CN109182162A - 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及应用 - Google Patents

一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，保藏号为CGMCC15780，本发明还包括该菌株的应用。所述植物乳杆菌从青藏高原传统发酵牦牛酸奶和青贮饲料中筛选具有高抗氧化能力的乳酸菌菌株，经过体内体外试验证明，其具有较好的抗氧化能力，能有效促进体内抗氧化酶活性的增加。该菌株较好的疏水能力增加了其黏附到肠道壁并发挥益生作用的机会，无毒副作用，可作为保健食品或药品提高机体免疫力、抗衰老、美容以及调节肠道菌群等。

Description

一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及功能性乳酸菌开发与应用领域，特别是一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，本发明还包括该植物乳杆菌的应用。
背景技术
氧化作用是机体的必要代谢过程，但过度的氧化作用会引起生物大分子的损伤。氧化应激是导致机体衰老和衰老相关疾病的根本原因。
自由基具有强烈的氧化作用，可以引发脂质过氧化反应造成细胞膜受损，进而使细胞死亡。当人体有过量自由基产生时，自由基会与人体细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子结合，并破坏它们的结构和功能。自由基对人的具体危害如下：(1)削弱细胞的抵抗力，使身体易受细菌和病菌感染； (2)产生破坏细胞的化学物质，形成致癌物质；(3)阻碍细胞的正常发展，干扰其复原功能，使细胞更新率低于死亡率；(4)破坏体内的遗传基因阻止，扰乱细胞的运作及再生功能，造成基因突变，演变成癌症；(5)破坏细胞内的线粒体，造成氧化性疲劳；(6)破坏细胞膜，干扰细胞的新陈代谢，使细胞膜丧失保护细胞的功能；(8)破坏蛋白质，破坏体内的酶，导致炎症和衰老；(9)破坏脂肪，使脂质过氧化，导致动脉粥样硬化，发生心脑血管疾病；(10)破坏碳水化合物，使透明质酸降解，导致关节炎。从以上所述十点可知，自由基是人体健康的杀手。
益生菌在自然界中分布广泛，是一种可以通过改善肠道微生物的平衡来对宿主产生有益影响的微生物。目前应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌等，它们是人体肠道内重要的生理菌，对机体有多种生理作用。益生菌可以调整肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢，产生抗菌素来抑制有害菌群生长，抗肿瘤，增强免疫力，降低血清胆固醇，抗氧化延缓衰老等。因此，将益生菌应用于功能性食品开发具有重要意义。而具有抗氧化功能的乳酸菌可以通过清除人体内过多的自由基来使人体维持正常状态，此外，乳酸菌产生的非酶物质能够通过抑制有害菌的生长来减少毒性物质的产生，从而发挥抗衰老作用。
青藏高原独特的极端环境高海拔、低压、强紫外线、低温等会造成有机体内的氧化胁迫。Dosek等(2007)报道，长期暴露在高海拔的环境下伴随大气中氧浓度减少会造成氧化胁迫，提高机体内活性氧浓度，造成细胞中蛋白质、DNA等大分子物质的破坏。同样，基于生物对环境的适应性原理，长期生存在该环境下的生物体为了适应这种氧化胁迫有可能产生具有高抗氧化能力的特殊遗传特性和机制。因此，在青藏高原极端环境下更有可能筛选出具有高抗氧化能力的特殊功能乳酸菌，且具有更独特的开发和应用价值。
由此，具有高抗氧化能力益生菌具有较大的应用价值，对维持人体健康具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高原植物乳杆菌，具有高抗氧化活性，能够有效清除机体内自由基。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌(Lactobacillus casei)，其保藏编号为CGMCC15780。
所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌的筛选方法，从青藏高原传统发酵牦牛酸奶和天然垂穗披碱青贮饲料中筛选具有高抗氧化能力的乳酸菌菌株。
具体筛选工艺步骤如下：
(1)从青藏高原传统牦牛酸奶和天然垂穗披碱草青贮饲料中分离、筛选和鉴定34株乳酸菌，通过将它们与1株购自与中国普通微生物菌种保藏管理中心的标准菌Lactobacillus rhamnosus GG做对比，筛选出一种具有高抗氧化能力、延缓衰老且维持基本益生特性，能在体内发挥抗氧化特殊益生功能的乳酸菌菌株。
(2)青藏高原传统发酵牦牛酸奶中的微生物通过MRS、M17、KFS和 SL四种不同的培养基培养，挑选特征菌株并纯化，得到纯分离的菌株。
(3)结合过氧化氢阴性、革兰氏染色阳性、菌体形态以及镜检分离挑选似乳酸菌菌株，进行16S rDNA测序，NCBI中进行Blast比对，鉴定并保存 34株乳酸菌菌株。
(4)测定(3)中已鉴定的乳酸菌菌体的DPPH清除能力进行初筛，共筛选出11株清除能力较好的菌株。
(5)测定并研究(4)中筛选出的11株菌株对DPPH、OH和O2-自由基的清除能力；
(6)测定具高抗氧化活性乳酸菌抗氧化酶活性，包括总抗氧化能力(T- AOC)、SOD和GSH-PX活性。
(7)通过体外益生特性试验评价乳酸菌的体外益生特性，进一步筛选出高抗氧化活性益生乳酸菌。
(8)通过动物实验，检测对比衰老模型小鼠体内的抗氧化指标，检验筛选出的具高抗氧化活性乳酸菌的摄入对衰老模型小鼠是否具有明显的抗氧化益生作用。
(9)通过步骤(1)～(8)得到具有高抗氧化活性和体内外益生特性的植物乳杆菌24-7。
(10)将菌株24-7的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得 Genbank数据库菌株24-7的序列号：MF179626。
本发明所述具有高抗氧化能力的植物乳杆菌24-7已于2018年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC15780。
所述的具有抗氧化能力的植物乳杆菌在制备发酵乳制品及其他发酵食品中的应用。
所述的具有抗氧化能力的植物乳杆菌在制备保健食品、化妆品和药品中的应用。
本发明提供的上述具有高抗氧化活性的植物乳杆菌具有较强的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽气化酶活性，在胆盐耐受能力、抑菌能力、疏水能力以及模拟胃肠道的体外试验中都表现较好的益生特性。能够应用在制备发酵乳制品及保健品和药品中。
本发明提供的上述具有高抗氧化活性的植物乳杆菌能够有效减少衰老老鼠中脑组织的损伤，提高老鼠肝脏和血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 的活性，并且还可以提高老鼠血清和脑中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，降低血清中丙二醛(MDA)的含量，能够广泛应用在发酵食品、保健、化妆品和药品中，具有抗氧化和清除自由基的能力，可提高机体免疫力。
附图说明
图1为本发明实施例1中高DPPH清除能力乳酸菌与参考菌株的对比；
图2为本发明实施例1中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中T- AOC活性；
图3为本发明实施例1中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液对HO·自由基的清除能力；
图4为本发明实施例1中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中O2 -清除能力；
图5为本发明实施例1中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中T-SOD 活性；
图6为本发明实施例1中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中GSH- Px活性；
具体实施方式
以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明做进一步详细说明。
相关培养基配方及缓冲液配方
乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂， 121℃灭菌15min，趁热倒平板。
M17培养基：精确称取植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨 5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，量取1.0mol/L MgSO4·7H2O 1.0mL，蒸馏水1000mL，琼脂15g。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.0，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。
SL培养基：称取酪蛋白水解物10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠25g，七水硫酸镁0.58g，琼脂15g，葡萄糖20g，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾6g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.15g，蒸馏水 1000mL。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 5.4，加入已加热溶解的琼脂，混合均匀，边搅拌边煮沸5min，冷却到50℃，倒平板。
KFS链球菌选择性培养基：月示蛋白胨10g，酵母粉10g，甘油磷酸钠 10g，氯化钠5g，麦芽糖20g，乳糖1g，叠氮钠0.4g，琼脂13g，溴甲酚紫0.015g，调节pH 7.2。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.2，加入琼脂，121℃灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入无菌1％TTC溶液10mL，混匀，趁热倒平板。
营养培养基(NB)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备营养培养基平板时，加入0.8％的琼脂。
脑心浸液肉汤(BHI)：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备培养基平板时，加入0.8％的琼脂。
双歧杆菌培养基(BS)、伊红美蓝琼脂(EMB)培养基、乳杆菌 (LBS)培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS):磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g。加去离子水800mL充分搅拌溶解，然后加入稀盐酸调pH到7.4，最后定容到1L。
试验中采用的参考菌株
标准菌：Lactobacillus rhamnosus(LGG；ATCC53103),购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)
实施例1：从青藏高原传统发酵牦牛酸奶和青贮饲料中分离并鉴定乳酸菌一、样品来源
来源于我国甘肃省天祝藏族自治县传统发酵牦牛乳制品和青贮饲料。
二、从传统牦牛乳制品和青贮饲料中分离得到乳酸菌
取1mL发酵牦牛乳制品按1:10比例，用灭菌生理盐水稀释，此为10-1稀释度。然后吸取1mL上述稀释液，再10倍稀释，为10-2稀释度，以此类推。选取10-5、10-6、10-7三个稀释度，分别吸取100μL稀释液分别均匀地涂布于MRS、M17、KFS和SL(调pH5.4)平板培养基上，接种的4种培养基依次分别在37℃、42℃、42℃和37℃厌氧恒温培养48小时，挑取特征菌落，并进一步纯化，得到纯分离的乳酸菌菌株。
三、对菌株进行鉴定
(1)革兰氏染色、过氧化氢酶实验
革兰氏染色：挑取平板上的纯菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染、干燥、油镜镜检。蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。
过氧化氢酶实验：将待测菌在空气中暴露30min，用滴管吸取3％(体积分数)过氧化氢滴于平板表面所生长的菌落，2-3分钟后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。
该菌株革兰氏染色为阳性，过氧化氢实验为阴性，可初步视为乳酸菌。
(2)16SrRNA鉴定
纯化后的乳酸菌在MRS培养基中培养8h后，10000rpm/min离心3- 5min收集菌体，按照试剂盒使用方法提取DNA。然后进行PCR扩增，在细菌的通用引物27F和1492R(Monis etal,2005)的扩增下，进行16SrRNA的扩增。扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s；72℃5 min，30次循环。PCR产物送上海美吉生测序公司进行序列分析。将测得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http： //wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，与待测菌株同源性值大于 98％，则可认为他们属于同一个种。可鉴定的乳酸菌共34株，全部用于高抗氧化能力乳酸菌的筛选。
实施例2：高抗氧化能力乳酸菌的筛选
一、乳酸菌完整细胞和无细胞提取物和发酵上清液的制备
细胞菌液的制备：将实验室-80℃保存的菌液接入已灭菌的MRS培养基中37℃培养过夜，连续传代3次。培养液经12,000g离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数。
无细胞提取液的制备：将菌液在37℃过夜活化两次，8000g，10min， 4℃，离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数1×109CFU/mL 或1×1010CFU/mL。冰浴超声破碎细胞，5s，5s，30min，360W。8000g， 10min，4℃，收集上清液为无细胞提取物。
发酵上清液的制备：将活化好的乳酸菌接种于MRS液体培养基中， 37℃培养24h，培养液经8000g，10min，4℃离心后上清液即为发酵上清液 (FS)。
二、初筛
在灭菌的MRS液体培养基中分别添加H2O2溶液，使培养基中的起始 H2O2浓度分别为0、1.0、2.0、3.0mmol/L。将菌体浓度为1×108CFU/mL的乳酸菌菌液按1％的接种量接种到含不同H2O2浓度的液体培养基中，置于 37℃恒温培养箱中培养，8h后用分光光度计测定在不同H2O2浓度下生长的乳酸菌菌液600nm下的的OD值。
试验中筛选出11株高DPPH清除能力的乳酸菌。
三、复筛
将初筛中的11株高DPPH清除能力乳酸菌全部用于复筛。
(1)DPPH自由基清除能力
称取0.008g DPPH溶于无水乙醇，定容至100mL，配制成0.2mmol/L DPPH。吸取1mL菌液(1×108CFU/mL)加入2mL 0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，室温下(20～25℃)避光反应30min，8000g，4℃，离心10 min，取上清液，517nm处测定上清液吸光度，去离子水调零(Shengyu Li， 2000)。
DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
Ai：1mL DPPH+1mL样品；Aj：1mL乙醇+1mL样品；Ac：1mL DPPH+1mL PBS。
(2)超氧阴离子(O2 -)清除能力的测定
本实验采用Liu等(2010a)的方法并略做修改。混合反应液包括：2.8 mL Tris-HCl(0.05M，pH 8.2)，0.1mL邻苯三酚(0.05M)，0.1mL无细胞提取物。将混合反应液混匀，25℃，黑暗中反应4min。反应结束后，添加1 mL 8M HCl终止反应，在320nm下检测吸光度。
超氧阴离子清除能力(％)＝[1-A1/A0]×100％
A0为没有添加样品的空白对照，A1为添加样品的吸光度(Liu et al., 2010)。
(3)清除羟自由基(HO·)的能力
吸取0.5mL无细胞提取物和1mL O-菲啰啉(浓度0.1％)，加入1mL PBS，1mL2.5mmol/L FeSO4，1mL 20mmol/L H2O2。37℃恒温水浴反应 1.5h后，536nm处测吸光值。利用以下公式计算超氧自由基的清除率：
清除率(％)＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100％
式中：A0—不含样品和H2O2；A1—不含样品，含H2O2；A2—含样品和 H2O2(Zhang etal.,2011)。
(4)总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定
用试剂盒测定无细胞提取物和发酵上清液的T-AOC、T-SOD和GSH-Px 活性，具体方法严格按照试剂盒说明书进行。
四、挑选综合抗氧化能力强的菌株
结合初筛和复筛中的各项抗氧化指标，挑选出1株综合抗氧化能力强的菌株，与ATCC53103标准菌株进行对比。图1、2、3、4、5、6表示筛选出的11株抗氧化能力表现较好乳酸菌的自由基清除能力，本发明植物乳杆菌 24-7综合抗氧化能力表现较好，且高于参考菌株。为了进一步在这11株菌中挑选出能作为益生菌的优势菌株，以下试验进行体外益生特性研究，验证本发明菌株是否满足作为益生菌的基本条件。
表1本发明菌株24-7抗氧化能力(1010CFU/mL IC)
实施例3：体外益生特性研究
一、发明菌株消化道模拟试验及疏水能力测定
(1)疏水能力
根据Mansona等(1992)的方法进行试验，将活化好的乳酸菌接种于液体MRS培养基，37℃培养16-18h，将菌液5000rpm/min离心，用0.1mol KNO3(pH6.2)洗涤两次后，用该溶液悬浮菌液，在600nm处测量其初始吸光度A0。再吸取菌悬液3ml，加入1ml二甲苯，室温预培养10min，涡流快速混合2min，室温静止放置15min使之分层，吸取下层水相，以缓冲液为空白对照，在600nm测量最终吸光度A并进行记录。
疏水能力(％)＝(A0-A)/A0×100％
式中：A0和A分别是与二甲苯混匀前、后菌液在600nm下测量得到的吸光值。
(2)耐模拟胃肠液能力的测定
采用Charteris等(1998)的方法。具体步骤如下：
模拟胃液的配制：0.35g胃蛋白酶溶于100mL 0.2％的无菌生理盐水，用浓盐酸调节pH到3.0，过0.45μm滤膜除菌。
模拟肠液的配制：0.1g胰蛋白酶，1.8g胆盐溶于无菌溶剂含1.1g NaHCO3、0.2gNaCl及100mL蒸馏水，用0.5M的NaOH调整pH到8.0。溶液过0.45μm滤膜除菌。
将已活化3次的菌液按10％的接种量接种到模拟胃液(pH3)中，混匀，37℃厌氧培养，分别在0,3h取样平板计数。在模拟胃液中培养3h后，吸取1mL培养液接种到9mL模拟肠液(pH 8)中，37℃厌氧培养，分别在 0,3,6,24h取样计数。
计数用MRS培养平板，生理盐水梯度稀释，取样涂布，37℃厌氧培养 48h，计数30～300菌数的平皿。
存活率(％)＝(log CFU N1/log CFU N0)×100％
N1代表经过模拟胃肠道培养后的乳酸菌数量；N0代表模拟胃肠道培养前的乳酸菌数量。
(3)耐胆盐能力
无菌MRS-THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠)中添加0.3％(W/V)的牛胆汁，然后接种1％的乳酸菌(已活化三次)，对照组为不含牛胆汁的 MRS-THIO培养液。水浴37℃培养，每两小时取样620nm下测定吸光度，用不含乳酸菌的相对应的空白培养基调零。记录OD620nm变化0.3个单位的时间。推迟时间(LT)的计算为乳酸菌生长到OD620nm变化0.3个单位时所推迟的时间。LT越小耐胆盐能力越强(Walker和Gilliland，1993)。
表2表明24-7具有较好的消化道耐受能力以及疏水能力，能够在消化道环境中保持较高的存活率，且增加了黏附到肠道壁的机会，满足作为益生菌的基本条件。
表2发明菌株24-7模拟消化道耐受能力及疏水能力
1乳酸菌在pH2.5人工胃液中存活3h后，再在模拟肠液中消化24h后的存活率。
2在吸光度OD620nm时，MRS-THIO与MRS-THIO(含0.3％胆盐)两种培养基中菌株生长增加0.3个单位所需要的时间差。
实施例4：动物模型试验
一、发明菌株对衰老模型小鼠的益生作用
(1)小鼠喂养试验
40只雄性昆明小鼠，体重范围在20g左右，于单独隔离的鼠笼中普通饲料喂养，自由采食和饮水，经7天的预试期后，空腹12h，不限制饮水，称重。根据体重随机分为4组，每组10只，每个处理组饲喂基础日粮，试验期为6周。乳酸菌处理组每日分别灌胃乳酸菌活菌数(1010CFU/d)，普通对照组和衰老模型组则每日灌胃等量的无菌生理盐水。衰老模型组、乳酸菌处理组每日接收腹腔注射5％D-半乳糖(500mg/kg)，普通对照组每日注射等量的生理盐水。试验分组及药剂分配见表6。
表3实验动物分组及处理
氧化衰老模型组试验鼠表现出明显的衰老体征(体重减少、毛色暗黄、行为缓慢、精神萎靡等)。最后一次灌胃和注射D-半乳糖后，停止进食8h，不限制饮水。称重，摘眼球取血，室温放置，离心(4000g，10min)分离血清，-80℃保存备用。采血后劲椎脱臼处死，放置于冰上，分离肝、脑、心、肾、脾。用预冷的生理盐水冲洗表面血迹，医用纱布拭干，称重。按下式计算脏器比重：
称重后，将脑和肝脏组织用电动组织研磨器匀浆，并加入9倍体积预冷的生理盐水，混匀。将制备好的10％的匀浆液用低温离心机4 000g离心10 min。取上清，-80℃保存，待测。
(2)小鼠血清、脑组织及肝脏组织中总抗氧化能力(T-AOC)
测定原理：许多抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，而Fe2+可与菲啉类物质结合构成稳定的络合物，比色法可检测其氧化能力的高低。具体方法根据南京建成试剂盒所配套的使用说明书的步骤进行。
(3)小鼠血清、脑组织及肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力(GSH-Px)
每0.1mL血清或每mg蛋白质，扣除非酶促反应作用的，使反应体系中 GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位，按照南京建成试剂盒说明书操作进行。
(4)小鼠血清和肝脏组织中丙二醛(MDA)含量
MDA测定采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，按照南京建成试剂盒说明书操作进行。
(5)小鼠血清、脑组织、肝脏组织中总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)
每mL血清或每mg组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。本试验采用黄嘌呤氧化酶法测定 T-SOD。具体方法根据南京建成试剂盒完成。
见表4、5、6、7、8动物试验结果表明，24-7对小鼠脏器无毒副作用，可减少衰老老鼠脑组织的损伤。发明菌株24-7能显著提高小鼠肝脏、脑组织和血清的T-SOD、GSH-Px活性，降低小鼠血清中MDA的含量，其中肝脏的 GSH-Px、T-AOC活性，脑组织和血清的T-SOD活性甚至能回到正常水平，具有体内抗氧化作用。
表4乳酸菌对小鼠体重和脏器指数的影响
表5小鼠各组织和血清中T-AOC的活性
表6小鼠各组织和血清中GSH-Px的活性
表7小鼠肝脏、脑和血清中MDA的含量
表8小鼠各组织和血清中T-SOD的活性
试验表明，本发明所提供的菌株植物乳杆菌24-7体内体外试验都证明其具有较好的抗氧化能力，能有效促进体内抗氧化酶活性的增加。该菌株较好的疏水能力增加了其黏附到肠道壁并发挥益生作用的机会。该产品无毒副作用，可作为保健食品或药品提高机体免疫力、抗衰老、美容以及调节肠道菌群等。
SEQUENCE LISTING
<110> 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司
<120> 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌菌株24-7
<130> 4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1407
<212> RNA
<213> 植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）
<400> 1
ccaccgactt tgggtgttac aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg 60
gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccgact tcatgtaggc 120
gagttgcagc ctacaatccg aactgagaat ggctttaaga gattagctta ctctcgcgag 180
ttcgcaactc gttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 240
atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca ccagagtgcc 300
caacttaatg ctggcaactg ataataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360
ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtat ccatgtcccc gaagggaacg 420
tctaatctct tagatttgca tagtatgtca agacctggta aggttcttcg cgtagcttcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc 540
ttgcggccgt actccccagg cggaatgctt aatgcgttag ctgcagcact gaagggcgga 600
aaccctccaa cacttagcat tcatcgttta cggtatggac taccagggta tctaatcctg 660
tttgctaccc atactttcga gcctcagcgt cagttacaga ccagacagcc gccttcgcca 720
ctggtgttct tccatatatc tacgcatttc accgctacac atggagttcc actgtcctct 780
tctgcactca agtttcccag tttccgatgc acttcttcgg ttgagccgaa ggctttcaca 840
tcagacttaa aaaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgcttgcc 900
acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaaataccg 960
tcaatacctg aacagttact ctcagatatg ttcttcttta acaacagagt tttacgagcc 1020
gaaacccttc ttcactcacg cggcgttgct ccatcagact ttcgtccatt gtggaagatt 1080
ccctactgct gcctcccgta ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgattac 1140
cctctcaggt cggctacgta tcattgccat ggtgagccgt taccccacca tctagctaat 1200
acgccgcggg accatccaaa agtgatagcc gaagccatct ttcaagctcg gaccatgcgg 1260
tccaagttgt tatgcggtat tagcatctgt ttccaggtgt tatcccccgc ttctgggcag 1320
gtttcccacg tgttactcac cagttcgcca ctcactcaaa tgtaaatcat gagcaagcac 1380
caatcaatac cagagttcgt tcgactg 1407

Claims (6)

1. 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌（Lactobacillus casei），其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC15780。
2.如权利要求1所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，从青藏高原传统发酵牦牛酸奶和青贮饲料中筛选具有高抗氧化能力的乳酸菌菌株。
3.如权利要求2所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，按下述步骤筛选：
（1）从青藏高原传统牦牛酸奶和天然垂穗披碱草青贮饲料中分离、筛选和鉴定乳酸菌，通过将它们与标准菌Lactobacillus rhamnosus GG做对比，筛选出具有高抗氧化能力、延缓衰老且维持基本益生特性，能在体能发挥抗氧化特殊益生功能的乳酸菌菌株；
（2）青藏高原传统发酵牦牛酸奶中的微生物通过MRS、M17、KFS和SL四种不同的培养基培养，挑选特征菌株并纯化，得到纯分离的菌株；
（3）结合过氧化氢阴性、革兰氏染色阳性、菌体形态以及镜检分离挑选似乳酸菌菌株，进行16S rDNA 测序，NCBI中进行Blast比对，鉴定并保存34株乳酸菌菌株；
（4）测定（3）中已鉴定的乳酸菌菌体的DPPH清除能力，进行初筛，通过对DPPH清除率值的大小，筛选出清除能力较好的菌株；
（5）测定并研究（4）中筛选出的菌株对DPPH、OH和O2-自由基的清除能力；
（6）测定具高抗氧化活性乳酸菌抗氧化酶活性，包括总抗氧化能力 (T-AOC)、SOD和GSH-PX活性；
（7）通过体外益生特性试验评价乳酸菌的体外益生特性，进一步筛选出高抗氧化活性益生乳酸菌；
（8）通过动物实验，检测对比衰老模型小鼠体内的抗氧化指标，检验筛选出的具高抗氧化活性乳酸菌的摄入对衰老模型小鼠是否具有明显的抗氧化益生作用；
（9）通过步骤（1）~（8）得到具有高抗氧化活性和体内外益生特性的植物乳杆菌24-7。
4. 如权利要求1或3所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，其特征在于将菌株24-7的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株24-7的序列号：MF179626。
5.如权利要求1所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌在制备发酵乳制品及其他发酵食品中的应用。
6.如权利要求1所述的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌在制备保健食品、化妆品和药品中的应用。
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