CN108148773A

CN108148773A - 一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法

Info

Publication number: CN108148773A
Application number: CN201611111579.4A
Authority: CN
Inventors: 丁轲; 陈亚茹; 刘炜; 余祖华; 李旺; 李元晓; 何万领; 曹平华; 赵龙妹; 王玉琴; 张春杰; 程相朝
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2018-06-12

Abstract

本发明公开了一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。该方法包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌。该方法通过第一步宏基因组特异性片段的扩增，就能将绝大多数不含产BSH的植物乳杆菌样品滤除，避免了盲目筛选，大大缩小了筛选范围，具有定向、快速、简便、工作量小等特点。

Description

一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法

技术领域

本发明涉及一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

近几十年来，心血管疾病成为了全人类死亡的首要原因。临床试验表明，血清胆固醇水平过高是引起心血管疾病的主要致病性因素。当机体超过血清胆固醇水平的正常值(0～5.2mmo/L)时就表现为高胆固醇，而导致机体罹患肾病、心脏疾病、脑中风等。机体内胆固醇水平每增加1％，将会使心血管疾病的患病风险增加35％。调查发现，2012年全球范围内由心血管疾病导致的死亡人数(大约1750万)占全人类死亡总数的31％左右，其中近42％的人死于冠心病，而近38％的人死于脑中风。血清低密度脂蛋白(low densith lipoproteincholesterol，LDL-C)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)和甘油三脂(triglyceride，TG)含量的升高，以及高密度脂蛋白(High densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)水平的降低与动脉硬化之间存在紧密的关系。流行病学调查表明，HDL-C水平每增加0.01μg/L，患心血管疾病的风险将降低3％。Bruckert等调查研究了在8545名欧洲血脂异常患者由较低HDL-C水平引起的患病率，当男性血清HDL-C低于1.03mmol/L时，其患病率为33％，当女性HDL-C低于1.29mmol/L时，其患病率为40％。探求一种相对安全、毒害小且便于人们使用的预防高胆固醇血症的方法势在必行。

对于高血脂症，目前较成熟的防治对策主要包括以下几种：1)饮食疗法：摄入胆固醇含量少的食物，不吃动物内脏、蛋黄、荤油等富含胆固醇的食物；2)适量运动：运动能增加机体脂质消耗，同时加快血清中LDL-C和TG的分解和排泄；3)药物治疗：服用洛伐他汀、莫那可林、普伐他汀等药物，但由于目前尚缺乏理想的降血脂药物，且大部分药物花费较高、疗效短暂、有副作用，所以药物疗法并非首选方法；4)物理和化学方法：如溶剂提取、蒸馏、萃取等；5)生物方法：利用微生物直接或间接降解食物或体内的胆固醇水平，如乳酸菌能降低机体胆固醇水平。

国外关于乳酸菌降胆固醇作用的研究起步较早。最初，Mann等对长期饮用乳酸菌发酵制品的非洲Maasai部落进行研究发现其体内胆固醇水平较低，且进一步研究发现长期饮用酸奶和其他乳制品的美国人体内胆固醇水平也较低。这些结果引起国内外研究者的广泛关注，引发了对乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。Gilliland等分离筛选出一株嗜酸乳杆菌，该菌株能降低培养基中胆固醇的浓度。Salaj等发现植物乳杆菌LS/07能降低大鼠血清TC和LDL-C水平，而植物乳杆菌Biocenol LP96能降低TG和VLDL水平，但同时不改变血清高密度脂蛋白和肝脏脂质水平。Tomaro-Duchesneau等对11株乳酸菌的胆固醇同化作用进行了研究，在MRS肉汤培养基中L.plantarum ATCC 14917同化胆固醇能力最高，达到15.18±0.55mg/10¹⁰cfu，而体外模拟肠道环境条件下L.reuteri NCIMB 701089同化胆固醇能力最高，达到2254.70±63.33mg/10¹⁰cfu。Singh等从哺乳期的婴儿粪便中分离出L.reuteriLR6，经体内外试验发现该菌株不仅具有降胆固醇能力，还表现出BSH活性。

相对于国外，国内关于乳酸菌降胆固醇作用的研究起步较晚。2003年，肖琳琳等从藏灵菇中成功分离出1株体外胆固醇降解率高达51.8％的干酪乳杆菌KM-16，通过对高脂模型小鼠为期14d的灌胃处理发现，该菌株能显著降低小鼠机体内TC水平。Liu等研究了乳酸菌在不同浓度胆固醇条件下的降解效果，结果显示在较低浓度胆固醇条件下，乳酸菌的胆固醇降解率随浓度的增大先升高后降低，当胆固醇浓度为1mg/mL时，降解效果最好，而当胆固醇高于该浓度时，降解率均表现为降低，这可能源于胆固醇浓度过高时抑制乳酸菌生长的作用。Li等通过构建SD大鼠高血脂症模型评估了L.plantarum NCU116的体内降胆固醇效果，结果发现该菌株能通过调控与低密度脂蛋白受体和胆固醇7α-羟化酶相关关键因子的基因表达，改变大鼠脂质的代谢并降低机体内胆固醇含量。Wang等共分离筛选出50株乳酸菌，其中乳酸片球菌B0006、植物乳杆菌B0007和B0022均表现显著的胆固醇降解能力，并显示不同程度的酸和胆盐耐受性，同时植物乳杆菌B0007和B0022对Caco-2细胞系有一定的粘附性。Chen等研究发现鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301及其发酵乳不但能改善大鼠肠道微生物构成，而且能显著降低大鼠体内胆固醇含量。

目前，具有降胆固醇潜能的乳酸菌的初筛方法通常有以下几种：1)常规方法，即从食品、人或动物肠道内容物中分离纯化出革兰氏阳性(G+)且接触酶阴性的菌株，接种至含胆固醇的培养基中培养，通过OPA、比色法等测定培养基中胆固醇水平，判定该菌株是否有胆固醇降解能力；2)指示剂法，即将分离纯化后的乳酸菌接种至含溴麝香草酚蓝的改良kenji培养基中，根据培养基的变色速度确定菌株降胆固醇能力；3)Ca²⁺沉淀法，由于部分乳酸菌具有BSH活性，水解产生的游离性胆酸能与Ca²⁺形成沉钙圈，通过测定沉钙圈大小来判定乳酸菌是否具有胆固醇降解能力。通过比较发现，方法1)的操作较为繁琐，需要对分离纯化出的每个菌株进行降胆固醇能力测试，但不会出现遗漏现象，而后两种方法虽操作简便，但都必不可少地要先将乳酸菌分离纯化出来，再通过指示剂法或钙沉淀法筛选具有降胆固醇能力的乳酸菌，前期分离工作量较大，且分离出来的乳酸菌不一定具有降胆固醇能力，所以前期工作绝大部分是无用功，同时还可能将目的菌株甚至是强降解效果的乳酸菌漏掉。因此，上述三种方法都不能称之为卓尔有效。

发明内容

本发明的目的是提供一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，包括以下步骤：

1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；

2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；

3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似植物乳杆菌菌株；

4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌。

步骤1)、3)中引物对BSH_L/BSH_R为：

BSH_L：5’-AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT-3’；

BSH_R：5’-GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG-3’。

步骤1)、3)中PCR扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L dNTPs2.0μL，5U/μL DNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物BSH_L、BSH_R各0.5μL，75mg/L模板0.5μL，超纯水18.5，总计25.0μL。

步骤1)、3)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。

步骤1)、3)中PCR扩增得到990bp的基因片段(序列如SEQ ID NO.1、2或3所示)，即为具有BSH基因。

步骤2)中纯化采用含牛磺胆酸钠的MRS培养基，组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g，胆固醇10mg(使用前先用0.5mL无水乙醇溶解)，琼脂1.5g，蒸馏水定容至100mL。

在纯化前，先将分离对象接种于含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中富集，于35～40℃下厌氧培养20～28h。优选的，在37℃下培养24h。含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基的组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g、胆固醇10mg(使用前先用0.5mL无水乙醇溶解)，蒸馏水定容至100mL。

步骤4)中分子鉴定主要是基于16S rDNA或16S rRNA序列分析技术的微生物鉴定方法(参见《用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法》，王浩丞)。以杆菌科鉴定通用引物对菌株进行16S rDNA片段鉴定确认，如利用引物对P1/P2进行PCR扩增，引物如下：

P1：5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’；

P2：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

所述扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L dNTPs 2.0μL，5U/μLDNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物P1、P2各0.5μL，75mg/L菌株全基因组DNA 0.5μL，超纯水18.5μL，总计25.0μL。

所述扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。

在分子鉴定前，可先对疑似菌株的降胆固醇能力进行评定，降解能力强的进行分子鉴定。评定方法为：将疑似菌株接种于含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中，35～40℃下厌氧培养2d左右，检测菌液中胆固醇残余量，残余量少的降胆固醇能力强，反之能力弱。

本发明的有益效果：

本发明的方法是基于植物乳杆菌降胆固醇机理之一，也即含有BSH基因的植物乳杆菌能够降解胆固醇，通过设计BSH基因特异性扩增引物，利用分子生物学的方法从各种含有多种微生物群的样品中快速确定是否存在含有BSH的植物乳杆菌，若筛选结果为阳性，则样品中存在含有BSH的植物乳杆菌，该步骤也是区别于现有技术的关键所在。现有技术是先从样品中将疑似菌株分离纯化，再进行关键基因的PCR扩增筛选，而这往往造成前期挑选疑似菌株的工作量增大，该操作能够免去初筛过程中无目标的分离纯化，并结合不同种类菌株BSH基因不同的实际情况，在2～3h内快速确认样品中目的菌株的有无，减少了工作的盲目性。而后再采用选择性培养基，通过对目的菌株进行有条件地富集培养并涂布平板，根据菌落形态挑选平板上疑似的植物乳杆菌做菌落PCR扩增，在48h内定向筛选出产BSH的阳性菌株。该方法具有定向、快速、简便、工作量小等特点，两步重复PCR操作即可获得目的菌株。

附图说明

图1为实施例1中不同样品总微生物宏基因组中BSH基因的PCR扩增图；

图2为疑似菌株菌落PCR扩增BSH基因的电泳图；

图3为疑似菌株BSH基因同源性比较结果；

图4为疑似菌株BSH基因进化树分析结果；

图5为疑似菌株16S rDNA基因片段扩增图；

图6为疑似菌株16S rDNA序列同源性比较结果；

图7为疑似菌株16S rDNA序列进化树分析结果。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

以不同动物肠道内容物(即新鲜粪便)为分离样品：

1)样品总微生物的收集及宏基因组的获取

无菌取约3克不同动物新鲜粪便，无菌研碎，分别置于50mL离心管中，加入7mL PBS液，充分涡旋振荡5min，500r/min离心3min，取上清，重复上述步骤1次；将上清液以6000r/min离心5min，弃上清，将沉淀的菌体转入干净的离心管中，采用热裂解法提取动物肠道内容物总微生物宏基因组DNA(参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克等著)；

2)含BSH植物乳杆菌样品的确认

根据GenBank公布的植物乳杆菌BSH基因序列(登录号：EU836149)，采用Primerpremier 5.0软件设计引物对BSH_L/BSH_R(由上海生物工程有限公司合成)；以上述宏基因组DNA为模板，利用引物对BSH_L/BSH_R进行PCR扩增(引物如SEQ ID NO.7、8所示)，PCR扩增的反应体系见下表1；

表1 PCR反应体系

将上述反应体系反复吹打混匀后，2500r/min瞬时离心，然后进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存备用；

取4.0μL PCR产物与1.0μL溴酚蓝混匀，点样于琼脂糖凝胶中，以Marker 2000为对照，调电压80V进行电泳，凝胶成像系统中观察目的片段大小(如图1所示，图中泳道1为DL2000Marker，泳道2为猪粪便，泳道3为兔粪便，泳道4为土鸡粪便，泳道5为华南虎粪便，泳道6为东北虎粪便，泳道7为羊粪便，泳道8为鱼粪便，泳道9为牛粪便，泳道10为熊猫粪便)；含有具BSH基因植物乳杆菌的样品均能扩增出长度990bp的特异性条带，序列如SEQ IDNO.1、2或3所示；

结果表明：羊粪便样品中含有BSH基因；

3)PCR阳性样品中疑似菌株的分离纯化

将PCR扩增阳性的样品以2％的比例接种至含0.3％牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中，37℃下厌氧培养24h；取0.5mL混合菌液接种于4.5mL生理盐水中，依次倍比稀释至10^-8；分别吸取浓度为10^-6、10^-7、10^-8的菌液200μL，涂布于含0.3％牛磺胆酸钠的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24h；以每平板长出10～400个菌落为标准，根据菌落形态(植物乳杆菌典型特征)随机挑取单菌落，同时将其标记影印到新的MRS固体培养基上，取少许进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态，挑选G+无芽孢的杆状菌株进行下一步操作；

MRS液体培养基的组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g、胆固醇10g(使用前先用0.5mL无水乙醇溶解)，蒸馏水定容至100mL；

MRS固体培养基的组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g，胆固醇10mg(使用前先用0.5mL无水乙醇溶解)，蒸馏水定容至100mL；

结果显示：共分离、纯化出20株菌，依次命名为DPP1～DPP20；

4)具有BSH基因的疑似植物乳杆菌的筛选

将上述疑似菌株的单个菌落分别进行热裂解，获得其全基因组DNA，然后分别进行菌落PCR扩增，筛选出具有BSH基因的菌株，具体操作同步骤2)，扩增结果见图2(图中泳道1～10、13～22依次为菌株DPP1～DPP20，泳道11～12均为DL2000 Marker)；

将扩增片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果见SEQ ID NO.1～3，其中DPP1、DPP5、DPP8的测序结果相同(如SEQ ID NO.1所示)，DPP6、DPP9、DPP11、DPP13、DPP15、DPP17的测序结果相同(如SEQ ID NO.2所示)，DPP2、DPP4、DPP12、DPP19、DPP20的测序结果相同(如SEQ ID NO.3所示)；

将测序结果用DNAstar6.0软件和MEGA6.0软件进行同源性比较和系统进化树分析，结果见图3～4(图3中1～18分别为下列菌株来源的BSH基因：1-Bifidobacteriumanimalis strain Bi30，2-Bifidobacterium breve，3-Bifidobacterium longum，4-DPP8，5-DPP15，6-DPP19，7-Lactobacillus plantarum，8-Lactobacillus plantarum strainAMD6，9-Lactobacillus plantarum strain KLDS，10-Lactobacillus plantarum strainlp529，11-Lactobacillus plantarum strain MBUL10，12-Lactobacillus plantarumstrain MBUL11，13-Lactobacillus plantarum strain MBUL21，14-Lactobacillusplantarum strain MBUL75，15-Lactobacillus plantarum strain MBUL90，16-Lactobacillus plantarum strain MBUL91，17-Lactobacillus plantarum strain NCDC201，18-Lactobacillus plantarum strain RK21)；

结果显示：共有14株菌具有BSH基因，分别为DPP1、DPP2、DPP4、DPP5、DPP6、DPP8、DPP9、DPP11、DPP12、DPP13、DPP15、DPP17、DPP19和DPP20；

5)筛选降胆固醇能力强的疑似菌株

将上述菌株分别接种到MRS培养基中活化，再按照2％(v/v)的接种量分别接种于10mL含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养，每个12h摇匀1次，培养48h后，吸取1.0mL混匀的菌液，5000r/min离心10min，检测培养基中胆固醇的残余量，并计算菌株的胆固醇降解率；

采用OPA法测定胆固醇的含量，标准曲线为：取1.0mg/mL胆固醇标准液，分别配制成5个不同浓度的工作液(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL)，各取1.0mL工作液进行测试，以1.0mL无水乙醇作为空白对照，平行测定3次；

胆固醇降解率的计算公式为：

D＝(A-B)/A×100％；

式中，D为胆固醇降解率，％；A为未接种菌株培养上清液550nm处吸光度值在标准曲线中对应的胆固醇浓度，μg/mL；B为分离菌株发酵后培养上清液550nm处吸光度值在标准曲线中对应的胆固醇浓度，μg/mL；

疑似菌株降胆固醇能力的测定结果见下表2；

表2分离菌株胆固醇降解能力的测定结果

筛选出疑似菌株DPP8、DPP15和DPP19进行分子鉴定；

6)菌株种属的验证

采用基于16S rDNA序列分析技术的微生物鉴定方法，以菌株全基因组DNA为模板，利用肠杆菌科16S rDNA片段的通用引物进行PCR扩增(引物对P1/P2如SEQ ID NO.9、10所示)，PCR扩增的反应体系见下表3；

表3 PCR反应体系

将上述反应体系反复吹打混匀后，2500r/min瞬时离心，然后进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5.0min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；

PCR产物于1％琼脂糖凝胶中检测(结果见图5，图中M为Marker2000，1～3依次为DDP8、DDP15和DPP19菌株的16S rDNA片段)，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.4～6所示；

将测序结果通过NCBI上的BLAST程序在GenBank基因库中进行比对，挑取相似性较高菌株的16S rDNA序列，分别利用MEGA6.0软件和DNAstar6.0软件进行系统进化树分析和同源性比较，结果见图6～7(图6中1～16分别为：1-DPP8，2-DPP15，3-DPP19，4-Lactobacillus brantae SL 1108，5-Lactobacillus camelliae MCH3-1，6-Lactobacillus fuchuensis JCM 11249，7-Lactobacillus furfuricola Nu 27，8-Lactobacillus iwatensis IWT246，9-Lactobacillus malefermentans KCTC 3548，10-Lactobacillus mudanjiangensis 11050，11-Lactobacillus plantarum ATCC 14917，12-Lactobacillus porcinae LMG 26767，13-Lactobacillus silage IWT126，14-Lactobacillus sucicola JCM 15457，15-Lactobacillus yonginensis THK-V8，16-Pediococcus inopinatus DSM 20285)；

结果显示：菌株DPP8、DPP15、DPP19均为植物乳杆菌，具有强胆固醇降解能力。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法

<120> 河南科技大学

<170> PatentIn version 3.5

<211> 990

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> BSH基因序列（DPP1、DPP5、DPP8）

<222> (1)..(990)

<400> 1

AACTGCAGAT GTGTACTGCC ATAACTTATC AATCTTATAA TAATTACTTC GGTAGAAATT 60

TCGATTATGA AATTTCATAC AATGAAATGG TTACGATTAC GCCTAGAAAA TATCCACTAG 120

TATTTCGTAA GGTGGAGAAC TTAGATCACC ATTATGCAAT AATTGGAATT ACTGCTGATG 180

TAGAAAGCTA TCCACTTTAC TACGATGCGA TGAATGAAAA AGGCTTGTGT ATTGCGGGAT 240

TAAATTTTGT AGGTTATGCT GATTATAAAA AATATGATGC TGATAAAGTT AATATCACAC 300

CATTTGAATT AATTCCTTGG TTATTGGGAC AATTTTCAAG TGTTAGAGAA GTGAAAAAGA 360

ACATACAAAA ACTAAACTTG GTTAATATTA ATTTTAGTGA ACAATTACCA TTATCACCGC 420

TACATTGGTT GGTTGCTGAT AAACAGGAAT CGATAGTTAT TGAAAGTGTT AAAGAAGGAC 480

TAAAAATTTA CGACAATCCA GTAGGTGTGT TAACAAACAA TCCTAATTTT GACTACCAAT 540

TATTTAATTT GAACAACTAT CGTGCCTTAT CAAATAGCAC ACCTCAAAAT AGTTTTTCGG 600

AAAAAGTGGA TTTAGATAGT TATAGTAGAG GAATGGGCGG ACTAGGATTA CCTGGAGACT 660

TGTCCTCAAT GTCTAGATTT GTCAGAGCCG CTTTTACTAA ATTAAACTCG TTGCCGATGC 720

AGACAGAGAG TGGCAGTGTT AGTCAGTTTT TCCATATACT AGGGTCTGTA GAACAACAAA 780

AAGGGCTATG TGAAGTTACT GACGGAAAGT ACGAATATAC AATCTATTCT TCTTGTTGTG 840

ATATGGACAA GGGAGTTTAT TACTATAGAA CTTATGACAA TAGTCAAATT AACAGTGTCA 900

GTTTAAACCA TGAGCACTTG GATACGACTG AATTAATTTC TTATCCATTA CGATCAGAAG 960

CACAATACTA TGCAGTTAAC TAAGAATTCC 990

<211> 990

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> BSH基因序列（DPP6、DPP9、DPP11、DPP13、DPP15、DPP17）

<222> (1)..(990)

<400> 2

AACTGCAGAT GTGTACTGCC ATAACTTATC AATCTTATAA TAATTACTTC GGTAGAAATT 60

TCGATTATGA AATTTCATAC AATGAAATGG TTACGATTAC GCCTAGAAAA TATCCACTAG 120

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<211> 990

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> BSH基因序列（DPP2、DPP4、DPP12、DPP19、DPP20）

<222> (1)..(990)

<400> 3

AACTGCAGAT GTGTACTGCC ATAACTTATC AATCTTATAA TAATTACTTC GGTAGAAATT 60

TCGATTATGA AATTTCATAC AATGAAATGG TTACGATTAC GCCTAGAAAA TATCCACTAG 120

TATTTCGTAA GGTGGAGAAC TTAGATCACC ATTATGCAAT AATTGGAATT ACTGCTGATG 180

TAGAAAGCTA TCCACTTTAC TACGATGCGA TGAATGAAAA AGGCTTGTGT ATTGCGGGAT 240

TAAATTTTGC AGGTTATGCT GATTATAAAA AATATGATGC TGATAAAGTT AATATCACAC 300

CATTTGAAAT AATTCCTTGG TTATTGGGAC AATTTTCAAG TGTTAGAGAA GTGAAAAAGA 360

ACATACAAAA ACTAAACTTG GTTAATATTA ATTTTAGTGA ACAATTACCA TTATCACCGC 420

TACATTGGTT GGTTGCTGAT AAACAGGAAT CGATAGTTAT TGAAAGTGTT AAAGAAGGAC 480

TAAAAATTTA CGACAATCCA GTAGGTGTGT TAACAAACAA TCCTAATTTT GACTACCAAT 540

TATTTAATTT GAACAACTAT CGTGCCTTAT CAAATAGCAC ACCCCAAAAT AGTTTTTCGG 600

AAAAAGTGGA TTTAGATAGT TATAGTAGAG GAATGGGCGG ACTAGGATTA CCTGGAGACT 660

TGTCCTCAAT GTCTAGATTT GTCAGAGCCG CTTTTACTAA ATTAAACTCG TTGCCGATGC 720

AGACAGAGAG TGGCAGTGTT AGTCAGTTTT TCCATATACT AGGGTCTGTA GAACAACAAA 780

AAGGGCTATG TGAAGTTACT GACGGAAAGT ACGAATATAC AATCTATTCT TCTTGTTGTG 840

ATATGGACAA GGGAGTTTAT TACTATAGAA CTTATGAAAA TAGTCAAATT AACAGTGTCA 900

GTTTAAACCA TGAGCACTTG GATACGACTG AATTAATTTC TTATCCATTA CGATCAGAAG 960

CACAATACTA TGCAGTTAAC TAAGAATTCC 990

<211> 1445

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> 植物乳杆菌DPP8菌株16Sr DNA序列

<222> (1)..(1445)

<400> 4

CGAACTCTGG TATTGATTGG TGCTTGCATC ATGATTTACA TTTGAGTGAG TGGCGAACTG 60

GTGAGTAACA CGTGGGAAAC CTGCCCAGAA GCGGGGGATA ACACCTGGAA ACAGATGCTA 120

ATACCGCATA ACAACTTGGA CCGCATGGTC CGAGCTTGAA AGATGGCTTC GGCTATCACT 180

TTTGGATGGT CCCGCGGCGT ATTAGCTAGA TGGTGGGGTA ACGGCTCACC ATGGCAATGA 240

TACGTAGCCG ACCTGAGAGG GTAATCGGCC ACATTGGGAC TGAGACACGG CCCAAACTCC 300

TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCAC AATGGACGAA AGTCTGATGG AGCAACGCCG 360

CGTGAGTGAA GAAGGGTTTC GGCTCGTAAA ACTCTGTTGT TAAAGAAGAA CATATCTGAG 420

AGTAACTGTT CAGGTATTGA CGGTATTTAA CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC 480

AGCCGCGGTA ATACGTAGGT GGCAAGCGTT GTCCGGATTT ATTGGGCGTA AAGCGAGCGC 540

AGGCGGTTTT TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC TTCGGCTCAA CCGAAGAAGT GCATCGGAAA 600

CTGGGAAACT TGAGTGCAGA AGAGGACAGT GGAACTCCAT GTGTAGCGGT GAAATGCGTA 660

GATATATGGA AGAACACCAG TGGCGAACGG CGGCTGTCTG GTCTGTAACT GACGCTGAGG 720

CTCGAAAGTA TGGGTAGCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCATACC GTAAACGATG 780

AATGCTAAGT GTTGGAGGGT TTCCGCCCTT CAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCATTCC 840

GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC 900

GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCTAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATACT 960

ATGCAAATCT AAGAGATTAG ACGTTCCCTT CGGGGACATG GATACAGGTG GTGCATGGTT 1020

GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTATTA 1080

TCAGTTGCCA GCATTAAGTT GGGCACTCTG GTGAGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG 1140

GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG 1200

GATGGTACAA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA GTAAGCTAAT CTCTTAAAGC CATTCTCAGT 1260

TCGGATTGTA GGCTGCAACT CGCCTACATG AAGTCGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGATCAG 1320

CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC CATGAGAGTT 1380

TGTAACACCC AAAGTCGGTG GGGTAACCTT GTAGGAAACC AGCCGCCTAA AGGTGGTACC 1440

CAGAA 1445

<211> 1445

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> 植物乳杆菌DPP15菌株16Sr DNA序列

<222> (1)..(1445)

<400> 5

ACGAACTCTG GTATTGATTG GTGCTTGCAT CATGATTTAC ATTTGAGTGA GTGGCGAACT 60

GGTGAGTAAC ACGTGGGAAA CCTGCCCAGA AGCGGGGGAT AACACCTGGA AACAGATGCT 120

AATACCGCAT AACAACTTGG ACCGCATGGT CCGAGTTTGA AAGATGGCTT CGGCTATCAC 180

TTTTGGATGG TCCCGCGGCG TATTAGCTAG ATGGTGGGGT AACGGCTCAC CATGGCAATG 240

ATACGTAGCC GACCTGAGAG GGTAATCGGC CACATTGGGA CTGAGACACG GCCCAAACTC 300

CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCA CAATGGACGA AAGTCTGATG GAGCAACGCC 360

GCGTGAGTGA AGAAGGGTTT CGGCTCGTAA AACTCTGTTG TTAAAGAAGA ACATATCTGA 420

GAGTAACTGT TCAGGTATTG ACGGTATTTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG 480

CAGCCGCGGT AATACGTAGG TGGCAAGCGT TGTCCGGATT TATTGGGCGT AAAGCGAGCG 540

CAGGCGGTTT TTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CTTCGGCTCA ACCGAAGAAG TGCATCGGAA 600

ACTGGGAAAC TTGAGTGCAG AAGAGGACAG TGGAACTCCA TGTGTAGCGG TGAAATGCGT 660

AGATATATGG AAGAACACCA GTGGCGAAAG GCGGCTGTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG 720

GCTCGAAAGT ATGGGTAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATAC CGTAAACGAT 780

GAATGCTAAG TGTTGGAGGG TTTCCGCCCT TCAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCATTC 840

CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG 900

CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCTA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATAC 960

TATGCAAATC TAAGAGATTA GACGTTCCCT TCGGGGACAT GGATACAGGT GGTGCATGGT 1020

TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTATT 1080

ATCAGTTGCC AGCATTAAGT TGGGCACTCT GGTGAGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA 1140

GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT 1200

GGATGGTACA ACGAGTTGCG AACTCGCGAG AGTAAGCTAA TCTCTTAAAG CCATTCTCAG 1260

TTCGGATTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAT GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA 1320

GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCATGAGAGT 1380

TTGTAACACC CAAAGTCGGT GGGGTAACCT TTTAGGAACC AGCCGCCTAA AGGGGGAACC 1440

CAGAA 1445

<211> 1445

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> 植物乳杆菌DPP19菌株16Sr DNA序列

<222> (1)..(1445)

<400> 6

CGAACTCTGG TATTGATTGG TGCTTGCATC ATGATTTACA TTTGAGTGAG TGGCGAACTG 60

GTGAGTAACA CGTGGGAAAC CTGCCCAGAA GCGGGGGATA ACACCTGGAA ACAGATGCTA 120

ATACCGCATA ACAACTTGGA CCGCATGGTC CGAGCTTGAA AGATGGCTTC GGCTATCACT 180

TTTGGATGGT CCCGCGGCGT ATTAGCTAGA TGGTGGGGTA ACGGCTCACC ATGGCAATGA 240

TACGTAGCCG ACCTGAGAGG GTAATCGGCC ACATTGGGAC TGAGACACGG CCCAAACTCC 300

TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCAC AATGGACGAA AGTCTGATGG AGCAACGCCG 360

CGTGAGTGAA GAAGGGTTTC GGCTCGTAAA ACTCTGTTGT TAAAGAAGAA CATATCTGAG 420

AGTAACTGTT CAGGTATTGA CGGTATTTAA CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC 480

AGCCGCGGTA ATACGTAGGT GGCAAGCGTT GTCCGGATTT ATTGGGCGTA AAGCGAGCGC 540

AGGCGGTTTT TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC TTCGGCTCAA CCGAAGAAGT GCATCGGAAA 600

CTGGGAAACT TGAGTGCAGA AGAGGACAGT GGAACTCCAT GTGTAGCGGT GAAATGCGTA 660

GATATATGGA AGAACACCAG TGGCGAACGG CGGCTGTCTG GTCTGTAACT GACGCTGAGG 720

CTCGAAAGTA TGGGTAGCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCATACC GTAAACGATG 780

AATGCTAAGT GTTGGAGGGT TTCCGCCCTT CAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCATTCC 840

GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC 900

GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCTAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATACT 960

ATGCAAATCT AAGAGATTAG ACGTTCCCTT CGGGGACATG GATACAGGTG GTGCATGGTT 1020

GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTATTA 1080

TCAGTTGCCA GCATTAAGTT GGGCACTCTG GTGAGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG 1140

GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG 1200

GATGGTACAA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA GTAAGCTAAT CTCTTAAAGC CATTCTCAGT 1260

TCGGATTGTA GGCTGCAACT CGCCTACATG AAGTCGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGATCAG 1320

CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC CATGAGAGTT 1380

TGTAACACCC AAAGTCGGTG GGGTAACCTT TTAGGAAACC CAGCCGCCTA AAGGGGGACC 1440

CAGAA 1445

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物BSHL

<222> (1)..(28)

<400> 7

AACTGCAGAT GTGTGTACTG CCATAACT 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物BSHR

<222> (1)..(30)

<400> 8

GGAATTCTTA GTTAACTGCA TAGTATTGTG 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P1

<222> (1)..(24)

<400> 9

AACTGAAGAG TTTGATCCTG GCTC 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P2

<222> (1)..(22)

<400> 10

TACGGTTACC TTGTTACGAC TT 22

Claims

1.一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌；

步骤1)、3)中引物对BSH_L/BSH_R为：

BSH_L：5’-AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT-3’；

BSH_R：5’-GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)、3)中PCR扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L dNTPs 2.0μL，5U/μL DNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物BSH_L、BSH_R各0.5μL，75mg/L模板0.5μL，超纯水18.5，总计25.0μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)、3)中PCR扩增得到990bp的基因片段，即为具有BSH基因。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中纯化采用含牛磺胆酸钠的MRS培养基，组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g，胆固醇10mg，琼脂1.5g，蒸馏水定容至100mL。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：在纯化前，先将分离对象接种于含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中富集，于35～40℃下厌氧培养20～28h；含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基的组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g，牛磺胆酸钠0.3g、胆固醇10mg，蒸馏水定容至100mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中分子鉴定为：利用引物对P1/P2进行PCR扩增，鉴定确认菌株的16S rDNA片段，引物如下：

P1：5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’；

P2：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述扩增的反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/L dNTPs 2.0μL，5U/μL DNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物P1、P2各0.5μL，75mg/L菌株全基因组DNA 0.5μL，超纯水18.5μL，总计25.0μL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。

10.根据权利要求1、7～9中任一项所述的方法，其特征在于：在分子鉴定前，先对疑似植物乳杆菌的菌株进行降胆固醇能力评定，评定方法为：将菌株接种于含牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中，35～40℃下厌氧培养，检测菌液中胆固醇残余量，计算胆固醇降解率。