CN109503719A

CN109503719A - 一种plg和crd功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物

Info

Publication number: CN109503719A
Application number: CN201811358119.0A
Authority: CN
Inventors: 高晓鸽; 郑骏年; 姚宏; 刘相叶; 蒋品
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Shandong Quangang Pharmaceutical Co ltd; Suzhou Three Billion Intellectual Property Service Co ltd
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2038-11-15
Also published as: CN109503719B

Abstract

本发明公开了一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物。本发明提供的融合蛋白包括：能够抑制肿瘤血管生成的人血纤维蛋白溶酶原的功能片段，识别肿瘤细胞表面糖基配体的半乳糖凝集素蛋白的糖基识别结合结构域，和刚性或柔性连接肽。本发明所述融合蛋白一方面增强了其抑制肿瘤血管生成的能力；另一方面能增强了对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，具有更好的抗肿瘤活性。本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法和应用药物。

Description

一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物

技术领域

本发明属于重组融合蛋白领域，特别涉及一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物。

技术背景

肿瘤血管生成是肿瘤生长、转移和复发的先决条件。当肿瘤体积超过2-3mm³时局部缺血缺氧，刺激肿瘤新生血管的形成。新生血管不仅可以给肿瘤细胞提供营养，降解对肿瘤细胞生长不利的代谢产物，也为肿瘤细胞的血行转移提供了条件。因此，靶向肿瘤血管的生成是目前癌症治疗的重要策略。目前已临床应用的抗肿瘤血管生成药物主要有单抗类、竞争性受体类、小分子激酶抑制剂、天然产物及其衍生物等。

人血纤维蛋白溶酶原(plasminogen，简称PLG)是人血纤维蛋白溶酶的前体，其N端包括5个通过二硫键连接的联环区结构(kringle)，第一到第四个kringle可以在内源性基质酶的作用下降解为血管抑素(angiostatin)。有研究发现，重组PLG的第五个kringle(PK5)结构域能够抑制血管内皮细胞的增殖，迁移，诱导内皮细胞凋亡，具有更强的抗血管生成活性，是目前分子量最小，活性最稳定的内源性血管增生抑制因子。但是PK5对肿瘤细胞的直接杀伤能力有限。

半乳糖凝集素-3属于特异性识别β-半乳糖残基的半乳糖凝集素家族，也是唯一的嵌合型半乳糖凝集素，主要由N-端一段与胶原蛋白序列同源的肽链和C-端的一个糖基识别结合结构域(Carbohydrate-recognition domain,简称CRD)组成。半乳糖凝集素-3广泛分布在细胞外、细胞膜、细胞质及细胞核中。半乳糖凝集素-3与糖基配体结合后通过N端的肽链的相互作用形成五聚体，进而介导细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用和信号传递，对肿瘤细胞的抗凋亡、免疫逃逸和血管生成起促进作用。此外，有研究报道，半乳糖凝集素-3用胶原酶水解分离得到CRD片段能够抑制乳腺癌原位肿瘤的生长和转移，与化疗药物联合使用能抑制多发性骨髓瘤的生长。单独CRD片段的抗肿瘤机理可能是竞争性抑制内源性半乳糖凝集素-3的功能。

蛋白多肽类药物是目前抗肿瘤药物研发的热点之一，与以往小分子药物相比，蛋白多肽类药物具有活性高、特异性强、毒性低，生物相容性好，有利于临床应用的特点。融合蛋白是将具有不同功能的蛋白片段通过连接肽融合表达，提高重组蛋白的靶向性和生物活性，也是目前重组蛋白质类药物的研发途径之一。

发明内容

本发明将具有抗血管生成作用的PK5和具有识别并结合细胞表面糖基配体功能的CRD通过刚性连接肽(Rigid linker，简称RL)或柔性连接肽(Flexible linker，简称FL)连接组成重组融合蛋白PK5-RL/FL-CRD，一方面增强对血管内皮细胞的杀伤能力，抑制肿瘤血管生成；另一方面能够增强融合蛋白对肿瘤细胞的识别和靶向性，提高对肿瘤细胞的杀伤能力；融合蛋白的双靶向性具有更好的抗肿瘤效果。此外，还提供了重组融合蛋白原核表达载体的制备和蛋白纯化，融合蛋白的体外抗血管生成和抑制肿瘤增殖功能，以及药物组合和体内抗肿瘤功能。

本发明技术方案如下：

一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段通过连接肽与半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段结合。

进一步的，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段起始于人血纤维蛋白溶酶原第481位氨基酸，含端点，终于人血纤维蛋白溶酶原第560位氨基酸，具体氨基酸序列为：SEQ.NO.1。

进一步的，所述半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段起始于半乳糖凝集素-3第107位氨基酸，含端点，终于半乳糖凝集素-3第250位氨基酸，具体氨基酸序列为：SEQ.NO.2，或具有序列和功能同源性的其它半乳糖凝集素的CRD结构域。

进一步的，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段的羧基端与连接肽的氨基端相连，半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段的氨基端与连接肽的羧基端相连。

可替换的，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段的氨基端与连接肽的羧基端相连，半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段的羧基端与连接肽的氨基端相连。

进一步的，所述连接肽是柔性连接肽或刚性连接肽。

进一步的，所述连接肽的氨基酸序列为：SEQ.NO.3或SEQ.NO.4。

所述PLG和CRD功能片段重组融合蛋白的制备方法，首先，将融合蛋白的表达基因克隆于pET-22b(+)表达载体，得到重组的表达质粒，然后，将表达质粒转化到原核细胞中诱导表达，并对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化；最后，收集细菌，超声破碎裂解得到包含融合蛋白的上清，利用乳糖层析柱进行纯化后，得到不含标签、纯度大于95％的可溶性重组融合蛋白。

一种抗癌药物，包括上述PLG和CRD功能片段重组融合蛋白。以融合蛋白作为活性成分，与药学上可接受的载体组合。所述药学上可接受的载体选自:溶剂、稀释剂、悬浮剂、乳化剂、抗氧化剂、药学防腐剂、着色剂、香味剂、介质、油性基底、赋形剂中的一种或几种。融合蛋白与上述所述任一药学上可接受的载体组成药物组合，并用于治疗癌症疾病。所述癌症疾病包括肝癌，胃癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌，乳腺癌，宫颈癌、脑胶质瘤、白血病等。

进一步的，所述抗癌药物为静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、口服、舌下给药或喷雾药物中的任意一种。

作为本发明所述的融合蛋白通过基因工程手段将融合蛋白的编码基因克隆到腺病毒载体上，以重组溶瘤腺病毒病毒的方式用于治疗癌症疾病，本发明所述的融合蛋白以蛋白的形式可通过各种途径用于治疗癌症疾病，给药途径包括但不限于静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、口服、舌下给药、喷雾等。

附图说明

附图1是pET-22b(+)载体质粒。

附图2是SDS-PAGE蛋白电泳图，纯化后的rPK5，rCRD，rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD四种蛋白，经SDS-PAGE蛋白电泳后，进行考马斯亮蓝染色。泳道1为蛋白Marker；泳道2-5分别为纯化后的rPK5，rCRD，rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD。4种蛋白纯度达95％以上。

附图3是为rPK5，rCRD，rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD抑制HUVEC细胞体外成管能力对比试验图，其说明与rPK5和rCRD相比，融合蛋白rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD增加了对肿瘤血管生成的抑制能力。

附图4是为rPK5，rCRD，rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD抑制HUVEC细胞体外成管能力对比统计图，其说明与rPK5和rCRD相比，融合蛋白rPK5-RL-CRD和rPK5-FL-CRD增加了对肿瘤血管生成的抑制能力。

附图5是MTT法测定融合蛋白对细胞增殖的抑制作用，其中图5A为融合蛋白对HepG2细胞增殖的影响；图5B为融合蛋白对Hep3B细胞增殖的影响，表明融合蛋白对两种细胞均有更强的细胞增殖抑制作用。

附图6是融合蛋白对小鼠原位肝癌的治疗效果，表明融合蛋白对小鼠肝癌具有明显的抑制作用。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明提供的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1:

SEQ.NO1.的功能片段

人血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)，简称PLG。

SEQ.NO1的蛋白是起始于人血纤维蛋白溶酶原第481位氨基酸，含端点，终于人血纤维蛋白溶酶原第560位氨基酸的功能片段，其简称为PK5(Plasmingen Kringle 5)。是一种内源性血管生成抑制剂，能够抑制血管内皮细胞增殖、迁移，诱导内皮细胞凋亡。

SEQ.NO.1氨基酸序列来自于NCBI：AAA60113，其氨基酸序列和DNA编码序列SEQ.NO.5。

实施例2:

SEQ.NO.2的功能片段

半乳凝集素-3(Galectin-3)，简称Gal-3。

SEQ.NO.2的蛋白是起始于半乳凝集素-3第107位氨基酸，含端点，终于半乳凝集素-3第250位氨基酸的功能片段，其简称为CRD(Carbohydrate Recognition Domain)，CRD能够抑制乳腺癌。

SEQ.NO.2氨基酸序列来自于NCBI：BAA22164，其氨基酸序列和DNA编码序列SEQ.NO.6。

实施例3:

SEQ.NO.3是刚性连接肽，由12个氨基酸组成的基本单元或1-4个重复单元组成，基本单元DNA序列为SEQ.NO.7，最大程度保证两端蛋白的正确折叠和装配，保证蛋白功能的正常发挥。

SEQ.NO.4是柔性连接肽，由14个氨基酸组成的基本单元或1-4个重复单元组成，基本单元DNA序列为SEQ.NO.8，最大程度保证两端蛋白的正确折叠和装配，保证蛋白功能的正常发挥。

实施例4:

(1)重组质粒pET22b-PK5的构建:

由苏州金唯智生物科技公司人工合成PK5基因，根据pET22b质粒的酶切位点，在PK5基因两端分别引入限制性内切酶NdeI和XhoI的酶切位点；将载体pET22b用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，离心后加入2μl去磷酸化酶，37℃水浴3小时，切胶回收载体。然后把PK5基因片段与经NdeI和XhoI酶切后的pET22b载体用T4连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒。

将获得的重组质粒转化至大肠杄菌DH5α感受态细胞，具体方法为:将10μl的连接产物与50μl的大肠杄菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰浴3分钟，然后加入500μl LB培养基中，于37℃摇床中孵育45分钟，涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性培养平板进行筛选，37℃培养12-16小时。将筛选得到的阳性克隆转至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，提取质粒交由金唯智生物科技公司进行测序，将含有PK5基因的pET22b重组质粒命名为pET22b-PK5。

(2)重组质粒pET22b-CRD的构建:

由苏州金唯智生物科技公司人工合成CRD基因，根据pET22b质粒的酶切位点，在CRD基因两端分别引入限制性内切酶NdeI和BamHI的酶切位点；将载体pET22b用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，离心后加入2μl去磷酸化酶，37℃水浴3小时，切胶回收载体。然后把CRD基因片段与经NdeI和BamHI酶切后的pET22b载体用T4连接酶16℃连接过夜，得重组质粒。

将获得的重组质粒转化至大肠杄菌DH5α感受态细胞，具体斱法为:将10μl的连接产物与50μl的大肠杄菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰浴3分钟，然后加入500μl LB培养基中，于37℃摇床中孵育45分钟，涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性培养平板进行筛选，37℃培养12-16小时。将筛选得到的阳性克隆转至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，提取质粒交由金唯智生物科技公司进行测序，将含有CRD基因的pET22b重组质粒命名为pET22b-CRD。

(3)重组质粒pET22b-PK5-RL/FL-CRD的构建，两种连接肽相应氨基酸序列为:

RL为SEQ.NO.3:

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

FL为SEQ.NO.4:

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

由苏州金唯智生物科技公司人工合成PK5-RL/FL-CRD基因，根据pET22b质粒的酶切位点，在PK5-RL/FL-CRD基因两端分别引入限制性内切酶NdeI和BamHI的酶切位点；将载体pET22b用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，离心后加入2μl去磷酸化酶，37℃水浴3小时，切胶回收载体。然后把PK5-RL/FL-CRD基因片段与经NdeI和BamHI酶切后的pET22b载体用T4连接酶16℃连接过夜，得重组质粒。

将获得的重组载体转化至大肠杄菌DH5α感受态细胞，具体斱法为:将10μl的连接产物与50μl的大肠杄菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰浴3分钟，然后加入500μl LB培养基中，于37℃摇床中孵育45分钟，涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性培养平板进行筛选，37℃培养12-16小时。将筛选得到的阳性克隆转至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，提取质粒交由金唯智生物科技公司进行测序，将含有PK5-RL/FL-CRD基因的pET22b重组质粒命名为PK5-RL/FL-CRD。

(4)重组PK5-RL/FL-CRD融合蛋白的原核表达和纯化:

提取步骤(3)中含有pET22b-PK5-RL/FL-CRD的大肠杄菌DH5α中的质粒，按照常规方法转化到表达型大肠杄菌BL21(DE3)中。将空载体对照和含有重组载体的菌液在含氨苄青霉素抗性的LB培养基中37℃培养至OD600达0.6-1.0之间，加入终浓度为0.4mM IPTG 25℃诱导表达蛋白12-16小时。离心收集细菌，超声破碎菌液后，12000g，30分钟离心，收集所得上清液即为含有重组PK5-RL/FL-CRD蛋白的粗产物。

取相应体积的lactosyl-α-agarose胶粒(每1L菌液使用2ml胶粒)与上述蛋白粗产物混匀，4℃结合2小时，然后装入亲和层析柱中。用10倍柱体积的平衡液和2倍柱体积的PBS清洗杂蛋白质，最后用洗脱缓冲液(200mM乳糖)洗脱并收集目的蛋白。

实施例5:

融合蛋白对血管形成的影响

实验前一天将基质胶、48孔板及200μl枪头放入4℃冰箱，使胶过夜缓慢融化。开始实验前，将基质胶始终保持放于冰盒内。取预冷好的48孔板及枪头，每孔加入100μl基质胶，使其均匀覆盖孔底，置于37℃培养箱30分钟使其凝固。将进入对数生长期的HUVEC细胞用PBS洗1次，以0.25％胰蛋白酶37℃消化2分钟，加入含血清的1640培养液吹打混匀，离心后用EGM培养基重悬，进行细胞计数，取5个1.5ml的EP管，每管加入4.5×10⁴个细胞，340g离心5分钟，吸去上清，分别加入200μl的EGM培养基或者使用EGM培养基配制的Endostatin(N端25个氨基酸)、rPK5、rCRD、rPK5-linker-CRD(浓度为2μM)，与细胞混匀后加入包被好基质胶的板孔中，3-8小时之间观察成管情况，并进行拍照、统计。

实施例6:

融合蛋白对肿瘤细胞增殖活性的影响

将进入对数生长期的HepG2、Hep3B细胞用PBS洗1次，以0.25％胰蛋白酶37℃消化1分钟，用DMEM培养基吹打混匀，进行细胞计数，将细胞接种于96孔平底型培养板中，细胞密度为3×10³个/孔，每孔体积为100μl。置于37℃培养箱中孵育24小时使其贴壁。吸去各孔培养基，按分组加入rPK5、rCRD、rPK5-RL/FL-CRD，每组做5个平行对照孔，置于37℃培养箱中继续培养，于24小时重复加药一次，48小时后终止反应，每孔加入MTT 10μl，置于37℃培养箱中孵育1-4小时，加入50μl DMSO终止反应；酶标仪上550nm波长下测定各孔吸光度值。

实施例7:

真核表达质粒EEV-PK5-RL/FL-CRD的构建:

两种连接肽相应氨基酸序列为:

RL为SEQ.NO.3:

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

FL为SEQ.NO.4:

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

由苏州金唯智生物科技公司人工合成带有分泌信号肽IgK的PK5-RL/FL-CRD基因，根据EEV604A质粒的酶切位点，在IgK-PK5-RL/FL-CRD基因两端分别引入限制性内切酶EcoRI和XhoI的酶切位点；将SBI公司的真核表达载体(CAGs-GFP-T2A-Luciferase-Enhanced Episomal Vector，简称EEV)用限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切，离心后加入2μl去磷酸化酶，37℃水浴3小时，切胶回收载体。然后把PK5-RL/FL-CRD基因片段与经EcoRI和XhoI酶切后的EEV604A载体用T4连接酶16℃连接过夜，得重组质粒。

将获得的重组质粒转化至大肠杄菌DH5α感受态细胞，具体方法为:将10μl的连接产物与50μl的大肠杄菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰浴3分钟，然后加入500μl LB培养基中，于37℃摇床中孵育45分钟，涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性培养平板进行筛选，37℃培养12-16小时。将筛选得到的阳性克隆转至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，提取质粒交由金唯智生物科技公司进行测序，将含有PK5-RL/FL-CRD基因的重组质粒命名为EEV-PK5-RL/FL-CRD。

实施例8:

融合蛋白对动物原位肿瘤的治疗

将ML-1细胞原位接种于Balb/c小鼠肝左叶上((2×10⁶个细胞)，4天后，将重组质粒EEV-PK5-RL/FL-CRD(100μg)与纳米载体H1混合腹腔注射于Balb/c小鼠体内，每周一次，共四次，末次注射10天后处死小鼠，取肿瘤组织，称重。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前体下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物

<130> 201810251

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> Plasmingen Kringle 5

<400> 1

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

1 5 10 15

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

20 25 30

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

35 40 45

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

50 55 60

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

65 70 75 80

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> Carbohydrate Recognition Domain

<400> 2

Tyr Gly Ala Pro Ala Gly Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu

1 5 10 15

Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val

20 25 30

Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp

35 40 45

Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val

50 55 60

Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg

65 70 75 80

Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val

85 90 95

Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu

100 105 110

Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu

115 120 125

Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile

130 135 140

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成(artificial)

<400> 3

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成(artificial)

<400> 4

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 240

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 60

ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 120

aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 180

ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 240

<210> 6

<211> 432

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

tatggcgccc ctgctgggcc actgattgtg ccttataacc tgcctttgcc tgggggagtg 60

gtgcctcgca tgctgataac aattctgggc acggtgaagc ccaatgcaaa cagaattgct 120

ttagatttcc aaagagggaa tgatgttgcc ttccacttta acccacgctt caatgagaac 180

aacaggagag tcattgtttg caatacaaag ctggataata actggggaag ggaagaaaga 240

cagtcggttt tcccatttga aagtgggaaa ccattcaaaa tacaagtact ggttgaacct 300

gaccacttca aggttgcagt gaatgatgct cacttgttgc agtacaatca tcgggttaaa 360

aaactcaatg aaatcagcaa actgggaatt tctggtgaca tagacctcac cagtgcttca 420

tataccatga ta 432

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成(artificial)

<400> 7

gccgaagccg ccgccaaaga agccgccgcc aaagcc 36

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(artificial)

<400> 8

gaaggtaaat ctagcggctc tggttccgaa tccaaatcta cc 42

Claims

1.一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段通过连接肽与半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段结合。

2.根据权利要求1所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段起始于人血纤维蛋白溶酶原第481位氨基酸，含端点，终于人血纤维蛋白溶酶原第560位氨基酸，具体氨基酸序列为：SEQ.NO.1。

3.根据权利要求2所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段起始于半乳糖凝集素-3第107位氨基酸，含端点，终于半乳糖凝集素-3第250位氨基酸，具体氨基酸序列为：SEQ.NO.2。

4.根据权利要求3所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段的羧基端与连接肽的氨基端相连，半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段的氨基端与连接肽的羧基端相连。

5.根据权利要求3所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段的氨基端与连接肽的羧基端相连，半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段的羧基端与连接肽的氨基端相连。

6.根据权利要求1至5中任意一条所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述连接肽是柔性连接肽或刚性连接肽。

7.根据权利要求6所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为：SEQ.NO.3或SEQ.NO.4。

8.一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，首先，将融合蛋白的表达基因克隆于pET-22b(+)表达载体，得到重组的表达质粒，然后，将表达质粒转化到原核细胞中诱导表达，并对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化；最后，收集细菌，超声破碎裂解得到包含融合蛋白的上清，利用乳糖层析柱进行纯化后，得到不含标签、纯度大于95％的权利要求1所述的可溶性PLG和CRD功能片段重组融合蛋白。

9.一种抗癌药物，其特征在于，包括权利要求1所述的PLG和CRD功能片段重组融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的抗癌药物，其特征在于，所述抗癌药物为静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、口服、舌下给药或喷雾药物中的任意一种。