PT1767546E - Proteína quimérica inibidora da angiogénese e utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNA QUIMÉRICA INIBIDORA DA ANGIOGÉNESE E UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à tecnologia da engenharia genética, mais especificamente a sequências de ADN que codificam proteínas quiméricas recombinantes de inibição da angiogénese, às proteínas quiméricas aqui codificadas, às suas aplicações terapêuticas e a composições farmacêuticas que contém as proteínas quiméricas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A angiogénese é um processo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes. A maior parte do sistema vascular adulto é quiescente, a angiogénese apenas ocorre em alguns mecanismos fisiológicos e patológicos, tais como tumor, retinopatias diabéticas, artrite, órgãos com anemia, hiperplasia do endométrio, etc. A angiogénese desempenha papéis chave no crescimento rápido de células tumorais durante o desenvolvimento tumoral (Hanahan e Folkman: "Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis", Cell, 1996, 86: 353-364). Estudos de modelos de cancro animais e ensaios clínicos em humanos já demonstraram que a inibição da angiogénese tumoral pode efectivamente inibir o crescimento e o desenvolvimento do tumor, prolongando, desse 1 modo, a vida do doente. A angiogénese é mediada e regulada por muitos factores biológicos. A maioria das células que medeiam a angiogénese são células endoteliais vasculares que formam a parede interna dos vasos sanguíneos. Vários factores de crescimento podem ligar-se a receptores relevantes na superfície de células endoteliais vasculares, regulam processos celulares através da transdução de sinal intracelular e, por isso, medeiam a angiogénese.

Entre vários factores de crescimento, o VEGF (factor de crescimento celular endotelial vascular) é o factor mais importante para a angiogénese (Ferrara: "VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor", Nat. Rev. Câncer, 2002, 10: 795-803;

Ferrara: "Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic

implications", Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl): 10-14). O VEGF

pode ser segregado por muitos tipos de células, mas é frequentemente sobre-expresso em células tumorais. O VEGF funciona através de ligação a receptores apropriados. Existem, principalmente, dois tipos de receptores de VEGF: FLT-1 (cinase da tirosina do tipo fms) e KDR. Em termos de estruturas moleculares, estes dois receptores consistem ambos em três regiões funcionais diferentes: a primeira região é a região extracelular, consistindo em sete domínios (dl-d7) do tipo imunoglobulina (tipo Ig) , que possui afinidade específica para VEGF e é a região chave para a ligação ao VEGF; a segunda região é a região transmembranar contendo resíduos de aminoácidos hidrofóbicos; a terceira região é o domínio intracelular que contém o grupo de funcionamento da cinase de tirosina, que se torna fosforilado após o receptor ser activado por VEGF, despoletando a transdução do sinal intracelular, conduzindo aos efeitos funcionais das células endoteliais e angiogénese. 2 FLT-1 e KDR são principalmente distribuídos nas células endoteliais vasculares. Assim, a actividade mediada pelo VEGF para as células endoteliais vasculares é altamente específica. 0 VEGF promove as diferenciações da célula endotelial, conduz as migrações da célula endotelial, inibe a apoptose, induz as alterações morfológicas vasculares e é um factor pró-angiogénese altamente eficaz. 0 nível de expressão do VEGF em células tumorais é superior àquele que existe nos tecidos normais. Adicionalmente, o crescimento rápido das células tumorais conduz, frequentemente, a hipoxia dentro do tumor, e a hipoxia induz ainda a expressão do VEGF. Assim, o VEGF é o factor chave que promove a angiogénese tumoral. Muitos estudos animais demonstraram que a inibição da ligação de VEGF aos seus receptores pode inibir eficazmente a angiogénese tumoral e, por isso, inibe o crescimento tumoral. Noutras doenças relacionadas com a angiogénese, tais como retinopatias diabéticas e artrites, etc., o VEGF está também intimamente envolvido no desenvolvimento destas doenças (Ferrara: "Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications". Semin. Oncol. 2002, 29 (6 supl) : 10-14) .

Devido aos papéis críticos do VEGF em cancros e outras doenças, as proteínas ou produtos químicos que inibem especificamente o VEGF têm potenciais terapêuticos. Por exemplo, estudos demonstraram que a neutralização do anticorpo contra o VEGF pode inibir eficazmente o crescimento tumoral (Jain: "Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor", Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl) : 3-9) . Por isso , o desenvolvimento de nódulos inibidores de VEGF eficazes é 3 importante na investigação clinica. Uma vez que FLT-1 e KDR são ligantes naturais de VEGF, houve estudos que investigaram os papéis na anti-angiogénese de FLT-1 solúvel (o dominio extracelular de FLT-1) e o KDR solúvel (o dominio extracelular do KDR) (Yoko Hasumi: "Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Câncer". Câncer Research 62, 2002: 2019-2023). O FLT-1 solúvel pode inibir eficazmente o crescimento de células endoteliais vasculares in vitro, mas possui uma semi-vida no soro curta e não consegue alcançar uma concentração no soro eficaz. De um modo semelhante, o KDR solúvel também foi capaz de inibir o crescimento das células endoteliais vasculares in vitro, mas a sua actividade anti-tumoral em modelos animais não foi satisfatória (Yoko Hasumi: "Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Câncer". Câncer Research 62, 2002: 2019-2023). A patente US 6100071 divulga proteínas quiméricas do receptor VEGF compreendendo sequências derivadas dos receptores KDR e flt-1. A publicação da patente internacional N° WO 00/75319 divulga polipéptidos quiméricos de receptor Flt-1 modificados. Shinkai et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273(47) p. 31283-31288) divulgam mutantes de deleção do receptor KDR e examina as afinidades de ligação destes mutantes para VEGF. Nenhum destes documentos divulga proteínas quiméricas como presentemente reivindicadas.

Para superar as desvantagens da técnica anterior, a presente invenção proporciona novas proteínas quiméricas contendo fragmentos diferentes de FLT-1 e KDR para bloquear eficazmente a actividade biológica do VEGF e inibir a angiogénese. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona novas proteínas quiméricas recombinantes que bloqueiam a actividade biológica do VEGF e inibem a angiogénese, as sequências de ADN que codificam as proteínas quiméricas acima mencionadas e vectores que contêm as sequências do ADN codificante das proteínas quiméricas e os seus hospedeiros recombinantes, como aqui reivindicado. A invenção também proporciona a utilização das proteínas quiméricas na preparação de medicamentos que bloqueiam a actividade do VEGF e inibem a angiogénese, e composições farmacêuticas que contêm as proteínas quiméricas e veículos médicos apropriados, assim como aplicações terapêuticas da composição médica, como aqui reclamado.

Pontos chave da invenção são a concepção e a construção de uma série de proteínas quiméricas com diferentes fragmentos de FLT-1 ou KDR, que contêm Fc de imunoglobulina humana (o método de construção preferido é apresentado na Figura 1) e, depois, seleccionar a proteína quimérica com elevada afinidade para VEGF utilizando ensaios que incluem o ensaio de ligação a VEGF e finalmente obter o inibidor de VEGF apropriado. A construção da proteína quimérica baseia-se nas tecnologias de clonagem molecular convencionais. A metodologia experimental detalhada pode ser encontrada em manuais de laboratório, tais como Molecular Cloning, a 2a ou a 3a edição (Joseph Sambrook).

As proteínas quiméricas que podem ser preparadas por via da tecnologia do ADN recombinante para conter diferentes fragmentos dos receptores do VEGF FLT-1 e KDR, incluem os seguintes grupos: 5 a. Consistindo no Io domínio de KDR de tipo Ig, o 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig e o 3o domínio de KDR de tipo Ig, designado como KDRdl-FLTd2-KDRd3; b. Consistindo no 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig e o 3o e o 4o domínios de KDR de tipo Ig, designado como FLTd2-KDRd3,4; c. Consistindo no 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig, o 3o domínio de KDR de tipo Ig e o 4o domínio de FLT-1 de tipo Ig, designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4; d. Consistindo no 2o Domínio de FLT-1 de tipo Ig e o 3o, o 4o e o 5o domínios de KDR de tipo Ig, designados como FLTd2-KDRd3,4,5; e. Consistindo no 2o domínio de FLT 1 de tipo Ig, o 3o dominio de KDR de tipo Ig e o 4o e o 5o domínios de FLT-1 de tipo Ig, designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5. A sequência de aminoácidos de FLTd2 é apresentada como SEQ ID N° 1. A sequência de aminoácidos de FLTd4 é apresentada como SEQ ID N° 2. A sequência de aminoácidos de KDRdl é apresentada como SEQ ID N° 3. A sequência de aminoácidos de KDRd3 é apresentada como SEQ ID N° 4. A sequência de aminoácidos de KDRd4 é apresentada como SEQ ID N° 5.

Como aqui utilizado, FLT refere-se à sequência de FLT-1, KDR refere-se à sequência de KDR; dí refere-se ao í° dominio de tipo Ig em FLT-1 ou KDR.

As proteínas quiméricas contêm vantajosamente Fc de imunoglobulina humana e incluem os seguintes grupos: FP2' designado como KDRdl-FLTd2-KDRd3-Fc; 6 FP3' designado como FLTd2-KDRd3,4-Fc; FP4' designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc; FP5' designado como FLTd2-KDRd3,4,5-Fc; FP6' designado como FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc.

Como aqui utilizado, Fc refere-se ao fragmento Fc de imunoglobulina humana derivado do FC de imunoglobulina humana tais como IgG, IgM, e IgA, ou as subclasses IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A região Fc pode ser a sequência de Fc de comprimento total ou um fragmento da sequência do Fc de CH2, CH3 ou a região da dobra.

Como apresentado na Figura 1, a proteína quimérica conhecida na técnica anterior (designada como FP1') consiste no 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig (FLTd2), o 3o domínio de KDR de tipo Ig (KDRd3), e o Fc de imunoglobulina humana. A proteína quimérica FP2' proporcionada na invenção foi adicionada com a sequência de aminoácidos do Io domínio de KDR de tipo Ig (KDRdl) em FP1', que aumenta os sítios de ligação para VEGF e aumenta a afinidade para VEGF. As proteínas quiméricas FP3' e FP4' possuem sequências adicionadas do 4o domínio de KDR de tipo Ig (KDRd4) ou o 4o domínio de FLT-1 de tipo Ig (FLTd4) com base em FP1', respectivamente. 0 FP5' e FP6' foram adicionados com o 4o e o 5o domínios de KDR de tipo Ig (KDRd4, 5) e o 4o e o 5o domínios de tipo Ig de FLT-1 (FLT-1 d4, 5) com base em FP1', respectivamente. Estas sequências adicionadas podem ajudar a dimerização das proteínas quiméricas, dobrando as estruturas tridimensionais favoráveis para a ligação de VEGF, e aumentando a afinidade para VEGF.

Assim, num primeiro aspecto, a invenção proporciona uma proteína quimérica como reivindicado na reivindicação 1. 7

De um modo mais preferido, a presente invenção proporciona uma proteina quimérica FP3 com a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N° 7.

As proteínas quiméricas descritas na invenção podem ser obtidas através de tecnologias de ADN recombinante convencionais. Inicialmente, podem ser obtidas sequências codificantes de ADN recombinante das proteínas quiméricas acima mencionadas, nas quais as sequências de ADN codificantes de FLT-1 e KDR estão disponíveis em GenBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information). Em segundo lugar, as sequências de ADN codificantes das proteínas quiméricas acima mencionadas são clonadas em vectores após síntese por PCR. Os vectores aqui apresentados podem ser plasmídeos, vírus ou fragmentos de ADN normalmente utilizados em biologia molecular. É inserida uma sequência sinal de secreção no terminal da sequência de ADN dos péptidos quiméricos acima referidos para assegurar a secreção das células. A sequência do vector inclui uma região do promotor que permite a transcrição genética, sinais de iniciação e de terminação para a tradução de proteínas e uma sequência de poliA. 0 vector contém um gene de resistência a antibióticos para propagação em bactérias. Adicionalmente, o vector contém um gene de selecção de células eucarióticas para a selecção de linhas celulares transfectadas estáveis.

Dado que não existe uma fronteira absoluta das sequências de aminoácidos de todos os domínios de tipo Ig em FLT-1 e KDR, o comprimento da sequência destes domínios podem possuir variações. Assim, as sequências das proteínas quiméricas descritas na invenção podem possuir variações semelhantes. 8

Após a construção de plasmídeos das proteínas quiméricas acima mencionadas, os plasmídeos podem ser utilizados para transfectar células hospedeiras para expressar as proteínas quiméricas. Existem muitos sistemas de expressão para estas proteínas quiméricas, incluindo (mas não limitado a) células de mamíferos, bactérias, leveduras e células de insectos. Entre elas, células de mamíferos e de insectos são células eucariotas, enquanto as células de bactérias e de leveduras são células procariotas. As proteínas expressas a partir de células de mamíferos são glicosiladas. Uma vez que as proteínas quiméricas da invenção contêm sítios de glicosilação, as células de mamíferos são as melhores células para as expressar. Existem muitos tipos de células de mamíferos adequadas para produções de proteína em grande escala, tais como células 293, células CHO, células SP20, células NSO, células COS, células BHK, células PerC6, e etc. Muitos outros tipos de células podem também ser utilizadas para expressar e produzir estas proteínas, e podem estar todos dentro do âmbito da invenção. Os plasmídeos que codificam as proteínas quiméricas acima mencionadas podem ser transfectados para as células. Os métodos de transfecção incluem, mas não estão limitados a electroporação, transfecção mediada por lipossomas, precipitação com cálcio, e etc.

Também podem ser utilizados sistemas de expressão diferentes de células de mamíferos para expressar essas proteínas quiméricas, tais como bactérias, leveduras, células de insectos, e etc. Podem todos estar considerados como estando dentro do âmbito da invenção. Estes sistemas de expressão possuem um rendimento de produção de proteína mais elevado em comparação com o de células de mamíferos. Todavia, eles produzem proteínas sem glicosilação ou com cadeias de hidratos de carbono glicosiladas diferentes daquelas das células de mamíferos. 9

Após a expressão das proteínas quiméricas, as concentrações das proteínas quiméricas no meio de cultura de células podem ser medidas por ELISA ou outros ensaios. Dado que as proteínas quiméricas contêm a região Fc da imunoglobulina, podem ser purificadas utilizando cromatografia de afinidade com Proteína A.

Após várias proteínas quiméricas terem sido obtidas do meio de cultura das células hospedeiras recombinantes, foram ensaiadas em experiências de ligação ao VEGF para comparar as suas afinidades ao VEGF. As suas actividades de inibição de VEGF foram ainda ensaiadas numa experiência de proliferação de células endoteliais vasculares humanas induzidas pelo VEGF. Os resultados experimentais demonstraram que todas as proteínas quiméricas construídas de acordo com a presente invenção se podem ligar ao VEGF com afinidades elevadas (Figura 2), comparando com o FP1' da técnica anterior. Adicionalmente, podem bloquear eficazmente a activação de VEGF das células endoteliais vasculares e inibir o crescimento das células endoteliais. Outras experiências demonstraram que o FP3 possui a melhor actividade de bloqueamento no VEGF e é a mais eficaz proteína quimérica do bloqueamento do VEGF da invenção.

Assim, as proteínas quiméricas construídas na invenção possuem actividades de bloqueamento supremo no VEGF e todas possuem actividades biológicas de anti-angiogénese, por isso podem ser utilizadas para tratar a angiogénese ou doenças realizadas com o VEGF, incluindo, mas não limitados a vários tumores, retinopatias diabéticas, artrite, anemia, hiperplasia do endométrio, etc. 10

De modo a substanciar ainda mais o efeito anti-angiogénese das proteínas quiméricas in vivo, também foram preparadas experiências em modelo animal. Os resultados destas experiências demonstraram que no modelo de murganho sem pêlo BALB/C de melanoma B16F10 e no modelo de murganho de xenoenxerto tumoral da próstata PC-3 humano, as proteínas quiméricas da invenção foram muito melhores do que FP1 ’ da técnica anterior e inibiram eficazmente o crescimento do tumor e o prolongamento da vida animal. Assim, as proteínas quiméricas da invenção são de actividades anti-cancerígenas elevadas. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma proteína quimérica da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. As referidas composições podem ser formuladas em quaisquer formas de dosagem, de acordo com metodologias de formulação convencionais, de um modo preferido numa forma de dosagem para injecção e, de um modo mais preferido, num formato liofilizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta as estruturas de cinco proteínas quiméricas e FP1 da técnica anterior. Elas são construídas com diferentes fragmentos de FLT-1, KDR e a região de Fc de imunoglobulina utilizando as tecnologias de engenharia genética. A Figura 2 apresenta os resultados da ligação ao VEGF das cinco proteínas quiméricas, em comparação com as de FP1 da técnica anterior, em que as leituras de DO se referem aos sinais de ligação das proteínas quiméricas para VEGF. Os resultados demonstraram que todas as cinco proteínas quiméricas se ligam ao 11 VEGF com afinidades muito mais elevadas do que FP1, de entre elas, a FP3 possui a afinidade mais elevada. A Figura 3 demonstra que as proteínas quiméricas da invenção podem inibir eficazmente o crescimento celular endotelial vascular humano in vitro, em comparação com FP1. A Figura 4 demonstra que a proteína quimérica FP3 pode inibir eficazmente o crescimento do tumor do melanoma B16F10 em murganhos. A Figura 5 demonstra que a proteína quimérica FP3 pode inibir eficazmente o crescimento de tumor da próstata PC-3 humano em murganhos. A Figura 6 compara as actividades do crescimento anti-tumoral da proteína quimérica FP3 da invenção com as do FPl da técnica anterior em murganhos.

FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS

Os seguintes exemplos proporcionam a descrição detalhada da construção, metodologia experimental e aplicação das proteínas quiméricas descritas na invenção. Mas estes exemplos não devem ser encarados como limitantes do âmbito de protecção da invenção.

Forma de Realização 1: Clonagem das sequências de ADN que codificam as proteínas quiméricas e construção dos vectores recombinantes. 12

Para além da sequência de ADN que codifica o Fc de imunoglobulina, outras sequências de ADN codificantes das várias proteínas quiméricas da invenção têm origem em ADNc de FLT-1 e KDR. Uma vez que FLT-1 e KDR são principalmente expressos em células endoteliais vasculares, os ARN totais foram extraídos a partir de células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVEC) utilizando um kit de purificação de ARN (QIAGEN); depois os ADNc foram sintetizados a partir do ARN utilizando Transcriptase Reversa de AMV (Promega); depois, vários fragmentos de FLT-1 e KDR foram amplificados por PCR com diferentes iniciadores; finalmente, as sequências de FLT-1, KDR e Fc da imunoglobulina humana (IgGl Fc) foram fundidos conjuntamente através de PCR para construir sequências de ADN recombinantes que codificam várias proteínas quiméricas. São apresentadas na Figura 1 estruturas de todas as seis proteínas quiméricas (incluindo FP1 da técnica anterior).

Exemplo 1 Construção da sequência que codifica FP3 e o vector recombinante

Foram cultivadas células HUVEC (Clonetics) com meio EGM-2 (Clonetics) em frascos T-175. Foram recolhidas 1 x 107 células e sujeitas a extracção de ARN total utilizando o kit de purificação de ARN da Qiagen e, depois, foi sintetizado ADNc utilizando o kit de ADNc da Invitrogen. 0 produto de ADNc foi armazenado a -80 °C até ser utilizado. De seguida, foram utilizados iniciadores específicos para amplificar por PCR vários domínios FLT-1 e KDR a partir do ADNc das células HUVEC. 13 0 Fc de IgG 1 humano foi amplificado por PCR utilizando os seguintes iniciadores específicos de ADNc dos Nódulos Linfáticos (BD Clontech) .

Iniciadores: FLT-1 d2 sentido directo: 5'-cctttcgtagagatgtacagtga-3' FLT-ld2 reverso: 5'-tatgattgtattggtttgtccat-3' KDR d3-4 sentido directo: 5'-gatgtggttctgagtccgtctca-3' KDR d3-4 reverso: 5'-cggtgggacatacacaaccaga-3'

Fc de IgGl Humano sentido directo: 5'-gacaaaactcacacatgcccact-3' Fc de IgGl Humano reverso: 5'-tcatttacccggagacagggagag-3'

Os domínios de tipo Ig e o fragmento Fc de IgGl humano foram amplificados por PCR nas condições de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, emparelhamento a 56 °C durante 45 segundos, extensão a 72 °C durante 2 minutos e 30 ciclos. Os produtos de PCR foram então clonados no plasmídeo pCR2.1 (Invitrogen) utilizando o "TA cloning kit". Após transformação em E.coli (JM109), foram repicadas colónias brancas e cultivadas durante a noite em meio LB. Foram preparados plasmídeos de ADN utilizando o kit da Qiagen e sujeitos a digestão enzimática e sequenciação de ADN.

Os ADNc de FLT-1, KDR e Fc de IgG foram fundidos em conjunto para PCR de costura utilizando os iniciadores que contêm o sítio .EcoRI. Após digestão com EcoRI, o fragmento de ADN foi purificado com o kit de purificação da Qiagen e clonado no plasmídeo pADNc3.1. Após transformação em E. coli (JM109), foram repicadas colónias positivas e cultivadas durante a noite em meio LB. Os plasmídeos de ADN foram extraídos com o kit de 14 purificação de plasmideos da Qiagen e depois sujeitos a digestão enzimática e sequenciação de ADN. A sequência codificante de ADN de FP3 obtida é apresentada como SEQ ID N° 6 . Os plasmideos confirmados foram utilizados para transfectar células 293 ou células CHO para obter linhas celulares estáveis que expressem FP3. A sequência de aminoácidos de FP3 é apresentada como SEQ ID N°.7.

Exemplo 2 Construção do gene FP1 e do vector recombinante 0 FP 1 foi construído de modo semelhante como no Exemplo 1. A única diferença foi que o ADN alvo recombinante foi construído através da fusão conjunta do 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig, o 3o dominio de KDR de tipo Ig e o mesmo Fc de IgGl humano que no Exemplo 1.

Exemplo 3 Construção do gene FP2 e do vector recombinante 0 FP2 foi construído de modo semelhante ao do Exemplo 1. A única diferença foi que o ADN alvo recombinante foi construído através da fusão em conjunto do Io domínio de KDR de tipo Ig, o 2o Domínio de FLT-1 de tipo Ig, o 3o domínio de KDR de tipo Ig e o mesmo Fc de IgGl humano que no Exemplo 1.

Exemplo 4 Construção do gene FP4 e do vector recombinante 0 FP4 foi construído de modo semelhante ao do Exemplo 1. A única diferença foi que o ADN alvo recombinante foi construído através da fusão em conjunto do 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig, 15 ο 3o domínio de KDR de tipo Ig, o 4o domínio de FLT-1 de tipo Ig e o mesmo Fc de IgGl humano que no Exemplo 1.

Exemplo 5 Construção do gene FP5 e do vector recombinante 0 FP5 foi construído de modo semelhante ao do Exemplo 1. A única diferença foi que o ADN alvo recombinante foi construído através da fusão em conjunto do 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig, o 3°-5° domínio de KDR de tipo Ig e o mesmo Fc de IgGl humano que no Exemplo 1.

Exemplo 6 Construção do gene FP6 e do vector recombinante 0 FP6 foi construído de modo semelhante ao do Exemplo 1. A única diferença foi que o ADN alvo recombinante foi construído através da fusão em conjunto do 2o domínio de FLT-1 de tipo Ig, o 3o domínio de KDR de tipo Ig, o 4°-5° domínio de FLT-1 de tipo Ig e o mesmo Fc de IgGl humano que no Exemplo 1.

Forma de realização 2: Expressão das proteínas quiméricas nas células

Exemplo 7 Expressão das proteínas quiméricas FP3

Após a construção dos plasmídeos recombinantes acima mencionados, foram obtidos ADN plasmídicos de elevada qualidade utilizando o kit de plasmídeos da Qiagen e, depois, foram transfectados para células 293 (ATCC) utilizando o kit de 16 transfecção FUGEN6 (Roche) . Foram utilizados dois métodos diferentes para expressar as proteínas quiméricas, dependendo da quantidade de proteínas necessária. 0 primeiro método foi um método de transfecção transiente. Foi produzida uma pequena quantidade das proteínas quiméricas utilizando este método. Primeiramente, as células 293 foram cultivadas em meio DMEM com 10% de FBS em placas de cultura de tecidos. Aos 60-80% de confluência celular, a mistura de ADN plasmídico e o reagente FUGEN6 foram adicionados à cultura. O meio de cultura foi substituído para DMEM sem soro no dia seguinte e as células foram continuadas em cultura durante mais 3 dias antes do meio ser recolhido. Estes meios continham as proteínas quiméricas expressas e a concentração das proteínas quiméricas foi ensaiada por ELISA. O segundo método foi um método de transfecção estável. Foi estabelecida uma linha celular estável para produzir uma grande quantidade das proteínas quiméricas. As células hospedeiras foram novamente as células 293 (ATCC). 0 passo de transfectar o plasmídeo recombinante foi o mesmo que o da transfecção transiente acima descrita. Contudo, ao 2o dia, as células foram cultivadas em DMEM com neomicina e clonadas por diluição limitada. Após cerca de 21 dias, os clones resistentes à neomicina foram repicados e cultivados numa escala maior. Finalmente, as proteínas quiméricas foram expressas em frascos com agitação. A concentração das proteínas quiméricas foi avaliada por ELISA. O FP3 foi purificado a partir do meio cultural utilizando ensaios que incluem cromatografia por afinidade e filtração por gel, etc. O peso molecular do FP3 foi 140 KD. 17

Exemplo 8 Expressão de outras proteínas quiméricas

As proteínas quiméricas FP1, FP2, FP4, FP5 e FP6 foram obtidas de acordo com os métodos do exemplo 7.

Forma de realização 3: Experiência de ligação das proteínas quiméricas ao VEGF

As afinidades das proteínas quiméricas para o VEGF foram determinadas através do ensaio de ligação a VEGF na presente invenção. Primeiramente, as proteínas de VEGF recombinantes (Chemicom) foram aplicadas no revestimento de uma placa de ELISA de 96 poços, e os sítios de ligação à proteína não especifica da placa foram, então, bloqueados utilizando uma solução de leite a 5%. Em segundo lugar, foram adicionados a cada poço concentrações diferentes das várias proteínas quiméricas, e incubadas, durante 2 horas, a 37 °C. Após lavagem, foi adicionado a cada poço Ig-HRP anti-humano de coelho (Sigma), e finalmente foram adicionados à placa substratos de enzima colorimétricos. As leituras de absorção DO foram registadas com a utilização de um leitor de placas de ELISA. Um valor da DO mais elevado indicou uma afinidade de ligação mais forte das proteínas quiméricas ao VEGF.

Como mostrado na figura 2, todas as cinco proteínas quiméricas construídas e expressas nas formas de realização da presente invenção foram capazes de se ligar ao VEGF e tiveram melhores afinidades do que o FP1 da técnica anterior. A ligação foi detectável a baixas concentrações de 1 pg/mL. De um modo preferido, o FP3 teve a melhor afinidade e foi o melhor inibidor 18 de VEGF. A sua concentração de metade do máximo de ligação foi cerca de 5 vezes inferior à de FP1. 0 FP5 tinha uma afinidade para VEGF um pouco mais baixa do que a do FP3. Este resultado sugere que o 4o domínio de KDR de tipo Ig pode aumentar substancialmente a actividade de bloqueamento da proteína quimérica a VEGF. Todavia, adicionar mais dos domínios de KDR, tais como o 5o domínio de tipo Ig pode não aumentar ainda mais o efeito inibidor do VEGF. As outras três proteínas quiméricas apresentam afinidades mais baixas em comparação como o FP3 e o FP5, mas afinidades mais elevadas do que FP1.

Forma de realização 4: As proteínas quiméricas inibem eficazmente a proliferação de células endoteliais vasculares humanas in vitro.

Esta forma de realização preferida da invenção é para provar que as proteínas quiméricas podem bloquear eficazmente o crescimento das células endoteliais vasculares induzido por VEGF. Na experiência, as células HUVEC (Clonetics) foram semeadas numa placa de cultura de tecidos de 96 poços em meio EBM com 2% de FBS e 15 ng/mL de VEGF. Foram adicionadas à placa quantidades diferentes dos sobrenadantes das células 293 que contêm as proteínas quiméricas. 0 meio das células 293 não transformadas não contendo proteínas quiméricas foi utilizado como controlo negativo. Todas as células HUVEC foram cultivadas, a 37 °C durante 3 dias antes de as densidades celulares serem determinadas através de contagem de células. A experiência de proliferação de HUVEC demonstrou que todas as cinco proteínas quiméricas, construídas de acordo com a invenção, podem inibir a proliferação das células endoteliais vasculares mais eficazmente do que o FP1 da técnica anterior 19 (Figura 3) . Uma vez que a proliferação de células HUVEC na experiência foi induzida pela activação do VEGF é, por isso, sugerido que todas as cinco proteínas quiméricas foram capazes de inibir a activação do receptor do VEGF e todas elas possuíam actividades anti-angiogénese. Entre as quais, o FP3 teve o melhor efeito inibidor na cultura de células HUVEC com uma IC50 de cerca de 3 ng/mL. A IC50 do FP1 da técnica anterior foi de cerca de 12 ng/mL e as IC50 de FP2, FP4, FP5 e PF6 eram todas acima de 5-8 ng/mL.

Forma de realizaçao 5: Os polipéptidos quiméricos inibiram o crescimento tumoral em murganhos.

Exemplo 9 Preparação da formulação de injecção contendo as proteínas quiméricas A formulação da injecção foi preparada de acordo com qualquer uma das metodologias convencionais, para formulações de injecção utilizando 24 mg/mL de FP3, 5 mM de PB, 100 mM de NaCl e 20% de sacarose.

Exemplo 10 As proteínas quiméricas inibiram eficazmente o crescimento de células de melanoma B16F10 em murganhos

Como inibidores do VEGF, uma aplicação das proteínas quiméricas é na terapia anti-cancro. Devido ao seu efeito bloqueador altamente eficaz sobre o VEGF, o FP3 foi escolhido para realizar experiências anti-tumorais em modelos animais. 20 0 modelo animal foi o murino com células de melanoma B16F10 que é um tipo de células tumorais de crescimento rápido. Na experiência, foram primeiro injectadas, subcutaneamente 1 x 105 células B16F10 em 0,05 mL no dorso de murganhos BALB/C sem pêlo. Depois, a proteína quimérica purificada foi injectada intraperitonealmente com 400 pg de cada murganho (peso médio dos murganhos, 22 g) , duas vezes por semana. A mesma quantidade do Fc da imunoglobulina humana purificada foi injectada nos murganhos do controlo negativo. As curvas de crescimento tumoral foram apresentadas na Figura 4, indicando que a proteína quimérica FP3 inibiu eficazmente o crescimento das células de melanoma (P<0,01).

Exemplo 11 As proteínas quiméricas inibiram eficazmente o crescimento de células PC-3 do cancro da próstata xenoenxertado em murganhos O modelo de xenoenxerto do crescimento de células tumorais humano em murganhos sem pêlo é um dos modelos animais que apresenta mais semelhanças com os tumores humanos. Os murganhos sem pêlo não possuem rejeição imune, por isso, muitas células tumorais humanas podem crescer em murganhos sem pêlo e formar tumor. A proteína quimérica FP3 foi testada para a inibição do crescimento de células PC-3 de tumor da próstata humana (ATCC) em murganhos sem pêlo BALB/C. Neste modelo, 1 x 105 células PC-3 em 0,05 mL foram primeiro injectados subcutaneamente no dorso dos murganhos. Depois, a proteína quimérica purificada foi injectada intraperitonealmente com 400 ug em cada murganho, duas vezes por semana. A mesma quantidade do Fc da imunoglobulina humana purificada foi injectada em murganhos de controlo negativo. Os resultados experimentais foram apresentados na 21

Figura 5. Nos murganhos de controlo, o tumor cresceu mais de 1000 mm3, 45 dias após a implantação. Todavia, nos murganhos administrados com as proteínas quiméricas, o FP3 inibiu quase completamente o crescimento tumoral (P<0,01), demonstrando um efeito anti-tumoral terapêutico significativo.

Forma de realização 6: Estudo comparativo da proteína quimérica FP3 e FP1 da técnica anterior na inibição do crescimento tumoral em murganhos

De modo a demonstrar ainda mais a actividade suprema ant i-cancerígena de FP3, os efeitos de FP1 e FP3 foram comparados numa experiência do crescimento tumoral. Foram seleccionados 10 murganhos sem pêlo BALB/C saudáveis e cada um foi injectado subcutaneamente no dorso com 1 x 105 células C6 de glioblastoma de rato em 0,05 mL. Depois, foi injectado intraperitonealmente 2,5 mg/kg de PF1 ou PF3 purificado duas vezes por semana, respectivamente, até 31 dias. A mesma quantidade do Fc de imunoglobulina humana purificada foi injectada em murganhos de controlo negativo. Os resultados experimentais são apresentados na Figura 6. A FP1 e FP3 tiveram ambas um efeito terapêutico significativo no tumor. No dia 35, os valores tumorais de murganhos administrados com FP1 e FP3 foram de 1167,3 e 557,6, respectivamente, enquanto o volume do tumor dos murganhos de controlo tratados com Fc já tinha alcançado 1312,3 no dia 24. Por isso, o FP3 tinha efeito mais significativo (P<0,05) do que o FP1 da técnica anterior.

Tomadas em conjunto, as proteínas quiméricas, construídas de acordo com a invenção, tinham uma afinidade elevada para VEGF, foram capazes de inibir a proliferação das células endoteliais 22 vasculares in vitro e inibiram eficazmente o crescimento tumoral in vivo. Uma vez que a angiogénese é critica em todas as células tumorais, as proteínas quiméricas da invenção podem ser utilizadas nas aplicações terapêuticas contra muitos tumores.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Chengdu Kanghong Biotechnologies C. Ltd <120> Proteína quimérica inibidora da angiogénese <130> 489.48.93527 <140> 05752254.2 <141> 2005-06-08 <150> CN20 0410 44965.7 <151> 2004-06-08 <16 0> 13 <170> Patentln Versão 3.3 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens utilização 23 <400> 1

Pro Phe Vai Glu Met Tyr Ser Glu ile Pro Glu lie Ile His Met Thr 15 10 15

Glu Gly Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cys Arg Vai Thr Ser Pro Asn Ile 20 25 30

Thr Vai Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 35 40 45

Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala 50 55 60

Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Vai Asn Gly 65 70 75 80

His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin Thr 85 90

<210> 2 <211> 96 <212> PRT <213> Horao sapiens <400> 2

Phe Ile Thr Vai Lys His Arg Lys Gin Gin Vai Leu Glu Thr Vai Ala 1 5 10 15 Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Vai Lys Ala Phe Pro Ser 20 25 30 Pro Glu Vai Vai Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser 35 40 45 Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Vai Thr 50 55 60 Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gin Ser 65 70 75 80 Asn Vai Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Vai Asn Vai Lys Pro 85 90 95 24

<210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Pro Arg Leu Ser Ile Gin Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr 15 10 15

Thr Leu Gin Ile Thr Cys Arg Gly Gin Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp 20 25 30

Pro Asn Asn Gin Ser Gly Ser Glu Gin Arg Vai Glu Vai Thr Glu Cys 35 40 45

Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Vai Ile Gly 50 55 60

Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala 65 70 75 80

Ser Vai Ile Tyr Vai Tyr 85 <210> 4 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens 25 <4Ο0> 4

Val Vai Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Vai Gly Glu Lys 15 10 15

Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp 20 25 30

Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gin His Lys Lys Leu Val 35 40 45

Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gin Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu 50 55 60

Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gin Gly Leu Tyr 65 70 75 80

Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe 85 90 95 Val Arg Val His Glu Lys 100 <210> 5 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser 15 10

Leu Val Glu Ala Thr Val 15

Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr 20 25

Leu Gly Tyr Pro Pro Pro 30

Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro 35 40

Leu Glu Ser Asn His Thr 45

Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met 50 55

Glu Val Ser Glu Arg Asp 60

Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn 65 70

Pro Ile Ser Lys Glu Lys 75 80

Gin Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr 85 90

Val Pro 26 <210> 6 <211> 1656 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> péptido_mat desde 1 a 1656 < 4 0 0 > 6 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttccggagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 120 atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 180 actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 240 tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 300 acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 360 accaatacaa tcatagatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 420 gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 480 tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc 540 cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 600 agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 660 acatttgtca gggtccatga aaacctttct gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 720 gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 780 ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 840 gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 900 cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt Cgtgtatgtc 960 ccaccgggcc cgggcgacaa aactcacaca tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg 1020 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1080 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1140 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1200 27 1260 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa ggccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1656 <210> 7 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CADEIA desde (1) a (552) <400> 7

Met Vai Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Vai Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 15 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Vai Glu 20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu 35 40 45

Leu Vai Ile Pro Cys Arg Vai Thr Ser Pro Asn Ile Thr Vai Thr Leu 50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile 65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu 85 90 95 28

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Vai Asn Gly His Leu Tyr Lys 100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin Thr Asn Thr Ile Ile Asp Vai Vai 115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Vai Gly Glu Lys Leu Vai 130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Vai Gly Ile Asp Phe Asn 145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gin His Lys Lys Leu Vai Asn Arg 165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gin Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr 180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Vai Thr Arg Ser Asp Gin Gly Leu Tyr Thr Cys 195 200 205

Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Vai Arg 210 215 220

Vai His Glu Lys Pro Phe Vai Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu 225 230 235 240

Vai Glu Ala Thr Vai Gly Glu Arg Vai Arg Leu Pro Ala Lys Tyr Leu 245 250 255

Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu 260 265 270

Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Vai Leu Thr Ile Met Glu 275 280 285

Vai Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Vai Ile Leu Thr Asn Pro 290 295 300

Ile Ser Lys Glu Lys Gin Ser His Vai Vai Ser Leu Vai Vai Tyr Vai 305 310 315 320

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala 325 330 335

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 340 345 350 29

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 355 360 365 Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 370 375 380 Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 385 390 395 400

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 405 410 415

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 420 425 430

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 435 440 445

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 450 455 460

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 465 470 475 480

Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 485 490 495

Lys Ala Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 500 505 510

Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 515 520 525

Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 530 535 540

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 545 550 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial 30 <220> <223> Iniciador <400> 8 cctttcgtag agatgtacag tga <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 9 tatgattgta ttggtttgtc cat <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <40 0> 10 23 gatgtggttc tgagtccgtc tca 31 210 > 11 <211> 23

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 11 cggtgggaca tacacaacca ga 22 210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 12 gacaaaactc acacatgccc 210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador 32 <4 Ο 0> 13 '24 tcatttaccc ggagacaggg agag

Lisboa, 7 de Março de 2012 33

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína quimérica compreendendo diferentes fragmentos dos receptores de VEGF, FLT-1 e KDR, caracterizada por a proteína quimérica consistir no 2o domínio de tipo Ig de FLT-1, o 3o e o 4o domínios de tipo Ig de KDR e o Fc de imunoglobulina humana, cuja proteína quimérica é designada como FLTd2-KDRd3,4-Fc.
2. 2. Proteína quimérica da reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos é como apresentada na SEQ ID N°: 7.
3. 3. ADN recombinante codificante da proteína quimérica da reivindicação 1 ou da reivindicação 2.
4. 4. ADN recombinante da reivindicação 3 que codifica a proteína quimérica da reivindicação 2, em que a sequência de ADN é como apresentada na SEQ ID N°: 6.
5. 5. Vector que compreende as sequências de ADN recombinante das reivindicações 3 ou 4, em que o vector é seleccionado de um plasmídeo, um vírus ou um fragmento de ADN.
6. 6 . Hospedeiro recombinante que contém o vector recombinante da reivindicação 5, em que as células hospedeiras são células eucariotas ou células procariotas.
7. 7. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 1
8. 8. Composição farmacêutica da reivindicação 7, em que a composição farmacêutica é uma solução injectável.
9. 9. Composição farmacêutica como reivindicado na reivindicação 7 ou reivindicação 8 para utilização no tratamento de doenças relacionadas com a angiogénese incluindo tumor, retinopatias diabéticas, artrite, anemia ou hiperplasia do endométrio.
10. 10. Utilização de uma proteina quimérica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 no fabrico de um medicamento para o tratamento anti-angiogénese.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10 no tratamento de doenças relacionadas com a angiogénese incluindo tumor, retinopatias diabéticas, artrite, anemia ou hiperplasia do endométrio.
12. 12. Proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para utilização no tratamento anti-angiogénese.
13. 13. Proteina quimérica de acordo com a reivindicação 12, para utilização no tratamento de doenças relacionadas com a angiogénese, incluindo tumor, retinopatias diabéticas, artrite, anemia ou hiperplasia do endométrio. Lisboa, 7 de Março de 2012 2