CN113755494B - 一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗水痘‑带状疱疹病毒的siRNAs，包括互补的正义链和反义链，所述正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29所示序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列；所述siRNAs的反义链核苷酸序列为与正义链分别对应的15种序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列的互补序列。另外，本发明还公开了该抗水痘‑带状疱疹病毒的siRNAs的应用。本发明的siRNAs具有很好的生物学活性，能够显著抑制水痘‑带状疱疹病毒的复制，具有功能性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus，VZV)是一种广泛存在并且具有高度传染性的人类α亚科-疱疹病毒。初次感染VZV可导致水痘，人群普遍易感(感染率约为61％～100％)。该病毒可在背根神经节潜伏感染，持续终生。水痘在全世界造成了巨大的疾病负担，每年至少有1.4亿新发水痘病例、420万水痘严重并发症病例以及4200死亡病例。此外，近三分之一的VZV感染者在年老时会因潜伏于神经的VZV重新激活而引起带状疱疹，通常伴有剧烈的神经痛，即使治愈后还会发生后遗神经痛，严重影响患者的生活质量。水痘和带状疱疹还会在新生儿与免疫缺陷人群中导致严重的危及生命的并发症。当前，VZV防治方法仍存在重大挑战，尚无特效治疗药物，且现有疫苗亦存在仍保留神经毒力的风险隐患和适用人群限制等问题。
RNAi(RNA interference)是指由RNA分子介导的基因抑制，RNAi在基因功能研究和疾病治疗方面都有广泛的应用，目前已有多种基于RNAi的药物获得FDA批准或进入临床试验。逐年增加的RNA类药物获批数量充分证明了RNA疗法的可行性，也说明了RNA疗法作为新一代治疗方案正在快速发展当中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs。本发明的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs能够显著抑制水痘-带状疱疹病毒的复制。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs，其特征在于，包括互补的正义链和反义链，所述正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQID NO：27和SEQ ID NO：29所示序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列；所述siRNAs的反义链核苷酸序列为与正义链分别对应的SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30所示序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列的互补序列。
另外，本发明提供了上述抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs在制备抗水痘-带状疱疹病毒基因组DNA组装、复制、细胞融合和/或在细胞间传播的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
进一步地，本发明提供了上述抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs在制备抗水痘-带状疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
本发明以人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)为细胞模型，检测了合成的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs的抗病毒活性，包括：
一、利用合成的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染，利用Stem loop qPCR技术检测siRNAs成熟体表达量；
二、将合成的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染并感染VZV病毒，利用qPCR技术检测siRNAs对靶基因的抑制情况；
三、将合成的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染并感染VZV病毒，利用Western blot、免疫荧光(IF)等实验技术评价si-ORF7、si-ORF68对靶基因的抑制情况。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs能够显著抑制水痘-带状疱疹病毒的复制，且具有功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，RNA药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来调节病毒mRNA表达，显著抑制病毒的复制和细胞间传播，降低病毒载量。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用qPCR技术检测VZV感染的人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)转染siRNA(si-ORF7、si-ORF68)48h后，其在mRNA水平对靶基因的抑制结果图。
图2为本发明实施例2中利用WB技术检测VZV感染的人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)转染siRNA(si-ORF7、si-ORF68)48h后，其在蛋白水平对靶基因的抑制结果图。
图3为本发明实施例2中利用免疫荧光实验技术检测转染siRNA(si-ORF7、si-ORF68)48h后，VZV感染的人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中的病变细胞数量，以评价siRNA的抗病毒效果的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
本发明的抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs包括互补的正义链和反义链，所述正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29所示序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列；所述siRNAs的反义链核苷酸序列为与正义链分别对应的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30所示序列中的一种，或者为与上述正义链核苷酸序列中的一种相似度达90％以上的序列的互补序列。根据VZV基因组(X04370.1)设计序列，委托上海吉玛公司合成普通siRNA。
序列分别为：
si-ORF7：
SEQ ID NO 1：GCUGCAAUUACCCAUUUGU(sense)
SEQ ID NO 2：ACAAAUGGGUAAUUGCAGC(Antisense)
si-ORF9：
SEQ ID NO 3：GGGUUACAUUACCACAGUU(sense)
SEQ ID NO 4：AACUGUGGUAAUGUAACCC(Antisesnse)
si-ORF14:
SEQ ID NO 5：GCCGAAACAUAACUAAAUA(Sense)
SEQ ID NO 6：UAUUUAGUUAUGUUUCGGC(Antisense)
si-ORF21：
SEQ ID NO 7：GCCUUAAAGGAUGCAACAA(Sense)
SEQ ID NO 8：UUGUUGCAUCCUUUAAGGC(Antisense)
si-ORF22：
SEQ ID NO 9：GCAUAUGACAUAUGCGCAU(Sense)
SEQ ID NO 10：AUGCGCAUAUGUCAUAUGC(Antisense)
si-ORF25:
SEQ ID NO 11：GGCGACUGGUAAAUGAUAU(Sense)
SEQ ID NO 12：AUAUCAUUUACCAGUCGCC(Antisense)
si-ORF31：
SEQ ID NO 13：GCCCAGGAAAUGAUUAAAU(Sense)
SEQ ID NO 14：AUUUAAUCAUUUCCUGGGC(Antisense)
si-ORF33：
SEQ ID NO 15：GGUGGAAUGUGGCGUUUAU(Sense)
SEQ ID NO 16：AUAAACGCCACAUUCCACC(Antisense)
si-ORF37:
SEQ ID NO 17：GGGCGAUUAUGGAUAUAAU(Sense)
SEQ ID NO 18：AUUAUAUCCAUAAUCGCCC(Antisese)
si-ORF38：
SEQ ID NO 19：GCGCCUAAAUAUGCUAUAU(Sense)
SEQ ID NO 20：AUAUAGCAUAUUUAGGCGC(Antisense)
si-ORF46:
SEQ ID NO 21：CCUGCGCCGAUUUAAAUAA(Sense)
SEQ ID NO 22：UUAUUUAAAUCGGCGCAGG(Antisense)
si-ORF47:
SEQ ID NO 23：GGGCCUUACUAAAUAUACU(Sense)
SEQ ID NO 24：AGUAUAUUUAGUAAGGCCC(Antisense)
si-ORF56:
SEQ ID NO 25：GACGUUCUUUCGUUAAUAU(Sense)
SEQ ID NO 26：AUAUUAACGAAAGAACGUC(Antisese)
si-ORF60：
SEQ ID NO 27：GCCAUUUGUUUGUCUUUAA(Sense)
SEQ ID NO 28：UUAAAGACAAACAAAUGGC(Antisense)
si-ORF68：
SEQ ID NO 29：GGACCAACCGUGGAUUGUU(Sense)
SEQ ID NO 30：AACAAUCCACGGUUGGUCC(Antisense)
下面以合成的si-ORF7(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)、si-ORF68(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30)为例，具体介绍本发明抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs的作用：
实施例1：si-ORF7、si-ORF68对靶基因(ORF7、ORF68)调控作用
1.qPCR检测靶基因的敲低效果
(1)siRNAs转染及病毒感染
将人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)以1×105接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM/F12，将si-ORF7、si-ORF68加入到一定量的空白DMEM/F12培养基中，转染试剂lipo2000也加入到一定量的空白DMEM/F12培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM/F12孵育物加入到si-ORF7、si-ORF68与DMEM/F12孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的12孔板中，si-ORF7、si-ORF68终浓度为10nM，转染6h后换液为2％FBS DMEM/F12培养基并以一定的感染复数(MOI＝0.3)感染VZV病毒。
(2)RNA提取
RNA提取说明书提取RNA，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
(3)qPCR检测靶基因(ORF7、ORF68)表达
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃，具体过程如下：
a:gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
表1 Real time qPCR gDNA消化反应体系
b:逆转录反应体系配制(20μL体系)
表2 Real time qPCR cDNA逆转录反应体系
取上述已反转录好的cDNA，稀释5倍，以GAPDH为内参，利用qPCR方法检测细胞内靶基因(ORF7、ORF68)表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃50s。所使用的引物序列如下：
表10 si-ORF7、si-ORF68 qPCR引物
图1是本实施例中利用qPCR技术检测检测si-ORF7和si-ORF68对水痘-带状疱疹病毒(VZV)靶基因的敲低作用(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，*P<0.05,**P<0.01，**P<0.001,****P<0.0001)。与空白对照组Blank相比，si-ORF7和si-ORF68能够显著抑制靶基因的表达。
实施例2：si-ORF7、si-ORF68抗病毒效果评价
1.WB检测siRNAs抗病毒效果
(1)siRNAs转染及病毒感染
将人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)以2×105接种到6孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为空白DMEM/F12，将si-ORF7、si-ORF68加入到一定量的空白DMEM/F12培养基中，转染试剂lipo2000加入到一定量的空白DMEM/F12培养基中各自孵育5min，然后将lipo2000与DMEM/F12孵育物加入到si-ORF7、si-ORF68与DMEM/F12孵育物中，混匀静置20min，然后将孵育物加入到对应的6孔板中，si-ORF7、si-ORF68终浓度为10nM，转染6h后换液为2％FBS DMEM/F12培养基并以一定的感染复数(MOI＝0.3)感染VZV病毒。
(2)蛋白提取
48h后，弃掉6孔板中的培养基，DPBS洗一遍，加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解30min，用细胞刮将细胞刮下来加入到1.5mL EP管中，在日立离心机上离心(12000rpm,15min,4℃)，将上清转移至新准备的EP管中，利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将蛋白定量加入loading buffer煮沸10min后，在10％的分离胶的蛋白胶中每个泳道加入30μg蛋白进行电泳(70V，30min；120V，1.3h)、PVDF膜转膜(200mA,2h)。将膜转移到3％BSA(TBST)封闭液中封闭1h，随后移除3％BSA，加入一抗gE(TBST稀释，1：3000，Abcam)4℃摇床过夜，第二天回收gE一抗，TBST洗三遍，加入内参GAPDH一抗(TBST稀释，1：10000，CST)4℃摇床过夜，第二天回收GAPDH一抗，TBST洗三遍，加入含有绿色荧光二抗鼠抗(TBST稀释，1：10000，CST)室温摇床孵育1h，TBST洗三遍，利用奥德赛成像仪进行扫膜(如图2)。
图2是本实施例中利用Western blot技术检测si-ORF7和si-ORF68对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白(gE)表达影响。如图所示，与空白对照Blank相比，si-ORF7和si-ORF68能够显著抑制VZV糖蛋白gE的表达，表明si-ORF7和si-ORF68能够显著抑制病毒粒子的形成，具有显著的抗病毒活性。
2.免疫荧光(IF)实验评价siRNAs抗病毒效果
(1)siRNAs转染及病毒感染
将人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)以1×105/孔接种到12孔板中，待细胞贴壁展开后按照脂质体转染试剂lipo2000说明书进行细胞转染，siRNAs终浓度为10nM。转染6h后换液为2％FBS DMEM/F12培养基并以一定的感染复数(MOI＝0.3)感染VZV病毒。
(2)免疫荧光染色
48h后，弃掉12孔板中的培养基，DPBS洗2遍，加入4％多聚甲醛固定30min，DPBS洗2遍，加入0.5％Triton-X100室温破膜10min，DPBS洗2遍，加入3％BSA封闭30min(现配现用)，DPBS洗2遍，加入VZV gE一抗(1：100，Abcam)4℃过夜，第二天DPBS洗5遍，加入cy5标记的鼠源二抗(1：500，CST)室温避光孵育1h，弃去二抗，DPBS洗5遍，加入细胞核染料DAPI(1：10000)室温孵育5min，弃去染料，DPBS洗5遍，利用荧光倒置显微镜进行观察拍照(如图3)。
图3是本实施例中利用免疫荧光技术(IF)检测si-ORF7和si-ORF68对水痘-带状疱疹病毒荧光数量的影响。如图所示，与空白对照Blank相比，si-ORF7和si-ORF68能够显著降低荧光数量，表明si-ORF7和si-ORF68能够显著抑制病毒粒子形成，具有显著的抗病毒活性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北工业大学
<120> 一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcugcaauua cccauuugu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaaugggu aauugcagc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggguuacauu accacaguu 19
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacuguggua auguaacc 18
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgaaacau aacuaaaua 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uauuuaguua uguuucggc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccuuaaagg augcaacaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uuguugcauc cuuuaaggc 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcauaugaca uaugcgcau 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
augcgcauau gucauaugc 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgacuggu aaaugauau 19
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<211> 19
<212> RNA
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auaucauuua ccagucgcc 19
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gcccaggaaa ugauuaaau 19
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<211> 19
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auuuaaucau uuccugggc 19
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gguggaaugu ggcguuuau 19
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gggcgauuau ggauauaau 19
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<400> 18
auuauaucca uaaucgccc 19
<210> 19
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<212> RNA
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gcgccuaaau augcuauau 19
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<212> RNA
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ccugcgccga uuuaaauaa 19
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<212> RNA
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gggccuuacu aaauauacu 19
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aguauauuua guaaggccc 19
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<212> RNA
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<400> 25
gacguucuuu cguuaauau 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
auauuaacga aagaacguc 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gccauuuguu ugucuuuaa 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
uuaaagacaa acaaauggc 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggaccaaccg uggauuguu 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacaauccac gguuggucc 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cctctgactt caacagcgac 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcctcttgtg ctcttgctgg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tggggtcgtt gctaaacctc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcttgcgtct gttttggggt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggggtgtata atcagggccg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgaatcggt gcgcgtaaag 20
Claims (2)
1.一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNA，其特征在于，包括互补的正义链和反义链，所述正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：29；所述siRNAs的反义链核苷酸序列为与正义链分别对应的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：30。
2.一种如权利要求1所述抗水痘-带状疱疹病毒的siRNA在制备抗水痘-带状疱疹病毒基因组DNA组装、复制、细胞融合和/或在细胞间传播的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110917240.8A CN113755494B (zh) | 2021-08-11 | 2021-08-11 | 一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110917240.8A CN113755494B (zh) | 2021-08-11 | 2021-08-11 | 一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用 |
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Citations (3)
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| US6528066B1 (en) * | 1999-09-14 | 2003-03-04 | University Of Iowa Research Foundation | Variant varicella-zoster viruses and methods of use |
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Patent Citations (3)
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| 胡妙凤 ; 尚世强 ; .RNA干扰对疱疹病毒的抑制作用.国际流行病学传染病学杂志.2006,(06),第402-405页. * |
Also Published As
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