ES2381014T3

ES2381014T3 - Proteína quimérica inhibidora de la angiogénesis y el uso

Info

Publication number: ES2381014T3
Application number: ES05752254T
Authority: ES
Inventors: Zheng Liu
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2012-05-22
Anticipated expiration: 2025-06-08
Also published as: EP1767546B1; RU2355414C2; CA2569108A1; JP2008503243A; RU2006146995A; US20080206238A1; KR20070029204A; EP1767546A4; KR100897379B1; DK1767546T3; US7750138B2; PT1767546E; JP4680997B2; ATE548384T1; PL1767546T3; BRPI0512286B8; BRPI0512286B1; EP1767546A1; US20100215655A1; WO2005121176A1

Abstract

Una proteína quimérica que comprende diferentes fragmentos de los receptores de VEGF, FLT-1 y KDR, caracterizada porque la proteína quimérica consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, los dominios 3º y 4º de tipo Ig de KDR y Fc de inmunoglobulina humana, designándose la proteína quimérica como FLTd2KDRd3, 4-Fc.

Description

Proteína quimérica inhibidora de la angiogénesis y el uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la tecnología de ingeniería genética, más específicamente a secuencias de ADN que codifican para proteínas quiméricas recombinantes inhibidoras de la angiogénesis, a las proteínas quiméricas codificadas del presente documento, a aplicaciones terapéuticas de las mismas y a composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas quiméricas.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes. La mayor parte del sistema vascular adulto es quiescente, sólo se produce angiogénesis en algunos mecanismos fisiológicos y patológicos, tales como tumor, retinopatías diabéticas, artritis, órganos anémicos, hiperplasia del endometrio, etc. La angiogénesis desempeña papeles clave en el crecimiento rápido de células tumorales durante el desarrollo tumoral (Hanahan y Folkman: Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86:353-364). Estudios de modelos de cáncer con animales y ensayos clínicos con seres humanos ya han demostrado que la inhibición de la angiogénesis tumoral pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento y el desarrollo tumorales, por tanto prolongar la vida del paciente. La angiogénesis está mediada y regulada por muchos factores biológicos. Las células principales que median la angiogénesis son células endoteliales vasculares que forman la pared interna de los vasos sanguíneos. Diversos factores de crecimiento pueden unirse a receptores relevantes en la superficie de las células endoteliales vasculares, regular procesos celulares a través de la transducción de señales intracelulares, y por tanto mediar la angiogénesis.

Entre diversos factores de crecimiento, VEGF (factor de crecimiento de células endoteliales vasculares) es el factor angiogénico más importante (Ferrara: VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor, Nat. Rev. Cancer, 2002,

10: 795-803; Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl.): 10-14). VEGF podría secretarse por muchos tipos de células, pero a menudo se sobreexpresa en células tumorales. VEGF funciona mediante la unión a a receptores apropiados. Existen principalmente dos tipos de receptores de VEGF: FLT-1 (tirosina cinasa de tipo fms) y KDR. En cuanto a las estructuras moleculares, estos dos receptores consisten ambos en tres regiones funcionales diferentes: la primera región es la región extracelular, que consiste en siete dominios de tipo inmunoglobulina (de tipo Ig) (d1d7), que tiene afinidad específica por VEGF, y es la región clave para la unión a VEGF; la segunda región es la región transmembrana que contiene residuos de aminoácidos hidrófobos; la tercera región es el dominio intracelular que contiene un grupo con funcionamiento de tirosina quinasa, que se fosforila después de que se activa el receptor por VEGF, desencadenando la transducción de señales intracelulares, que conduce a efectos funcionales de células endoteliales y angiogénesis.

FLT-1 y KDR se distribuyen principalmente en las células endoteliales vasculares. Por tanto, la actividad mediadora de VEGF en células endoteliales vasculares es altamente específica. VEGF promueve diferenciaciones de células endoteliales, guía las migraciones de células endoteliales, inhibe la apoptosis, induce cambios morfológicos vasculares, y es un factor proangiogénico altamente eficaz.

El nivel de expresión de VEGF en tejidos tumorales es superior a aquél en los tejidos normales. Además, el crecimiento rápido de células tumorales conduce a menudo a hipoxia dentro del tumor, y la hipoxia induce además la expresión de VEGF. Por tanto, VEGF es el factor clave que promueve la angiogénesis tumoral. Muchos estudios con animales han mostrado que inhibiendo la unión a VEGF a sus receptores pudo inhibirse de manera eficaz la angiogénesis tumoral, y por tanto inhibir el crecimiento tumoral. En otras enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como retinopatías diabéticas y artritis, etc., VEGF también está implicado estrechamente en el desarrollo de estas enfermedades (Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin. Oncol. 2002, 29 (6 supl.): 10-14).

Debido a los papeles críticos de VEGF en cánceres y otras enfermedades, las proteínas o químicos que inhiben específicamente VEGF tienen potenciales terapéuticos. Por ejemplo, estudios han mostrado que el anticuerpo neutralizante contra VEGF pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento tumoral (Jain: Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl.): 3-9). Por tanto, el desarrollo de inhibidores de VEGF eficaces novedosos es importante en investigación clínica. Puesto que FLT-1 y KDR son elementos de unión naturales de VEGF, hubo estudios que investigaron los papeles antiangiogénicos del FLT-1 soluble (el dominio extracelular de FLT-1) y el KDR soluble (el dominio extracelular de KDR) (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023). El FLT-1 soluble pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento de células endoteliales vasculares in vitro, pero tiene una corta semivida sérica y no puede alcanzar una concentración sérica eficaz. De manera similar, el KDR soluble también pudo inhibir el crecimiento de células endoteliales vasculares in vitro, pero su actividad antitumoral en modelos con animales no fue satisfactoria (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023).

La patente estadounidense n.º 6.100.071 da a conocer proteínas receptoras de VEGF quiméricas que comprenden secuencias derivadas de los receptores flt-1 y KDR. La publicación de patente internacional n.º WO 00/75319 da a conocer polipéptidos quiméricos modificados del receptor Flt-1. Shinkai et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273(47), págs. 31283-31288) dan a conocer mutantes de deleción del receptor KDR y examinan las afinidades de unión de estos mutantes para VEGF. Ninguno de estos documentos da a conocer proteínas quiméricas tal como se reivindica actualmente.

Para superar las deficiencias de la técnica anterior, la presente invención proporciona proteínas quiméricas novedosas que contienen diferentes fragmentos de FLT-1 y KDR para bloquear de manera eficaz la actividad biológica de VEGF e inhibir la angiogénesis.

Sumario de invención

La invención proporciona proteínas quiméricas recombinantes novedosas que bloquean la actividad biológica de VEGF e inhiben la angiogénesis, secuencias de ADN que codifican para las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente, y vectores que contienen las secuencias de ADN codificantes de las proteínas quiméricas y huéspedes recombinantes de los mismos, tal como se reivindica en el presente documento.

La invención también proporciona el uso de las proteínas quiméricas en la preparación de medicamentos que bloquean la actividad de VEGF e inhiben la angiogénesis, y composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas quiméricas y vehículos médicos apropiados, así como aplicaciones terapéuticas de la composición médica, tal como se reivindica en el presente documento.

Los puntos clave de la invención son diseñar y construir una serie de proteínas quiméricas con diferentes fragmentos de FLT-1 o KDR, que contienen Fc de inmunoglobulina humana (en la figura 1 se muestra el método de construcción preferido), y entonces seleccionar la proteína quimérica con alta afinidad para VEGF usando ensayos incluyendo el ensayo de unión a VEGF, y finalmente obtener el inhibidor de VEGF apropiado. La construcción de la proteína quimérica se basa preferiblemente en las tecnologías de clonación molecular convencionales. Podría encontrarse la metodología experimental detallada en manuales de laboratorio tales como Molecular Cloning, la 2ª o la 3ª edición (Joseph Sambrook).

Las proteínas quiméricas que pueden prepararse a través de tecnología de ADN recombinante para contener diferentes fragmentos de los receptores de VEGF, FLT-1 y KDR, incluyen los siguientes grupos:

a.: Que consiste en el 1er dominio de tipo Ig de KDR, el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1 y el 3er dominio de tipo Ig de KDR, designado como KDRd1-FLTd2-KDRd3;

b.: Que consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1 y los dominios 3º y 4º de tipo Ig de KDR, designado como FLTd2-KDRd3,4;

c.: Que consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR y el 4º dominio de tipo Ig de FLT-1, designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4;

d.: Que consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1 y los dominios 3º, 4º y 5º de tipo Ig de KDR, designado como FLTd2-KDRd3,4,5;

e.: Que consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR y los dominios 4º y 5º de tipo Ig de FLT-1, designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5.

La secuencia de aminoácidos de FLTd2 se muestra como SEQ ID NO.1. La secuencia de aminoácidos de FLTd4 se muestra como SEQ ID NO.2. La secuencia de aminoácidos de KDRd1 se muestra como SEQ ID NO.3. La secuencia de aminoácidos de KDRd3 se muestra como SEQ ID NO.4. La secuencia de aminoácidos de KDRd4 se muestra como SEQ ID NO.5.

Tal como se usa en el presente documento, FLT se refiere a la secuencia de FLT-1, KDR se refiere a la secuencia de KDR; di se refiere al dominio de tipo Ig de orden i en FLT-1 o KDR.

Las proteínas quiméricas contienen ventajosamente Fc de inmunoglobulina humana, e incluyen los siguientes grupos:

FP2’ designada como KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc;

FP3’ designada como FLTd2-KDRd3,4-Fc;

FP4’ designada como FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc;

FP5’ designada como FLTd2-KDRd3,4,5-Fc; FP6’ designada como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc.

Tal como se usa en el presente documento, Fc se refiere al fragmento Fc de inmunoglobulina humana derivado de FC de inmunoglobulina humana tal como IgG, IgM e IgA, o las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La región Fc puede ser la secuencia de Fc de longitud completa o un fragmento de la secuencia de Fc de CH2, CH3, o la región bisagra.

Tal como se muestra en la figura 1, la proteína quimérica conocida en la técnica anterior (designada como FP1’) consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1 (FLTd2), el 3er dominio de tipo Ig de KDR (KDRd3) y el Fc de inmunoglobulina humana. La proteína quimérica FP2’ proporcionada en la invención tiene una secuencia de aminoácidos añadida del 1er dominio de tipo Ig de KDR (KDRd1) en FP1’, que aumenta los sitios de unión para VEGF y potencia la afinidad para VEGF. Las proteínas quiméricas FP3’ y FP4’ tienen secuencias añadidas del 4º dominio de tipo Ig de KDR (KDRd4) o el 4º dominio de tipo Ig de FLT-1 (FLTd4) basado en FP1’, respectivamente. FP5’ y FP6’ tienen añadido los dominios 4º y 5º de tipo Ig de KDR (KDRd4,5) y los dominios 4º y 5º de tipo Ig de FLT-1 (FLT1-d4,5) basado en FP1’, respectivamente. Estas secuencias añadidas pudieron ayudar a la dimerización de las proteínas quiméricas, plegando estructuras tridimensionales favorables para la unión a VEGF, y potenciando la afinidad para VEGF.

Por tanto, en un primer aspecto la invención proporciona una proteína quimérica tal como se reivindica en la reivindicación 1.

Más preferiblemente, la presente invención proporciona una proteína quimérica FP3 con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.7.

Las proteínas quiméricas descritas en la invención pueden obtenerse a través de tecnologías de ADN recombinante convencionales. En primer lugar, podrían obtenerse las secuencias codificantes de ADN recombinante de las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente, estando disponibles las secuencias de ADN codificantes de FLT-1 y KDR en GenBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information). En segundo lugar, se clonan las secuencias codificantes de ADN de las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente en vectores tras la síntesis por PCR. Los vectores del presente documento podrían ser plásmidos, virus o fragmentos de ADN usados comúnmente en biología molecular. Se inserta la secuencia señal secretora en el extremo terminal de la secuencia de ADN de los péptidos quiméricos mencionados anteriormente para garantizar la secreción fuera de las células. La secuencia de vector incluye una región promotora que permite la transcripción génica, señales de iniciación y terminación para la traducción de proteínas y una secuencia de poliA. El vector contiene un gen resistente a antibióticos para la propagación en bacterias. Además, el vector contiene un gen de selección de célula eucariota para la selección de líneas celulares transfectadas estables.

Debido a que no hay ningún límite absoluto de las secuencias de aminoácidos de todos los dominios de tipo Ig en FLT-1 y KDR, la longitud de secuencia de estos dominios podría tener variaciones. Por tanto, las secuencias de las proteínas quiméricas descritas en la invención podrían tener variaciones similares.

Tras la construcción de plásmidos de las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente, pudieron usarse los plásmidos para transfectar células huésped para expresar las proteínas quiméricas. Existen muchos sistemas de expresión para estas proteínas quiméricas, incluyendo (pero sin limitarse a) células de mamífero, células de bacterias, levadura e insectos. Entre ellas, las células de insectos y de mamífero son células eucariotas, mientras que las células de bacterias y levadura son células procariotas. Las proteínas expresadas a partir de células de mamífero están glicosiladas. Puesto que las proteínas quiméricas de la invención contienen sitios de glicosilación, las células de mamífero son las mejores células para expresarlas. Existen muchos tipos de células de mamífero adecuadas paras las producciones de proteínas a gran escala, tales como células 293, células CHO, células SP20, células NS0, células COS, células BHK, células PerC6, y etc. También podrían usarse muchos otros tipos de células para expresar y producir estas proteínas, y están dentro del alcance de la invención. Podrían transfectarse plásmidos que codifican para las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente en las células. Los métodos de transfección incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transfección mediada por liposomas, precipitación con calcio, y etc.

También podrían usarse sistemas de expresión distintos de las células de mamífero para expresar estas proteínas quiméricas, tales como células de bacterias, levadura, insectos, y etc. Deben considerarse todos como dentro del alcance de la invención. Estos sistemas de expresión tienen un mayor rendimiento de producción de proteínas en comparación con el de las células de mamífero. Sin embargo, producen proteínas sin glicosilación o con cadenas de hidratos de carbono glicosiladas diferentes de las de las células de mamífero.

Tras la expresión de las proteínas quiméricas, pudieron medirse las concentraciones de proteínas quiméricas en los medios de cultivo celular mediante ELISA u otros ensayos. Puesto que las proteínas quiméricas de la invención contienen la región Fc de inmunoglobulina, pudieron purificarse usando cromatografía de afinidad con proteína A.

Después de que se obtuvieron diversas proteínas quiméricas a partir de los medios de cultivo de las células huésped recombinantes, se sometieron a ensayo en experimentos de unión a VEGF para comparar sus afinidades para VEGF. Se sometieron a ensayo adicionalmente sus actividades de inhibición de VEGF en un experimento de proliferación inducida por VEGF de células endoteliales vasculares humanas. Los resultados experimentales han mostrado que todas las proteínas quiméricas construidas según la presente invención pueden unirse a VEGF con altas afinidades (figura 2), en comparación con el FP1’ de la técnica anterior. Además, pudieron bloquear de manera eficaz la activación por VEGF de las células endoteliales vasculares e inhibir el crecimiento de las células endoteliales. Experimentos adicionales han mostrado que FP3 tiene la mejor actividad de bloqueo sobre VEGF y son las proteínas quiméricas que bloquean VEGF más eficaces de la invención.

Por tanto, las proteínas quiméricas construidas en la invención tienen actividades de bloqueo supremas sobre VEGF, y todas las actividades biológicas de antiangiogénesis, por tanto pueden usarse para tratar la angiogénesis o enfermedades relacionadas con VEGF, incluyendo pero sin limitarse a diversos tumores, retinopatías diabéticas, artritis, anemia, hiperplasia del endometrio, etc.

Con el fin de corroborar adicionalmente el efecto antiangiogénico de las proteínas quiméricas in vivo, también se prepararon algunos experimentos de modelos con animales. Los resultados de estos experimentos han mostrado que en el modelo de ratón atímico BALB/C con melanoma B16F10 y el modelo de ratón con xenoinjerto de tumor de próstata PC-3 humano, las proteínas quiméricas de la invención han sido mucho mejores que FP1’ de la técnica anterior, e inhibieron de manera eficaz el crecimiento tumoral y prolongaron la vida del animal. Por tanto, las proteínas quiméricas de la invención tienen altas actividades anticancerígenas.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína quimérica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden formularse en cualquier forma farmacéutica según las metodologías de formulación convencionales, preferiblemente en una forma farmacéutica para inyección, y más preferiblemente en un formato liofilizado.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las estructuras de cinco proteínas quiméricas y FP1 de la técnica anterior. Se construyen con diferentes fragmentos de FLT-1, KDR y la región Fc de inmunoglobulina usando tecnologías de ingeniería genética.

La figura 2 presenta los resultados de la unión a VEGF de las cinco proteínas quiméricas, en comparación con la de FP1 de la técnica anterior, en los que las lecturas de DO se refieren a las señales de unión de las proteínas quiméricas a VEGF. Los resultados han mostrado que las cinco proteínas quiméricas se unieron a VEGF con afinidades mucho mayores que FP1, entre ellas, FP3 tiene la mayor afinidad.

La figura 3 muestra que las proteínas quiméricas pudieron inhibir de manera eficaz el crecimiento de células endoteliales vasculares humanas in vitro, en comparación con FP1.

La figura 4 muestra que la proteína quimérica FP3 pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento tumoral de melanoma B16F10 en ratones.

La figura 5 muestra que la proteína quimérica FP3 pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento de tumor de próstata PC-3 humano en ratones.

La figura 6 compara las actividades contra el crecimiento tumoral de la proteína quimérica FP3 de la invención con la de FP1 de la técnica anterior en ratones.

Realizaciones específicas

Los siguientes ejemplos proporcionan una descripción detallada de la construcción, metodología experimental y aplicación de las proteínas quiméricas descritas en la invención. Pero estos ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de protección de la invención.

Realización 1: Clonación de las secuencias de ADN que codifican para las proteínas quiméricas y construcción de los vectores recombinantes

Aparte de la secuencia de ADN que codifica para Fc de inmunoglobulina, las secuencias de ADN codificantes de las diversas proteínas quiméricas de la invención proceden de ADNc de FLT-1 y KDR. Puesto que FLT-1 y KDR se expresan principalmente en células endoteliales vasculares, se extrajo el ARN total de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) usando un kit de purificación de ARN (QIAGEN); entonces se sintetizaron los ADNc a partir del ARN usando transcriptasa inversa AMV (Promega); entonces se amplificaron por PCR los diversos fragmentos FLT-1 y KDR con diferentes cebadores; finalmente se fusionaron las secuencias de FLT-1, KDR y Fc de inmunoglobulina humana (Fc de IgG1) juntas por PCR para construir secuencias de ADN recombinante que codificaban para diversas proteínas quiméricas. En la figura 1 se muestran las estructuras de las seis proteínas quiméricas (incluyendo FP1 de la técnica anterior).

Ejemplo 1 Construcción de secuencia codificante de FP3 y vector recombinante Se cultivaron células HUVEC (Clonetics) con medios EGM-2 (Clonetics) en frascos T-175. Se recogieron 1 x 107 células y se sometieron a extracción del ARN total usando el kit de purificación de ARN de Qiagen, y entonces se sintetizó ADNc usando el kit de ADNc de Invitrogen. Se almacenó el producto de ADNc a -80ºC hasta su utilización. A continuación se usaron cebadores específicos para amplificar por PCR diversos dominios de FLT-1 y KDR del ADNc de HUVEC.

Se amplificó por PCR el Fc de IgG 1 humano usando los siguientes cebadores específicos a partir de ADNc de ganglios linfáticos (BD Clontech).

Cebadores:

FLT-1 d2 directo: 5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’

FLT-1d2 inverso: 5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’

KDR d3-4 directo: 5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’

KDR d3-4 inverso: 5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’

Fc de IgG1 humano directo: 5’-gacaaaactcacacatgcccact-3’

Fc de IgG1 humano inverso: 5’-tcatttacccggagacagggagag-3’

Se amplificaron por PCR los dominios de tipo Ig y el fragmento Fc de IgG1 humano en condiciones de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a 56ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, y 30 ciclos. Entonces se clonaron los productos de PCR en el plásmido pCR2.1 (Invitrogen) usando el kit de clonación TA. Tras la transformación en E.coli (JM109), se recogieron las colonias blancas y se cultivaron durante la noche en medio LB. Se prepararon los plásmidos de ADN usando el kit de Qiagen y se sometieron a digestión enzimática y secuenciación de ADN.

Se fusionaron los ADNc de FLT-1, KDR y Fc de IgG juntos mediante PCR de fusión (sewing) usando cebadores que contenían el sitio EcoRI. Tras la digestión con EcoRI, se purificó el fragmento de ADN con el kit de purificación de Qiagen y se clonó en el plásmido pcDNA3.1. Tras transformarse en E. coli (JM109), se recogieron las colonias positivas y se cultivaron durante la noche en medio LB. Se extrajeron los plásmidos de ADN con el kit de purificación de plásmidos de Qiagen y entonces se sometieron a digestión enzimática y secuenciación de ADN. Se muestra la secuencia codificante de ADN de FP3 obtenida como SEQ ID NO.6. Se usaron los plásmidos confirmados para transfectar células 293 o células CHO para obtener líneas celulares estables que expresan FP3. Se muestra la secuencia de aminoácidos de FP3 como SEQ ID NO.7.

Ejemplo 2 Construcción del gen FP1 y vector recombinante

Se construyó FP1 de manera similar a como en el ejemplo 1. La única diferencia fue que se construyó el ADN recombinante seleccionado como diana fusionando juntos el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR y el mismo Fc de IgG1 humano que en el ejemplo 1.

Ejemplo 3 Construcción del gen FP2 y vector recombinante

Se construyó FP2 de manera similar a como en el ejemplo 1. La única diferencia fue que se construyó el ADN recombinante seleccionado como diana fusionando juntos el 1er dominio de tipo Ig de KDR, el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR y el mismo Fc de IgG1 humano que en el ejemplo 1.

Ejemplo 4 Construcción del gen FP4 y vector recombinante

Se construyó FP4 de manera similar a como en el ejemplo 1. La única diferencia fue que se construyó el ADN recombinante seleccionado como diana fusionando juntos el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR, el 4º dominio de tipo Ig de FLT-1 y el mismo Fc de IgG1 humano que en el ejemplo 1.

Ejemplo 5 Construcción del gen FP5 y vector recombinante

Se construyó FP5 de manera similar a como en el ejemplo 1. La única diferencia fue que se construyó el ADN recombinante seleccionado como diana fusionando juntos el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, los dominios 3er-5º de tipo Ig de KDR y el mismo Fc de IgG1 humano que en el ejemplo 1.

Ejemplo 6 Construcción del gen FP6 y vector recombinante

Se construyó FP6 de manera similar a como en el ejemplo 1. La única diferencia fue que se construyó el ADN recombinante seleccionado como diana fusionando junto el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, el 3er dominio de tipo Ig de KDR, los dominios 4º-5º de tipo de FLT-1 y el mismo Fc de IgG1 humano que en el ejemplo 1.

Realización 2: Expresión de las proteínas quiméricas en células

Ejemplo 7 Expresión de las proteínas quiméricas FP3

Tras la construcción de los plásmidos recombinantes mencionados anteriormente, se obtuvieron ADN de plásmido de alta calidad usando el kit de plásmidos de Qiagen, y entonces se transfectaron en células 293 (ATCC) usando el kit de transfección FUGEN6 (Roche). Se usaron dos métodos diferentes para expresar las proteínas quiméricas dependiendo de la cantidad de proteínas necesaria.

El primer método era un método de transfección transitoria. Se produjo una pequeña cantidad de las proteínas quiméricas usando este método. En primer lugar, se cultivaron células 293 en medio DMEM con FBS al 10% en placas de cultivo tisular. A una confluencia celular del 60-80%, se añadió la mezcla de ADN de plásmido y reactivo FUGEN6 al cultivo. Se cambiaron los medios de cultivo por DMEM libre de suero al día siguiente y se continuó cultivando las células durante 3 días más antes de que se recogieran los medios. Estos medios contenían las proteínas quiméricas expresadas, y se sometió a ensayo la concentración de las proteínas quiméricas mediante ELISA.

El segundo método era un método de transfección estable. Se estableció una línea celular estable para producir una gran cantidad de las proteínas quiméricas. Las células huésped eran de nuevo células 293 (ATCC). La etapa de transfectar el plásmido recombinante era la misma que la de la transfección transitoria descrita anteriormente. Sin embargo, al 2º día, se cultivaron las células en DMEM con neomicina y se clonaron mediante dilución limitada. Tras aproximadamente 21 días, se recogieron los clones resistentes a neomicina y se cultivaron a mayor escala. Finalmente, se expresaron las proteínas quiméricas en matraces con agitación. Se sometió a ensayo la concentración de proteínas quiméricas mediante ELISA.

Se purificó FP3 a partir de los medios cultivados usando ensayos que incluyeron cromatografía de afinidad y filtración en gel, etc. El peso molecular de FP3 era de 140 KD.

Ejemplo 8 Expresión de otras proteínas quiméricas

Se obtuvieron las proteínas quiméricas FP1, FP2, FP4, FP5 y FP6 según los métodos del ejemplo 7.

Realización 3: Experimento de unión de las proteínas quiméricas a VEGF

Se determinaron las afinidades de las proteínas quiméricas para VEGF mediante el ensayo de unión a VEGF en la presente invención. En primer lugar, se recubrieron con proteínas de VEGF recombinantes (Chemicom) una placa de ELISA de 96 pocillos, y entonces se bloquearon los sitios de unión a proteínas no específicos de la placa usando una disolución de leche al 5%. En segundo lugar, se añadieron diferentes concentraciones de diversas proteínas quiméricas en cada pocillo, y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Tras el lavado, se añadió anticuerpo de conejo de anti-Ig humana-HRP (Sigma) en cada pocillo, y finalmente se añadieron sustratos enzimáticos colorimétricos a la placa. Se registraron las lecturas de DO de absorción con el uso de un lector de placas de ELISA. Un mayor valor de DO indicó una afinidad de unión más fuerte de las proteínas quiméricas a VEGF.

Tal como se muestra en figura 2, las cinco proteínas quiméricas construidas y expresadas en las realizaciones de la presente invención tuvieron capacidad de unión a VEGF, y tuvieron mejores afinidades que FP1 de la técnica anterior. La unión era detectable a bajas concentraciones de 1 !g/ml: Preferiblemente, FP3 tuvo la mejor afinidad y era el mejor inhibidor de VEGF. Su concentración de unión mitad de la máxima era aproximadamente 5 veces menor que la de FP1. FP5 tuvo una afinidad algo menor para VEGF que la de FP3. Este resultado sugiere que el 4º dominio de tipo Ig de KDR podría aumentar sustancialmente la actividad de bloqueo de la proteína quimérica para VEGF. Sin embargo, añadiendo más cantidad de los dominios de KDR tales como el 5º dominio de tipo Ig no pudo potenciar adicionalmente el efecto inhibidor sobre VEGF. Las otras tres proteínas quiméricas presentaron afinidades menores en comparación con FP3 y FP5, pero afinidades mayores que FP1.

Realización 4: Las proteínas quiméricas inhibieron de manera eficaz la proliferación de células endoteliales vasculares humanas in vitro

Esta realización preferida de la invención es para probar que las proteínas quiméricas podían bloquear de manera eficaz el crecimiento inducido por VEGF de células endoteliales vasculares. En el experimento, se sembraron células HUVEC (Clonetics) en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos en medios EBM con FBS al 2% y 15 ng/ml de VEGF. Se añadieron diferentes cantidades del sobrenadante de células 293 que contenía las proteínas quiméricas a la placa. Se usaron medios de células 293 no transfectadas que no contenían proteínas quiméricas como control negativo. Se cultivaron todas las células HUVEC a 37ºC durante 3 días antes de que se determinasen las densidades celulares mediante el recuento celular.

El experimento de proliferación de HUVEC ha mostrado que las cinco proteínas quiméricas pudieron inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares de manera más eficaz que FP1 de la técnica anterior (figura 3). Puesto que la proliferación de células HUVEC en el experimento se indujo mediante la activación por VEGF, se sugiere por tanto que las cinco proteínas quiméricas pudieron inhibir la activación del receptor de VEGF, y todas ellas tenían actividades antiangiogénicas. Entre las cuales, FP3 tuvo el mejor efecto de inhibición sobre el crecimiento de células HUVEC con CI50 de aproximadamente 3 ng/ml. La CI50 de FP1 de la técnica anterior era de aproximadamente 12 ng/ml, y las CI50 de FP2, FP4, FP5 y PF6 eran todas de aproximadamente 5-8 ng/ml.

Realización 5: Los polipéptidos quiméricos inhibieron el crecimiento tumoral en ratones

Ejemplo 9 Preparación de formulación para inyección que contiene las proteínas quiméricas

Se preparó la formulación para inyección según cualquier metodología convencional, para formulaciones para inyección usando 24 mg/ml de FP3, 5 mM de PB, 100 mM de NaCl y sacarosa al 20%.

Ejemplo 10 Las proteínas quiméricas inhibieron de manera eficaz el crecimiento de células de melanoma B16F10 en ratones

Como inhibidores de VEGF, una aplicación de las proteínas quiméricas es en terapia anticancerígena. Debido a su efecto de bloqueo altamente eficaz sobre VEGF, se eligió FP3 para realizar experimentos antitumorales en modelos con animales.

El modelo con animales era murino con células de melanoma B16F10 que es una clase de células tumorales de crecimiento rápido. En el experimento, en primer lugar se inyectaron por vía subcutánea 1 x 105 células B16F10 en 0,05 ml, en el lomo de ratones atímicos BALB/C. Entonces se inyectaron por vía intraperitoneal 400 !g de la proteína quimérica purificada a cada ratón (peso promedio de los ratones 22 g), dos veces a la semana. Se inyectó la misma cantidad del Fc de inmunoglobulina humano purificado en ratones control negativo. Se mostraron las curvas de crecimiento tumoral en la figura 4, indicando que la proteína quimérica FP3 inhibió de manera eficaz el crecimiento de las células de melanoma (P<0,01).

Ejemplo 11 Las proteínas quiméricas inhibieron de manera eficaz el crecimiento de células PC-3 de cáncer de próstata xenoinjertadas en ratones

El modelo de xenoinjerto de células tumorales humanas que se hacen crecer en ratones atímicos es uno de los modelos con animales, que es el más similar a los tumores humanos. Los ratones atímicos carecen de rechazo inmunitario, por tanto pudieron hacerse crecer muchas células tumorales humanas en ratones atímicos y formar tumores. Se sometió a prueba proteína quimérica FP3 para inhibir el crecimiento de células PC-3 de tumor de próstata humano (ATCC) en ratones atímicos BALB/C. En este modelo, en primer lugar se inyectaron por vía subcutánea 1 x 105 células PC-3 en 0,05 ml, en el lomo de los ratones. Entonces se inyectaron por vía intraperitoneal 400 !g de la proteína quimérica purificada a cada ratón, dos veces a la semana. Se inyectó la misma cantidad del Fc de inmunoglobulina humano purificado en ratones control negativo. Se mostraron los resultados experimentales en la figura 5. En los ratones control, el tumor creció más de 1000 mm3 45 días tras la implantación. Sin embargo, en los ratones a los que se les administraron las proteínas quiméricas, FP3 ha inhibido casi completamente el crecimiento tumoral (P<0,01), demostrando un efecto antitumoral terapéutico significativo.

Realización 6: Comparación del estudio de las proteínas quiméricas FP3 y FP1 de la técnica anterior en la inhibición del crecimiento tumoral en ratones

Con el fin de demostrar adicionalmente la actividad anticancerígena suprema de FP3, se compararon los efectos de FP1 y FP3 en un experimento de crecimiento tumoral. Se eligieron 10 ratones atímicos BALB/C sanos y a cada uno se le inyectó por vía subcutánea en el lomo 1 x 105 células C6 de glioblastoma de rata en 0,05 ml. Entonces se inyectaron por vía intraperitoneal 2,5 mg/kg de PF1 o PF3 purificadas dos veces a la semana, respectivamente, hasta 31 días. Se inyectó la misma cantidad del Fc de inmunoglobulina humano purificado en ratones control negativo. Se muestran los resultados experimentales en la figura 6. Tanto FP1 como FP3 tuvieron un efecto terapéutico significativo sobre el tumor. En el día 35, los volúmenes tumorales de los ratones a los que se les administraron FP1 y FP3 eran de 1167,3 y 557,6, respectivamente, mientras que el volumen tumoral de los ratones control tratados con Fc ya había alcanzado 1312,3 en el día 24. Por tanto, FP3 tuvo un efecto más significativo (P<0,05) que FP1 de la técnica anterior.

En conjunto, las proteínas quiméricas tuvieron una alta afinidad para VEGF, pudieron inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares in vitro, e inhibieron de manera eficaz el crecimiento tumoral in vivo. Puesto que la angiogénesis es crítica en todo el crecimiento tumoral, puede usarse la proteína quimérica de la invención en aplicaciones terapéuticas contra muchos tumores.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd

<120> Proteína quimérica inhibidora de la angiogénesis y el uso

5 <130> 489.48.93527

<140> 05755524.2

<141> 2005-06-08

10 <150> CN20041044965.7 <151>

<160> 13

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 96

25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 86

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 92

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6 <211> 1656

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> mat_péptido desde 1 a 1656

<400> 6

<210> 7

<211> 552 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CADENA desde (1) hasta (552)

<400> 7

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> cctttcgtag agatgtacag tga: 23

<210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 9 tatgattgta ttggtttgtc cat: 23

<210> 10 <211>23

<212> ADN <220>

<213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 10 gatgtggttc tgagtccgtc tca: 23

<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400>11 cggtgggaca tacacaacca ga: 22

<210>12 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 12 gacaaaactc acacatgccc act: 23

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<223>oligonucleótido <400>13 tcatttaccc ggagacaggg agag 24

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína quimérica que comprende diferentes fragmentos de los receptores de VEGF, FLT-1 y KDR, caracterizada porque la proteína quimérica consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, los dominios 3º y 4º de tipo Ig de KDR y Fc de inmunoglobulina humana, designándose la proteína quimérica como FLTd2KDRd3,4-Fc.
2.

La proteína quimérica según la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos es como se muestra en SEQ ID NO: 7.
3.

ADN recombinante que codifica para la proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4.

El ADN recombinante según la reivindicación 3 que codifica para la proteína quimérica según la reivindicación 2, en donde la secuencia de ADN es como se muestra en SEQ ID NO: 6.
5.

Un vector que comprende las secuencias de ADN recombinante según las reivindicaciones 3 ó 4, donde el vector es seleccionado de un plásmido, un virus o un fragmento de ADN.
6.

Un huésped recombinante que contiene el vector recombinante según la reivindicación 5, en donde las células huésped son células eucariotas o células procariotas.
7.

Una composición farmacéutica la cual comprende una proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8.

Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la composición farmacéutica es una disolución inyectable.
9.

Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.
10.

El uso de una proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiangiogénico.
11.

El uso según la reivindicación 10 en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.
12.

La proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento antiangiogénico.
13.

La proteína quimérica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.