CN110724644A - 一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌，所述里氏木霉工程菌命名为里氏木霉INS‑GFP，属于丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Trichoderma)里氏木霉(Trichoderma reesei)，菌株号INS‑GFP，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18599，保藏日期为2019年10月23日，还提供了应用，里氏木霉INS‑GFP用于重组人胰岛素的生产。本发明的里氏木霉工程菌里氏木霉INS‑GFP能够用于重组人胰岛素的生产，发酵5d后，重组人胰岛素的含量达42.9mIU/L，为胰岛素的来源提供新的途径，为探寻更低成本的胰岛素生物合成生产工艺具有非常重要的意义。

Description

一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌及其应用。

背景技术

随着现代社会饮食与生活方式的转变，以及预期寿命的增加和日益严峻的肥胖问题，糖尿病的发病率呈逐年上升的趋势。据世界卫生组织预计，到2030年全球罹患糖尿病的人数将超过3亿，这意味着每年对胰岛素的需求量将超过1.6吨，而现有的胰岛素表达系统的产率将无法满足未来的市场需求。

目前在工业生产中，药用胰岛素主要由重组大肠杆菌或重组酵母生产而得。前一种方式是在大肠杆菌中表达胰岛素前体，发酵结束后产物以包涵体的形式存在于大肠杆菌体内，经过破胞、溶解、复性等操作后获得胰岛素(PloS ONE 2016；11:e0167207,生物技术通报2016；32:226-30)，此法产量低、操作繁琐、成本较高；后一种方式是在酵母中(主要是酿酒酵母)表达胰岛素前体，已折叠成正确构象的成熟胰岛素原被直接分泌到发酵液中，相较于前者，不仅产量更高，而且此法的后续分离纯化更简便，所以成本较低。也正因为如此，世界胰岛素产量的一半来自重组酿酒酵母。注射胰岛素治疗糖尿病是二十世纪最伟大的医学成就之一，拯救了无数人的生命，但由于糖尿病不能根治，需要终生注射胰岛素，其高昂的治疗费用不仅对于中低收入人群来说是个沉重的经济负担，而且对医疗保障系统来说也是巨大的挑战。因此，降低胰岛素的生产成本变成了当务之急。主要的解决方案就是要提高现有重组酵母系统的胰岛素产量，但进展有限，重组酿酒酵母在0.08g/L左右，重组毕赤酵母在3g/L左右。另一种解决方案是为大规模低成本生产重组人胰岛素探索更为高效的微生物细胞工厂。

里氏木霉Rut-C30作为重要的工业菌株，广泛用于纤维素酶和其他酶制剂的工业化生产，发酵工艺成熟。该菌株的胞外蛋白浓度可达100g/L 以上，利用该菌株强劲的胞外蛋白分泌能力，异源表达分泌胰岛素原，对于探寻更低成本的胰岛素生物合成生产工艺具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌及其应用，该里氏木霉工程菌里氏木霉INS-GFP能够用于重组人胰岛素的生产，发酵5d后，重组人胰岛素的含量达42.9mIU/L，为胰岛素的来源提供新的途径，为探寻更低成本的胰岛素生物合成生产工艺具有非常重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌，所述里氏木霉工程菌命名为里氏木霉INS-GFP，属于丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Trichoderma)里氏木霉(Trichoderma reesei)，菌株号INS-GFP，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18599，保藏日期为2019年10月 23日；所述里氏木霉INS-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述里氏木霉INS-GFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了上述的产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌的应用，所述里氏木霉INS-GFP用于重组人胰岛素的生产。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明的里氏木霉工程菌里氏木霉INS-GFP能够用于重组人胰岛素的生产，发酵5d后，重组人胰岛素的含量达42.9mIU/L，为胰岛素的来源提供新的途径，为探寻更低成本的胰岛素生物合成生产工艺具有非常重要的意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明的里氏木霉INS-GFP及其出发菌株的菌丝体显微镜图。

图2是本发明的实施例3中里氏木霉INS-GFP发酵液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3是本发明的实施例3中里氏木霉INS-GFP发酵液的免疫印迹试验图。

图4是本发明的实施例3中里氏木霉INS-GFP发酵液中重组人胰岛素原的含量图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌，所述里氏木霉工程菌命名为里氏木霉INS-GFP，属于丛梗孢目(Moniliales)木霉属 (Trichoderma)里氏木霉(Trichoderma reesei)，菌株号INS-GFP，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.18599，保藏日期为2019年10月23日；所述里氏木霉INS-GFP 的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述里氏木霉INS-GFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本实施例还提供了上述的产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌的应用，所述里氏木霉INS-GFP用于重组人胰岛素的生产。

实施例2

本实施例为实施例1中所述的产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌里氏木霉INS-GFP的制备方法：

(一)人胰岛素原异源表达重组载体的构建：

从GeneBank中获得人胰岛素原基因(BT006808)序列，并按照里氏木霉密码子偏好性进行优化，构建人胰岛素原基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1；所述人胰岛素原基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3；所述人胰岛素原基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1的核苷酸序列的5’端为EcoRI酶切位点，3’端为BamHI酶切位点；所述人胰岛素原基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1的核苷酸中包含里氏木霉纤维二糖水解酶cbh1基因的信号肽的核苷酸序列；所述里氏木霉纤维二糖水解酶cbh1 基因的的信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；

将人胰岛素原基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1的含有amdS基因的载体 pGH-Pcbh1-ins-Tcbh1(所述含有amdS基因的载体pGH-Pcbh1-ins-Tcbh1 由上海捷瑞生物工程有限公司生产)和含有潮霉素筛选标记的 pCAMBIA1300载体质粒(市购)用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，连接得到表达载体pCA-ins，将表达载体pCA-ins转化大肠杆菌E.coli进行扩增并提取，得到人胰岛素原异源表达重组载体。

(二)人胰岛素原异源表达重组载体转化根瘤农杆菌，制备根瘤农杆菌转化子：

(1)根瘤农杆菌感受态细胞制备：

将根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1在LB平板a上活化培养2-3d后，从长出单菌落的LB平板a上挑取长势较好的单菌落至5mL的 LB液体培养基a中，在温度为28℃、转速为200rpm的条件下培养*h，得到菌液a，将1mL的菌液a转接至50mL的LB液体培养基a中，在温度为28 ℃、转速为200rpm的条件下培养至OD600为0.6时，得到菌液b，将菌液b 冰浴30min后，在转速为8000rpm的条件下离心2min，弃去上清液，得到菌体b，将菌体b重悬于50μL的提前预冷的浓度为100mM的MgCl₂溶液中，冰浴10min～20min后，在转速为8000rpm的条件下离心2min，弃去上清液，得到菌体c。将菌体c重悬于100μL的预冷的浓度为20mM的CaCl₂溶液中，冰浴20min，得到根瘤农杆菌感受态细胞。

(2)将测序验证正确的人胰岛素原异源表达重组载体通过冻融法转入根瘤农杆菌感受态细胞中：

将人胰岛素原异源表达重组载体加入到根瘤农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴0.5h，液氮冷冻1min，37℃水浴30min，冰浴2min，然后加入800μL 的LB培养基，混合均匀，再温度为28℃，转速为100rpm的条件下孵育3h，然后在转速为4000rpm的条件下离心3min，弃去上清液，得到菌液d，将菌液d涂布至LB平板b中，在温度为28℃的避光培养箱中转化2-3天，在LB 平板b上随机挑取单克隆，接种到LB液体培养基b中，在温度为28℃、转速为200rpm的条件下培养48h，得到根瘤农杆菌转化子，提取根瘤农杆菌转化子的DNA，用引物INSF和引物INSR进行PCR验证根瘤农杆菌转化子是否为阳性转化子；所述PCR验证的PCR反应体系为：根瘤农杆菌转化子的 DNA 1μL，10μmol/L的引物INSF 0.3μL，10μmol/L的引物INSR 0.3μL，2x Taq DNA聚合酶5μL，重蒸水补足至10μL；所述引物INSF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述引物INSR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述PCR验证的PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min，进行32次循环；72℃终延伸5min；琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(三)阳性的根瘤农杆菌转化子制备根瘤农杆菌菌液介导转化里氏木霉：

(1)根瘤农杆菌菌液的制备：

将阳性的根瘤农杆菌转化子划线接种至LB平板b，48h后挑取单克隆接种至LB液体培养基b中，在温度为28℃、转速为220rpm的条件下培养2d，然后在转速为4000rpm的条件下离心3min，弃去上清液，收集根瘤农杆菌菌体，用IM液体培养基洗涤2次，将根瘤农杆菌菌体重悬，分光光度计检测 OD600值在0.15～0.2之间，加入终浓度为200mM的乙酰丁香酮，然后再温度为28℃、转速为220rpm～250rpm的条件下避光培养10h～16h，当OD600 达到0.6～0.8时，得到根瘤农杆菌菌液。

(2)里氏木霉孢子悬液的制备及萌发：

用5mL～8mL的萌发用无菌水冲洗在斜面PDA培养基上培养4d～7d的里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut-C30，用4层纱布过滤，得到里氏木霉孢子悬液，将里氏木霉孢子悬液在转速为4000rpm的条件下离心3min，弃去上清液，用IM液体培养基重悬里氏木霉孢子，得到里氏木霉孢子重悬液，用血球计数板在显微镜下对里氏木霉孢子计数，将浓度稀释至10⁷～10⁸个孢子 /mL，在24℃培养箱中培养3h，得到萌发的氏木霉孢子液；所述里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut-C30购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)，登录号为ATCC 56765。

(3)萌发的氏木霉孢子和根瘤农杆菌菌液共培养：

用已灭菌的镊子将灭菌后的硝酸纤维素膜贴在IM平板a上，将根瘤农杆菌菌液和萌发的氏木霉孢子液等体积混合均匀后，涂布到铺有硝酸纤维素膜 IM平板a上，在温度为24℃培养箱中避光共培养2d～3d。

(4)里氏木霉转化子的筛选：

将萌发的氏木霉孢子和根瘤农杆菌菌液共培养后的硝酸纤维素膜揭下，反铺到PDA平板a上，在温度为30℃的条件下培养5d～7d，待长菌落后，挑取萌发的菌落转接至乙酰胺筛选培养基，培养5d～7d，待长出里氏木霉菌落后，视为含有重组胰岛素原表达盒的潜在里氏木霉转化子。

(5)里氏木霉转化子验证：

将含有重组胰岛素原表达盒的潜在里氏木霉转化子划线接种到斜面PDA 培养基，在温度为30℃的条件下培养5d～7d，刮取孢子接种到Mandels液体培养基中，在温度为30℃，转速为170rpm的条件下培养48h后，得到里氏木霉转化子T7，提取里氏木霉转化子T7的DNA，用引物INSF和引物INSR 进行PCR验证里氏木霉转化子T7是否为阳性转化子，阳性的里氏木霉转化子T7即为里氏木霉INS-GFP；

所述PCR验证的PCR反应体系为：T7是否为阳性转化子的DNA 1μL， 10μmol/L的引物INSF 0.3μL，10μmol/L的引物INSR 0.3μL，2x Taq DNA聚合酶5μL，重蒸水补足至10μL；所述引物INSF同实施例3中的引物INSF；所述引物INSR同实施例3中的引物INSR；

所述PCR验证的PCR程序同实施例3中的PCR验证的PCR程序。

本实施例中所述LB平板a中含有浓度为25μg/mL的抗生素利福平Rif； LB平板b中含有浓度为50μg/mL的抗生素卡那霉素Kan和浓度为25μg/mL 的抗生素利福平Rif；所述LB液体培养基a中含有浓度为25μg/mL的抗生素利福平Rif；所述LB液体培养基b中含有浓度为50μg/mL的抗生素卡那霉素 Kan和浓度为25μg/mL的抗生素利福平Rif；所述IM平板a中含有浓度为 0.2mM的乙酰丁香酮；所述PDA平板a中含有浓度为100μg/mL的潮霉素和浓度为200μmol/L的头孢噻肟。

图1为里氏木霉INS-GFP及其出发菌株在发酵5天后的菌丝体显微镜图，图中左侧为出发菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut-C30，菌丝细长、饱满、圆润；右侧为里氏木霉INS-GFP，菌丝短小、细碎。

实施例3

本实施例提供了里氏木霉INS-GFP的应用，用于重组人胰岛素的生产。

(1)里氏木霉INS-GFP发酵液的制备：

将浓度为10⁸个孢子/mL的里氏木霉INS-GFP接种于50mL的Mandels 液体培养基中，在温度为30℃、转速为170rpm的条件下培养36h，得到里氏木霉种子液，移取5mL的里氏木霉种子液接种至45mL的发酵培养基中，在转速为170rpm的条件下交替进行1d的温度为30℃和1d的温度为28℃的发酵，得到里氏木霉INS-GFP发酵液。

(2)里氏木霉INS-GFP发酵液的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：

将里氏木霉INS-GFP发酵液在温度为4℃、转速为8000rpm的条件下离心10min，取上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，经考马斯亮蓝染色液染色和脱色液脱色后，得到SDS-PAGE蛋白胶，如图2所示，图中第1泳道里氏木霉INS-GFP发酵液的上清液，第2泳道为SDS-PAGE蛋白 Marker，图中第1泳道箭头所指为人胰岛素的前体——胰岛素原，说明MMMMM发酵液中存在重组人胰岛素原。

(3)免疫印迹试验(WesternBlot)：

转膜：用半干转仪对SDS-PAGE蛋白胶进行转膜反应。

免疫反应：将转膜反应后的膜用TBST缓冲液洗脱3次，每次5min,之后在含有5％的牛血清白蛋白的TBST缓冲液中封闭浸泡过夜后，用滤纸吸去膜上的残留液，将膜放入一抗稀释液中(胰岛素兔多克隆抗体，工作浓度为 1:1000，市购)，脱色摇床孵育1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min，然后用二抗稀释液(山羊抗兔IgG-HRP,工作浓度1:3000，市购)孵育1h， TBST缓冲液洗脱3次，每次5min，得到免疫反应后的膜。

红色发光：将免疫反应后的膜在化学发光成像仪下，用显色液成像，结果如图3所示，箭头所指为二抗山羊抗兔IgG-HRP的显色条带，只有存在人胰岛素或其前体的情况下，一抗胰岛素兔多克隆抗体才能吸附，而后二抗才能与一抗吸附，催化显色反应，，此结果说明MMMMM发酵液中存在重组人胰岛素原。

(3)ELISA法定量里氏木霉INS-GFP发酵液中的重组人胰岛素原的含量：

将发酵1d～7d的里氏木霉INS-GFP发酵液分别作为待测样品，用真菌胰岛素酶ELISA(双抗体一步夹心法酶联免疫)试剂盒对发酵1d～7d的里氏木霉INS-GFP发酵液的重组人胰岛素原的含量分别进行测定，结果如图4所示，随着发酵时间的增加，重组人胰岛素原的含量增加，发酵5d时的重组人胰岛素原的含量达到42.9mIU/L，而后重组人胰岛素原的含量持续增加，但趋势减缓，原因是虽然表达胰岛素原基因的启动子是强启动子Pcbh1，只要有诱导物(里氏木霉INS-GFP)的存在，会持续诱导表达重组人胰岛素原，但发酵5d后的里氏木霉INS-GFP开始进入衰亡期，菌丝开始破碎，故发酵 5d后的重组人胰岛素原的含量增加趋势减缓。

综上所述，里氏木霉INS-GFP能用于重组人胰岛素的生产。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 1

atgtatcaaa agttggccct catctcggcc ttcttggcta ctgctcgagc tttcgtcaac 60

cagcacctct gcggcagcca cctcgtcgag gccctctacc tcgtctgcgg cgagcgcggc 120

ttcttctaca cccccaagac ccgccgcgag gccgaggacc tccaggtcgg ccaggtcgag 180

ctcggcggcg gccccggcgc cggcagcctc cagcccctcg ccctggaggg cagcctccag 240

aagcgcggca tcgtcgagca gtgctgcacc agcatctgca gcctctacca gctggagaac 300

tactgcaact aa 312

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 2

Met Tyr Gln Lys Leu Ala Leu Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

20 25 30

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg

35 40 45

Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln

65 70 75 80

Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

85 90 95

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100

<210> 3

<211> 3413

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 3

catgaattca aaggctatga gaaattctgg agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 60

cttcgacaag caaagcgttc cgtcgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 120

attcctaagt agcgatggaa ccggaataat ataataggca atacattgag ttgcctcgac 180

ggttgcaatg caggggtact gagcttggac ataactgttc cgtaccccac ctcttctcaa 240

cctttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc gtacaagtcg taatcactat taacccagac 300

tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 360

ctgcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaatgtagg attgttatcc gaactctgct 420

cgtagaggca tgttgtgaat ctgtgtcggg caggacacgc ctcgaaggtt cacggcaagg 480

gaaaccaccg atagcagtgt ctagtagcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 540

aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaaggagtca tataccagcg 600

gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttcttcact 660

cagtccaatc tcagctggtg atcccccaat tgggtcgctt gtttgttcca cctgtaaagc 720

cgcaatgcag catcactgga aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct 780

aaaggagtca tataccagcg gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat 840

ttgccaacgg cttcttcact cagtccaatc tcagctggtg atcccccaat tgggtcgctt 900

gtttgttcca cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga aaatacaaac caatggctaa 960

aagtacataa gttaatgcct aaaggagtca tataccagcg gctaataatt gtacaatcaa 1020

gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttcttcact cagtccaatc tcagctggtg 1080

atcccccaat tgggtcgctt gtttgttcca cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 1140

aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaaggagtca tataccagcg 1200

gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttcttcact 1260

cagtccaatc tcagctggtg atcccccaat tgggtcgctt gtttgttccg gtgaagtgaa 1320

agaagacaga ggtaagaatg tctgactcgg agcgttttgc atacaaccaa gggcagtgat 1380

ggaagacagt gaaatgttga cattcaagga gtatttagcc agggatgctt gagtgtatcg 1440

tgtaaggagg tttgtctgcc gatacgacga atactgtata gtcacttctg atgaagtggt 1500

ccatattgaa atgtaagtcg gcactgaaca ggcaaaagat tgagttgaaa ctgcctaaga 1560

tctcgggccc tcgggccttc ggcctttggg tgtacatgtt tgtgctccgg gcaaatgcaa 1620

agtgtggtag gatcgaacac actgctgcct ttaccaagca gctgagggta tgtgataggc 1680

aaatgttcag gggccactgc atggtttcga atagaaagag aagcttagcc aagaacaata 1740

gccgataaag atagcctcat taaacggaat gagctagtag gcaaagtcag cgaatgtgta 1800

tatataaagg ttcgaggtcc gtgcctccct catgctctcc ccatctactc atcaactcag 1860

atcctccagg agacttgtac accatctttt gaggcacaga aacccaatag tcaaccgcgg 1920

actggcatca tgtatcaaaa gttggccctc atctcggcct tcttggctac tgctcgagct 1980

ttcgtcaacc agcacctctg cggcagccac ctcgtcgagg ccctctacct cgtctgcggc 2040

gagcgcggct tcttctacac ccccaagacc cgccgcgagg ccgaggacct ccaggtcggc 2100

caggtcgagc tcggcggcgg ccccggcgcc ggcagcctcc agcccctcgc cctcgagggc 2160

agcctccaga agcgcggcat cgtcgagcag tgctgcacca gcatctgcag cctctaccag 2220

ctcgagaact actgcaacta atctagatga acccttacta ctctcagtgc ctgtaaagct 2280

ccgtggcgaa agcctgacgc accggtagat tcttggtgag cccgtatcat gacggcggcg 2340

ggagctacat ggccccgggt gatttatttt ttttgtatct acttctgacc cttttcaaat 2400

atacggtcaa ctcatctttc actggagatg cggcctgctt ggtattgcga tgttgtcagc 2460

ttggcaaatt gtggctttcg aaaacacaaa acgattcctt agtagccatg cattttaaga 2520

taacggaata gaagaaagag gaaattaaaa aaaaaaaaaa aacaaacatc ccgttcataa 2580

cccgtagaat cgccgctctt cgtgtatccc agtaccacgg caaaggtatt tcatgatcgt 2640

tcaatgttga tattgttccc gccagtatgg ctccaccccc atctccgcga atctcctctt 2700

ctcgaacgcg gtagtggcgc gccaattggt aatgacccat agggagacaa acagcataat 2760

agcaacagtg gaaattagtg gcgcaataat tgagaacaca gtgagaccat agctggcggc 2820

ctggaaagca ctgttggaga ccaacttgtc cgttgcgagg ccaacttgca ttgctgtcaa 2880

gacgatgaca acgtagccga ggaccgtcac aagggacgca aagttgtcgc ggatgaggtc 2940

tccgtagatg gcatagccgg caatccgaga gtagcctctc aacaggtggc cttttcgaaa 3000

ccggtaaacc ttgttcagac gtcctagccg cagctcaccg taccagtatc gaggattgac 3060

ggcagaatag cagtggctct ccaggatttg actggacaaa atcttccagt attcccaggt 3120

cacagtgtct ggcagaagtc ccttctcgcg tgcgagtcga aagtcgctat agtgcgcaat 3180

gagagcacag taggagaata ggaacccgcg agcacattgt tcaatctcca catgaattgg 3240

atgactgctg ggcagaatgt gctgcctcca aaatcctgcg tccaacagat actctggcag 3300

gggcttcaga tgaatgcctc tgggccccca gataagatgc agctctggat tctcggttac 3360

gatgatatcg cgagagagca cgagttggtg atggagggga cgagggatcc aat 3413

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 4

atgtatcaaa agttggccct catctcggcc ttcttggcta ctgctcgagc t 51

Claims (2)

1.一种产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉工程菌命名为里氏木霉INS-GFP，属于丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Trichoderma)里氏木霉(Trichoderma reesei)，菌株号INS-GFP，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18599，保藏日期为2019年10月23日；所述里氏木霉INS-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述里氏木霉INS-GFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种如权利要求1所述的产重组人胰岛素原的里氏木霉工程菌的应用，其特征在于，所述里氏木霉INS-GFP用于重组人胰岛素的生产。

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