CN107438664A - 具有胆固醇吸收能力的益生菌株、其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述益生菌株具有胆固醇‑吸收能力的变体，并且涉及其方法和治疗用途。本发明还涉及组合物、药物组合物、饲料或营养品，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述益生菌株具有胆固醇‑吸收能力的变体。

Description

具有胆固醇吸收能力的益生菌株、其方法和用途
发明领域
本发明涉及益生菌株领域，更具体涉及具有胆固醇吸收能力的益生菌株和其治疗用途的领域。本发明还涉及使用益生菌株治疗血脂异常(dyslipidemias)。
背景
高胆固醇血症(hypercholesterolemia)是心血管疾病的最重要的风险因素，并且在很多国家被认为是死亡和残疾的主要原因之一。已经表明，血清胆固醇浓度的1％的减少可能使冠心病风险降低2-3％。高胆固醇血症的药物治疗具有不希望的副作用，所述副作用已经对其治疗用途引起了关注。因此，需要在人中的比较自然的降低血清胆固醇浓度的方法。
尽管研究尚未建立剂量-效果之间的关系，乳杆菌(Lactobacilli)和其他产乳酸细菌在平衡消化功能和帮助胆固醇去除方面发挥重要作用。因为其解缀合胆汁盐的能力，近年来对使用乳酸细菌作为生物学降血胆固醇剂的可能性有兴趣。一些研究已经提出了乳酸细菌的消耗与人、大鼠和鸡血液中胆固醇浓度的降低之间的关系。胆汁盐水解酶(BSH)的存在在富胆汁盐环境中对该细菌具有选择优势。BSH活性通过增强其对缀合的胆汁盐的抗性和增加其在胃肠道中的存活并且因此增加其在此定殖的能力来使细菌获益。已经主要针对分离自人、猪和发酵的乳制品的菌株进行了关于乳杆菌的胆汁盐解缀合和减少胆固醇的能力的研究。
已经报道嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和双歧杆菌(bifidobacteria)的菌株从实验室培养基吸收胆固醇。因此，这两种类型的细菌可能具有降低人中的血清胆固醇的潜力。已经进行了很多尝试来阐明参与乳酸细菌菌株的降胆固醇作用的机制。一种提议的机制是在生长过程中由细胞壁降低胆固醇。另一种可能的机制是由产生BSH的细菌去缀合胆汁盐。然而，这些机制需要细菌存活以成功降低血清胆固醇。
因此，本领域中仍然存在提供基于益生菌的疗法的需要，所述基于益生菌的疗法有效用于治疗血脂异常，特别是高胆固醇血症。
发明简述
在第一个方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)BT820的益生菌株，或所述益生菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
在另一方面，本发明涉及生物纯的培养物，其包含本发明所述的益生菌株。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含本发明所述的益生菌株。
在另一方面，本发明涉及药品，其包含本发明所述的益生菌株。
在另一方面，本发明涉及营养品，其包含本发明所述的益生菌株。
在另一方面，本发明涉及饲料，其包含本发明所述的益生菌株。
在另一方面，本发明涉及本发明所述的益生菌株的细胞膜-或细胞壁-富集的级分。
在另一方面，本发明涉及获得本发明所述的具有增加的胆固醇-吸收能力的益生菌株的方法，其包括灭活所述细胞的步骤。
在另一方面，本发明涉及获得本发明所述的具有增加的胆固醇-吸收能力的益生菌株的方法，其包括在其指数期间在6至9的pH培养所述细胞的步骤。
在另一方面，本发明涉及获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法，其包括将具有胆固醇-吸收的微生物与包含肽聚糖水解酶活性的组合物接触。
在另一方面，本发明涉及可通过本发明所述的获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法中的任一种获得的细胞。
在另一方面，本发明涉及本发明所述的益生菌株，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及可通过本发明所述的获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法中的任一种获得的细胞，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及本发明所述的益生菌株，其用于治疗和/或预防选自由以下各项组成的组的疾病或病症：血脂异常(dyslipidemia)，胰岛素抗性和代谢综合征。
在另一方面，本发明涉及可通过本发明所述的获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法中的任一种获得的细胞，其用于治疗和/或预防选自由以下各项组成的组的疾病或病症：血脂异常，胰岛素抗性和代谢综合征。
附图简述
图1：与fluoresterol(对照-)和依泽麦布(Ezetimibe)(对照+)、路氏乳杆菌(L.reuteri)V3401或短双歧杆菌(B.breve)BT820细菌悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。
图2：与fluoresterol(对照-)和依泽麦布(对照+)或灭活的细菌的悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。A，路氏乳杆菌V3401。B，短双歧杆菌BT820。
图3：由(gtg)5(左图)和OPL1(右图)引物产生的路氏乳杆菌株的RAPD样式。左图：泳道从左到右：泳道1，100bp分子量标志物；泳道2，路氏乳杆菌V3401；泳道3，LR35；泳道4，LR20；泳道5，LR01；泳道6，CECT925；泳道7，DSM 19738；泳道8，无模板对照(NTC)；泳道9，100bp分子量标志物和泳道10，1kb分子量标志物。右图：泳道1，V3401；泳道2，LR35；泳道3，LR20；泳道4，100bp分子量标志物。
图4：来自短双歧杆菌BT820和其他短双歧杆菌株和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)菌株的(gtg)5RAPD指纹。泳道1，分子大小标志物1kb。泳道2，分子大小标志物100bp。泳道3，短双歧杆菌BT820。泳道4，BB26。泳道5，DSM20091。泳道6，CECT4839。泳道7，BB69。泳道8，长双歧杆菌ATCC15707。
图5：与fluoresterol胶束(对照)，依泽麦布(300μM)，路氏乳杆菌V3401、短双歧杆菌BT820的热灭活的细胞悬浮液(5·108个细菌/mL)孵育的HT-29肠细胞，以及与Ezetime和每种微生物共孵育的肠细胞的相对荧光(几何平均数)。
图6：与fluoresterol孵育的路氏乳杆菌V3401、短双歧杆菌BT820样品和阴性对照(随机选择的)的净荧光(任意单位)，并且通过荧光光度测定法测量。
图7：路氏乳杆菌V3401、短双歧杆菌BT820和随机选择的阴性对照的悬浮液中的荧光(几何平均数)/细菌，其通过荧光光度测定法测定。
图8：A，生长培养基(培养基A pH 6和培养基B pH 5)中获得的路氏乳杆菌V3401培养物的存活细菌的浓度。B，与fluoresterol(对照-)、依泽麦布(对照+)或热灭活的在所述条件下生长的路氏乳杆菌V3401的悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。
图9：与fluoresterol(对照-)、依泽麦布(对照+)或在不同培养基和生长pH生长的热灭活的路氏乳杆菌V3401的悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。A，培养基B pH 5加上葡萄糖。B，培养基B pH 5加上磷酸钾。C，培养基B pH 5低浓度的酵母提取物。D，培养基B pH 5加上磷酸钾和低浓度的酵母提取物。E，标准培养基B pH 5。F，培养基BpH 6。G，培养基A pH 6。H，培养基A pH 5。
图10：与fluoresterol(对照-)、依泽麦布(对照+)或在不同生长pH值在培养基B中生长的热灭活的路氏乳杆菌V3401的悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。
图11：与fluoresterol和在pH 5的培养基B中生长14小时、在pH 6孵育24h并且以不同时间间隔收集的热灭活的路氏乳杆菌V3401的细菌悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。
图12：通过qPCR测量的在培养基B和培养基A中的溶解酶的相对基因表达值。
图13：获自在pH 4(泳道1-2)、pH 5(3-4)、pH 6(5-6)、pH 7(7-8)的培养基B和pH 6(9-10)的培养基A中生长的路氏乳杆菌V3401的蛋白提取物的酶谱(A)和SDS-PAGE(B)
图14：在pH 6的培养基A(A，B)和pH 5的培养基B(C，D)中生长的路氏乳杆菌V3401的透射电镜图像。
图15：与fluoresterol和热灭活的在培养基ApH 6和培养基B pH 5培养基中生长的细菌悬浮液孵育的H-T29肠细胞的相对细胞荧光平均值(％)。A，路氏乳杆菌LR01。B，短双歧杆菌BB16。C，发酵乳杆菌(L.Fermentum)CECT5716。D，路氏乳杆菌LR35。E，路氏乳杆菌LR20。F，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LL18。F，肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)LM37。H，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PP02。
图16：通过qPCR定量的在培养基ApH6和培养基B pH5培养基中生长的路氏乳杆菌V3401和LR20株的溶解酶基因的相对表达。
图17：与fluoresterol胶束孵育但不与细菌样品(对照-)孵育，与依泽麦布(对照+)和热灭活的路氏乳杆菌LR35、植物乳杆菌(L.plantarum)LP18和短双歧杆菌BT820悬浮液(C)以及与来自路氏乳杆菌V3401的蛋白提取物(T)孵育的每个HT-29肠细胞的相对荧光(％)。
图18：通过流式细胞术测量的荧光强度/细胞(几何平均数)。C：没有fluoresterol的热灭活的细菌样品(自身荧光对照)。F：与fluoresterol孵育的热-灭活的细菌。TF：用路氏乳杆菌V3401蛋白提取物处理的、热灭活的并且与fluoresterol胶束孵育的细菌样品。
图19：57天后在6个动物组中测量的血清胆固醇。误差线描述平均值的标准误差。A，健康对照组；B，高胆固醇血症对照组；C，活的路氏乳杆菌V3401组；D，热灭活的路氏乳杆菌V3401组；E，活的短双歧杆菌BT820组；F，热灭活的短双歧杆菌BT820组。
图20：57天后在六组动物中测量的HDL-胆固醇(A)，LDL-胆固醇(B)和LDL-C/HDL-C比例(C)。误差线描述平均值的标准误差。显示了关于对照组A(#)和关于高胆固醇血症组B(*)的显著差异(t Student α＝0.05和p＜0.5)。
图21：57天后6个动物组中的血浆甘油三酯(A)和磷脂(B)水平。误差线描述平均值的标准误差。
图22：57天后6个动物组中的血浆葡萄糖值。误差线描述平均值的标准误差。显示了关于对照组A(#)和关于高胆固醇血症组B(*)的显著差异(t Student α＝0.05和p＜0.5)。
发明详述
本发明的作者鉴定了两种益生菌株，路氏乳杆菌V3401(登记号CECT8605)和短双歧杆菌BT820(登记号CECT 8606)，它们在体外和体内测定中成功降低由肠上皮细胞对fluoresterol(一种荧光胆固醇类似物)和胆固醇的吸收。它们发挥其作用的机制是基于其吸收胆固醇的能力，由此将胆固醇与肠道隔离并且降低可由肠上皮吸收的量。此外，本发明的作者确定了所述菌株的胆固醇-吸收能力可以出人意料地通过增加似乎是路氏乳杆菌V3401(CECT 8605)株特有的溶解活性(lytic activity)而诱导。该预料不到的研究结果使得能够激活具有所述已有功能的微生物中的胆固醇吸附功能。
菌株和培养物
在第一方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，下文称为“本发明的益生菌株”。
如本文中使用的术语“菌株”，是指微生物物种、优选细菌物种的遗传变体或亚型。如本文中使用的，术语“益生菌株”是指微生物(优选细菌)的活菌株，其当以足够量施用时，对宿主赋予健康益处。适于本发明的情况的宿主包括任何动物，优选灵长类，如人类和黑猩猩，猪，马，牛，山羊，母羊，狗，猫，大鼠和小鼠；更优选是人类。其他适当的宿主包括鸟类，优选鸡、鸭、鹅、天鹅、雉、鸽子(pigeons)、鸽(doves)和鸵鸟。
本发明考虑选自以下各项的益生菌株：
-路氏乳杆菌V3401株(以登记号CECT 8605保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónde Cultivos Tipo，CECT)中)，或其具有胆固醇-吸收能力的变体，和
-短双歧杆菌BT820(以登记号CECT 8606保藏在CECT中)，或其具有胆固醇-吸收能力的变体。
因此，本发明还涉及路氏乳杆菌V3401株和短双歧杆菌BT820株的具有胆固醇-吸收能力的变体。如本文中使用的，术语菌株的“变体″或″突变体″是指任何天然存在的或主要通过突变从参考菌株X获得的特别开发的菌株，它们保持参考株，即CECT 8605路氏乳杆菌V3401株或CECT 8606短双歧杆菌BT820株的胆固醇-吸收能力。
变体可以或可以不具有与本文中示例的特定菌株相同的鉴定的生物特性，条件是它们关于参考株的胆固醇-吸收能力共有类似的有利性质。例如，本文考虑的″变体″株的16S rRNA基因可以与本文中公开的菌株具有约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在另一实施方案中，本发明所述的菌株的变体是指任意这样的菌株：在严格条件下，其基因组与CECT 8605路氏乳杆菌V3401株或CECT 8606短双歧杆菌BT820株中的任一个的基因组杂交。通常，低的严格性杂交反应在10xSSC中在约40摄氏度或相当的离子强度的溶液/温度进行。中等严格性杂交通常在6xSSC中在约50摄氏度进行，并且高严格性杂交反应通常在1xSSC中在约60摄氏度进行。
在另一实施方案中，变体和亲本株的相关程度根据平均核苷酸同一性(ANI)确定，其检测核心基因组的DNA保守性(Konstantinidis K和Tiedje JM，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：2567-2592)。在一些实施方案中，变体和亲本株之间的ANI为约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99,1％，约99,5％，约99,6％，约99,7％，约99,8％，约99,9％，约99,99％，约99,999％，约99,9999％，约99,99999％，约99,999999％以上，但小于100％。
在另一实施方案中，变体和亲本株之间的相关程度根据四核苷酸出现频率相关系数(Tetranucleotide Signature Frequency Correlation Coefficient)确定，其基于寡核苷酸频率(Bohlin J.等人2008，BMC Genomics，9：104)。在一些实施方案中，变体和亲本株之间的四核苷酸出现频率相关系数是约0,99，0,999，0,9999，0,99999，0,999999，0,999999以上但小于1。
在另一实施方案中，变体和亲本株之间的相关性程度根据使用一种以上限制性内切核酸酶通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析亲本和变体株的基因组时获得的相似性程度确定。通过PFGE获得的相似性程度可以通过Dice相似性系数测量。在一些实施方案中，变体和亲本株之间的Dice相似性系数是约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99,1％，约99,5％，约99,6％，约99,7％，约99,8％，约99,9％，约99,99％，约99,999％，约99,9999％，约99,99999％，约99,999999％以上但小于100％。
在另一实施方案中，当两个菌株具有相同的核糖核酸型时(如使用本领域已知的任意方法，例如，Bouchet等人(Clin.Microbiol.Rev.，2008，21：262-273)所述获得的)，菌株被认为是给定亲本株的变体。
在另一实施方案中，变体和亲本株之间的相关程度是通过比较经由基于重复的基因外的回文结构元件的PCR(REP-PCR)获得的两个菌株的遗传性质获得的Pearson相关系数(参见例如Chou和Wang，Int J Food Microbiol.2006，110：135-48)。在一些实施方案中，通过比较变体和亲本株的REP-PCR性质获得的Pearson相关系数是约0,99，0,999，0,9999，0,99999，0,999999，0,999999以上但小于1。
在另一实施方案中，变体和亲本株之间的相关程度是通过经由多基因座序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)获得的两个菌株的遗传特性获得的关联距离(参见例如Maiden，M.C.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：3140-3145)。在一些实施方案中，通过变体和亲本株的MLST获得的关联距离是约0,99，0,999，0,9999，0,99999，0,999999，0,999999以上但小于1。
在优选的实施方案中，变体和亲本株是相同的属的。在更优选的实施方案中，变体和亲本株是相同种或亚种的。
如本文中使用的术语“胆固醇-吸收能力”，是指菌株能够捕获胆固醇并将其结合到其细菌细胞结构中的性质。本领域技术人员将认识到，本领域中存在很多技术适于确定细胞的胆固醇-吸收能力。这包括，但不限于，本专利申请的实施例部分中描述的方法，其基于通过荧光分析(fluorometry)或荧光细胞测定(fluorocytometry)检测fluoresterol或NBD-胆固醇(其是式(I)的胆固醇类似物)从胶束到在细菌中的结合。
适于在本发明中使用的变体包括与它们所源自的菌株的胆固醇-吸收能力相比，具有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，至少150％以上胆固醇-吸收能力的那些变体。
在特定实施方案中，本发明的益生菌株是能存活的细胞的形式。在另一特定实施方案中，本发明的益生菌株是不能存活的细胞的形式。如本文中使用的术语“存活力”，是指细胞维持自身或恢复其潜能并且存活直到它们能够分裂的能力。因此，能存活的细胞是指细胞能够存活并分裂；相反，不能存活的细胞表示细胞不能存活和分裂。应该理解不能存活的细胞包括死细胞。
存活力可以通过很多本领域中常见的测定确定。这些包括细胞溶解或膜渗漏测定，如乳酸盐脱氢酶测定、碘化丙啶测定、台盼蓝测定和7-氨基放线菌素D测定，以及使用DNA微阵列和蛋白芯片测试应激通路的激活的基因组和蛋白组测定。
本发明的益生菌株具有0％，或至少5％，或至少10％，或至少15％，或至少20％，或至少25％，或至少30％，或至少35％，或至少40％，或至少45％，或至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或100％的存活力。细胞存活力百分数反映能够维持自身或恢复其潜力并存活直到它们分裂的细胞的百分数。相反，本发明的益生菌株具有100％，或至少95％，或至少90％，或至少85％，或至少80％，或至少75％，或至少70％，或至少65％，或至少60％，或至少55％，或至少50％，或至少45％，或至少40％，或至少35％，或至少30％，或至少25％，或至少20％，或至少15％，或至少10％，或至少5％，或0％的不能存活力。细胞不能存活力的百分数反映不能维持自身或不能恢复其潜力并存活直到它们分裂的细胞的百分数。
在另一方面，本发明涉及本发明的益生菌株的生物纯的培养物。
如本文中使用的术语“生物纯的培养物”，是指其中与培养物中存在的其他生物相比，本发明的细菌占90％以上，例如95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上或100％的比例的培养物。如本文中使用的术语“培养物”，是指本发明的细菌的群体。培养物可以包含本发明的细菌之外的其他要素，如培养基或能够加入培养基的对培养物生长或维持有益的任何其他物质。术语“培养基(culture medium)”或“培养基(medium)”在本领域中是公知的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制剂。参照细胞培养物使用的术语“培养基”，包括细胞周围环境的成分。培养基可以是固体、液体、气体或相(phases)和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性的气体培养基包括在皮氏培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”还指意在用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触。换言之，为细菌培养而制备的富含营养的液体是培养基。类似地，当与水或其他液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可以称为“粉末的培养基”。“限定的培养基”是指由化学成分限定的(通常纯化的)成分制成的培养基。“限定的培养基”不含表征不够的生物提取物如酵母提取物和牛肉汤。“富培养基”包括设计用于支持大多数或全部可存活形式的特定物种的生长的培养基。富培养基常常包括复合生物提取物。本领域中已知的适于乳酸菌或双歧杆菌培养的任何常规培养基可以用于本发明，如，例如，MRS培养基，HANK’S培养基，APT培养基，RCM培养基，LM17培养基，BSM培养基和Elliker培养基。
在另一方面，本发明涉及本发明的益生菌株的细胞膜-或细胞壁-富集的级分。
如本文中使用的术语“细胞膜-富集的级分”，是指从细胞分级步骤得到的含有比在未分级细胞中多的细胞膜含量的制备物。类似地，如本文中使用的术语“细胞壁-富集的 级分”，是指从细胞分级步骤得到的含有比在未分级细胞中多的细胞壁含量的制备物。获得细胞膜-富集的级分和细胞壁-富集的级分的技术是本领域公知和常规的，并且包括匀浆(如渗透匀浆或使用研钵、研棒、捏混器或超声的物理匀浆)和分级技术(如离心)的组合。
增加微生物的胆固醇-吸收能力的方法
本发明的作者还已经确定，出人意料地，CECT 8605路氏乳杆菌V3401株和CECT8606短双歧杆菌BT820株吸收胆固醇的能力能够通过将细胞进行细胞灭活而诱导或增加(实施例3)。备选地，当细胞在6或更高的pH生长时观察到相同效果(实施例4)。
因此，在另一方面，本发明涉及获得具有增加的胆固醇-吸收能力的选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的方法，下文中称为“本发明的第一个方法”，其包括灭活细胞的步骤或将细胞在6或更高的pH培养的步骤。
术语“胆固醇-吸收能力”，“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820”，和“变体”已经在本发明的益生菌株的上下文中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
本发明的第一个方法包括灭活细胞的步骤。对于本领域技术人员将显而易见的是，该步骤可以对本发明的益生菌株的培养物或对分离的细胞进行。如本文中使用的术语“细胞灭活”，是指将细胞从能够存活转变成不能存活的过程。有不同方法来确定细胞是能存活的还是不能存活的，其在本发明的菌株的上下文中描述。得到的细胞由0％能存活的细胞和100％不能存活的细胞组成，或由至少1％能存活的细胞和99％不能存活的细胞组成，或由至少5％能存活的细胞和95％不能存活的细胞组成，或由至少10％能存活的细胞和90％不能存活的细胞组成，或由至少15％能存活的细胞和85％不能存活的细胞组成，或由至少20％能存活的细胞和80％不能存活的细胞组成，或由至少25％能存活的细胞和75％不能存活的细胞组成，或由至少30％能存活的细胞和70％不能存活的细胞组成，或由至少35％能存活的细胞和65％不能存活的细胞组成，或由至少40％能存活的细胞和60％不能存活的细胞组成，或由至少45％能存活的细胞和55％不能存活的细胞组成，或由至少50％能存活的细胞和50％不能存活的细胞组成，或由至少55％能存活的细胞和45％不能存活的细胞组成，或由至少60％能存活的细胞和40％不能存活的细胞组成，或由至少65％能存活的细胞和35％不能存活的细胞组成，或由至少70％能存活的细胞和30％不能存活的细胞组成，或由至少75％能存活的细胞和25％不能存活的细胞组成，或由至少80％能存活的细胞和20％不能存活的细胞组成，或由至少85％能存活的细胞和15％不能存活的细胞组成，或由至少90％能存活的细胞和10％不能存活的细胞组成，或由至少95％能存活的细胞和5％不能存活的细胞组成，或由至少99％能存活的细胞和1％不能存活的细胞组成。
在本领域中可获得不同的细胞灭活方法，包括热灭活，微波灭活，压力灭活，酸灭活，碱灭活，醇灭活和过氧化物灭活。
在本发明的第一个方法的特定实施方案中，灭活选自由以下各项组成的组：热灭活，微波灭活，压力灭活，酸灭活，碱灭活，醇灭活和过氧化物灭活。
如本文中使用的术语“热灭活”，是指使用高温灭活细胞。通常，这通过将细胞或含有它们的培养基的温度增加到超过50℃来实现。适于热灭活的方法是本领域中公知的，并且包括，但不限于，实施例部分所描述的方法，其由在120℃温育含有本发明的益生菌株的培养物20分钟和允许所述培养物冷却到室温组成。
如本文中使用的术语“微波灭活”，是指使用微波灭活细胞。适于微波灭活的方法是本领域中公知的，并且包括，但不限于，使用实验室微波装置将细胞或含有它们的培养基(含有本发明的益生菌株)进行微波处理。例如，灭活可以通过在3分钟内逐渐将装置的功率增加至300W，并且再维持这些条件5分钟来实现。
如本文中使用的术语“压力灭活”，是指使用压力灭活细胞。适于压力灭活的方法是本领域中公知的，并且包括，但不限于，匀浆，例如使用匀浆器或弗氏细胞压碎器(Frenchpress)。例如，细胞灭活可以使用高压匀浆器在1,500-2,000巴的压力和15-20脉冲/min持续10分钟来实现。
如本文中使用的术语“酸灭活”，是指通过降低pH灭活细胞。这通常通过将酸加入到细胞或含有它们的培养基中并且随后中和所述细胞或所述培养基来实现。为了灭活细胞，强酸是优选的，并且包括，但不限于，盐酸(HCl)，氢碘酸(HI)，氢溴酸(HBr)，高氯酸(HClO4)，硝酸(HNO3)，和硫酸(H2SO4)。酸的强度是指其失去质子的能力或趋势。例如，灭活可以通过向细胞中加入H2SO4直到达到浓度为80mM，在55℃温育细胞4小时，并且通过加入10M NaOH中和直到pH是7来实现。
类似地，如本文中使用的术语“碱灭活”，是指利用pH的增加灭活细胞。这通常通过将碱加入至细胞或含有它们的培养基中并且随后中和所述细胞或培养基来实现。为了灭活细胞，强碱是优选的，并且包括，但不限于，氢氧化钾(KOH)，氢氧化钡[Ba(OH)2]，氢氧化铯(CsOH)，氢氧化钠(NaOH)，氢氧化锶[Sr(OH)2]，氢氧化钙[Ca(OH)2]，氢氧化锂(LiOH)，和氢氧化铷(RbOH)。碱的强度是指其使酸去质子化的能力。例如，灭活可以通过将NaOH加入至细胞直到达到80mM的浓度，在55℃温育细胞4小时，并且通过加入96％H2SO4中和直到pH是7来实现。
如本文中使用的术语“过氧化物灭活”，是指使用过氧化物灭活细胞。过氧化物是含有氧-氧单键或过氧化物阴离子O2 2-的化合物，并且包括过氧化氢(H2O2)，超氧化物，双氧基(dioxygenyls)，臭氧和臭氧化物。例如，细胞灭活可以通过将细胞在1.5％(v/v)H2O2中在37℃温育1小时实现。随后，通过用过氧化氢酶处理细胞消除H2O2。
如本文中使用的术语“醇灭活”，是指使用醇灭活细胞。醇是-OH官能团结合于饱和碳原子的有机羟基化合物，并且包括乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇。例如，细胞灭活可以通过制备细胞培养物与96％乙醇的1∶1稀释液，并且在37℃温育1小时实现。随后，通过在旋转蒸发器或旋转蒸发仪(rotavap)中蒸发去除乙醇。
在优选的实施方案中，所述灭活是热灭活。
由于灭活步骤，本发明的益生菌株的细胞变成不能存活的，或甚至死亡。
备选地，本发明的第一个方法包括在其活跃生长期在6至9的pH培养所述细胞的步骤。
根据本发明的第一个方法的该备选方案，为使细胞生长，必要的是培养基的pH在6至9之间，优选在6至8.5之间，更优选在6至8之间，甚至更优选在6至7.5之间，甚至更优选在6至7之间，或甚至更优选在6至6.5之间。在特定实施方案中，pH是6。
本领域技术人员，使用公知常识，将立即理解，6至9的pH可以通过使用具有该pH的培养基获得。pH在此范围内的培养基是本领域中公知的，但6至9的pH也可以通过用适当的酸，如HCl，或碱，如NaOH调节pH而在任意培养基中获得。
在另一特定实施方案中，本发明的第一个方法包括在6至9的pH培养细胞的步骤，并且其还包括灭活所述细胞的步骤。
如本文中使用的术语“活跃生长期”，是指特征为总生物量或细胞数增加的细菌生长阶段。细菌生长可以以生长曲线的形式表达，其通常绘制为细胞数的对数相对时间的图。批次培养中的细菌生长可以以四个不同时期为模式：
-迟滞期，在此阶段细菌适应生长条件并且细胞数量增长速率最小。
-对数期或指数期，特征为逐渐增加(早期对数/指数期)直到其二者对于特定生长条件都恒定并且最大的生长速率。
-稳定期，特征为下降(早期稳定期)并且最终达到零的生长速率。
-死亡期，培养物中存活的细胞的数量在此阶段下降。
因此，本领域技术人员将立即意识到，活跃生长期从早期对数/指数期延伸，直到早期稳定期。
细菌生长可以通过监测细胞数量，通过测量给定时间间隔内形成的生物质的干重的增加，通过监测特定物质的摄取和代谢(或释放)，和通过测量给定时间内生物质中结合的放射性代谢物的量来测量。通常，通过在分光光度计中测量光密度确定悬浮液中的细菌浓度来测量细胞数量；OD600通常用于此目的。
从本发明的第一个方法得到的细胞表现出与未经历灭活的细胞相比增加的胆固醇-吸收能力。
如本文中使用的术语“增加的胆固醇-吸收能力”，是指是未进行灭活的细胞所显示的胆固醇吸收能力的至少101％，至少105％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，至少150％，至少160％，至少170％，至少180％，至少190％，至少200％，至少250％，至少300％，至少500％，至少1000％以上的胆固醇吸收能力。适于确定细胞的胆固醇-吸收能力的方法包括本专利申请的实施例部分中所述的方法，其基于通过荧光分析或荧光细胞测定检测fluoresterol从胶束到结合到细菌中。
本发明还考虑通过本发明的第一个方法获得的细胞。
因此，在另一方面，本发明涉及可通过增加选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的胆固醇-吸收能力的方法获得的细胞，所述方法包括灭活所述细胞的步骤。
在另一方面，本发明涉及可通过增加选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的胆固醇-吸收能力的方法获得的细胞，所述方法包括在6或更高的pH培养所述细胞的步骤。
令人惊讶地，本发明的作者还观察到，可以改造具有已有吸收胆固醇能力的细胞以增加其胆固醇吸收能力。所述改造通过将所述细胞用从CECT 8605路氏乳杆菌V3401株获得的细胞提取物温育而进行，如实施例7所述。将引起该胆固醇-吸收活性的吸收增加的试剂鉴定为具有胞壁质水解酶活性的酶。不希望受任何理论限制，怀疑肽聚糖水解酶在渗透具有胆固醇-吸收能力的微生物的细胞壁，或在增加其细胞壁对含胆固醇胶束的亲和力方面发挥作用。这将导致增加量的由该微生物吸收的胆固醇。此外，该效应似乎是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株表达的肽聚糖水解酶所特有的。
因此，在另一方面，本发明涉及获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法，下文称为“本发明的第二个方法”，所述方法包括将具有胆固醇-吸收能力的微生物与包含具有肽聚糖水解酶活性的酶的组合物接触。
术语“胆固醇-吸收能力”和“增加的胆固醇-吸收能力”已经在本发明的益生菌株和本发明的第一个方法的内容中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考而包括在此处。
本发明的第二个方法包括将具有胆固醇-吸收能力的微生物与包含肽聚糖水解酶的组合物接触的步骤。
如本文中使用的术语“微生物”，是指微观生物，其可以是单细胞或多细胞生物，并且还可以是具有胆固醇-吸收能力的原核或真核生物。确定微生物是否具有吸收胆固醇的能力的方法已经在本发明的益生菌株的内容中详细描述并且通过参考包括在这里。
在特定实施方案中，具有胆固醇-吸收能力的微生物是原核生物。在另一特定实施方案中，具有胆固醇-吸收能力的微生物是真核生物。
在优选的实施方案中，具有胆固醇-吸收能力的微生物是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株的细菌。在另一优选的实施方案中，具有胆固醇-吸收能力的微生物是CECT 8606短双歧杆菌BT820株的细菌。
为了本发明，与具有胆固醇-吸收能力的微生物接触的组合物包含肽聚糖水解酶。如本文中使用的术语“肽聚糖水解酶”或“胞壁质水解酶”，是指催化肽聚糖的水解的酶，即，能够裂解肽聚糖球囊或其片段中的共价键的酶。该酶的生理功能包括调节细胞壁生长，在细胞分裂和自溶期间分离子细胞，和生长期间周转肽聚糖，其中周转产物用作由其他生物识别细菌的信号传导分子，和在一些细菌中，用于诱导β-内酰胺酶。具体的水解酶放大肽聚糖中的孔，用于组装大的跨包膜复合体(菌毛，鞭毛，分泌系统)，或它们在孢子形成或芽孢产生期间特异性裂解肽聚糖。此外，肽聚糖水解酶参与溶解现象，如在细菌群体中发生的自残或发育溶解。
肽聚糖水解酶活性是指肽聚糖中酰胺、肽和糖苷键的水解。不同肽聚糖水解酶以及其各自的裂解位点在Vollmer等人，2008(Vollmer等人，2008，FEMS Microbiol Rev 32：259-86)中描述。简言之，肽聚糖水解酶包括以下各项：
-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，其水解茎肽的MurNAc和N-末端L-丙氨酸残基之间的酰胺键。这些包括一些酰胺酶(anhAmi)，特异性在1，6-酐MurNAc残基处裂解。
-羧肽酶，其水解肽键以移除C-末端D-或L-氨基酸。这些包括DD-羧肽酶，LD-羧肽酶，和DL-羧肽酶。
-内肽酶，其裂解肽中的酰胺键。这些包括DD-内肽酶，LD-内肽酶，和DL-内肽酶。
-糖苷酶，其裂解多糖链。存在三种类型的糖苷酶：
a)N-乙酰氨基葡糖苷酶，其水解N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基和相邻单糖之间的糖苷键，
b)溶菌酶，和
c)溶解转糖基酶，
溶菌酶和溶解转糖基酶也统称为N-乙酰基-β-D-胞壁质酶(胞壁质酶)并且裂解相同的糖苷键，即，肽聚糖中MurNAc和GlcNAc残基之间的β1，4-糖苷键(图1B)。
肽聚糖水解酶的活性常常对下述特异：特定的肽聚糖类型，存在或不存在二级修饰，或高分子量肽聚糖或小片段之一。因此，肽聚糖水解酶选自由以下各项组成的组：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，羧肽酶，内肽酶，或糖苷酶。
在特定实施方案中，肽聚糖水解酶是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。在另一特定实施方案中，肽聚糖水解酶是羧肽酶。在另一特定实施方案中，肽聚糖水解酶是内肽酶。在另一特定实施方案中，肽聚糖水解酶是选自由以下各项组成的组的糖苷酶：N-乙酰基葡糖胺酶，溶菌酶和溶解转糖基酶。
在优选的实施方案中，糖苷酶是N-乙酰基葡糖胺酶。在另一优选的实施方案中，糖苷酶是溶菌酶。在另一优选的实施方案中，糖苷酶是溶解转糖基酶。
在另一特定实施方案中，肽聚糖水解酶是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株特有的肽聚糖水解酶。
对于肽聚糖水解酶发挥其增加具有胆固醇-吸收能力的微生物中的胆固醇吸收能力的作用，需要将肽聚糖水解酶与所述生物接触。本领域技术人员将容易理解，接触步骤可以以多种方式进行。此种方式之一是通过在所述生物中重组表达肽聚糖水解酶。
因此，在特定实施方案中，包含肽聚糖水解酶的组合物是表达所述肽聚糖水解酶的生物的提取物。
肽聚糖水解酶的重组表达可以使用本领域中常规的方法进行。优选地，编码肽聚糖水解酶的核苷酸序列还编码该酶可能含有的任何天然存在的信号肽。例如，核苷酸序列可以可操作地结合表达-调节序列，由此形成基因构建体或表达盒。如本文中使用的，术语″可操作连接″意为，核苷酸序列编码的肽聚糖水解酶以正确的阅读框在控制序列或表达-调节序列的控制下表达。本发明的表达盒可以通过本领域公知的分子生物学技术获得。控制序列是控制和调节所述肽聚糖水解酶的转录(并且，在适用的情况下，控制翻译)的序列，并且包括启动子序列，编码转录调节子的序列，核糖体结合序列(RBS)和/或转录终止子序列。适于本发明的情况的启动子包括，但不限于，诱导型和组成型启动子。表达盒还可以包括增强子，其可以在启动子序列附近或远端并且可以通过增加转录行使功能。在特定实施方案中，所述表达控制序列在原核细胞中有功能。在另一特定实施方案中，所述表达控制序列在真核核细胞中有功能。
有利地，表达盒还包含编码基序或表型的标志物或基因，其允许选择转化了所述表达盒的宿主细胞。可以存在于本发明的表达盒中的所述标志物的说明性实例包括抗生素抗性基因、对毒性化合物有抗性的基因，并且通常它们全都允许选择遗传转化的细胞。
表达盒可以插入适当的载体中。载体的选择将取决于其随后将被引入的宿主细胞，即，取决于具有胆固醇-吸收能力的微生物。为了说明，其中引入所述核酸序列的载体可以是质粒或载体，当引入宿主细胞中时它们整合或不整合到所述细胞的基因组中。获得所述表达载体可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。在特定实施方案中，所述重组载体是用于转化原核细胞的有用载体。在特定实施方案中，所述重组载体是用于转化真核核细胞的有用载体。
包含编码肽聚糖水解酶的序列的载体可以用于转化、转染或感染具有胆固醇-吸收能力的微生物的细胞。转化、转染或感染的细胞可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得。所述细胞可以是原核或真核的。因此，得到的转化、转染或感染的细胞包含编码肽聚糖水解酶的序列。
包含编码肽聚糖水解酶的序列的基因构建体、表达盒和载体也是本发明的方面。
一旦具有胆固醇-吸收能力的微生物含有包含肽聚糖水解酶的表达载体，所述肽聚糖水解酶可以通过本领域技术人员已知的常规方法重组表达。例如，肽聚糖水解酶的重组表达可以是诱导型的或组成型的。优选地，重组表达的肽聚糖水解酶是分泌的。
因此，得到的重组-表达的肽聚糖水解酶形成与具有胆固醇-吸收能力的微生物接触的组合物的一部分，优选是细胞外的，由此发挥其增加所述胆固醇-吸收能力的功能。
由于负责增加具有胆固醇-吸收能力的微生物的胆固醇吸收能力的肽聚糖水解酶似乎在CECT 8605路氏乳杆菌V3401株中特异性表达，本发明的第二个方法还可以通过应用从所述菌株获得的蛋白提取物进行。
因此，在另一特定实施方案中，包含肽聚糖水解酶的组合物是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株的蛋白提取物。优选地，将CECT 8605路氏乳杆菌V3401株细胞在6或更高的pH培养。
如本文中使用的术语“蛋白提取物”，是指细胞的蛋白内容物。在一些实施方案中，蛋白提取物是指“总蛋白提取物”或“粗蛋白提取物“，其是指源自本发明所述的菌株的蛋白的集合，并且几乎没有细胞壁的片段或碎片和大的细胞器。根据一个示例性的实施方案，总组织蛋白提取物可以通过将细菌加入到裂解缓冲液中获得，但本发明不限于此。然而，总蛋白提取物可以使用本领域中已知的任何提取方法提取。
获得蛋白提取物的方法是常规的和技术人员公知的。通常，通过破坏含有它们的细胞使蛋白进入到溶液中。存在多种实现它的方法，如反复冻融、超声、高压匀浆、过滤或通过有机溶剂渗透化处理。
在一些实施方案中，蛋白提取物至少部分分级，以富集肽聚糖水解酶活性，由此获得“肽聚糖水解酶-富集的提取物”。本领域已知的任何合适方法可以用于获得肽聚糖水解酶-富集的提取物，适当选择和组合如亲和层析、离子交换层析、过滤、超滤、凝胶过滤、电泳、盐析和透析等以使得能够分离和纯化肽。肽聚糖水解酶活性的富集程度可以通过测量富集的提取物中的特定肽聚糖水解酶活性(即，肽聚糖水解酶活性单位/mg蛋白)确定，其中相对于粗提取物中活性的增加表明所述提取物已经富集了肽聚糖水解酶活性。在优选的实施方案中，肽聚糖水解酶-富集的提取物含有是粗提取物中发现的活性的至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的肽聚糖水解酶活性。在另一实施方案中，肽聚糖水解酶-富集的提取物含有相对于粗提取物的活性为至少2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，6-倍，7-倍，8-倍，9.倍，10-倍，100-倍，1000-倍，10000-倍以上的肽聚糖水解酶活性。
本发明的第二个方法的接触步骤需要包含肽聚糖水解酶的组合物接触具有胆固醇-吸收能力的微生物达足够的时间量以允许肽聚糖被裂解。接触步骤是至少1秒，至少10秒，至少30秒，至少1分钟，至少5分钟，至少10分钟，至少30分钟，至少1小时，至少2小时，至少4小时，至少6小时，至少8小时，至少10小时，至少12小时，至少24小时，或更长。
为了确定微生物是否使其胆固醇-吸收能力增加，本领域技术人员将认识到需要确定胆固醇-吸收能力，并且与未进行本发明的第二个方法的相同微生物的胆固醇-吸收能力相比。确定细胞的胆固醇-吸收能力的方法已经在本发明的益生菌株的内容中描述，并且通过参考包括在这里。
本发明还考虑通过本发明的第二个方法获得的细胞。
因此，可通过增加具有胆固醇-吸收能力的微生物的胆固醇-吸收能力的方法获得的细胞是本发明的另一方面，所述方法包括使所述微生物与包含肽聚糖水解酶的组合物接触。
组合物和饲料或营养品
本领域技术人员将立即理解，本发明的益生菌株特别用作组合物，饲料或营养品的一部分。
因此，在另一方面，本发明涉及组合物，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，和“胆固醇-吸收能力”，已经在本发明的益生菌株的内容中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
在特定实施方案中，组合物包含本发明的益生菌株的混合物。
优选地，组合物包含至少2个、至少3个、至少4个以上的本发明的菌株，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例提供在组合物中。在另一实施方案中，组合物包含本发明的细菌菌株中的任一种连同另一菌株或菌株的混合物，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例存在于组合物中。在另一实施方案中，本发明提供组合物，其包含本发明所述的一种以上菌株的培养物上清。优选地，上清以0.1％至99.9％，更优选1％至99％并且甚至更优选10％至90％的比例存在于组合物中。
在另一特定实施方案中，本发明还涉及冻干、冷冻干燥或干燥形式的本发明的菌株的组合物，其可以通过本领域已知的任何常规方法获得。
在另一特定实施方案中，益生菌株或其混合物是不能存活的细胞的形式。
在另一方面，本发明涉及饲料或营养品，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，和“胆固醇-吸收能力”，已经在本发明的益生菌株的内容中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
在特定实施方案中，饲料或营养品包含本发明的益生菌株的混合物。
优选地，饲料或营养品包含至少2个，至少3个，至少4个以上的本发明的菌株，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例提供在组合物中。在另一实施方案中，饲料或营养品包含本发明的细菌菌株中的任一种连同另一菌株或菌株的混合物，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例存在于组合物中。在另一实施方案中，本发明提供饲料或营养品，其包含本发明所述的一种以上菌株的培养物上清。优选地，上清以0.1％至99.9％，更优选1％至99％并且甚至更优选10％至90％的比例存在于饲料或营养品中。
可以用于本发明的适当的食品的非限制性实例是乳、酸奶、奶酪、凝乳、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于发酵的谷物的产品、发酵的肉制品、其他基于乳或谷物的粉末、临床营养配方、冰淇淋、果汁、面包、蛋糕或糖果、动物饲料配方、半合成或合成膳食配方、婴儿配方食品、临床营养配方食品、冰淇淋、果汁、面粉、面包、蛋糕、糖果或口香糖。
在另一实施方案中，包含本发明的益生菌株的饲料或营养品是冻干、冷冻干燥或干燥的形式，其可以通过本领域已知的任何常规方法获得。
在饲料或营养品的另一实施方案中，益生菌株或其混合物是不能存活的细胞的形式。
治疗用途
本发明人已经表明，在含fluoresterol胶束的存在下共培养时，本发明的益生菌株能够减少HT-29细胞(一种肠细胞细胞系)的fluoresterol吸收，如实施例1所示。这是益生菌细胞与HT-29细胞竞争捕获胶束的结果(参见实施例2)。该效应可以开发用于治疗血浆中胆固醇水平起作用的疾病，如血脂异常。本发明人已经证明，摄入本发明的益生菌株降低高胆固醇血症的体内模型中的总血浆胆固醇、LDL/HDL指数和糖血水平(参见实施例8)。
因此，在另一方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防血脂异常。
备选地，该方面可以重新阐述为选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体在制备用于治疗和/或预防血脂异常的药物中的用途。备选地，该方面可以重新阐述为用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的血脂异常的方法，其包括施用选自登记号为CECT8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，和“胆固醇-吸收能力”，已经在本发明的益生菌株的内容中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
如本文中使用的术语″治疗″或“疗法”，包括任何过程、作用、应用、疗法等，其中向受试者(或患者)(包括人类)提供医学帮助，目的是直接或间接改善受试者的病况，或减缓受试者中的病况或病症的进展，或在治疗下减轻疾病或病症的至少一个症状。尤其是，术语治疗涉及向诊断患有血脂异常的受试者施用选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
如本文中使用的术语“预防(prevention)”，“预防(preventing)”或“预防 (prevent)”，涉及向未诊断患有血脂异常，但通常会预期发展所述疾病或处于增加的所述疾病的风险中的受试者施用选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。预防意在避免血脂异常的出现。预防可以是完全的(例如完全不存在疾病)。预防也可以是部分的，从而例如受试者中疾病的出现少于未施用本发明的抑制剂时会出现的。预防还指降低对临床病况的易感性。
如本文中使用的术语“受试者”，是指分类为哺乳动物和鸟类的所有动物，并且包括，但不限于，家养和耕作动物、灵长类和人，例如人类、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、啮齿类、鸡、鸭、鹅、天鹅、雉、鸽子、鸽、或鸵鸟。优选地，患者是任何年龄和种族的男性或女性。
如本文中使用的术语“血脂异常”，是指血液中异常量的脂质或脂蛋白，即，相对于正常值增加或减少的脂质的量。脂质和脂蛋白可以是：
-胆固醇，其异常量可以引起高胆固醇血症，包括由于19号染色体缺陷(19p13.1-13.3)引起的家族性高胆固醇血症，和低胆固醇血症(hypocholesterolemia)。
-甘油酯，如甘油三酯，其异常量可以引起高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)和低甘油三酯血症(hypotriglyceridemia)。
-脂蛋白，如LDL和HDL，其异常量可以引起高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)和低脂蛋白血症(hypolipoproteinemia)。
本发明的益生菌株，由于其吸收胆固醇的能力，特别适于治疗以增加的脂质或脂蛋白水平为特征的血脂异常。
因此，在特定实施方案中，血脂异常是高胆固醇血症。如本文中使用的术语“高胆 固醇血症”，是指其中血液胆固醇水平升高超过临床建议的水平的任何医学病况。例如，如果使用低密度脂蛋白(LDLs)测量胆固醇，如果测量的LDL水平高于，例如，约70mg/dl，则可能存在高胆固醇血症。备选地，如果使用游离血浆胆固醇测量胆固醇，如果测量的游离胆固醇水平超过，例如，约200-220mg/dl，则可能存在高胆固醇血症。
在另一特定实施方案中，血脂异常是高甘油三酯血症。如本文中使用的术语“高甘 油三酯血症”，是指高血液甘油三酯水平。基于空腹水平，轻度和中度高甘油三酯血症诊断为150-999mg/dl的甘油三酯水平，并且严重和非常严重高甘油三酯血症诊断为超过1,000mg/dl的甘油三酯水平。
在另一特定实施方案中，血脂异常是高脂蛋白血症。如本文中使用的术语“高脂蛋 白血症”，是指血液中异常升高的任何脂蛋白水平。脂蛋白包括乳糜微粒，VLDL，LDL，和IDL。高水平的脂蛋白与动脉粥样硬化(atherosclerosis)相关。高脂蛋白血症分为以下五种类型：
-I型：脂肪引起的高脂血症或特发性家族高脂血症(idiopathic familialhyperlipidemia)，其是由缺陷或异常的脂酶引起的罕见病况，特征为1,000-10,000mg/dl以上的甘油三酯水平。
-II型：家族性高β脂蛋白血症(familial hyperbetalipoproteinemia)和基本的家族性高胆固醇血症，其是由于缺陷型细胞表面受体导致，特征为升高的胆固醇和甘油三酯，升高的低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。
-III型：家族性广泛-β疾病结节性黄瘤(familial broad-beta diseasexanthoma tuberosum)，其由缺陷型低密度脂蛋白受体引起，特征为升高的胆固醇和甘油三酯；升高的中密度脂蛋白。
-IV型：内源性高甘油三酯血症(endogenous hypertriglyceridemia)和高β脂蛋白血症，原因是特发性的，特征为低于1,000mg/dL的甘油三酯水平，正常的胆固醇，升高的VLDL。
-V型：混合的高甘油三酯血症，由于缺陷性甘油三酯清除导致，特征为甘油三酯水平高于1,000mg/dL，升高的胆固醇，正常的LDL。
因为各种血脂异常参与胰岛素抗性，可能由于低的HDL血液水平，本发明的益生菌株也用于治疗胰岛素抗性或代谢综合征。
因此，在另一方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防代谢综合征。备选地，这方面可以重新阐述为选自登记号为CECT8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体在制备用于治疗和/或预防代谢综合征的药物中的用途。备选地，这方面可以重新阐述为治疗和/或预防有此需要的受试者中的代谢综合征的方法，其包括施用选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
如本文中使用的术语“代谢综合征”或“胰岛素抗性综合征”或“代谢综合征X”或“心脏代谢综合征”或“综合征X”，是指能量利用和储存的病症，通以下五个医学病况中的三个共存来诊断：腹部(中央)肥胖，升高的血压，升高的空腹血浆葡萄糖，高甘油三酯血症，和低的高密度胆固醇(HDL)水平。代谢综合征增加发展为心血管疾病(特别是心力衰竭)和糖尿病的风险。
在另一方面，本发明涉及选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体作为降血胆固醇剂的用途。
如本文中使用的术语“降血胆固醇剂”，是指促使血液胆固醇水平降低的药剂。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用做药物。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防血脂异常。
备选地，这方面可以重新阐述为包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的组合物在制备用于治疗和/或预防血脂异常的药物中的用途。备选地，这方面可以修改为治疗和/或预防有此需要的受试者中的血脂异常的方法，其包括施用包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的组合物。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防代谢综合征。备选地，这方面可以重新阐述为包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的组合物在制备用于治疗和/或预防代谢综合征的药物中的用途。备选地，这方面可以重新阐述为治疗和/或预防有此需要的受试者中的代谢综合征的方法，其包括施用包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的组合物。
在另一方面，本发明涉及包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的组合物作为降血胆固醇剂的用途。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，“胆固醇-吸收能力”，“血脂异常”，“代谢综合征”，和“降血胆固醇剂”已经在之前详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
在另一方面，本发明涉及饲料或营养品，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及饲料或营养品，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防血脂异常。
备选地，这方面可以重新阐述为包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的饲料或营养品在制备用于治疗和/或预防血脂异常的药物中的用途。备选地，这方面可以重新阐述为治疗和/或预防有此需要的受试者中的血脂异常的方法，其包括施用包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的饲料或营养品。
在另一方面，本发明涉及饲料或营养品，其包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体，其用于治疗和/或预防代谢综合征。备选地，这方面可以重新阐述为包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的饲料或营养品在制备用于治疗和/或预防代谢综合征的药物中的用途。备选地，这方面可以修改为治疗和/或预防有此需要的受试者中的代谢综合征的方法，其包括施用包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的饲料或营养品。
在另一方面，本发明涉及包含选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株、或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体的饲料或营养品作为降血胆固醇剂的用途。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，“胆固醇-吸收能力”，“血脂异常”，“代谢综合征”，和“降血胆固醇剂”已经在之前详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
药品
本领域技术人员将立即理解本发明的益生菌株特别用作药品的部分。
因此，在另一方面，本发明涉及药品，其包含治疗有效量的选自登记号为CECT8605的路氏乳杆菌V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌BT820的益生菌株，或所述菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
术语“益生菌株”，“登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌V3401”，“登记号为CECT8606的短双歧杆菌BT820”，“变体”，和“胆固醇-吸收能力”，已经在本发明的益生菌株的内容中详细描述，并且其定义和实施方案通过参考包括在这里。
如本文中使用的术语″治疗有效量″，是指需要实现预防、治愈、延迟、降低血脂异常、胰岛素抗性或代谢综合征中的一种以上显著症状的严重度，或减轻血脂异常，胰岛素抗性或代谢综合征中的一种以上显著症状所需的本发明的益生菌株的量。术语血脂异常、胰岛素抗性和代谢综合征已经在本发明的治疗用途的内容中详细描述，并且其定义和具体内容通过参考也包括在这里。治疗有效量的本发明所述的益生菌株可以通过本领域常规的方法确定。
在特定实施方案中，药品包含本发明的益生菌株的混合物。
优选地，药品包含至少2个，至少3个，至少4个以上的本发明的菌株，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例提供在组合物中。在另一实施方案中，组合物包含本发明的细菌菌株中的任一种连同另一菌株或菌株的混合物，并且其中每个菌株以0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％的比例存在于组合物中。在另一实施方案中，本发明提供药品，其包含本发明所述的一种以上菌株的培养物上清。优选地，上清以0.1％至99.9％，更优选1％至99％并且甚至更优选10％至90％的比例存在于药品中。
在特定实施方案中，药品包含本发明的益生菌株的混合物。
本发明提供的药品或组合物可以施用给受试者以治疗血脂异常、胰岛素抗性或代谢综合征。术语血脂异常、胰岛素抗性和代谢综合征已经在本发明的治疗用途的内容中详述，并且其定义和具体内容也通过参考包括在这里。
在另一特定实施方案中，药品或组合物还包含一种或多种载体、赋形剂或药用溶剂。
在本发明的情况下，术语″药用载体″或″药用溶剂″或″药用赋形剂″意在包括任何和所有与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、和抗真菌剂等。使用这样的载体和赋形剂(vehicles)用于药物活性物质是本领域共知的，除了迄今与本发明的益生菌株不相容的任何常规载体。稳定剂是在使用的剂量和浓度对受试者无毒性的可接受的载体、赋形剂或溶剂，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苄基氯化铵，氯化六甲铵，苯扎氯铵，苄索氯铵，苯酚，丁醇或苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，和间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个氨基酸)；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成反离子，如钠盐；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN TM，PLURONICS TM或聚乙二醇(PEG)。
本发明提供的药品或组合物可以连同施用说明一起包括在容器、包装或分散器中。
药物制剂可以采用片剂、胶囊、液体细菌悬浮液、干燥口服补充品、湿润口服补充品、干燥管喂料(dry tube feeding)或湿润管喂料(wet tube feeding)的形式。优选地，将益生菌的、含益生菌的或含表面活性剂的组合物和药品导向口腔、胃和/或肠粘膜表面；然而，还可以导向鼻咽、呼吸道、生殖系统或腺体粘膜，并且其可以通过口、鼻、眼、直肠、局部和/或阴道途径施用给受试者。
前述组合物、饲料或营养品或药品组合物中需要的益生菌株的剂量的量将根据病症的性质或组合物的建议用途和涉及的生物类型变化。
益生菌或其组合的任何合适剂量可以用于本发明，条件是毒性作用不超过治疗效果。治疗功效和毒性可以通过标准药学过程，利用实验动物，如通过计算ED，(在50％的群体中治疗有效的剂量)或LD(对50％的群体致死的剂量)统计学而确定。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD/ED比例。尽管如此，个体中新的菌株的活性天然是剂量依赖性的。即，通过摄入或施用上述食材或药物组合物的方式结合更多新的菌株，菌株的保护和/或治疗活性越高。因为本发明的菌株对人和动物无害，可以结合更高的量，从而基本上所述新菌株将定殖高比例的个体粘膜。优选呈现大的治疗指标的组合物。从动物研究获得的数据用于明确用于人或动物用途的剂量范围。该组合物中含有的剂量优选在循环浓度范围内，所述循环浓度范围包括ED，有很少或没有毒性。剂量在该范围内根据使用的剂型、患者的严重度和施用途径改变。根据与需要治疗的受试者相关的因素，由医生确定准确剂量。例如，对于制备本发明所述的食品组合物，本发明的益生菌株结合在合适的支持物中，量为105cfu/g至约1012cfu/g支持物材料，优选约106cfu/g至约1011cfu/g支持物材料，更优选约106cfu/g至约1010cfu/g支持物材料。
在药品或组合物的情况下，益生菌株的剂量应该为约105cfu/g至约1014cfu/g支持物材料，优选约106cfu/g至约1013cfu/g支持物材料，更优选约107cfu/g至约1012cfu/g支持物材料。为了本发明，缩写cfu应该表示“集落生成单位”，其定义为细菌细胞的数量，通过在琼脂平板上的微生物计数表明。
调节剂量和施用以提供足够水平的活性结构部分或维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重度，受试者的一般健康状况，受试者的年龄、体重和性别，施用时间和频率，药物组合，反应敏感度，对疗法的响应。长期作用组合物可以每天、每3至4天，每周，或每两周施用，这取决于特定制剂的半衰期和清除率。
在另一实施方案中，本发明还指采用冻干、冷冻干燥或干燥形式的本发明的菌株的药品或组合物，其可以通过本领域已知的任何常规方法获得。
在药品或组合物的另一实施方案中，益生菌株或其混合物是不能存活的细胞的形式。
生物材料保藏
路氏乳杆菌V3401在布达佩斯条约规定的条件下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(英文是，Type Culture Spanish Collection，CECT)(Edificio 3CUE，Parc CientíficUniversitat de Valencia，Catedrático Agustín Escardino 9，46980Paterna，Spain)。其在2014年9月25日保藏，并且所述保藏物的分配的编号是CECT 8605。
短双歧杆菌BT820在布达佩斯条约规定的条件下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(英文是，Type Culture Spanish Collection，CECT)(Edificio 3CUE，Parc CientíficUniversitat de Valencia，Catedrático Agustín Escardino 9，46980Paterna，Spain)。其在2014年9月25日保藏，并且所述保藏物的分配的编号是CECT 8606。
以下实施例用于说明本发明并且不应理解为限制其范围。
实施例
材料和方法
细菌菌株和生长条件
将路氏乳杆菌V3401和其他乳杆菌物种常规在MRS培养基(Oxoid)中在37℃在厌氧条件下培养。短双歧杆菌BT820和其他双歧杆菌在MRS-半胱氨酸(0.1％p/v)培养基中，也在37℃和厌氧下生长。用于灭活步骤和活性测定的细胞悬浮液在标准生长培养基中在Biostat B 5L发酵罐(B.Braun)中生长8-24小时。尤其是，使用不同pH的培养基A和培养基B。通过以8,000g离心浓缩(10x)生物质并储存在-20℃，直到使用它。
使用API 50CH测试(Biomerieux)，按照供应商的说明测试路氏乳杆菌V3401使用不同碳源生长的能力。在温育的24和48小时分析发酵条。
用于细菌灭活的步骤
当制备灭活的细菌样品时，进行以下步骤：在标准实验室高压灭菌器中在120℃进行热灭活20分钟。微波灭活通过使用Milestone Ethos One装置(其中细菌样品进行3分钟功率提升，达300W，并且在该功率值进行最后5分钟温育)来完成。通过在Microfluidics M-110P匀浆器中以15-20次脉冲/分钟在1,500-2,000巴进行10分钟来进行压力灭活。在55℃在80mM H2SO4中温育4小时并且之后用10M NaOH中和(直到pH是7)是酸灭活的条件。对于碱灭活，按照相同的步骤，但首先使用80mM NaOH，并且使用96％H2SO4用于碱中和。化学灭活通过将细菌样品与1.5％(v/v)H2O2或50％(v/v)乙醇在37℃温育1小时进行。分别通过利用过氧化氢酶的酶处理或蒸发去除化学剂。
肠细胞培养
HT-29肠细胞获得自格拉纳达大学(University of Granada)(西班牙)的CIC，并且在补充有10％(v/v)的FBS，非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中在37℃和5％(v/v)CO2培养。用于fluoresterol吸收的培养物使用96-孔板生长14天，与fluoresterol胶束和细菌悬浮液(5·108个细菌/mL)，或150μM依泽麦布(MSD-SP Ltd)(作为阳性对照)温育3-4小时。在荧光细胞测定之前，通过胰蛋白酶处理将HT-29培养物解团聚，通过离心去除培养基和游离的fluoresterol胶束，并且将肠细胞悬浮在PBS缓冲液中。
Fluoresterol吸收分析
如Sparrow等人(Sparrow等人，1999，J Lipid Res 40：1747-57)所述制备fluoresterol胶束(含有10mM牛磺胆酸钠，6mM磷脂酰胆碱和0.2mM fluoresterol)。细菌的Fluoresterol吸收通过将细菌悬浮液(5·108个细菌/mL)与胶束(0.1mg/mLfluoresterol)在PBS缓冲液中在37℃温育来分析。2小时的温育后，将混合物以5.000g离心5分钟，弃上清，并且将细菌沉淀重悬在0.1mL PBS中。重复该步骤3次以去除游离的fluoresterol胶束。最后，在Tecan Genius微平板读数器(485nm激发，535nm发射滤光片)或在Beckton Dickinson FACScalibur流式细胞仪中确定细菌相关荧光。当流式细胞术是使用的技术时，还用硼酸盐缓冲液(20mM硼酸钠；12mM EDTA；0.01％甲醛和0.01Triton X-100)中的溴化乙锭(10μg/mL)将细菌染色，从而鉴别其群体(分别在488nm和661nm的激发和发射波长读取荧光)。基于从每个样品中的2,000个事件获得的每个细胞的荧光数据(λex：488nm；λem：530nm)定量吸收的fluoresterol。
HT-29肠细胞吸收的Fluoresterol仅通过流式细胞术定量，使用上述设备和相同的激光设置，但不需要溴化乙锭染色来鉴别真核细胞群体。在每个测定中，来自阴性对照(与fluoresterol胶束温育的肠细胞)的数据用作参考来计算问题样品中的相对(％)吸收。
显微镜检
在Carl Zeiss Libra 120Plus显微镜上拍摄在培养基A pH 6和培养基B pH 5培养基中生长的路氏乳杆菌V3401的透射电镜图片。
路氏乳杆菌V3401蛋白提取物和蛋白电泳
将来自路氏乳杆菌V3401的细菌细胞以0.2g/mL(湿重)重悬在冰冷的50mM磷酸钾，1mM EDTA缓冲液(pH 6，含有0.1-0.2g/mL酸洗涤的玻璃珠(0.25-0.5mm))中。在涡旋振荡器中通过搅拌进行物理细胞破坏十次20秒的时期(冰上冷却间隔20秒)。在4℃以14.000g离心15分钟后，弃去细胞碎片，并且按照Bradford方法定量富含蛋白的上清。
在“激活”实验中，将短双歧杆菌BT820和其他细菌用0.1-0.2mg/mL的路氏乳杆菌V3401蛋白提取物在37℃在50mM磷酸钾缓冲液pH 6中温育8-12小时(5·109个细菌/mL)。温育后，通过离心和用PBS缓冲液洗涤去除蛋白提取物。
变性SDS-PAGE在8％(p/v)凝胶中进行，并且电泳条带通过考马斯染色显现。用于溶解酶检测的酶谱在含有10mg/mL的高压灭菌的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)细胞的8％SDS-PAGE半天然凝胶中运行。蛋白样品(15-20μg)电泳后，在37℃在50mM磷酸钾pH 6缓冲液，0.1％(v/v)Triton X-100中温育凝胶。具有溶解活性的蛋白条带通过用亚甲基蓝(在0.01％p/v KOH中0.1％p/V)染色1-2分钟，并且用水彻底洗涤来检测。
胆汁盐水解测定
如下述测定通过细菌样品的胆汁盐水解：在37℃，将5·108cfu/mL的细菌(活的)与1mg/mL的猪胆汁盐在1M硼酸盐缓冲液pH 10中温育2小时：通过将10μL的酶反应液与100μL的邻苯二醛(OPA)试剂混合来定量由水解酶释放的牛磺酸。最后，加入2mL的0.5M NaOH，并且在TecanGenius微平板读数器中分析荧光(λex 340nm/λem 465nm)。通过使用已知浓度的该有机酸进行的校准曲线的方式计算牛磺酸浓度。
胆固醇酯酶活性
用分光光度法在415nm分析胆固醇酯酶动力学；在37℃在Tecan Genius微平板读数器中10分钟，以研究路氏乳杆菌V3401或短双歧杆菌BT820是否能够抑制该酶。4-硝基苯基丁酸盐(2.5mM)用作发色底物，其溶解在100mM磷酸钠缓冲液pH 7，100mM NaCl，0.5mM牛磺胆酸钠中。将细菌样品(5·108个细菌/mL)在反应混合物中与0.04U/mL的酶共温育，并且直线(A415nm相对时间)的斜率用于确定和比较酶活性。
DNA纯化，扩增和测序
使用QIAamp DNA微试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，QIAgen)，按照用于革兰氏阳性细菌的说明纯化来自细菌样品的基因组DNA。DNA在PCR扩增测定中用作模板，用于16S基因纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAgen)和测序(Sistemas Genomicos，S.L.Spain)，RAPD模式产生和特定DNA序列检测。PCR反应在Eppendorf热循环仪中进行，使用表1中提供的寡核苷酸(Eurofins Genomics)作为引物和MasterTaq(5Prime GmbH)PCR试剂盒中含有的反应成分。通过标准琼脂糖凝胶电泳技术解析和显现DNA片段。
RNA分离和基因表达分析
按照TRIzol方法(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal Biochem 162：156-159)，分离原核和HT-29肠细胞RNA样品。初始生物质样品获自10mL处于晚期对数期的乳酸菌培养物，和获自对于肠细胞温育14天的24-孔平板(每种样品一个孔)。将总RNA样品与DNA酶I温育，并且重复TRIzol提取以去除核酸酶。RNA浓度、完整性和纯度通过琼脂糖凝胶电泳和UV分光光度法确认。
对于qPCR基因表达研究，进行两步反转录cDNA合成。首先，使用oligo d(T)15和随机六聚体作为反转录引物(分别用于真核和原核RNA样品)，和AffinityScript QPCR cDNA合成试剂盒(Agilent)，按照制造商的说明合成cDNA。在第二步中，在Stratagene MX3005P热循环仪中，使用green(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green，Agilent)作为荧光团扩增特定cDNA片段。按照ΔΔCt方法和Willems等人(Willems等人，2008；AnalBiochem 379：127-9)关于数据标准化的建议，将来自对照基因(GADPH)反应和分析的基因(NPC1L1或溶解酶基因)的Ct值用于基因表达计算。
消减杂交
按照PCR-SelectTM cDNA消减试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，USA)的用户使用手册进行细菌抑制性消减杂交(suppressive substractive hybridization，SSH)，不同之处在于，随机引物用于第一链cDNA合成。在抑制性消减杂交实验中，培养基A中生长的路氏乳杆菌V3401用作测试者样品，并且在培养基B中生长的路氏乳杆菌V3401用作驱动者。
将消减的cDNA片段克隆在pGEM-T载体(Promega)中，使用T7和SP6寡核苷酸作为引物扩增，并且由Sistemas Gen6micos，S.L(Spain)测序。使用NCBI主页上的Blastn程序在核苷酸数据库中鉴定所获得的核苷酸序列。
动物组和膳食
六十只雌性Wistar大鼠(重量为约200g)购自Janvier Labs(France)。将大鼠分别圈养在笼中并且维持在恒定温度(23±2℃)和湿度(55±5％)，并暴露在12-小时亮/暗周期。
以正常饮食(2014Teklad Global 14％蛋白啮齿类维持饮食(Protein RodentMaintenance Diet)，Harlan)2周适应期后，将60只大鼠分为6组，每组10只大鼠。六组如下分配饮食：(A)对照组，正常饮食，既不接受细菌样品，也不接受高胆固醇饮食；(B)阳性对照，高-胆固醇饮食。剩余组，除了高-胆固醇饮食，还给予在饮用水中的每日剂量的细菌样品(2x 109个细菌/动物/日)：(C)活的路氏乳杆菌V3401；(D)热灭活的路氏乳杆菌V3401；(E)活的短双歧杆菌BT820；(F)热灭活的短双歧杆菌BT820。高-胆固醇饮食在标准饮食(2014Teklad Global 14％蛋白啮齿类维持饮食，Harlan)中含有1％(w/w)胆固醇。将大鼠喂食57天，并且记录体重。此时期之后，处死大鼠。
血液血清指数的测定
每7-10天从尾静脉采集血液样品，以使用来自BioSystems的胆固醇试剂盒确定血清胆固醇。到实验期(57天)结束时，禁食12小时后，使用心脏穿刺从每只大鼠采集约5mL血液样品。使用Mindray BS200自动化学分析仪测量血清总胆固醇(TCH)、高-密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯、磷脂和葡萄糖。
实施例1：筛选具有抑制人肠细胞的胆固醇吸收的能力的细菌菌株
为了进行此工作，开发了基于HT-29人肠细胞的培养物和荧光胆固醇类似物(fluoresterol)的方法。
HT-29肠细胞对fluoresterol(溶解在磷脂酰胆碱和牛磺胆酸钠的胶束中)的吸收可以通过流式细胞术定量。将HT-29细胞培养物在fluoresterol胶束的存在下温育至少3小时，并且在培养物解聚集后，通过上述技术确定细胞群的荧光。细胞荧光与吸收的fluoresterol的量成比例。通过在所述体外模型中测定降低胆固醇的药物依泽麦布(依替米贝)(浓度为150μM)验证该方法。
使用该方法确定多于400种样品的细菌采集降低fluoresterol吸收的能力。将细胞培养物与fluoresterol胶束和能存活的或灭活的细菌的悬浮液(5·108cfu/mL)温育。不能存活的样品的库使用不同灭活方法获得：热，高压，微波和用酸、碱、醇和过氧化氢温育。
将阴性对照培养物(没有细菌样品)的平均细胞荧光数据与获自与细菌悬浮液温育的培养物的值相比，使我们鉴定了两种能够降低多于25％的fluoresterol吸收的细菌物种：路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820(图1)。
当活体并且通过不同方法灭活测定时，两种细菌菌株均显示活性(图2)。
实施例2：细菌菌株的表征
2.1路氏乳杆菌V3401
在MRS培养基上从生牛奶分离路氏乳杆菌V3401。其鉴定通过核糖体16S基因扩增和测序进行。所得到的部分核糖体16S基因序列(SEQ ID NO：1)显示出与来自对应于路氏乳杆菌株的几个EMBL条目(I5007，BCS159，NM94-6和TB-B11)的16S基因序列100％的相似性。
使用来自路氏乳杆菌V3401和五种其他路氏乳杆菌株的模板基因组DNA作为模板，利用RAPD(多态性DNA的随机扩增)指纹测试进行路氏乳杆菌V3401的区分(图3)。(gtg)5和OPL1寡核苷酸用作引物(表1)。
表1.在PCR测定中用作引物的寡核苷酸
(gtg)5和OPL-1RAPD模式使我们能够区分路氏乳杆菌V3401和其他5个测试的菌株。(gtg)5条带样式引物对V3401和LR20路氏乳杆菌株特异，是必要的另外的RAPD分析，利用OPL-1引物区分V3401和LR20路氏乳杆菌株。
此外，使用API CH50碳水化合物发酵测试(BioMerieux)，基于其生物化学性质表征路氏乳杆菌V3401。结果显示在表2中。
表2.由路氏乳杆菌V3401在24小时和48小时温育后显示的碳水化合物发酵模式，利用API CH 50系统检测。
2.2.短双歧杆菌BT820
在MRS-半胱氨酸琼脂培养基上从人乳中分离该微生物。通过核糖体16S基因扩增和测序在物种水平鉴定短双歧杆菌BT820。表明获得的部分核糖体16S基因序列(SEQ IDNO：14)与在EMBL DNA数据库中保存的多个短双歧杆菌株(BR2，BGM6，689b，875和JCM1273)的16S基因序列具有显著的相似性(98.6-100％之间)。
以与路氏乳杆菌V3401相同的方式，进行进一步分析以区分短双歧杆菌BT820与属于相同种或属的细菌菌株。使用来自短双歧杆菌BT820、四种短双歧杆菌株和长双歧杆菌株的基因组DNA，使用(gtg)5寡核苷酸作为引物进行RAPD指纹测试。我们的结果(在图4和表3中显示)表明可以基于其特定的(gtg)5RAPD模式将短双歧杆菌BT820与其他双歧杆菌菌株区分。
表3.在利用双歧杆菌菌株进行的(gtg)5-RAPD测定中检测的DNA片段。
实施例3：作用机制
为了知晓两种细菌菌株如何降低HT-29肠细胞中的fluoresterol吸收，进行了多种测定。首先，猜想胆汁盐的解缀合可能促进更低的fluoresterol水平。胆酸盐水解酶是负责该反应的酶，并且甘氨酸和牛磺酸是该水解的产物。为了评价路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820中的这一酶活性，将两种菌株与胆汁盐(10mg/mL)温育2小时，并且检测释放的牛磺酸。结果表明，在我们的实验条件下，路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820都不诱导胆汁盐水解。
另一可能性可能是fluoresterol被细菌菌株代谢或降解，引起荧光团降解，并且解释了与HT-29细胞相关的荧光减少。将路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820与fluoresterol胶束温育24小时，并且在不同时间间隔测量荧光。结果表明，总荧光不比没有细菌样品的fluoresterol阴性对照衰减得多，并且因此，fluoresterol降解和/或代谢假说可能被推翻。
路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820可能通过与真核膜受体NPC1L1相互作用抑制HT-29肠细胞中的fluoresterol吸收。该受体似乎参与哺乳动物中胆固醇通过肠细胞膜的运输，并且其是依泽麦布的分子靶标。我们设计了间接测定以尝试观察路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820是否抑制阻断NPC1L1膜蛋白的胆固醇转运。将HT-29肠细胞与fluoresterol、细菌样品以及与在我们的体外模型中观察到的最大有效浓度(300μM)(其诱导对fluoresterol吸收的40％抑制)的依泽麦布温育。我们猜测，在这些情况下，如果其靶标是相同的胆固醇转运蛋白，依泽麦布完全抑制NPC1L1受体并且将掩盖细菌的可能效应。相反，药物和细菌样品的叠加效果可能解释为它们通过不同机制起作用的证据。我们的实验结果表明，在那些与依泽麦布和路氏乳杆菌V3401或短双歧杆菌BT820温育的HT-29培养物中fluoresterol吸收抑制增加(图5)。因此，我们认为两种微生物都不降低阻断NPC1L1受体的fluoresterol吸收。
其他可能性是，路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820在遗传水平抑制NPC1L1的合成。该假设通过定量与或不与细菌温育的HT-29肠细胞中的相对mRNA浓度进行研究。RNA纯化和反转录后，通过qPCR，使用GAPDH基因作为用于数据标准化的参考来确定NPC1L1基因表达。我们的结果表明，没有由于在路氏乳杆菌V3401或短双歧杆菌BT820的存在下温育导致的HT-29中的NCP1L1表达水平的改变。
胰腺的胆固醇酯酶是参与消化道中胆固醇酯的水解的酶。该水解在胆固醇吸收过程的调节中发挥关键作用。尽管该生理步骤不能造成我们基于HT-29肠细胞的体外模型中fluoresterol吸收的抑制，我们决定评价路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820是否能够抑制该酶，因为该效应可能参与菌株的体内降血胆固醇活性。在细菌样品的存在下，分光光度法测量胰腺胆固醇酯酶的活性，并且结果表明，相对于没有细菌样品的对照反应，酶动力学不改变。
进行三种不同实验来研究路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820是否能够摄取fluoresterol。首先，将两种菌株(热灭活的)与fluoresterol胶束温育3小时，并且，充分洗涤后，通过荧光分光光度法确定与细菌细胞相关的荧光。这些测定的结果显示在图6中。
我们的结果表明，路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820将fluoresterol结合到其细胞中。将来自提到的菌株的细菌样品(以如之前所述的相同方式处理)通过流式细胞术进行分析，获得相似的结果。该技术允许区分与细菌细胞相关的荧光和对应于残留的fluoresterol胶束的荧光，因此是更准确的技术。再次，两种细菌菌株能够吸收fluoresterol(图7)。
为了确认之前的测定中获得的结果，通过共聚焦激光显微镜分析路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820样品(热灭活的，并且与fluoresterol胶束温育)。结果表明，路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820的细胞结构被fluoresterol染色。图像证实两种菌株都能够摄取fluoresterol，并且在细胞测定中可以与HT-29肠细胞竞争，减少可供人细胞吸收的fluoresterol。
实施例4：路氏乳杆菌V3401可以在特定生长条件下培养以增加其减少人肠细胞的 fluoresterol吸收的能力
在路氏乳杆菌V3401的生长条件的优化过程中，测定了几种生长培养基和物理-化学变量，从而增加细菌浓度。利用pH调节至6的名称为培养基A的生长培养基获得其结果已经表明的路氏乳杆菌V3401样品。优化实验的结果允许设计更有效的生产过程(图8A)，所述生产过程使用pH值为5的名称为培养基B的生长培养基。然而，热灭活细菌样品(利用所述生长过程获得的)后，与pH6的培养基A中获得的样品相比，在相同水平，路氏乳杆菌V3401不能降低HT-29肠细胞培养物的fluoresterol吸收(图8B)。
为了确定造成路氏乳杆菌V3401中的这种活性改变的因素，研究培养基的组成和生长pH的效应。在HT-29肠细胞中测试细菌样品(热灭活的，在不同生长条件下获得的)，并且确定其降低fluoresterol的吸收的能力。这些测试的结果显示在图9中。
我们的结果似乎表明，胞外pH可能是路氏乳杆菌V3401降低人肠细胞中fluoresterol吸收的能力的激活过程中的关键因素。为了证实该假设，将路氏乳杆菌V3401在不同胞外pH值的培养基B中培养。再次，一旦获得细菌悬浮液并热灭活，立即测定其降低HT-29肠细胞中fluoresterol吸收的能力。该实验的结果表明，等于或大于6的生长pH值增加路氏乳杆菌V3401抑制HT-29人肠细胞中fluoresterol摄取的能力(图10)。
进行新的测定，以知晓胞外pH是否能够在短的时期内激活路氏乳杆菌V3401。为此，将微生物在pH 5的培养基B中培养14小时。然后，将胞外pH改变至6达24小时。在不同时间间隔收集细菌样品，热灭活，并且在HT-29肠细胞培养物中测试其生物活性。如在图11中所示，在所述条件下生长的路氏乳杆菌V3401不能降低HT-29中的fluoresterol吸收。这些数据似乎表明，路氏乳杆菌V3401的激活过程需要在活跃生长期期间进行在pH 6的温育。
实施例5：激活过程的表征
为了研究造成在pH6相对pH5生长时激活路氏乳杆菌V3401的分子事件，使用从在pH 6的培养基A中生长的路氏乳杆菌V3401(测试者样品)和从在pH 5的培养基B中生长的相同菌株(驱动者样品)分离的cDNA文库进行消减杂交测定。设计该实验来鉴定在第一生长条件中过表达的那些基因。
该实验的结果允许鉴别在pH 6的培养基A中具有更高表达水平的一些基因。这些基因中的一种是溶解酶编码基因(基于序列相似性的鉴别)，其能够参与路氏乳杆菌V3401细胞壁的改变过程，增加其对fluoresterol胶束的亲和性和/或渗透性。在pH 6的培养基A中该基因的过表达通过使用特定引物(表1)的qPCR确认，并且gadph作为对照用于基因数据标准化(图12)。
另一方面，在半天然SDS-PAGE凝胶(酶谱)中在生物化学水平鉴别电泳蛋白条带。从在不同pH的培养基B中生长的路氏乳杆菌V3401中纯化蛋白提取物，并且将其溶解在含有藤黄微球菌的SDS-PAGE凝胶中。亚甲基蓝染色后，在那些从在更高的pH值生长的路氏乳杆菌V3401获得的样品中可以检测到溶解酶(图13)。
尽管在酶谱中检测到在所述基因的表达与酶活性之间存在关联，但是不能得出结论：生化鉴定的溶解酶由消减杂交测定中鉴定的基因编码。
这些结果似乎表明，在pH6的培养基A或培养基B中培养路氏乳杆菌V3401，诱导可能在细菌包膜透化中暗含的溶解酶的活性。为了研究细胞壁完整性，通过透射电镜分析在pH6的培养基A和pH 5的培养基B中生长的路氏乳杆菌V3401样品(图14)。获得的图像表明在pH 6的培养基A中生长的路氏乳杆菌V3401的样品中细胞包膜散开的细菌(图14A和B)，并且这能够由细胞壁的部分水解解释。相反，在pH 5的培养基B中生长的路氏乳杆菌V3401的样品(图14C和D)显示具有限定的形状的电子更致密的细菌。
实施例6：激活机制的特异性
在其他细菌菌株中分析培养基在fluoresterol摄取活性中的影响，以试图找出在路氏乳杆菌V3401中观察到的效果可能有多特异。首先，利用H-T29肠细胞测定分析在pH 6的培养基A和pH 5的培养基B中生长的几个细菌物种的活性(图15)。
结果表明分析的细菌没有一种降低HT-29肠细胞中的fluoresterol吸收，不论是否使用生长培养基。
如之前提及的，路氏乳杆菌V3401的激活似乎至少部分由溶解酶表达的增加调控。此外，在我们的消减杂交实验中鉴定编码溶解酶的基因，并且其存在于其他路氏乳杆菌株(其基因组在科学文献中公开)中。决定使用特定引物(表1)使用路氏乳杆菌的所述菌株的基因组DNA进行PCR实验，研究所述基因是否存在于我们公司得到的其他路氏乳杆菌株中。结果表明，该基因存在于路氏乳杆菌LR20中但不存在于LR35中。在我们的肠细胞测定中，这些菌株没有显示出降低fluoresterol吸收的能力。决定观察路氏乳杆菌LR20中存在的溶解酶基因是否活跃表达。使用从在pH 6的培养基A和pH 5的培养基B中生长的生物质纯化的RNA样品和蛋白提取物，通过qPCR定量基因表达并且通过酶谱检测酶。
这些结果表明，不同于在路氏乳杆菌V3401中，在路氏乳杆菌LR20中，溶解酶基因不根据培养基改变其表达水平，低于在路氏乳杆菌V3401中定量的那些(图16)。
总之，这些数据似乎表明，尽管编码溶解酶的基因存在于其他路氏乳杆菌株中，但是改善路氏乳杆菌V3401的fluoresterol摄取的激活机制(通过溶解酶诱导的方式)是菌株特异的。
实施例7：其他细菌菌株的激活
如上文所述，使路氏乳杆菌V3401能够吸收fluoresterol的优化的生长条件，似乎是菌株特异的。该过程的部分分子机制是基于溶解酶激活，其可能消化细胞壁并且增加细胞渗透性。测试其他细菌的由该酶造成的激活，并且测定其fluoresterol吸收能力。
将该微生物在pH 6的培养基A中培养，获得路氏乳杆菌V3401蛋白提取物，并与以下细菌菌株温育：路氏乳杆菌LR35，植物乳杆菌LP18和短双歧杆菌BT820。温育后，热灭活这些微生物的细菌悬浮液，并且在HT-29fluoresterol吸收测定中进行测试(图17)。结果表明路氏乳杆菌LR35和植物乳杆菌LP18都不降低肠细胞(未处理或与蛋白提取物温育的)中的fluoresterol吸收。相反，短双歧杆菌BT820证实其降低fluoresterol的能力，其在之前的测定中检测，是在与路氏乳杆菌V3401蛋白提取物温育的细菌样品中更高的活性(图17)。
细菌悬浮液对fluoresterol的摄取证实了在HT-29细胞中观察到的结果。路氏乳杆菌LR35和植物乳杆菌LPl8都没有显示出fluoresterol吸收能力。在与和不与路氏乳杆菌V3401蛋白提取物温育的情况下测试两种菌株。相反，相对于未处理的细菌样品，与路氏乳杆菌V3401蛋白提取物温育的那些样品中，短双歧杆菌BT820显示更高的荧光/细胞值(图18)。
实施例8：在高胆固醇血症的动物模型中的体内活性
决定测试路氏乳杆菌V3401和短双歧杆菌BT820对于人肠细胞fluoresterol吸收的体外效果是否能够在体内得到证。为此，使用高胆固醇血症的动物模型进行测定。测定由六个雌性Wistar大鼠组(n＝10)组成，大鼠重量约200g，喂食含有1％(w/w)胆固醇的高胆固醇饮食。在饮用水中施加细菌样品(2·109个细菌/动物/天)(表5)。
表5.体内测定中测试的动物组和饮食。
每7-10天从尾经脉采集血液样品；以确定血清胆固醇。57天后，与喂食标准饮食的组(对照组A)相比，高胆固醇血对照组(组B)显示显著更高的血清胆固醇值。此时，处死大鼠并且测量血清总胆固醇(TCH)、高-密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯、磷脂和葡萄糖。
结果显示在消费益生菌样品的四组动物中较低的TCH值(图19)。与喂食相同的高-胆固醇饮食的那些(对照组B)相比，具有四种样品中的任一种的饮食补充在降血清胆固醇中有效。
此外，喂食高-胆固醇饮食和益生菌样品的大鼠(组C-F)显示出与对照组(组A)相似的HDL-C水平，与之相反，高胆固醇血对照(组B)显示出显著降低的HDL-C水平(图20A)。LDL-C/HDL-C比用于预测心血管风险，被认为比血清胆固醇和/或LDL-C的绝对值更有用。当使用LDL-C值(图20B)以计算该比例时(图20C)，确认饮食摄取益生菌使LDL-C/HDL-C比例降低至与健康组(组A)相似的值。
研究的其他参数是血浆甘油三酯和磷脂水平。高-胆固醇喂食对照动物(组B)显示出比对照组(组A)更高的值，与之相反，喂食高-胆固醇饮食和益生菌样品的大鼠(组C-F)显示出与健康对照组A相似的甘油三酯水平。然而，这些差异不是统计学显著的(图21A)。此外，在从6个实验组获得的血浆磷脂水平之间未发现差异(图21B)。
在非脂质参数中的动物组数据之间也观察到差异。高-胆固醇喂食大鼠(组B)的平均血浆葡萄糖水平比健康对照组(组A)的高。可能是，该增加与胰岛素抗性相关，胰岛素抗性通常与高胆固醇血症和低HDL-C水平相关。喂食益生菌样品的4个动物组显示与健康对照组(组A)相似的血糖值。该结果可以解释为可能由在高胆固醇血对照组B中检测到的高HDL-C水平促进的胰岛素抗性的逆转，并且在益生菌喂食组中未观察到(图22)。
序列表
<110> 生物学研究院
<120> 具有胆固醇吸收能力的益生菌株、其方法和用途
<130> P11074PC00
<150> EP14384202
<151> 2014-12-10
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> 路氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）
<400> 1
ccccagtcat ctgtcccgcc ttaggcggct ccctccataa tggttaggcc accgactttg 60
ggcgttacaa actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac 120
cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc gtgtaggcga gttgcagcct 180
acagtccgaa ctgagaacgg ctttaagaga ttagcttact ctcgcgagct tgcgactcgt 240
tgtaccgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatctgacgt 300
cgtccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcact agagtgccca acttaatgct 360
ggcaactagt aacaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga 420
gctgacgacg accatgcacc acctgtcatt gcgtccccga agggaacgcc ttatctctaa 480
ggttagcgca agatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca 540
tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac 600
tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct ccggcactga agggcggaaa ccctccaaca 660
cctagcactc atcgtttacg gcatggacta ccagggtatc 700
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDHreuExmRNA_D引物
<400> 2
tgtactacta gctgcttggc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDHreuExmRNA_R引物
<400> 3
cagtacggtt gttacgcatc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lysin2_ExmRNA_D引物
<400> 4
atattcatga ggcatttcaa a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lysin2_ExmRNA_R引物
<400> 5
cacgatactg ggaatgaaaa 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (gtg)5引物
<400> 6
gtggtggtgg tggtg 15
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7引物
<400> 7
taatacgact cactataggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP6引物
<400> 8
cgatttaggt gacactatag 20
<210> 9
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPL1引物
<400> 9
ggcatgacct 10
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H_GAPDH_Fw引物
<400> 10
tgaacgggaa gctcactgg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H_GAPDH_Rw引物
<400> 11
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNPC1L1 D引物
<400> 12
tatggtcgcc cgaagca 17
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNPC1L1 R引物
<400> 13
tgcggttgtt ctggaaatac tg 22
<210> 14
<211> 438
<212> DNA
<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）
<400> 14
gggatccagg cagcttgctg cctggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga 60
cctgccccat gcaccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat gctccatcac 120
accgcatggt gtgttgggaa agcctttgcg gcatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt 180
gatggcgggg taacggccca ccatggcttc gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg 240
ccacattggg actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 300
acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atggaggcct tcgggttgta 360
aacctctttt gttagggagc aaggcacttt gtgttgagtg tacctttcga ataagcaccg 420
gctaactacg tgccagca 438

Claims (15)

1.选自登记号为CECT 8605的路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)V3401和登记号为CECT 8606的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)BT820的益生菌株，或所述益生菌株具有胆固醇-吸收能力的变体。
2.根据权利要求1所述的益生菌株，其中所述益生菌株是能存活的细胞或不能存活的细胞的形式。
3.生物纯的培养物，或组合物，或药品，或饲料或营养品，其包含权利要求1或2中任一项所述的益生菌株，或权利要求1或2中任一项所述的益生菌株的细胞膜-或细胞壁-富集的级分。
4.一种获得权利要求1或2中任一项所述的具有增加的胆固醇-吸收能力的益生菌株的方法，所述方法包括灭活所述细胞的步骤或在其活跃生长期在6至9的pH培养所述细胞的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述灭活选自由以下各项组成的组：热灭活，微波灭活，压力灭活，酸灭活，碱灭活，乙醇灭活和过氧化物灭活。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述灭活是热灭活。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述pH是6。
8.一种获得具有增加的胆固醇-吸收能力的微生物的方法，其包括将具有胆固醇吸收的微生物与包含肽聚糖水解酶活性的组合物接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肽聚糖水解酶选自由以下各项组成的组：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，羧肽酶，内肽酶，或糖苷酶。
10.权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述包含肽聚糖水解酶活性的组合物是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株的蛋白提取物。
11.权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述具有胆固醇-吸收能力的微生物是CECT 8605路氏乳杆菌V3401株或CECT 8606短双歧杆菌BT820株的细菌。
12.能够通过权利要求4至11中任一项所述的方法获得的细胞。
13.根据权利要求1或2中任一项所述的益生菌株，或根据权利要求12所述的细胞，或根据权利要求3所述的饲料或营养品，其用作药物。
14.根据权利要求1或2中任一项所述的益生菌株，或根据权利要求12所述的细胞，或根据权利要求3所述的饲料或营养品，其用于治疗和/或预防选自由以下各项组成的组的疾病或病症：血脂异常，胰岛素抗性和代谢综合征。
15.根据权利要求14所述的益生菌株，或根据权利要求14所述的细胞，或根据权利要求14所述的饲料或营养品，其中所述血脂异常是高胆固醇血症。
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