的症狀為雷諾氏現象(Raynaud phenomenon)，因血液循環不良，手指頭會變色，因缺氧先成白色，又因硬化(sclerosis)再變成藍色，因為充血(Reactive hyperemia)最後再變紅。

綜合上述，在正常情況下，自我的免疫耐受性機制可以使個體免於自我反應(self-reaction)。當這種機制無法正常運作，免疫系統會促使T細胞或B細胞活化，產生體液性或細胞性的反應，對抗自身的抗原，這些反應使細胞及器官受到傷害。自體免疫疾病可以被分成兩類，一為器官專一性(organ-specific)，免疫反應直接攻擊單獨的器官或腺體的特定目標抗原(target antigen)，所以只有某一器官的功能可以被自體抗體(autoantibodies)刺激或阻斷，而出現病變，如溶血性貧血、重症肌無力、胰島素型糖尿病；二為全身性自體免疫疾病(systemic autoimmune)，作用的是大範圍的全身性目標抗原，引起全身性的組織傷害，其是藉由免疫複合體(immune complex)的堆積或是藉由自體抗體所引發的細胞性反應或直接造成細胞的傷害，如多發性硬化症。對於過度活化的免疫系統，人體有自我調節的機制，那就是調節型T細胞(Regulatory T cells,Tregs)。調節型T細胞是在胸腺中持續性的產生，存續在血液循環中。當對抗病源微生物的戰爭到達尾聲，調節型T細胞開始執行它的任務，它扮演煞車的角色，使免疫系統歸於平靜。它的作用主要透過釋放抗發炎的細胞激素(anti-inflammatory cytokine)，包括間白素10(IL-10)及腫瘤壞死因子-貝塔(TGF-β)。細胞激素就是細胞間溝通的語言，當其它的免疫細胞像是樹突細胞(dendritic cell)、發炎性T細胞(inflammatory T cell)、巨噬細胞和B細胞，接受到間白素10與腫瘤壞死因子-貝塔的訊號，就會停止增生，抑制活化，甚至進行凋亡，於是發炎反應就會緩解，免疫系統歸於平靜。根據過去對於調節型T細胞的研究，它的功能之一是辨識自身抗原，避免自體免疫性疾病的產生。研究中發現調節型T細胞缺失會造成致命的自體免疫性疾病，淋巴球失控性的增生，產生嚴重的發炎反應。在人體研究中發現，調節型T細胞在自體免疫病的致病機轉中扮演重要的角色。調節型T細胞所分泌的抗發炎激素IL-10或TGF-β可以作為評估調節型T細胞的功能指標。益生菌在腸道中生長，能夠透過腸道的淋巴組織，刺激人體調節型T細胞的增生。因為益生菌的細胞壁胜肽聚醣的成分能夠和免疫細胞中的接受器結合，使調節型T細胞活化增生，成熟的調節型T細胞會分泌IL-10與TGF-β，透過這些抗發炎的細胞激素，能夠抑制發炎型T細胞，使發炎反應緩解。因此口服益生菌對於自體免疫的發炎反應具有調節的作用。

有鑑於此，本發明為提供一種產生高抗發炎細胞激素之分離株BR101，本發明之分離株BR101乃篩選自新生兒糞便檢體之菌種，其係寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910512。

本發明將分離出來之菌株利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，其化學與物理特性為具觸酶、不具氧化酶及運動性，於好氧、厭氧環境下皆會生長。

本發明利用16S rDNA部份序列進行比對鑑定確認該分離株BR101為洛德乳酸桿菌菌種，並與其他三株購自生物資源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476標準菌株進行菌落外觀型態、16S rDNA基因片段、隨機引子對擴增多態性DNA分析、API50CHL微生物醣類生化反應等差異分析，顯顯示該菌株BR101與其他標準菌株有顯著差異，為一新穎的洛德乳酸桿菌。

另一方面，本發明與其他常見的益生菌進行抗發炎細胞激素偵測分析。利用人類週邊血球細胞與不同益生菌種進行共同培養後，以ELISPOT assay進行間白素10分析。ELISPOT assay是利用呈色反應，於細胞分泌細胞激素的對應位置上顯現可辨的斑點，並可直接在顯微鏡下人工計數斑點或利用ELISPOT辨識系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，計算出分泌該細胞激素的細胞數量。

本發明在於綜合鑑定結果中顯示此分離株BR101為一新穎洛德乳酸桿菌菌株，並可產生較高之抗發炎細胞激素，可運用於降低自體免疫的發炎反應，達到改善自體免疫疾病。

本發明提供一種洛德乳酸桿菌BR101之用途，係用以製備改善類風濕性關節炎之藥物或保健食品，其中，該洛德乳酸桿菌係投予一所需個體，以改善該所需個體之類風濕性關節炎症狀，該洛德乳酸桿菌係具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列，且該洛德乳酸桿菌之投予劑量係每天3×10¹⁰ CFU，且連續投予4週。

有關本發明的特徵與實作，茲以最佳實施例詳細說明如下：

1. 新穎性微生物BR101菌種鑑定

利用篩選培養基分離單一菌落，且觀察菌落外觀型態及革藍氏染色結果，並配合16S rDNA基因片段序列比對，結果顯示此分離株BR101為洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。

1.1 菌落外觀及革藍氏染色鏡檢

本發明BR101菌株乃是利用新生兒糞便檢體，以ROGOSA-AGAR plate(Merck,Cat No.1.05413.0500)作為選擇性培養基進行菌種分離，將分離之單一菌落以MRS Broth(Merck,Cat No.1.10661.0500)培養基於攝氏37度環境下培養48小時，將單一菌落進行分析，挑選分離株BR101進行菌種鑑定。由試驗結果顯示，此分離株BR101菌落外觀為圓形，白色菌落，表面光滑凸起狀，結果如圖1所示。依革蘭氏染色結果顯示，染色後呈藍紫色，分離株BR101為革蘭氏陽性桿菌，結果如圖2所示。不具運動性，具觸酶，不具氧化酶，好氧及厭氧環境下皆會生長。

1.2 16S rDNA基因片段序列

根據2002 P.S.M.Yeunget.al. 等人研究指出，利用特殊引子對：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3′]與Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，進行乳酸菌16S rDNA gene PCR放大即可進行乳酸菌屬的鑑定。BR101 16S rDNA基因片段序列(約計555bp)，且將基因片段序列經美國國家生物技術資訊中心(NCBI)提供之核酸基因庫序列比對工具(Nuclotide BLAST)比對結果顯示如表1-3所示，分離株BR101係具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列，為洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) ，且結果顯示BR10116S rDNA gene片段與洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 高達99%的相似度，因此可說明本發明BR101為洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。

1.3 API50CHL微生物醣類生化反應

利用API 50 CH微生物生化反應鑑定套組進行49種醣類發酵，結果顯示如表4所示，本發明BR101可發酵下列12種醣類，分別為D-樹膠醛醣(D-arabinose)、L-樹膠醛醣(L-arabinose)、甲基-βD-比喃木糖苷(Methyl-β D-xylopyranoside)、D-分解乳醣(D-galactose)、熊果苷(Arbutin)、馬栗樹苷醣(Esculin ferric-citrate)、D-纖維雙醣(D-celobiose)、D-麥芽糖(D-maltose)、D-乳糖(D-lactose)、D- 松三醣(D-melezitose)及D-來蘇醣(D-lyxose)。

2. BR101與其他標準菌株之差異分析結果

2.1 菌落外觀型態差異

利用BR101與其他三株洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 標準菌株(購自生物資源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476)進行差異分析。將4株菌接種於MRS培養基上，置於攝氏37度環境下，厭氧培養48小時，菌落型態呈現如圖3A-D所示，BR101菌落(colony)呈白色、邊緣(Margins)平滑(Entire)、表面凸起(Raised)；BCRC14625菌落呈白色、邊緣平滑具透明環、表面凸起；BCRC16091菌落較小、邊緣平滑、菌落平坦(flat)；BCRC17476菌落呈白色、邊緣平滑、表面凸起。

2.2 16S rDNA基因片段差異分析結果

利用BR101與其他三株洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 標準菌株(購自生物資源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476)以16S rDNA基因片段序列進行序列比對，並將BR101與其他標準菌株16S rDNA基因片段定序後，利用Vector NTI 7.0軟體進行比對，序列比對結果如表5所示，序列比對結果4株菌各代表不同洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。顯示BR101確實與其他標準菌株具有顯著差異。

另利用UPGMA(UNWEIGHTED PAIR-GROUP METHOD USING ARITHMETIC AVERAGES)運算法，建立演化親緣樹。結果如圖4所示：BR101為不同於BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476之洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。

2.3 利用隨機引子對擴增多態性DNA分析進行差異比對

運用隨機引子對擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上，它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引子，對所研究基因組DNA(本實驗乃指乳酸菌基因組DNA)進行PCR擴增，檢測擴增產物DNA片段的多態性，這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位元點分佈發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。利用引子Primer P3[5′GGT GAC GCA G 3′]進行BR101與BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476標準菌株基因組DNA之RAPD比對，DNA電泳圖結果顯示如圖5所示，BR101 RPAD Pattern為1050bp、700bp、400bp、280bp、190bp；BCRC 14625 RPAD Pattern為1400bp、1050bp、700bp、400bp、280bp、190bp；BCRC16091 RPAD Pattern為1050bp、700bp、400bp、280bp；BCRC17476 RPAD Pattern為2Kb、1800bp、1400bp、800bp、700bp、400bp、190bp、2Kb~700bp。此一結果證實BR101與BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476不同的洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。

2.4 利用API50CHL進行菌株醣類生化反應之差異分析

利用API50CHL檢測4株菌株於49種醣類發酵之情形，觀察4株菌株之醣類發酵差異情形。其中僅BR101對於Arbtine(熊果苷，也稱對苯二酚葡萄糖苷)、Esculin ferric citrate(馬栗樹苷醣)與D-lyxose(D-來蘇糖)三種醣類反應為陽性反應，顯示BR101不同於其他洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 標準菌株，結果如表6所示。

3. 刺激分泌IL-10之益生菌株篩選及其功能分析

病人血液樣本約10毫升(ml)，將病人血液沿管壁緩慢加入含有Ficoll-Hypaque(GH Healthcare，Cat.No.17-1400-02)的離心管中，以冷凍離心機進行離心(每分鐘1500轉，15分鐘)進行全血的血球分離，分界面處為周邊血球細胞(PBMC)。將取出的PBMC置於新的15毫升(ml)離心管，並加入10ml 1×PBS至離心管中，以離心機進行離心每分鐘1500轉，15分鐘(1500rpm，5min)，除去上清液，留下血球細胞pellet。取10毫升(ml)RPMI-1640培養基(含1% Penicillin-Streptomycin及10% Calf serum)至離心管中，來回吸沖避免氣泡產生，使血球細胞均勻分佈。取血球細胞懸浮液與trypan blue染劑等體積混合，以血球計數盤進行細胞計數。並以RPMI-1640培養基調整血球細胞懸浮液濃度為4.0×10⁶ cells/ml備用。

取200微升(μl)的血球細胞懸浮液加入無菌96孔盤，並加入20微升(μl)之益生菌菌液，置於攝氏37度5% CO₂ 環境中培養48小時後，取出上清液進行IL-10 ELISPOT assay。其結果如表7所示。藉由上述篩選結果，具有刺激細胞分泌IL-10之益生菌株為BR101。

4. 利用人類週邊血球細胞篩選刺激分泌IL-10之益生菌株

自體免疫疾病中，以類風濕性關節炎較為常見，故收集類風濕性關節炎患者之血液，並分離出其人類週邊血球細胞與不同益生菌種進行共同培養後，以ELISPOT assay分析判斷適合類風濕性關節患者之益生菌種。進行比較分析之菌種包括副乾酪乳桿菌(L.paracasei )、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus )、比菲德氏龍根菌(B. longum )、腸球菌(E.faecium )、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus )、本發明BR101(L.reuteri )等六種較常見的益生菌種。

4.1 BR101及其他益生菌菌株之製備

將欲進行篩選之益生菌以MRS Broth進行培養後，以每分鐘4000轉，離心5分鐘，去除上清液加入1×PBS buffer洗滌三次，將試管底部的沉澱物以1×PBS buffer回溶成懸浮液，並以1×PBS稀釋調整菌數為5.0×10⁸ CFU/ml(以OD₆₀₀ 進行測定，OD₆₀₀ 為1.0時，預估菌數為5.0×10⁸ cell/ml)，置於攝氏95度水浴槽中加熱處理5分鐘後，置於攝氏4度備用。

洛德乳酸桿菌L.reuteri BR101乃由光晟生物科技公司篩選自嬰兒糞便檢體之菌種，該菌種經分子生物學鑑定為L.reuteri 。將該菌株接種於MRS液體培養基中，置於厭氧環境下以攝氏37度培養6-8小時活化放大後，利用冷凍乾燥方式進行凍乾。凍乾菌粉粉末檢測菌數須大於1.0×10¹¹ CFU/g。取1g菌粉溶於10毫升(ml)無菌水中，充分均勻混合後，以每分鐘4000轉，離心5分鐘，去除上清液加入1×PBS buffer洗滌三次，將試管底部的沉澱物以1×PBS buffer回溶成懸浮液，並以1×PBS稀釋調整菌數為5.0×10⁸ CFU/ml(以OD₆₀₀ 進行測定，OD₆₀₀ 為1.0時，預估菌數為5.0×10⁸ cell/ml，將菌粉混合液稀釋至2.0×10⁸ CFU/ml，置於攝氏95度水浴槽中加熱處理5分鐘後，置於攝氏4度備用。

4.2 人類週邊血球細胞收集及製備

收集病人血液樣本約10毫升(ml)，將病人血液沿管壁緩慢加入含有Ficoll-Hypaque(GH Healthcare，Cat.No.17-1400-02)的離心管中，以冷凍離心機進行梯度離心(1500rpm，15min)來進行全血的血球分離，分界面處為周邊血球細胞(PBMC)，沉澱物為紅血球。將取出的PBMC置於新的15毫升(ml)離心管，並加入10毫升(ml)1×PBS至離心管中，以離心機進行離心(每分鐘1500轉，5分鐘)，除去上清液，留下血球細胞pellet。取10毫升(ml)RPMI-1640培養基(含1% Penicillin-Streptomycin及10% Calf serum)至離心管中，來回吸沖20次並避免氣泡產生，使血球細胞均勻分佈。取血球細胞懸浮液與trypan blue染劑等體積混合，以血球計數盤進行細胞計數。並以RPMI-1640培養基調整血球細胞懸浮液濃度為4.0×10⁶ cells/ml備用。

4.3 實驗控制組之製備

本試驗之控制組為正常控制組(Normal control)及正控制組(Positive control)，正常控制組即為PRMI-1640(含10%FBS)；正控制組為1微克/毫升(μg/ml)LPS(Lipopolysaccharide,Escherichia coil serotype O55：B5，Sigma)。本試驗使用脂多糖(Lipopolysaccharide)為正控制組乃因其為一大型分子由脂和多糖由共價鍵相連組成的。脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，提供細菌以結構的完整性，並保護細菌膜受某些化學物質的攻擊。脂多糖是內毒素，可引起強烈免疫反應。

4.4 利用ELISPOT assay進行乳酸菌刺激PBMC產生IL-10之分析

ELISPOT assay利用呈色反應，於細胞分泌細胞激素的對應位置上顯現可辨的斑點，並可直接在顯微鏡下人工計數斑點或利用ELISPOT辨識系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，計算出分泌該細胞激素的細胞數量。其檢測原理乃是利用96孔盤底部PVDF材質薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內毒素endotoxin)的單株抗體。當血液檢體經過分離後的取得之PBMC(人類週邊血球細胞)細胞被加至96孔盤上，利用抗原刺激後將微孔盤放置於是當溫度下培養16~24小時後，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時後會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除並清洗後，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標記的二次抗體來標誌，其後再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，並加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點。其反應步驟如下：1)於無菌操作台中，將已precoated mAb 9D7 plate自攝氏4度回溫至室溫後，以無菌1×PBS洗滌4次(200μl/well)；2)加入200μl/well之培養基RPMI-1640(含10% FBS)於室溫下進行blacking 30分鐘； 3)去除培養基，以100μl 1×PBS洗滌一次，於吸水紙上輕拍；4)加入PBMC(細胞濃度調整為1.0×10⁶ ~1.0×10⁸ cells/ml)及BR101菌液(1.0×10⁶ ~1.0×10⁸ CFU/ml)，最後體積約計150μl/well，此時正對照組為mAb CD3-2同時加入，試驗濃度為100ng/毫升(ml)；5)將plate置於攝氏37度5% CO₂ 培養箱中反應12~48小時。6)去除細胞懸浮液，加入200μl/well 1×PBS洗滌五次；7)稀釋偵測抗體12-G8-biotin至濃度1μg/毫升(ml)於1×PBS-0.5%FBS(1×PBS含0.5%胎牛血清)，加入100μl/well稀釋之抗體，於室溫下反應2小時；8)去除上清液，加入200μl/well 1×PBS洗滌五次；9)稀釋Streptavidin-ALP(1：1000)於1×PBS-0.5%FBS(1×PBS含0.5%胎牛血清)，加入100μl/well於室溫下反應1小時；10)去除上清液，加入200μl/well 1×PBS洗滌五次；11)將呈色劑BCIT/NBT以0.45μm濾膜進行過濾並加入100μl/well，至於室溫下直到斑點呈現為止；12)完全顯色後，將上清液加入相應的盤中，以蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜乾燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜乾燥後，利用顯微鏡或判讀系統即可讀取斑點數，將plate置於室溫下避光保存。

利用ELISPOT assay分析六株益生菌與人類週邊血球細胞共同培養後，進行刺激分泌IL-10之分析，依據斑點數計算出分泌該細胞激素的細胞數量，結果如表7所示。其斑點數結果依序為BR101為324；B.longum 為306；E.faecium 為304；L.rhamnosus 為298；L.acidophilus 為294；L.paracasei 為240。故篩選出刺激分泌量最高之益生菌為BR101洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) 。

5. 利用BR101進行非正式人體試驗

受試者以能定期在門診追蹤治療者為優先，且需符合以下條件：1)年齡19至75歲；2)最近一年內曾經抽血檢驗發現類風濕因子為陽性者；3)罹病期為6週~1年；4)固定服用藥物者請定期追蹤；5)類固醇藥物劑量每天>7.5毫克；6)或於近4周內接受關節內注射者。

其他排除參與試驗者標準包括：診斷為類風濕性關節炎病期大於1年以上者、肝腎功能受損者、慢性或經常感染(如慢性支氣管炎，復發性鼻竇炎)或其他感染疾病等，其他行政因素，如搬家、經濟因素或不肯配合試驗等則排除試驗。完成試驗者共計14位，試驗時間為1個月。

取洛德乳酸桿菌菌種(Lactobacillus reuteri) BR101進行活化放大後，以冷凍乾燥方法進行粉末加工，將菌粉添加賦型劑後充填膠囊，使每顆膠囊菌數大於5×10⁹ CFU。本試驗篩選期為4週，於門診確認並取得患者同意後進行試驗，並填寫第一次症狀評分表，之後每日食用6顆膠囊，於1個月後請受試者再填寫第二次症狀評分表，並依據受試者所填寫之症狀評分表進行分析。此症狀評分表乃修改DAS(Disease Activity Score)及HAQ(Health Assessment Questionnaire)，內容包含五個主要關節(手肘關節、腕部關節、手指關節、膝關節及族關節之症狀)於疼痛、僵硬、腫脹及發熱等症狀之發生頻率及嚴重程度，另包含日常生活之評估，如表8所示。

資料收集後，以統計軟體SPSS 17.0版進行資料分析，以nonparametric test統計，以Wilcoxon Signed Rank Test統計，分析後P值<0.05具統計上顯著差異意義，主要評估依據是類風濕性關節炎症狀調查表上的分數，所有數據以Mean±S.D.表示。

統計結果如表9所示，受試者食用含有BR101菌粉的膠囊30天後，受試者自我評估食用前後類風濕性關節炎相關症狀是否具有差異情形。經統計分析後，就症狀發生之嚴重程度，在手指關節、日常生活總分等均具有統計上顯著差異(Table 6.， P<0.05)；而在症狀發生頻率上，受試者在腕部關節、手指關節及日常生活上均有顯著差異。顯示受試者在食用含有BR101菌粉的膠囊30天後，於症狀嚴重程度及發生頻率上有明顯的改善(P值<0.05)，表示食用BR101確實能使類風濕性關節炎患者除了降低症狀嚴重程度之外，還具有改善生活品質的能力。所有的受試者均完成30天的實驗，在實驗期間內沒有嚴重不良的反應產生。

雖然已說明且描述了本發明之實施例，但是熟悉此項技術者可作各種修改及改良。並不意欲將本發明限制於如所說明之特殊形式，且所有不背離本發明之精神及範圍的修改都屬於如隨附之申請專利範圍中所界定之範圍內。

綜觀上述，本發明以其整體之組合與特徵而言，既未曾見諸於同類產品中，申請前亦未公開，誠已符合專利法之法定要件，依法提出發明專利之申請。

圖1 BR101之菌落外觀；圖2 BR101之革蘭氏染色鏡檢結果；圖3A BR101之菌落外觀型態圖3B BCRC14625之菌落外觀與BR101作比較差異；圖3C BCRC16091之菌落外觀與BR101作比較差異；圖3D BCRC17476之菌落外觀與BR101作比較差異；圖4 親緣演化樹結果；以及圖5 RAPD圖譜之差異分析結果。

<110> 光晟生物科技股份有限公司

<120> 洛德乳酸桿菌BR101之用途

<130> PK13521

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 1

Claims

一種洛德乳酸桿菌BR101之用途，係用以製備改善類風濕性關節炎之藥物，其中，該洛德乳酸桿菌係投予一所需個體，以改善該所需個體之類風濕性關節炎症狀，該洛德乳酸桿菌係寄存於食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC910512，該洛德乳酸桿菌係具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列，且該洛德乳酸桿菌之投予劑量係每天3×10¹⁰ CFU，且連續投予4週。
一種洛德乳酸桿菌BR101之用途，係用以製備改善類風濕性關節炎之保健食品，其中，該洛德乳酸桿菌係投予一所需個體，以改善該所需個體之類風濕性關節炎症狀，該洛德乳酸桿菌係寄存於食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC910512，該洛德乳酸桿菌係具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列，且該洛德乳酸桿菌之投予劑量係每天3×10¹⁰ CFU，且連續投予4週。