CN102666842B - Orf7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用 - Google Patents
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Abstract
提供了ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及其应用,以及该病毒的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于病毒学和生物药学领域。具体而言,本发明提供了ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及其应用,为水痘-带状疱疹病毒等的预防提供良好的候选疫苗药物。
技术背景
水痘-带状疱疹病毒(Varicellazostervirus:VZV,简称“水痘病毒”或“VZV”)是严格种属特异性的病毒,是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。其中,P-Oka株是由Takahashi等于1971年在日本Oka姓氏的3岁男孩的水痘囊泡液中分离出来的,并经人胚肺细胞培养获得的,被认为具有引发水痘和带状疱疹功能(TakahashiM,OtsukaT,OkunoY,etal.Livevaccineusedtopreventthespreadofvaricellainchildreninhospital.Lancet1974;2:1288-90.)。
美国专利3985615中公开了P-Oka株通过豚鼠胚胎组织(GPEC)和人胚肺细胞多次传代,产生减毒的V-Oka病毒,制备预防水痘的V-Oka活疫苗。美国专利4000256中叙述了用人胚成纤维细胞WI-38株传代培养VZV病毒10-80次生产VZV减毒疫苗。但迄今为止,只有P-Oka株经细胞传代获得的“水痘病毒减毒冈株”(特公昭53-41202号公报;Lancet2:1288-1290,1974)为WHO批准的唯一用于预防水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株,该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用[RequirementforVaricellaVaccine(Live)Adopted1984:WHOTechnicalReportSeries,No.725,pp.102-104,1985]。但是,尽管水痘疫苗接种的人群比水痘自然感染人群的带状疱疹发生率低,且大多为免疫功能低下儿童,但是,带状疱疹发生是不争的事实,且从患者的疱疹中分离到V-Oka株(SchmidD.S,etal.ImpactofVaricellaVaccineonVaricella-ZosterVirusDynamics,CLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,Jan.2010,p.202-217)。
专利CN1163604C涉及水痘病毒减毒冈株的鉴定,并且从分子水平上揭示该毒株是由多个不同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中,源于V-Oka疫苗接种者产生V-Oka株的带状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的,但是,现在还没有其它预防VZV的疫苗株上市。该病毒具有严格种属特异性,人是其唯一的自然宿主,没有合适的动物模型研究VZV基因功能;再者该病毒对宿主细胞具有强结合性,游离的病毒极易失活,获得可供转化的VZV病毒DNA非常困难,故很长时间以来该病毒基因功能研究的进展极为缓慢。
但是,随着细菌人工染色体(BAC)在研究中的应用,组织培养技术的进步,异种生物间器官移植屏障的突破(联合免疫缺陷型小鼠的开发),拓宽了种属特异的VZV基因功能研究的空间,可以在体外或移植到动物体内进行VZV基因功能研究。2004年KazuhiroN.等在“Cloningofthevaricella-zostervirusgenomeasaninfectiousbacterialartificialchromosomeinEscherichiacoli”一文中揭示被克隆到BAC载体上的VZVOka株全基因组,可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖,BAC可被一同转化到人胚肺细胞中的Cre酶精确切除,产生的重组VZV病毒具有p-Oka同样结构,完全具有亲本病毒的特性。BAC的应用为VZV的功能研究带来了极大便利,可以对VZV每个基因进行功能研究,加速了VZV基因功能研究的进程。
水痘-带状疱疹病毒(VZV)的ORF7位于病毒基因组的8607-9386bp之间,编码一个29kDa的蛋白,可能位于皮层结构中,它的功能目前仍不清楚。
本发明人经过不懈的研究,惊奇地发现,ORF7决定着VZV感染人皮肤和感觉神经节的功能。当ORF7缺陷即发生如下情况之一:全部或部分缺失、被插入终止密码子,以及被一个或多个碱基取代,特别是删除了ORF7或者ORF7产生翻转反向移码突变时,ORF7的功能丧失,即VZV不感染皮肤和感觉神经节,故不存在产生水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害(我们在本发明中称之为ORF7缺陷引起的功能丧失,所述功能是指能够感染人的皮肤和感觉神经节)。ORF7删除的水痘病毒株(VZV-7DBAC或VZV-7DRMBAC)可以在大肠杆菌中进一步经抗生素筛选或半乳糖筛选(麦糠基氏培养机上产生亮红色斑)得到单一克隆株,不存于混合型V-Oka株的潜在危害,这为开发更加安全有效的疫苗带来了希望。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种水痘病毒(例如P-Oka株),其基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入,并且所述的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。
ORF7(8607-9386bp)的序列如下:
ATGCAGACGGTGTGTGCCAGCTTATGTGGATATGCTCGAATACCAACTGAAGAGCCATCTTATGAAGAGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAACCGCTGTGAATGGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGTCGTTTGGTCCGCGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACAGCACCATTTTACTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATGTTATGCTTGTATAA(SEQIDNO:1)
在本发明的一个实施方案中,ORF7全部或部分被抗生素抗性基因和/或者无功能的核酸序列所取代。所述无功能的核酸序列是指该核酸序列不使ORF7功能恢复,即水痘病毒仍不能感染皮肤和感觉神经节,该无功能的核酸序列可以是不编码融合蛋白的,也可以是编码蛋白的核酸序列,只要所编码的蛋白不会使ORF7功能的恢复。在本发明的一个实施方案中,所述无功能的核酸序列是翻转反向移码突变的ORF7片段。
术语“ORF7片段”是指ORF7的全部或部分核酸序列。
在本发明的一个实施方案中,所述翻转反向移码突变的ORF7片段的序列如SEQIDNO:13所示。
在本发明的一个实施方案中,所述抗生素抗性基因选自:青霉素、链霉素、以及卡那霉素的抗性基因。
在一个具体的实施方式中,发明人以来自斯坦福大学医学院Dr.AnnArvin实验室的P-Oka临床分离株为材料,以VZV-BAC(P-Oka)为框架,应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长ORF7被Kanr基因取代而产生VZV-7DBAC株或被翻转反向移码突变的ORF7部分片段取代而产生VZV-7DRMBAC株。其中,Kanr基因的序列如下:
ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA(SEQIDNO:2)
具体地,本发明提供一种水痘病毒,其保藏编号为CGMCCNo.3207,保藏日期2009年7月28日,保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
体内外实验证实该病毒株不感染人皮肤和感觉神经节,故极可能不存在引发水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害;该毒株可在MRC-5、Mewo、或ARPE细胞上生长,且同P-Oka株生长特性一致,并且也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性;该毒株保留了P-Oka株的所有糖蛋白,其免疫原性理应同P-Oka株的免疫力相同;该毒株是通过Kanr筛选或半乳糖筛选单一克隆株,不存于混合型V-Oka株的潜在危害;由于整个ORF7删除,或以翻转反向移码突变,VZV-7DBAC或VZV-7DRMBAC株不可能产生回复突变,因而,以VZV-7DBAC或VZV-7DRMBAC株制备减毒活疫苗更为安全和有效。
本发明的另一方面涉及上述的水痘病毒的制备方法,包括如下步骤:
1)将野生型水痘病毒的基因组克隆到BAC载体上,然后通过细菌内重组,使得水痘病毒的基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入,导致得到的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节;
2)分离1)中得到的水痘病毒的DNA,并与含Cre酶的重组质粒共转染Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞;
3)通过Cre酶的作用在Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞中删除BAC。
在本发明的一个实施方案中,所述野生型水痘病毒是P-Oka株,并且步骤1)中所述的ORF7被Kanr取代,或者翻转反向移码突变的ORF7片段所取代。在一个具体的实施方式中,所述翻转反向移码突变的ORF7片段是SEQIDNO:13。
本发明的还一方面涉及一种组合物,其含有上述的任一种水痘病毒。
本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的疫苗,其含有上所述的任一种水痘病毒,以及疫苗用赋形剂或载体。
在本发明中,术语“预防水痘和/或带状疱疹的疫苗”是指水痘疫苗、带状疱疹疫苗、以及预防水痘和带状疱疹的疫苗。
本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒在制备预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途。
本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒的DNA在制备表达载体中的用途。
发明的还一方面涉及一种表达载体,其由BAC和插入到BAC中的上述的任一种水痘病毒的DNA组成。一种表达载体,其为上述的任一种水痘病毒的DNA。上述的表达载体至少可以插入10kb的外源基因而不影响其本身生长和增殖,可用于表达外源基因,并且所述表达载体由于ORF7功能缺失而变得安全。也可以将该表达载体用荧光素酶基因标记(Zhangetal.JournalofVirology,Sept,2007,p9024-9033),用于体内外VZV-7DRM功能研究的监测。
发明的还一方面涉及一种重组载体,其含有上述的表达载体以及插入的外源基因。
发明的还一方面涉及一种重组细胞,其含有上述的表达载体或重组载体。
本发明的一个实施方案中,所述重组细胞所用的宿主细胞选自如下细胞:
MRC-5、Mewo、ARPE、2BS、WI-38、以及KMB17。
本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的方法,包括给予患者接种有效量的上述疫苗的步骤。
在本发明中,术语“DPI”是“dayspostinfection”的缩写,是指病毒感染后的天数。
附图说明
图1:p-OkaBAC(VZVBAC)载体构建。
图2:ORF7缺失BAC株(VZV-7DBAC)的制备。
图3:ORF7缺失的VZV病毒的电泳鉴定。
图4:VZV-7D病毒的背根神经节培养。A.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在MeMo细胞中的生长曲线。B.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在背根神经节(DRG)中的生长曲线。
图5:ORF-7回复突变(VZV-7R)水痘病毒的制备。
图6:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人体MeWo细胞中生长曲线。
图7:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人胸腺组织培养(TOC)物中的生长曲线。
图8:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人皮肤组织培养(SOC)物中的生长曲线。
图9:A.用WT、VZV-7DRM和VZV-7R的DNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞中生长。B.背根神经节(DRG)从人胚胎的脊髓中分离所得。C.DRG被移植到重症联合免疫缺陷(SCID-hu)小鼠的肾囊里,WT或VZV-7DRM病毒感染DRG,用IVIS仪器测试病毒生长,VZV-7DRM不能在SCID-hu鼠(植入人组织的重症联合免疫缺陷鼠)中生长。D.感染后GFP强度增加显示,野生型(WT)VZV能够在DRG培养物中生长。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:p-OkaBAC(VZVBAC)载体构建
1)BAC载体(pUSF-6),含有原核复制起始序列(Ori)、复制和分区基因(repE,parAandparB),氯霉素抗性基因(camR)、绿色荧光蛋白(gfp),两个500bpVZV片段a和b(灰色)、两个loxP位点(白色)。pUSF-6用BamH1消化成线性结构,通过同源重组将pUSF-6插入含VZV的科斯质粒pvSpe23中;
2)p-Oka基因结构模式图显示VZV由125kb核苷酸组成,包括一个长片段(UL)和一个短片段(US)。完整基因组被消化成4个含重叠区的VZV基因片段,克隆到科斯质粒中,产生4个重组克隆pvFsp73、pvSpe14、pvPme19和pvSpe23,pUSF-6通过同源重组插在VZV科斯质粒pvSpe23的ORF60和ORF61之间;
3)含BAC载体(pUSF-6)的pvSpe23与其它三个VZV科斯质粒共转染MeWo细胞,重组病毒(VZVBAC)能在MeWo细胞中复制并产生绿色荧光斑。
另外,操作过程也可以参见Fig.1。
比较VZVBAC病毒和野生型pOka病毒的生长曲线。病毒感染后每天记录蚀斑形成单位数(PFU)。结果显示VZVBAC病毒(绿色)没有出现生长缺陷,与亲本病毒体外生长一致。
实施例2:ORF7缺失的BAC株(VZV-7DBAC)的制备以及检验
ORF7删除的VZV突变体的构建可以参照lucVZVBAC(Zhangetal.JournalofVirology,Sept,2007,p9024-9033)。操作过程也可以参见Fig.2以及下面的步骤:
1.设计的两条引物各包含20bp的卡那霉素抗性基因同源核苷酸序列和ORF7删除区起始或终止密码子相连的40bp同源序列。所用引物F1、R1如下:
F1:GATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCGCTCTTGTTGGCTAGTGCGTA(SEQIDNO:3),
R1:AAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTCTGCCAGTGTTACAACCAA(SEQIDNO:4)。
卡那霉素抗性基因从质粒pGEM-oriV/kan1上扩增(Netterwald,Yangetal.2005),PCR产物用DpnI酶进行消化,用Qiagen凝胶提取试剂盒进行回收。
2.以1.6kv,250μF的BioRadGenePulserII电转仪将大约200ng的PCR产物转进载有VZVLucBAC的DY380菌体中。
3.采用大肠杆菌DY380株作为高效同源重组系统,所需同源序列短至40bp。利用重组酶42℃激活/32℃抑制的特性,完成Kanr基因与ORF7的同源重组,ORF7被Kanr基因取代,在32℃下从含有30μg/ml卡那霉素的琼脂板上选择单克隆的重组子,从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株(ORF7缺失)VZV-BAC的DNA。
4.所得病毒基因组完整性由HindIII酶切检验,重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7缺失的BAC株(VZV-7DBAC),其ORF7被Kanr基因取代。
实施例3:ORF7翻转反向移码突变BAC株(VZV-7DRMBAC)的制备以及检验
思路如下:用galk基因取代野生型病毒中的ORF7序列,含galk基因的VZV在以半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏琼脂培养物上产生亮红色斑,用这种方法筛选出单克隆;再用翻转反向移码突变序列取代galk,在完全培养基和基础培养基上筛选单克隆,获得VZV-7DRMBAC
步骤如下:
1.设计正反向引物5′端各含有60bpORF7基因两端侧翼同源序列的galk基因表达框的扩增引物F2和R2。从pgalk上扩增galk基因序列(1-82bp为启动子,83-1231bp为galk的ORF),序列如下(SEQIDNO:5):
CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGGCTACCCTGCCACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAACGACGGTTTCGTTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTAAAGTTCGCGTGATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCACATGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGTAACAACAGCTTCGGCGGCGTGGACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGGCAAGAAAGATCATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTGTGGCTGTCGTCATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAACAGTGCGAAACCGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGCTGTTGCGCATGAACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCGTTGAAGCTGCCAGCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGGAGTCTCATGCCTCTATGCGCGATGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGATTGGCGACAAAGGTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAGAGCTGGTGCCTGCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTTTACGTTTGTAAACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA(SEQIDNO:5)
F2和R2序列如下:
F2:
ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQIDNO:6);
R2:
TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQIDNO:7);
2.用此引物扩增galk基因表达框,用DpnI消化过夜后纯化;
3.用VZVBAC转化大肠杆菌SW102;
4.挑取单克隆接种到5mlLB-CM(含氯霉素LB)的培养基,在32℃培养过夜;
5.用过夜培养菌接种到250mlLB-CM培养液中,32℃振荡培养到OD值达到0.4-0.6;
6.制备电转细胞(VZVBAC转化的大肠杆菌SW102);
7.取1-2μl(约200ng)步骤2纯化的PCR产物按实施例2中的电转参数电转到步骤6中制备的VZVBAC大肠杆菌SW102感受态细胞中;
8.向转化细胞中加1mlLB并于32℃培养1小时;
9.恢复后,用1×M9盐如下洗涤细菌3次:13200RPM离心沉淀培养物15秒,吸取离心上清,用1×M9盐重悬沉淀,如上离心,重复洗涤一次。经3次洗涤后,弃除上清液,沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物、10倍稀释物、100倍稀释物加到含半乳糖、亮氨酸、生物素和氯霉素的M63基础培养基上。
10.32℃培养3天;
11.挑取几个克隆到含有半乳糖、氯霉素指示剂的麦糠基氏琼脂培养板上培养,获得单克隆。培养3天出现的克隆应该是Gal+,但是,为了排除Gal-污染,获得单一亮红色克隆对进行下一步试验是非常重要的;
12.挑取单一亮红色(半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏培养基上培养,Gal+)克隆,接种到5mlLB-CM培养液中,32℃过夜培养;用过夜培养物制备BACDNA,并用PCR确证含有galk基因,所用引物如下:
F3:CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQIDNO:8);
R3:TCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQIDNO:9);
13.以F4(SEQIDNO:10)和R4(SEQIDNO:11)为引物的ORF7近3′端457bp的PCR扩增(457bp读码框序列(SEQIDNO:12))。由于F4、R4引物设计引入了1位碱基移码,故扩增产物产生移码突变。
F4和R4引物序列如下:
F4
CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG(SEQIDNO:10)
R4
AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAAC(SEQIDNO:11)
457bp读码框序列如下:
GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG(SEQIDNO:12)。
然后参照本实施例的步骤4-10制备电转感受态SW102细胞。
14.200ng含与步骤2galk基因侧翼同源的PCR产物经热激转化50μl步骤13的感受态细菌。转化产物加到含10mlLB培养液的50ml锥形瓶中,32℃水浴振荡培养4.5小时进行恢复。这种长时间恢复旨在获得只含目标序列的重组VZVBAC(舍弃含galk表达框的VZVBAC)。因为F4由60bpOFR75′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp反向序列组成,R4由60bpOFR73′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp正向序列组成,所以扩增产物与OFR7位点上的galk基因同源重组时,3′端457bp序列产生翻转反向连接,产生翻转反向移码突变突变(SEQIDNO:13),不具表达功能。翻转反向移码突变序列如下:
CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCAACACGGGCTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATACTTCTATAAGTGGGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCACATTTTCCCCTTTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACGACCCCAAGAGTTTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTCATTCTCAGGGTTTGATCGACAATATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTAAACACATATCAGCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC(SEQIDNO:13)。
15.如步骤9操作,沉淀1ml培养物,用1×M9盐洗涤细菌3次,沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物和10倍稀释物各100μl加到含甘油、亮氨酸、生物素、2-脱氧-半乳糖和氯霉素的M63培养板上。
16.32℃培养3-4天;
17.挑选并移种单克隆转到LB-CM和Galk-M63CM基础培养基的平板上。在LB-CM生长而在基础培养板上不生长的单克隆,提取病毒基因组用HindIII酶切检验完整性,重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7翻转反向移码突变的BAC株(VZV-7DRMBAC)。
上述步骤所用试剂的配制如下面的表1所示:
表1:本实施例所用试剂及其配制
实施例4:VZV-7D和VZV-7DRM病毒的制备
1.从实施例2制得的VZV-7DBAC中提取DNA,转入DY380菌中培养、增殖、提取、纯化。
2.将提取纯化的DNA单独电转染至(Marchini,Liuetal.2001)MRC-5细胞,(BAC上带的GFP可以用于病毒在细胞中生长增殖研究)或与Cre表达载体一同电转染至(Marchini,Liuetal.2001)MRC-5细胞,BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除,产生VZV-7D病毒。
类似地,可以得到翻转反向移码突变取代ORF7的VZV-7DRM病毒,由于VZV-7DRM的ORF7只有部分且为翻转反向序列,所以,此片段不能表达,更无ORF7功能。因此,VZV-7DRM与VZV-7D具有相同的功能。
实施例5:VZV-7D病毒的鉴定
用实施例4中制得的VZV-7D病毒感染长成单层的MRC-5细胞,用含2%牛血清的MEM培养基培养,约80%细胞病变发生时,弃培养基,收获病变细胞,提取DNA,以P-Oka为对照进行试验。PCR扩增ORF-10和ORF-7基因,用HindIII消化VZV-7D和P-Oka株的DNA。PCR产物和HindIII消化产物用0.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳产物见Fig.3。VZV-7D在ORF-10的PCR产物同P-Oka的一致,但在ORF-7上没有条带,证实ORF-7缺失。HindIII对病毒的酶切图谱上,VZV-7D和P-Oka之间看不出差别。
实施例6:VZV-7D病毒的背根神经节培养
用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠20周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节(DRG),分离的背根神经节用含1%青霉素/链霉素的冰浴1XPBS瞬时洗涤,然后转到冰浴的培养基(DEM,含15%热灭活的胎牛血清和1%青霉素/链霉素),将每个背根神经节单独放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上,加0.5ml培养基,培养5天,其间换培养基一次。六孔细胞板中制备50%Mewo细胞培养物,用于滴度检测和生长曲线分析(Fig.4A)。第6天收获P-Oka,VZV-7D和VZV-7R新近感染的Mewo细胞,于培养基悬浮至1ml。每个背根神经节单独饲养在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl悬液用于病毒滴度检测,2μl用于Mewo细胞感染的生长曲线。其余细胞悬液用力通过27号针20次,细胞碎片通过4000rpm离心10min沉淀。上清均分,用于感染背根神经节,约120μl/样品,另外,2滴(20μl)细胞悬液用于感染另一个背根神经节,37℃5%CO2下培养3小时后,背根神经节用1×PBS洗涤,再补加新鲜培养基。每24小时检测一次荧光素酶活性。样品用含150μg/ml的D-luciferin37℃培养10分钟后,用IVIS仪器和软件分析光子数。检测结果见Fig.4B。
结果表明,VZV-7D在Mewo上生长正常,而在背根神经节中几乎不生长。VZV-7D不感染背根神经节细胞,这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。
实施例7:VZV-7D病毒的回复突变体(VZV-7R)制备以及验证
ORF7缺失正确与否不仅可以用HindIII酶切鉴定,而且可以通过基因的同源重组获得完整的VZV加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的VZV,见Fig.5。可以利用Invitrogen的高保真TaqDNA聚合酶试剂盒PCR扩增ORF7片段,并将其克隆到质粒pGEM-lox-zeo的NotI和BglII位点之间,从而形成pGEM-zeo-ORF7质粒。该克隆片段通过测序分析鉴定正确,且通过PCR扩增没有错误密码子被引入ORF7编码框中。之后以pGEM-zeo-ORF7质粒为模板用下述引物PCR扩增zeoR-ORF7编码框。
F5:GATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCAGACGGTGTGTGCCAG(SEQIDNO:14);
R5:AAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATGGATGGATCCATAACTTCGT(SEQIDNO:15),
得到的PCR产物是两端各含一段40bp的VZV基因序列,与kanR编码框序列相连的,位于删除的ORF7位点上。将得到的这段嵌合PCR产物按上文提到的方法电转化到携带有ORF7DBAC的DY380菌体中。重组体要通过含有50μg/ml的zeocin(Invitrogen)和12.5μg/ml的氯霉素的琼脂平板32℃培养筛选。正确的VZV克隆通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、潮霉素抗性、zeocin抗性、卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性的。这些克隆进一步被酶切消化和PCR分析确证正确。
将鉴定正确的克隆(即携带有ORF7缺失或者lucVZVBAC拯救子的大肠杆菌DY380)接种于含12.5μg/ml的氯霉素的500mlLB培养基中32℃培养20小时。VZVBAC的DNA通过BACDNA大量提取试剂盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA)分离得到,并且利用转染试剂FuGene6(Roche,Indianapolis,IN)按照使用说明转染到MRC-5细胞。6孔板中的一孔(35-mm)在转染时DNA与转染试剂的使用比例为1.5μg∶6μl。一般情况转染后3天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除BAC载体(两侧有loxP酶切位点),可将Cre表达载体与VZVBACDNA一起共转染(Marchini,Liuetal.2001)MRC-5细胞,利用Cre酶的特性而精确切除BAC,产生完整的VZV。
水痘ORF-7回复突变的病毒具有同P-Oka病毒相同的生长和增殖特性。说明ORF-7的功能可以通过回复突变手段得到恢复。
实施例8:VZV-7DRM病毒的Mewo细胞培养
六孔板中长成单层的Mewo细胞分别用含Luc的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染,以未感染的Mewo细胞作对照,Mewo细胞在37℃下用含2%牛血清的MEM培养基培养。感染24小时后,D-luciferin加到培养的细胞孔中,终浓度为150μg/ml,37℃培养10分钟,不同孔的生物荧光用体内成像系统IVIS(50Series;XenogenCorporation,Alameda,CA)同时测量光子数,每天测量3孔感染细胞,测量后,细胞用病毒培养液取代D-luciferin物质继续培养。病毒荧光量每24小时测量一次,连续测量7天。用3孔测量的数据均值对时间绘制生长曲线。结果见Fig.6。
人MeWo细胞不被感染或者被水痘-带状疱疹病毒野生株(lucVZV)或者VZV-7DRM突变株或者VZV-7D回复株(luc7R)感染、培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数,用3孔测量的均值对时间绘制生长曲线,图中标出3孔测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM病毒和VZV-7R病毒和野生株一样都可以在MeWo细胞中正常生长。同时,试验结果表明将BAC插入VZV-7DRM中,7DRM能正常增殖,BAC上的基因也能正常表达,即VZV-7DRM可以用作外源基因表达的载体。
实施例9:VZV-7DRM病毒在人胸腺组织的培养
人胸腺-肝脏联合移植体异体移植到雄性的CB-17SCID/beige鼠内。人胸腺-肝脏联合移植体构建和使用按JenniferF.M(JournalofVirology,Sept.1995,p.52365242)描述的方法进行。移植3月后,人胸腺-肝脏移植体经外科手术暴露后,直接注射2×103至4×103PFU的Mewo培养的含有荧光素酶的VZV-7DRM和P-Oka,10-20μl细胞悬液,每种病毒感染3只小鼠,以未感染鼠为对照,感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物,即D-luciferin10分钟后,用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量,每种病毒测量3只小鼠。结果见Fig.7。
培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受VZV野生株或者VZV-7DRM株感染,培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数。用3只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲线。图中显示3只测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM缺陷株像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。
类似的实验证明,VZV-7D缺陷株也像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。
实施例10:VZV-7DRM病毒的皮肤培养
人胚胎皮肤完整结构按JenniferF.M(JournalofVirology,Sept.1995,p.52365242)描述的方法,异体移植到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。移植4周后,三种含荧光素酶的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染皮肤,每种病毒感染3只小鼠,以未感染鼠为对照,感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物,即D-luciferin10分钟后,用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量,每种病毒测量3只小鼠。结果见Fig.8。
培养的人皮肤组织被病毒野生株(P-Oka)或者ORF7缺失株(VZV-7DRM)或者ORF7回复突变株(VZV-7R)感染、以不被感染的鼠为对照,培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数,用3只测量的光子均值对时间绘制生长曲线。图中标出3只测量数据的误差线。实验证实VZV-7DRM在皮肤中有严重生长缺陷,这种功能缺陷在VZV-7DRM株回复突变后可以被恢复。
类似的实验显示,VZV-7D在皮肤中也有严重生长缺陷,并且这种功能缺陷在VZV-7D株回复突变后可以被恢复。
实施例11:ORF7对VZV感染神经细胞为必需的验证实验
1.神经细胞瘤细胞感染实验
用野生型(WT)、ORF7删除型(VZV-7DRM)和ORF7回复突变型(VZV-7R)的BACDNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。研究发现,WT、VZV-7R在MeWo细胞和神经细胞瘤细胞上生长正常,但VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞上生长(Fig.9A)。研究结果显示ORF7很可能是VZV感染神经细胞所必需的。
2.DRG移植体感染实验
为了进一步验证本实施例中实验1的结果,使用植入人胎儿背根神经节(DRG)移植体的重症联合免疫缺陷鼠(SCID-hu)模型进行试验。结果发现,野生型在DRG移植体中经历一个短暂的复制循环(有荧光现象)后,很可能一直潜伏着。但是,VZV-7D不能在DRG移植体中复制。这些结果表明,ORF7很可能是VZV的嗜神经因子(Fig.9B-D)。
以上两个实验证明,ORF7是VZV感染神经元所必需的。
实施例12:疫苗的制备以及VZV-7DRM病毒的免疫原性检定
VZV-7DRM按MOI=0.1感染长成单层的ARPE或MRC-5细胞,病毒在细胞上吸附40分钟后,向培养瓶中加病毒培养液后于35℃下培养。细胞病变达到80%左右(通常为3天)时,用0.1%EDTA消化收获,收获物经离心、加保护剂破碎和澄清后冻干制成疫苗。
疫苗复溶后经皮下接种体重约250g豚鼠,5只/苗,5000PFU/0.5ml/剂,初免4周后,加强免疫1剂,以P-Oka和V-Oka为对照进行试验。
加强免疫后2周经心脏采血,用gp-ELISA检测免疫血清抗体滴度。用免疫抑制法检测免疫血清对病毒的中和能力。免疫血清或免前血清10倍稀释后与病毒1∶1混合,37℃培养60分钟,培养混合液感染MRC-5细胞,于37℃5%二氧化碳培养箱中培养7天后,弃去培养液,用考马斯蓝染色,计蚀斑数再换算病毒滴度,用100×(被免前血清中和的病毒滴度-被免后血清中和的病毒滴度)/被免前血清中和的病毒滴度。检定结果见表2。
表2:水痘病毒的豚鼠免疫血清抗体滴度和中和水平
实验结果表明VZV-7DRM有良好的免疫原性,抗体水平和V-Oka的相当,且VZV-7DRM免疫血清对三株病毒都有良好的中和作用,初步显示有疫苗开发前景。
类似的实验显示,VZV-7D也具有良好的免疫原性,具有疫苗开发前景。
实施例13:VZV-7DRM为载体的生物活性原料制备
用含ORF7侧翼区同源序列的EV71-VP1引物从pT-VP1质粒上PCR扩增EV71-VP1阅读框。
阅读框序列如下:
TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAGAGATAGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA(SEQIDNO:16)
PCR引物序列:
F6(ORF75′端侧翼区同源序列,起始密码子和EV71-VP1同源序列):
CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAA(SEQIDNO:17)
R6(ORF73′端侧翼区同源序列和EV71-VP1同源序列):
AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTTAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA(SEQIDNO:18)
PCR产物采用电转手段转入含VZV-7DRMBAC的SW102细菌中,按照实施例2筛选重组菌,经鉴定正确后,适量培养,提取VZV-7DRM-VP1BAC,与Cre表达载体一同电转染至ARPE细胞,BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除,产生VZV-7DRM-VP1重组病毒。重组病毒感染长成单层的ARPE细胞,35℃培养3-4天,细胞出现病变。收集的病毒培养上清、细胞悬液经反复冻融或超声裂解后的离心上清原倍上样,采用EV71特异的双抗体夹心法检测VP1活性,用EV71和VZV-7DRM作对照。结果(见表3)在VZV-7DRM-VP1病毒感染的ARPE细胞中检测到VP1活性,表明VP1重组到VZV-7DRM中。此例表明VZV-7DRM能用作外源基因的表达载体表达目标蛋白。
表3:VZV-7DRM-VP1重组病毒的VP1活性检测(双抗体夹心法)
类似的实验证明,VZV-7D也可以用于制备表达外源蛋白的载体。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (3)
1.水痘病毒在制备预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途,其中所述水痘病毒的基因组ORF7全部或部分被抗生素抗性基因所取代,并且所述水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。
2.根据权利要求1所述的用途,其中,所述抗生素抗性基因选自:青霉素、链霉素、以及卡那霉素的抗性基因。
3.水痘病毒在制备预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途,其中所述水痘病毒的基因组ORF7被SEQIDNO:13所示的翻转反向移码突变的ORF7片段所取代,并且所述水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。
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