KR20220151176A - 혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물 - Google Patents

혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CAP1과 PCSK9 사이의 결합 저해제, CAP1과 레지스틴 사이의 결합 저해제, 또는 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명은 CAP1과 PCSK9의 결합, CAP1과 레지스틴의 결합, 또는 CAP1 유전자의 발현을 억제함으로써 혈중 LDL-콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있는 효과가 있다. 따라서 본 발명은 비정상적인 혈중 콜레스테롤 수준과 이로 인해 발병하는 각종 심혈관 대사질환, 예를 들어 이상지질혈증, 뇌졸중, 동맥경화증 등을 치료하고, 염증을 억제하기 위한 약학적 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물
본 발명은 CAP1과 PCSK9 사이의 결합 저해제, CAP1과 레지스틴 사이의 결합 저해제, 또는 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용, 항염용 약학적 조성물 및 CAP1과 PCSK9 또는 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단용 조성물 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 3월 2일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0026073호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type-9)은 LDL(low-density lipoprotein) 수용체의 내재화 및 리소좀 분해(lysosomal degradation)를 조절함으로써 혈장 LDL-콜레스테롤의 수준을 결정하며, 이에 따라 유망한 치료 표적이 되었다. PCSK9 억제제는 혈장 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키고 개선된 심혈관 결과를 보였다. 그러나 PCSK9가 LDL 수용체의 운명을 결정하는 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았다. LDL 수용체는 LDL-콜레스테롤에 결합된 상태에서 세포로 들어간 후 엔도솜(endosome)에서 LDL-콜레스테롤로부터 분리되어 세포 표면으로 재순환되는 반면, LDL-콜레스테롤은 분해를 위해 리소좀으로 보내진다. 이와는 대조적으로, PCSK9에 결합된 경우 LDL 수용체는 내재화되고 알려지지 않은 메커니즘을 통한 분해를 위해 리소좀으로 안내된다. PCSK9은 단백분해효소(proteinase) K-유사 세린 단백분해효소이지만, 자가촉매적 절단 후 프로-도메인(pro-domain; 아미노산 32-152)의 말단 부분이 세 촉매 작용기(catalytic triad)를 덮음으로써 추가적인 단백질 분해 활성을 방지한다. PCSK9의 촉매 도메인은 LDL 수용체와 결합하고, PCSK9의 또 다른 부분, 즉 C-말단 시스테인-풍부 도메인(cysteine rich domain; CRD)은 단백질 복합체를 리소좀 분해 쪽으로 에스코트하는 추정상의 막-결합 단백질(putative membrane-bound protein)과 상호 작용하는 것으로 의심되어 왔다.
한편, CAP1은 세포의 형태, 이동 및 내포작용(endocytosis)에 중요한 액틴 필라멘트의 동역학을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이전의 연구 결과에서는 CAP1이 인간 레지스틴(resistin)의 수용체임이 보고된 바 있다. 그러나, CAP1이 PCSK9 또는 레지스틴과 상호작용하여 이상지질혈증(dyslipidemia), 뇌졸중, 동맥경화증 등을 포함한 각종 심혈관 대사질환에서 LDL-콜레스테롤 농도 조절에 관여하는지 여부는 전혀 알려진바 없다.
본 발명자들은 CAP1이 LDL 수용체의 운명을 결정하는 PCSK9과 직접 결합하여 상기 수용체의 분해를 유도하며, CAP1과 PCSK9 사이의 결합 또는 CAP1과 레지스틴 사이의 결합을 억제하거나, CAP1의 발현을 억제하는 경우 LDL 수용체의 분해가 저해됨으로써 LDL-콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 이와 동시에 염증이 억제됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(Adenylyl cyclase-Associated Protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및 (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 항염용 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자의 시료 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환의 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(Adenylyl cyclase-associated Protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제의 혈중 콜레스테롤 저하 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제의, 혈중 콜레스테롤 저하 또는 고콜레스테롤혈증에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3(Src homology 3) 결합 도메인 및 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인(cysteine rich domain; CRD)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CAP1의 SH3 결합 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 M1 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 M3 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3 결합 도메인에 존재하는 34B번 아스파르트산(aspartic acid)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 PCSK9의 M1 도메인에 존재하는 494번 라이신(lysine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 PCSK9의 M3 도메인에 존재하는 659번 아르기닌(arginine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제의 혈중 콜레스테롤 저하 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제의, 혈중 콜레스테롤 저하 또는 고콜레스테롤혈증에 대한 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 LDL(Low-density lipoprotein) 수용체의 분해를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 심혈관 대사질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는 조성물의, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는 조성물의, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 심혈관 대사질환은 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 통풍, 뇌졸중, 동맥경화증, 심근경색증, 협심증, 말초혈관 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및 (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i)의 결합 저해제는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (ii)의 결합 저해제는 레지스틴에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 (i) 또는 (ii)의 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 (iii)의 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB의 활성을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 환자의 시료 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환의 진단 방법 또는 이의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 환자의 시료는 간 조직, 간 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 단백질 또는 이의 단편;을 포함하는 시료에 피검물질을 처리하는 단계; (b) 상기 CAP1; 및 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 레지스틴 단백질 또는 이의 단편; 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계의 결합 수준의 측정은 효모단백질잡종법(Yeast two-hybrid), 표면 플라스몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR), 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, PCSK9과 직접 결합하여 LDL 수용체의 생활주기를 조절하는 CAP1이 PCSK9 또는 레지스틴과 결합하는 것을 저해하거나, CAP1 유전자의 발현을 억제함으로써 콜레스테롤 수치를 조절할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 CAP1과 PCSK9 또는 레지스틴 사이의 결합 저해제 또는 CAP1 유전자의 발현 억제제 등은 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 이에 따라 혈중 콜레스테롤의 비정상적 수준과 관련되거나 그로 인해 발병하는 각종 심혈관 대사질환을 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 NF-κB 활성화 억제를 통한 염증 억제 효과도 함께 누릴 수 있다.
도 1a 내지 도 1i는 CAP1과 PCSK9이 직접 상호작용함을 보여주는 도이다: (도 1a) C57/BL6 야생형 마우스의 간 용해물로부터 내인성 CAP1 또는 PCSK9의 면역침강반응 결과; (도 1b) mFc-hCAP1 및 hPCSK9-His의 파-웨스턴 블롯 분석 결과; (도 1c) 살아있는 세포에서 hCAP1과 hPCSK9 사이의 상호작용을 시각화한 이분자 형광 상보성 분석 결과; (도 1d) 외인성 재조합 hPCSK9를 처리한 HepG2 세포에서 CAP1 및 PCSK9의 공편재화를 확인하기 위한 면역형광 염색 결과(오버랩 계수: 평균±표준편차); (도 1e) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 rhPCSK9와 CAP1 사이의 직접 결합 분석 결과(평형 해리 상수: 1.01μM); (도 1f) HEK293 세포에서 hPCSK9-Flag 및 야생형 CAP1 또는 각 CAP1 돌연변이체의 공동면역침강반응 결과; (도 1g) HEK293 세포에서 hPCSK9-Flag 및 CAP1 SH3BD의 공동면역침강반응 결과; (도 1h) HEK293 세포에서 야생형 PCSK9 또는 CRD 결실 PCSK9 돌연변이체와 야생형 hCAP1의 공동면역침강반응 결과; (도 1i) 단백질-단백질 도킹 시뮬레이션 및 결합 에너지 스코어 분석을 이용한 복합체의 3D 분자 모델링.
도 2a 내지 도 2c는 PCSK9의 기능 상실 돌연변이체를 이용한 실험 결과를 나타낸 도이다: (도 2a) 인간 혈장에서 LDL-콜레스테롤과 연관되어 있다고 알려진 8개의 PCSK9-CRD 단일 뉴클레오타이드 변이체에 대한 개략도; (도 2b) PCSK9에 대한 기능 상실 돌연변이체와 CAP1 사이의 결합 친화도 실험 결과; (도 2c) BLItz 시스템을 사용한 PCSK9 야생형 및 그의 돌연변이체와 CAP1의 상호작용에 대한 직접 결합 분석 결과.
도 3a 내지 도 3j는 CAP1이 PCSK9에 의한 LDL 수용체 분해에 필수적임을 보여주는 도이다: (도 3a) PCSK9에 의해 유도된 LDL 수용체의 분해가 CAP1 siRNA에 의해 약화됨을 보여주는 도; (도 3b) CAP1 siRNA를 처리한 HepG2 세포에서 His-rhPCSK9을 처리한 후 LDL 수용체, PCSK9 및 CAP1의 분포를 나타낸 도; (도 3c) CAP1 결핍 세포에서 야생형 CAP1 및 각각의 돌연변이체의 발현에 의해 LDL 수용체 분해 정도를 측정한 결과; (도 3d) CAP1+/- 마우스의 각 장기별 CAP1 발현량을 비교한 도; (도 3e) CAP1+/+ 및 CAP1+/- 마우스에서 LDL 수용체의 발현 수준을 비교한 도; (도 3f) 16주 동안 고지방식이 또는 일반 식이를 섭취한 CAP1+/- 및 CAP+/+ 마우스에서 혈장 콜레스테롤 수치를 측정한 도; (도 3g) 고지방식이를 공급한 CAP+/+ 및 CAP+/- 마우스에서 풀링된 혈장 샘플로부터 FPLC 분획의 콜레스테롤 수준을 나타낸 도; (도 3h) CAP1+/- 및 CAP1+/+ 마우스의 간에서 PCSK9에 의해 유도된 LDL 수용체 분해에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과(P, pro-PCSK9; M, mature PCSK9); (도 3i) ELISA에 의해 측정한 혈장 hPCSK9의 수준; (도 3j) PCSK9을 과발현시키거나 과발현시키지 않은 CAP1+/- 및 CAP1+/+ 마우스에서의 혈장 콜레스테롤 수준 분석 결과.
도 4a 내지 도 4s는 CAP1이 LDL 수용체의 카베올린-의존성 내포작용 및 리소좀 분해를 매개함을 나타내는 도이다: (도 4a 내지 도 4c) HepG2 세포에 재조합 hPCSK9를 처리한 후 LDL 수용체(녹색), PCSK9(적색) 및 엔도솜 마커 EEA1 또는 리소좀 마커 LAMP2(백색)로 일련의 면역형광 염색을 수행한 결과; (도 4d) HepG2 세포에 재조합 hPCSK9를 처리하고 240분이 경과한 후 LDL 수용체(녹색), PCSK9(적색) 및 리소좀 마커 LAMP2(백색)로 면역형광 염색을 수행한 결과; (도 4e) CAP1 siRNA를 처리한 HepG2 세포에 PCSK9 처리 후 LDL 수용체, PCSK9 및 CAP1의 세포 분포를 나타내는 세포막 분획화 및 웨스턴 블롯 분석 결과; (도 4f) 도 4e의 웨스턴 블롯 결과를 정량한 그래프; (도 4g) HepG2 세포에서 재조합 hPCSK9 처리 30분 후 LDL 수용체(녹색)과 카베올린 1(상단에서 적색) 또는 클라트린(하단에서 적색) 사이의 공동 편재화를 비교한 도; (도 4h 및 도 4i) HepG2 세포에서 재조합 인간 PCSK9을 30분 동안 처리한 뒤 클라트린 또는 카베올린-1과 엔도솜 마커 EEA1의 공동 편재화를 보여주는 도; (도 4j 및 도 4k) HepG2 세포에서 카베올린 또는 클라트린을 넉다운한 경우 PCSK9에 의해 유도된 LDL 수용체 분해에 미치는 영향을 나타낸 도; (도 4l) CAP1, 카베올린-1 또는 클라트린에 대한 siRNA를 전처리한 HepG2 세포에서 hPCSK9 처리 240분 후 LDL 수용체(녹색) 및 리소좀 마커 LAMP2(적색)로 면역형광 염색을 수행한 결과; (도 4m) HepG2 세포에서 EGF(적색) 및 알부민(녹색)을 면역형광 염색한 도(scale bar, 10μm); (도 4n) PCSK9 과발현에 의해 유도된 LDL 수용체 분해에서 CAP1, 카베올린-1 또는 클라트린의 넉다운에 따른 영향을 나타낸 도; (도 4o) HepG2 세포에서 PCSK9 처리 15분 후 CAP1 siRNA 처리에 따른 투과 전자현미경 이미지(scale bar, 0.5μm); (도 4p) CAP1과 카베올린-1의 결합에서 SH3BD가 중요함을 보여주는 도; (도 4q) 야생형 마우스의 간 용해물에서 카베올린-1, LDL 수용체, CAP1 및 PCSK9에 대한 면역침강 분석 결과; (도 4r) HepG2 세포에서 LDL 콜레스테롤의 처리 4시간 후 Rab11(적색), LDL 수용체(녹색) 및 DAPI(청색)로 면역형광염색을 수행한 결과; (도 4s) LDL 수용체가 카베올라-의존적 내포작용 및 PCSK9에 의해 유도된 리소좀 분해를 겪는 개략도.
도 5a 및 도 5b는 mFC-CAP1이 말초혈액 단핵구에서 NF-κp65 서브유닛의 활성화를 억제할 수 있음을 보여주는 도이다: (도 5a) 재조합 인간 레지스틴(rhResistin) 및/또는 농도별 mFc-CAP1의 처리에 따른 p65의 인산화 양상을 확인한 웨스턴 블롯 사진; (도 5b) PCSK9 및/또는 농도별 mFc-CAP1의 처리에 따른 p65의 인산화 양상을 확인한 웨스턴 블롯 사진.
도 6a 내지 도 6f는 mFc-CAP1이 간세포에서 LDL 수용체 보호 효과, AMPK 경로 활성화 및 NF-κ억제 효과가 있음을 보여주는 도이다: (도 6a) 재조합 인간 PSCK9(rhPCSK9) 및/또는 농도별(0.1, 1 μg/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 LDL 수용체의 발현 수준, pAMPK 및 pACC 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 각각 GAPDH로 정량화한 그래프(우측); (도 6b) rhPCSK9 및/또는 농도별(0.01, 0.1, 1 μg/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 LDL 수용체의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 정량화한 그래프(우측); (도 6c) rhResistin 및/또는 농도별(50, 150, 500 ng/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 LDL 수용체의 발현 수준, p-p65 및 pAMPK의 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 각각 GAPDH로 정량화한 그래프(우측); (도 6d) rhResistin 및/또는 농도별(10, 50, 500 ng/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 LDL 수용체의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 정량화한 그래프(우측); (도 6e) AMPK를 AICAR로 자극한 후 rhResistin 및/또는 농도별(50, 500 ng/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 pAMPK 및 LDL 수용체의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 GAPDH로 정량화한 그래프; (도 6f) rhResistin 및/또는 농도별(50, 150, 500 ng/ml) mFc-CAP1의 처리에 따른 LDL 수용체의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 사진(좌측) 및 이를 정량화한 그래프(우측).
도 7은 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC)에서 shRNA를 이용한 CAP1 유전자의 넉다운(knock-down)에 따른 LDL-콜레스테롤의 흡수 변화를 확인한 형광현미경 이미지(상단) 및 비교 그래프(하단)이다.
본 발명자들은 CAP1을 PCSK9의 새로운 결합 파트너로 확인함으로써 PCSK9에 의한 LDL 수용체의 내포작용에 대한 이해를 넓혔다.
먼저, 본 발명의 일 실시예에서는 CAP1의 SH3BD(Src Homology 3 Binding Domain)가 PCSK9의 CRD(cysteine rich domain)와 직접 결합함을 보여주었다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 인간 PCSK9에서 발견된 2가지의 기능 손실 다형성(loss-of-function polymorphism)은 CAP1과의 상호작용에 있어 결함이 존재함을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 간세포에서 CAP1에 대한 siRNA뿐만 아니라 혈장 LDL-콜레스테롤의 수준이 낮은 이형접합 CAP1 넉아웃 마우스에서 PCSK9-매개성 LDL 수용체의 분해가 방지됨을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CAP1이 카베올린-1에 결합하고, 이어서 PCSK9-LDL 수용체 복합체를 카베올라-의존성 내포작용 및 리소좀성 분해로 이끈다는 것을 증명하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CAP1의 경쟁적 저해제로서 mFc-CAP1을 제조하고(실시예 5 참조), 이를 말초혈액 단핵구 및 간세포에 처리하여 LDL 수용체에 대한 보호 효과 및 체내 거의 모든 염증반응의 조절과 관련된 NF-κB의 억제 효과를 확인하였다(실시예 6 및 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CAP1을 넉다운하여 그 발현을 억제한 경우 LDL 콜레스테롤에 대한 흡수가 억제됨을 확인하였다(실시예 8 참조).
이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(Adenylyl cyclase-associated Protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “CAP1”은, 'Adenylyl cyclase-associated Protein 1'을 의미하는 것으로서, 구조적, 기능적인 면에서 세 개의 도메인으로 나눌 수 있다. 첫째로, 높게 보존된 카르복실 말단 도메인은 단량체의 액틴과 결합하고, 일반적인 세포 형태학에 필수적이다. 두 번째로, CAP1의 아미노 말단 도메인은 효모에서 아데닐산 고리화효소(adenylyl cyclase)와 상호작용한다. 세 번째로, 중앙에 위치하는 프롤린-리치 도메인(proline-rich domain)은 특정 단백질들의 SH3(Src homology 3)도메인과 상호작용한다. 본 발명에 따른 CAP1은, 예를 들어 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “PCSK9”은, 'proprotein convertase subtilisin/kexin type-9'을 의미하는 것으로서, 인간 PCSK9 유전자는 염색체 1p32.3 상에 위치하고, 25,378bp 길이이다. 이는 692개의 아미노산을 코딩하는 12개의 엑손을 함유한다. PCSK9 단백질은 신호 펩티드, 프로-도메인, 촉매 도메인, 및 3개 모듈 (M1, M2 및 M3)로 구성된 C-말단 시스테인-히스티딘-풍부 도메인을 함유한다. 본 발명에 따른 PCSK9은, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 “서열 상동성의 %”의 의미는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, CAP1 또는 PCSK9에 결합하여 이들의 상호 작용을 방해할 수 있는 모든 물질은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, “펩타이드 모방체(Peptide mimetics)”는 CAP1 또는 PCSK9의 결합 도메인에 결합하여 CAP1과 PCSK9 사이의 결합을 저해하는 것이다. 펩타이드 모방체는 펩타이드 또는 비펩타이드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 구조적으로 강제된(conformationally constrained) 펩타이드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩타이드 모방체는 CAP1 또는 PCSK9 단백질의 이차 구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머(aptamer)”는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오타이드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 CAP1 단백질은 PCSK9과 특이적으로 결합할 수 있을 정도의 단편, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 PCKS9의 421번째 아미노산부터 629번째 아미노산 부분에 해당하는 시스테인-풍부 도메인(cystein-rich domain)에 특이적으로 결합할 수 있을 정도의 단편일 수 있으며, 상기 단편은 CAP1 단백질의 SH3 결합 도메인 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 폴리펩타이드의 길이에는 제한이 없다.
상기 Fc 단편은 인간을 포함한 포유류, 예를 들어 원숭이, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 개, 고양이, 소, 돼지, 말 등의 면역글로불린 중쇄에서 유래한 것일 수 있고, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 면역글로불린 중쇄에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Fc 단편의 서열은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 체내 CAP1이 PCSK9 또는 레지스틴과 결합하는 것을 저해하고, 상기 체내 CAP1 대신 PCSK9 또는 레지스틴과 결합하여 이들에 의해 조절되는 LDL 수용체의 분해를 저해하기 위한 목적을 달성할 수 있는 한도 내에서 그 서열을 적절하게 변형/수정하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 Fc 단편은 CAP1 단백질의 N-말단 부분 또는 바람직하게는 C-말단 부분에 결합될 수 있으며, 직접 결합되거나 본 발명의 기술분야에서 널리 알려진 펩타이드 링커 또는 힌지(hinge)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 융합 단백질은 인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편 또는 마우스 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편이 각각 융합된 CAP1 단백질일 수 있다. 이때, 인간 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편이 융합된 CAP1 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 5의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 마우스 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편이 융합된 CAP1 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 7의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 기능적 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서, 상기 서열번호 4로 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩타이드(polypeptide)를 의미하며, PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 인간 CAP1 단백질에 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편이 콘쥬게이션된 융합 단백질(Fc-CAP1)을 제조하였고, 이의 LDL 수용체 보호 효과를 직접 관찰하였으며, 이에 따라 상기 Fc-CAP1은 혈중 LDL-콜레스테롤 수치를 저하시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3(Src homology 3) 결합 도메인 및 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인(cysteine rich domain; CRD)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 결합하는 것일 수 있다.
이때, 상기 결합 저해제가 상호작용하는 CAP1의 SH3 결합 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 상기 아미노산 서열은 SH3 결합 도메인의 Asp34B 아미노산을 포함하는 길이 3-250, 3-200, 3-150, 3-100, 3-50, 3-25, 3-10, 3-7 또는 3-5의 아미노산 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3 결합 도메인에 존재하는 Asp34B를 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 예를 들어, CAP1의 SH3 결합 도메인 내에 Asp34B를 포함하는 부위에 특이적으로 결합하여 PCSK9과의 결합을 저해하는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 PCSK9의 CRD는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 CRD는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 M1 도메인 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 M3 도메인을 포함한다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 PCSK9의 M1 도메인에 존재하는 494번 라이신(lysine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 494번째 아미노산을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하여 PCSK9과의 결합을 저해하는 것일 수 있다.
이때, 상기 결합 저해제가 결합하는 PCSK9의 M1 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 상기 아미노산 서열의 42번째 아미노산(또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 494번째 아미노산)을 포함하는 길이 3-70, 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 3-7 또는 3-5의 아미노산 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 PCSK9의 M3 도메인에 존재하는 659번 아르기닌(arginine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 659번째 아미노산을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하여 PCSK9과의 결합을 저해하는 것일 수 있다.
이때, 상기 결합 저해제가 결합하는 PCSK9의 M3 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 상기 아미노산 서열의 56번째 아미노산(또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 659번째 아미노산)을 포함하는 길이 3-85, 3-75, 3-65, 3-55, 3-45, 3-35, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 3-7 또는 3-5의 아미노산 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 CAP1 유전자의 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “발현 억제”는 CAP1 유전자의 전사 억제 및 단백질로의 번역 억제를 포함하는 의미이다. 또한, 유전자의 발현이 완전히 정지된 것뿐만 아니라 발현이 감소된 것도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “siRNA, shRNA 및 miRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 miRNA, siRNA 및 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “리보자임”은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오타이드 서열을 인식하여 부위 특이적으로 절단시킴으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “PNA”는 핵산 모방체, 예를 들어, DNA 모방체를 의미하고, 여기에서 데옥시리보오스 포스페이트 백본은 슈도펩티드 백본으로 치환되고 단지 원래 4개의 뉴클레오염기가 유지된다. PNA의 중성의 백본은 낮은 이온성 강도의 조건 하에 DNA 및 RNA에 특이적인 하이브리드를 제공하는 것으로 알려져 있으며, 전사 또는 번역 억제를 유도하거나 복제를 억제하여 유전자 발현의 서열-특이적 조절에 대한 안티센스 또는 항원 제제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 상기 siRNA 서열 또는 shRNA 서열은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 CAP1 유전자의 발현 억제(또는 넉다운) 목적을 달성할 수 있는 한도 내에서 적절하게 변형/수정하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, LDL-콜레스테롤을 포함하는 총 콜레스테롤일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 LDL(Low-density lipoprotein) 수용체의 분해를 억제하는 것일 수 있다. CAP1의 발현 또는 활성을 억제하면 PCSK9에 의한 LDL 수용체의 분해가 억제되며, 이에 따른 결과로서 혈중 LDL-콜레스테롤 수치를 낮출 수 있는 효과가 있는 것이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 심혈관 대사질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 융합 단백질에 대한 사항은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 심혈관 대사질환은 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 통풍, 뇌졸중, 동맥경화증, 심근경색증, 협심증, 말초혈관 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 혈중 콜레스테롤 수치의 이상 또는 이로 인하여 발생하는 병증이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및 (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (i)의 결합 저해제는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 (ii)의 결합 저해제는 레지스틴에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (i) 또는 (ii)의 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 (iii)의 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB의 활성을 억제할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리바이닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “개체”란 질병의 예방, 치료, 치료 증진 또는 내성 억제를 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있으며, 식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 다이사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “건강기능식품”이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항대사성질환 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 건강기능식품은 CAP1과 PCSK9 또는 레지스틴 사이의 결합 저해제 또는 CAP1 유전자의 발현 억제제를 포함하되, 적절한 식품보조제가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 CAP1과 PCSK9의 결합이 증가하면 LDL 수용체의 분해도 증가되어 혈중 콜레스테롤의 농도가 높아지거나, 반대로 Fc-CAP1에 의해 CAP1과 레지스틴의 결합이 방해되는 경우 LDL 수용체의 분해가 감소되어 혈중 콜레스테롤의 농도가 감소됨을 확인하였는바, CAP1과 PCSK9의 결합 수준, 또는 CAP1과 레지스틴의 결합 수준을 측정하였을 때, 정상 대조군과 비교하여 더 높은 결합 수준을 보인 경우 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환이 있는 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 환자의 시료 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 환자의 시료는 간 조직, 간 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 단백질 또는 이의 단편;을 포함하는 시료에 피검물질을 처리하는 단계; (b) 상기 CAP1; 및 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 레지스틴 단백질 또는 이의 단편; 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 결합 수준의 측정은 효모단백질잡종법(Yeast two-hybrid), 표면 플라스몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR), 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있으나, CAP1과 PCSK9의 결합 수준을 측정할 수 있는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. CAP1은 PCSK9의 CRD(cysteine rich domain)에 직접 결합한다.
마우스 간 조직에서 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용하여 CAP1 및 PCSK9 사이의 물리적 상호작용을 확인하였다(도 1a). 파-웨스턴 블롯(far-western blot) 분석을 위해, 비-환원 조건하에 정제된 mFc-CAP1 또는 His-PCSK9를 프레이(prey)로서 사용하고, 각각에 대한 베이트(bait)로서 His-PCSK9 또는 mFc-CAP1를 사용하였다(도 1b). 살아있는 세포에서 상기와 같은 상호작용을 시각화하기 위해, 각 단편에 융합된 단백질 사이의 상호작용에 의해 함께 모이는 형광 단백질의 두 비-형광 단편 사이의 상보성에 기반한 이분자 형광 상보성 분석(Bimolecular fluorescence complementation assay)을 수행하였다. 이를 통해 hCAP1과 hPCSK9 사이의 직접적인 결합을 명확하게 시각화하였다. 도 1c에 나타난 바와 같이 CAP1 및 PCSK9가 각각의 단편(pVC155 및 pVN173)에 융합되고 둘 다 발현될 때 녹색 형광이 관찰되었다(왼쪽 패널). 그러나, 인간 CAP1 또는 PCSK9가 단독으로 발현될 때, 형광은 검출되지 않았다(각각 중간 및 우측 패널).
또한, 면역형광 염색(immunofluorescent staining)을 통해 HepG2 세포에 재조합 PCSK9을 처리한 경우 세포막과 세포기질(cytosol)에서 PCSK9은 CAP1 및 LDL 수용체와 함께 편재화 됨을 입증하였다(도 1d). 마지막으로, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 기반 시스템을 이용하여 직접 결합 분석을 수행한 결과 PCSK9의 용량 의존적으로 CAP1과 PCSK9 사이의 반응 단위(response unit)가 증가함을 확인하였다(도 1e).
나아가, 본 발명자들은 PCSK9의 CRD가 CAP1의 SH3BD(Src Homology 3 Binding Domain)와 결합하는지 여부에 대하여 시험하였다. 이를 위하여 wtPCSK9-Flag와 다음의 CAP1 돌연변이체를 사용한 시험관내 공동면역침강 분석을 수행하였다: 아데닐산 고리화효소 결합 도메인 결실(ΔACBD) 돌연변이체, 액틴 결합 도메인 결실(ΔActinBD) 돌연변이체 및 SH3BD와 ActinBD 결실(ΔSH3BD ΔActinBD) 돌연변이체.
그 결과 도 1f에 나타난 바와 같이, PCSK9는 wtCAP1, ΔACBD 돌연변이체 및 ΔActinBD 돌연변이체와 상호작용하였지만, ΔSH3BD ΔActinBD 돌연변이체와는 상호작용하지 않았으며, 이는 CAP1이 SH3BD를 통해 PCSK9에 결합함을 시사하는 것이다. 또한, 도 1g에 나타난 바와 같이 CAP1의 SH3BD은 PCSK9와의 상호작용에 충분함을 확인하였다. CAP1은 wtPCSK9와는 결합하였지만, CRD 결실 PCSK9과는 그렇지 못했다(도 1h).
나아가, 도 1i에 나타난 바와 같이, 단백질-단백질 도킹 시뮬레이션 및 결합 에너지 스코어 분석을 이용한 복합체의 3D 분자 모델링 분석을 통해 CAP1의 SH3BD에 존재하는 Asp34B와 PCSK9-CRD의 M1 도메인에 존재하는 Lys494 및 M3 도메인에 존재하는 Arg659 사이의 상호작용이 주요함을 확인하였다.
실시예 2. PCSK9 기능 손실 돌연변이체는 CAP1과 상호작용할 수 없다.
본 발명자들은 인간 유전자 연구에서 발견된 잘 알려진 기능 손실 및 기능 획득 변이를 포함하는 PCSK9-CRD의 부위-특이적 돌연변이유도(site-directed mutagenesis)에 의해 8개의 PCSK9 점돌연변이체(point mutants)를 생성하였다(도 2a; 화살표는 점돌연변이 유발 지점). HepG2 세포에서 PCSK9의 Q544E 및 H683fs 돌연변이체는 발현되지 않았으며, 이는 이들 돌연변이체가 단백질의 발현 또는 안정성과 관련이 있음을 시사한다.
이와는 대조적으로, 도 2b에 나타난 바와 같이, PCSK9 CRD의 S668R 및 G670E 돌연변이체는 잘 발현되었지만, CAP1과의 결합 능력이 심각하게 손상되었음이 면역침강법에 의해 확인되었다. 이러한 결과는 PCSK9의 CRD가 CAP1과의 결합에 있어 중요하며, LDL 수용체 단백질, 즉 LDL-콜레스테롤의 수준을 조절하는데 중요하다는 것을 시사하는 것이다.
PCSK9-CRD 돌연변이와 CAP1의 직접적인 상호작용에 대한 추가적인 특징을 알아보기 위해, 본 발명자들은 BLItz 시스템(Molecular Devices, LLC., 미국)을 사용하여 CAP1에 대한 PCSK9 WT, PCSK9 A514T, PCSK9 G670E 및 PCSK9 S668RG670E의 결합 친화도(affinity)를 측정하였다. 그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이, PCSK9 A514T는 WT(야생형)에 비해 더 강한 상호작용을 보인 반면, G670E 및 G670ES668R 돌연변이체는 더 약한 상호작용을 나타냈다.
실시예 3. CAP1은 PCSK9-매개 LDL 수용체 분해를 유도하고, LDL-콜레스테롤의 수준을 증가시킨다.
3.1. siRNA를 이용한 CAP1 발현 억제 효과 연구
HepG2 세포에서 PCSK9 처리는 용량 의존적으로 LDL 수용체의 분해를 촉진시킨다. 본 발명자들은 CAP1의 발현 억제가 LDL 수용체의 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 CAP1 유전자를 siRNA를 이용하여 발현을 억제시켰다. siRNA 서열은 다음과 같다:
CAP1 siRNA, 5'-AAACCGAGTCCTCAAAGAGTA-3' (서열번호 8).
그 결과 도 3a에 나타난 바와 같이, CAP1이 siRNA(siCAP1)에 의해 고갈되면 외인성 PCSK9 의한 LDL 수용체의 분해 또한 현저하게 저하되었다. 또한, 도 3b에 나타난 결과는 CAP1 siRNA가 처리된 세포의 세포기질에서 His-rhPCSK9를 처리한지 30분 또는 60분 후 모두 LDL 수용체 및 외인성 His-태그된 PCSK9가 덜 검출된다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명자들은 과발현에 의해 wtCAP1 또는 각각의 CAP1 돌연변이체를 갖는 CAP1 결핍 세포(siCAP1)를 회복(rescue)시키고, PCSK9-매개성 LDL 수용체 분해를 조사하였다. 그 결과 도 3c에 나타난 바와 같이, wtCAP1 및 ΔactinBD 돌연변이체만이 감쇠된 PCSK9-매개성 LDL 수용체 분해를 회복시켰으며, 상기 결과는 SH3BD 및 ACBD가 외인성 PCSK9-매개 LDL 수용체 분해에 중요하다는 것을 시사하는 것이다.
3.2. CAP1 넉아웃 마우스를 이용한 CAP1의 LDL 수용체 분해 효과 연구
생체내(in vivo)에서 CAP1의 역할을 알아보기 위해, TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)을 이용하여 CAP1 엑손 3를 표적화한 CAP1 넉아웃(knock-out) 마우스를 생성하였다. 동형접합 넉아웃 마우스는 배아 16.5일째에 사망함에 따라 이종접합 넉아웃 마우스(CAP1+/- 마우스)를 사용하였다. CAP1+/- 마우스의 장기(organs)는 최대 약 16주까지 야생형 마우스의 장기와 다르지 않았으며, CAP1의 mRNA 및 단백질 수준은 CAP1+/- 마우스의 다양한 장기에서 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 3d). 이에 따라, 본 발명자들은 고지방식이(high-fat diet)를 실시하거나 하지 않은 CAP1+/- 마우스 및 CAP1+/+ 마우스의 간에서 LDL 수용체 및 PCSK9의 발현 수준을 비교하였다. rt-PCR을 통한 LDL 수용체의 mRNA 발현을 조사에서는 유의한 차이를 확인할 수 없었으나, LDL 수용체의 단백질 수준은 CAP1+/+ 마우스에서 보다 CAP1+/- 마우스에서 현저하게 높았다(도 3e). 상기 결과에 부응하여, 고지방식이 하에서 CAP1+/- 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 더 낮은 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 수치를 가지고 있음이 확인되었다(도 3f). 혈장 트리글리세리드(triglyceride, TG) 및 고밀도 지단백질(HDL) 콜레스테롤 수준에는 유의한 차이가 없었다.
다음으로, 본 발명자들은 FPLC(Fast protein liquid chromatography)에 의해 혈장 지단백질을 분별(fractionation)함으로써, 고지방식이를 한 CAP+/+ 마우스와 비교하여 CAP1+/- 마우스에서 LDL-콜레스테롤 및 VLDL-콜레스테롤 수준이 감소하고, HDL-콜레스테롤이 큰-부력 형태(large-buoyant form)로 이동한 것을 확인하였다(도 3g).
이어서 본 발명자들은 CAP1+/- 및 CAP1+/+ 마우스에서 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus)를 사용하여 PCSK9를 과발현시킨 후, LDL 수용체의 발현 수준 및 LDL-콜레스테롤의 수준을 측정하였다. 그 결과 도 3h 내지 3j에 나타난 바와 같이, CAP1 이형-넉아웃 마우스에서는 PCSK9의 형질도입(transduction)에 의한 LDL 수용체 단백질의 감소 또는 분해가 방지되어 야생형 동물에 비해 개선된 콜레스테롤 프로파일(profile)을 나타냈다. 이러한 결과는 CAP1 단백질이 PCSK9에 의한 LDL 수용체 단백질의 분해에 필수적임을 보여주는 것이다.
실시예 4. CAP1은 PCSK9-LDL 수용체 복합체의 카베올라-의존적 내포작용을 유도하여 LDL 수용체의 분해를 초래한다.
LDL 수용체의 PCSK9-매개성 분해는 리소좀 프로테아제 억제제(E-64d)에 의해 독점적으로 차단되었지만, 프로테아좀(proteasome; lactacystin) 또는 오토파지(autophagy; bafilomycin)의 억제제에 의해서는 차단되지 않았으며, 이는 LDL 수용체가 이전에 보고된 바와 같이 리소좀 경로에 의해 분해됨을 시사한다. 이와 같은 발견은 또한 Cy3 염료가 콘쥬게이션된 PCSK9(PCSK9-Cy3)를 처리한 HepG2 세포에서 PCSK9-Cy3, 엔도솜 마커 EEA1(early endosome antigen 1) 및 리소좀 마커 LAMP2(lysosome-associated membrane protein 2)를 갖는 LDL 수용체를 다양한 시점에서 추적함으로써 설명되었다. 즉, PCSK9-Cy3 처리 후 30분 내에 EEA1은 PCSK9 및 LDL 수용체와 함께 편재화(co-localization)되었다(도 4a). 이어서, 60분 내에 PCSK9 및 LDL 수용체와 함께 편재화되는 LAMP2가 나타났다(도 4b). 이는 PCSK9 및 LDL 수용체가 사라진 240분까지 증가하였다(도 4a 및 4c). 이와 같은 초기 엔도솜 형성이 아닌 리소좀 형성은 CAP1 고갈에 의해 차단되었다(도 4d).
래프트(raft) 분리 실험에서, 외인성 PCSK9 처리 전의 내인성 PCSK9는 비-래프트 분획에 더 많이 분포하였다[래프트(36.8%)/비-래프트(63.2%)]. 외인성 PCSK9 처리 후 30분 이내에, 그것은 주로 지질 래프트 분획에 포함되었으며 [래프트(54.3%)/비-래프트(45.7%)], 이는 카베올라(caveolae) 형성에 밀접하게 관련이 있는 것이다(도 4e 및 도 4f). 막 분획에서의 LDL 수용체 발현은 PCSK9 처리 60분 후에 감소하였다. 그러나, CAP1 결핍 세포에는 PCSK9을 처리하였음에도 불구하고 PCSK9 및 LDL 수용체의 발현 패턴에는 유의한 변화가 나타나지 않았다(도 4e 및 도 4f).
PCSK9에 의한 초기 엔도솜 형성은 클라트린(clathrin) 경로에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 그러나, PCSK9 처리는 클라트린뿐만 아니라 카베올린과 함께 편재화된 엔도솜의 수도 증가시켰다(도 4g). 흥미롭게도, 강화된 엔도솜 형성과 관련하여, PCSK9 처리 후 CAP1의 넉다운은 카베올린-엔도솜은 감소시켰지만 클라트린-엔도솜은 감소시키지 않았으며, 이러한 결과는 CAP1이 PCSK9-LDL 수용체 복합체의 클라트린-매개 내포작용(endocytosis)이 아닌 카베올린-매개 내포작용을 유도함을 시사하는 것이다(도 4h 및 도 4i).
따라서, 카베올린 또는 클라트린을 넉다운하여 PCSK9의 처리에 따른 카베올린 및 클라트린-매개 LDL 수용체 내포작용을 각각 비교하였다. 그 결과 도 4j에 나타난 바와 같이 카베올린 결핍 세포에서 LDL 수용체는 PCSK9의 처리에도 불구하고 분해되지 않았다. 이와 비교하여 도 4k에서 나타난 바와 같이 클라트린 결핍 세포에서 PCSK9의 처리에 의해 용량-의존적 방식으로 LDL 수용체가 분해되는 것을 확인하였고, 이러한 결과는 PCSK9-매개 LDL 수용체의 분해가 클라트린-비의존적임을 암시하는 것이다.
카베올린이 없는 경우, LAMP2는 형성될 수 없었고 LDL 수용체는 PCSK9에 의해 분해되지 않았다. 반면, 클라트린이 없는 경우에는 LAMP2가 나타났고 LDL 수용체는 분해되었다(도 4l). 또한, CAP1의 넉다운은 LAMP2를 생산할 수 없었으며, 이는 CAP1이 PCSK9에 의한 LDL 수용체의 카베올린-매개 분해에 밀접하게 관련되어 있음을 시사하는 것이다(도 4l).
다음으로, 본 발명자들은 CAP1의 결핍에 따른 EGF 또는 알부민의 내포작용에 대한 영향을 평가하였다. EGF 및 이의 수용체 복합체는 주로 클라트린-의존성 내포작용에 의해 내재화되는 반면, 알부민의 흡수는 카베올라에 의존하는 것으로 알려져 있다. 그 결과 도 4m에 나타난 바와 같이, 카베올린-의존성 알부민 내포작용은 CAP1의 결핍에 의해 상당히 감소한 반면, 클라트린-의존적 EGF 수용체 내포작용은 아무런 영향을 받지 않았다.
이러한 관찰은 CAP1이 PCSK9-LDL 수용체 복합체의 내포작용뿐만 아니라 일반적인 카베올린-의존성 내포작용에 관여할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 도 4n에 나타난 바와 같이, 내인성으로 과발현된 PCSK9에 의해 매개된 LDL 수용체의 분해는 CAP1 또는 카베올린에 대한 siRNA에 의해 약화되었다. 또한, 전자현미경 분석은 PCSK9 처리 후 클라트린이 아닌 카베오좀(caveosome)의 형성만이 CAP1 siRNA에 의해 현저하게 약화됨을 보여주었다(도 4o). CAP1이 PCSK9-LDL 수용체 복합체를 카베오좀에 유도하는 메커니즘은 CAP1의 AC-도메인과 카베올린-1의 결합에 기초한다. 면역침강 실험에서, LDL 수용체를 포함하는 PCSK9은 wtCAP1 및 카베올린-1과의 복합체를 형성할 수 있었지만, ΔSH3BD ΔactinBD 또는 ΔACBD CAP1과 같은 돌연변이체 CAP1의 존재하에서는 불가능하였다(도 4p). 이러한 결과는 CAP1의 SH3BD는 PCSK9의 CRD와의 결합에 필수적임을 증명하는 것이다.
또한, CAP1의 ActinBD는 카베올린과의 결합에 필요하다. 도 4q에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스의 간 용해물에 대한 면역침강 분석은 카베올린이 LDL 수용체, CAP1 및 PCSK9에 결합한다는 것을 보여주었다. 추가로, 마우스 간에서 LDL 수용체-PCSK9-CAP1 복합체는 카베올린과 함께 편재화되었다. LDL-콜레스테롤을 처리하고 1시간 경과 후 초기 엔도솜 마커 Rab5와 함께 염색되는 LDL 수용체 내포작용은 클라트린 siRNA 및 카베올린 siRNA 둘 다에 의해 유의하게 감소하였다. siRNA-감쇠 LDL 수용체 분해 경로로 PCSK9을 차단한 경우, 카베올린-매개 LDL 수용체 내포작용은 유의하게 감소된 반면, 클라트린-매개 내포작용에는 유의한 변화가 없었다. 게다가, LDL-콜레스테롤 처리 4시간 후 재순환 메커니즘과 관련된 Rab11과 LDL 수용체를 공동-염색한 경우, 카베올린 siRNA를 처리한 경우와 비교하여 클라트린 siRNA를 처리한 경우 재순환 LDL 수용체의 양이 현저하게 감소되었다(도 4r).
상기 실시예 1 내지 4를 통해 증명된 결과를 종합하면, 도 4s의 개략도에 나타난 바와 같이, LDL 수용체는 LDL-콜레스테롤과 결합함에 따라 클라트린-의존적 내포작용에 의해 세포 내로 들어가고, 그 후 엔도솜의 산성 pH에 의해 알로스테릭 해리(allosteric dissociation)가 유발되어 세포 표면으로 재생된다. PCSK9는 또한 클라트린-의존성 내포작용을 촉진하지만, LDL 수용체의 리소좀 분해를 야기하지는 않는다. 그러나 LDL 수용체 및 PCSK9의 복합체가 CAP1과 상호작용할 때, CAP1이 액틴 결합 도메인을 통해 카베올린-1에 결합할 수 있기 때문에, 이들 단백질은 카베올린-의존적 내포작용에 의해 세포로 들어가게 된다. 이어서, LDL 수용체-PCSK9-CAP1 복합체를 함유하는 카베올린-코팅된 엔도솜은 분해를 위해 리소좀으로 유도된다. 즉, CAP1은 PCSK9의 결합 파트너로서 카베올린 의존성 LDL 수용체의 내포작용 및 리소좀성 분해를 매개하는 필수적인 분자임을 최초로 밝힌 것이다.
실시예 5. CAP1의 경쟁적 저해제 Fc-CAP1의 제조
본 발명에 따른 hFc-CAP1은 서열번호 4의 아미노산 서열에 따라 단백질 합성 업체에 의뢰하여 제작하였다. mFc-CAP1의 발현을 위해, pCEP4 발현 벡터를 이용하였다.
단백질 정제에 사용한 Expi293 세포의 배양은 제조사(Thermo Scientific, 미국)의 배양 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 보다 구체적으로, FreeStyle 배지에 0.5X 항균-항진균제(antibiotic-antimycotic; Gibco, 15240-062, 미국)를 첨가하여 온도 37℃, CO2 분압 7%, 140 RPM이 유지되는 진탕기에서 배양하였다. mFc-CAP1 플라스미드 형질도입시 1 ml당 1 × 106 세포수로 300 ml을 배양하였다. 다음날 형질주입 혼합체[150 mM NaCl 30 ml + 600 μg (2 μg/ml) mFc-CAP1 플라스미드 + 1200 μg PEI]를 만들어 상온에서 30분간 배양한 후 드롭방식(drop wise manner)으로 세포에 넣어주었다. 형질을 주입한 날로부터 7일째 세포와 배지를 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 회수하였다. 상기 회수한 상등액은 농축 후 컬럼과 mFc 비드(CaptureSelect™IgG-Fc, ms)를 이용하여 걸러주고, 0.1M 글라이신(pH 2.8)을 이용해 순차적으로 비드에서 분리하였다. 이후, 웨스턴 블롯(western blot)으로 단백질의 발현 정도를 확인하고, 컬럼(Zeba™Spin Desalting Columns)을 이용해 버퍼를 PBS로 투석하였다.
상기와 같이 분리·정제된 mFc-CAP1은 하기 실시예 6 내지 8에서 CAP1과 레지스틴 또는 CAP1과 PCSK9 사이의 결합 저해제(또는 억제제)로서 사용되었다.
실시예 6. 말초혈액 단핵구에서 mFc-CAP1은 NF-κB p65 서브유닛의 활성화를 억제한다.
인간 단핵구 세포주 THP-1 세포는 ATCC(American type culture collection, 미국) 사의 배양 방법에 따라 1X 항균-항진균제(antibiotic-antimycotic; Gibco, 15240-062, 미국) 및 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 RPMI 배지에서 온도 37℃, CO2 분압 5%가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 이후 THR-1 세포를 RPMI 배지로 희석한 다음, 각 well 당 1 × 106 cells로 세포를 균일하게 넣어주고, 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
THP-1 세포에 대한 효과를 극대화하기 위해 0.1% FBS RPMI에서 37℃, 5% CO2 조건으로 16시간 동안 배양하여 세포의 기아(starvation) 상태를 유도하였다. 그 뒤, 1 μg/ml의 재조합 인간(recombinant human; rh) PCSK9 또는 50 ng/ml 재조합 인간 레지스틴(recombinant human resistin; rhResistin)을 각 농도(0.1, 0.5, 2 μg/ml)별 mFc-CAP1과 혼합하여 30분 동안 사전 배양한 다음, 이를 THP-1 세포에 30분 동안 처리하였다. 이후 세포 용해 버퍼(lysis buffer; CST, #9803)를 이용하여 THP-1 세포로부터 단백질을 분리하고 이를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인하였다.
그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, THP-1에서 레지스틴의 처리에 의해 p65 서브유닛의 S276 위치가 인산화(phosphorylation)되어 NF-κ의 활성화를 유도하는데, mFc-CAP1을 함께 처리한 그룹의 경우 농도 의존적으로 p65의 인산화가 억제되는 것이 확인되었다. PCSK9의 경우 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이 THP-1에서 PCSK9의 처리에 의해 p65 서브유닛의 S276 위치가 인산화되며, mFc-CAP1을 함께 처리하면 농도 의존적으로 p65의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 PCSK9에 의한 NF-κB 활성화에 따른 염증의 유도가 mFc-CAP1에 의해 효과적으로 저해됨을 의미하는 것이다.
실시예 7. 간세포에서 mFc-CAP1은 LDL 수용체의 분해 및 NF-κB의 활성화를 억제하고 AMPK 경로의 활성화를 촉진한다.
7.1. HepG2 인간 간암세포의 배양
HepG2 세포는 ATCC 사의 배양 방법에 따라 1X 항균-항진균제(Gibco) 및 10% FBS를 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, high glucose) 배지에서 온도 37℃, CO2 분압 5%가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 이후 HepG2 세포를 DMEM 배지로 희석한 다음, 각 well 당 5 × 105 cells로 세포를 균일하게 넣어주고, 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
7.2. mFc-CAP1의 PCSK9 매개 LDL 수용체 보호 효과 및 AMPK 경로 활성화 효과 확인
HepG2 세포를 기본(basal) DMEM으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 그 뒤, 상기 세포에 2 μg/ml 재조합 인간 PCSK9과 각 농도(0.1, 1 μg/ml 또는 0.05, 0.15, 0.5 μg/ml)별 mFc-CAP1을 동시에 4시간 동안 처리하였다. 이후 세포 용해 버퍼(CST, #9803)를 이용하여 HepG2 세포로부터 단백질을 분리하고, 이를 전기영동 한 다음 단백질을 PVDF 막(polyvinylidene fluoride membrane; Millipore, 미국)으로 트랜스퍼 한 후 각 항체를 반응시켰다.
그 결과 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, HepG2 세포에서 PCSK9을 단독 처리한 경우 PCSK9에 의해 LDL 수용체의 분해가 촉진되었으며, mFc-CAP1을 동시에 처리한 경우에는 LDL 수용체에 대한 보호 효과가 농도 의존적으로 나타나는 것을 확인하였다. 또한, mFc-CAP1 처리 시 AMPK가 효과적으로 인산화되고, 이에 따라 ACC의 인산화가 억제됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 mFc-CAP1이 AMPK 활성화를 통해 LDL 수용체 분해를 성공적으로 억제할 수 있으며, 따라서 혈중 LDL-콜레스테롤의 수치를 감소시키기 위한 LDL 수용체의 보호 효과가 있음을 직접적으로 보여주는 것이다.
7.3. mFc-CAP1의 레지스틴 매개 LDL 수용체 보호 효과 및 NF-κ억제 효과 확인
HepG2 세포에 50 ng/ml rh레지스틴과 각 농도(0.1, 1 μg/ml 또는 0.05, 0.15, 0.5 μg/ml)별 mFc-CAP1을 처리하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 12~16시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 7.2에서와 동일한 방법에 의해 단백질을 얻어 전기영동 한 후 각각에 특이적인 항체와 반응시켰다.
그 결과 도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, mFc-CAP1과 rh레지스틴을 밤새 공동처리 하였을 때, rh레지스틴에 의한 LDL 수용체의 분해 수준은 비교적 온화한 것으로 나타났다. 또한, 레지스틴에 의해 활성화된 p-p65는 mFc-CAP1의 처리에 의해 감소한 반면, pAMPK는 mFc-CAP1 처리에 따라 활성화되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는, 본 발명에 따른 mFc-CAP1이 레지스틴에 의한 LDL 수용체 분해를 억제할 수 있으며, 이는 p65의 인산화 억제 및 AMPK의 활성화에 의한 것임을 확인한 것으로서, CAP1의 경쟁적 저해제가 혈중 LDL-콜레스테롤의 수치를 감소시키기 위한 LDL 수용체의 보호 효과를 가짐을 증명한 것이다.
7.4. mFc-CAP1의 레지스틴 매개 LDL 수용체 보호 효과 및 AMPK 경로 활성화 효과 확인
배양 중인 HepG2 세포를 기본 DMEM 배지로 바꿔준 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 뒤 AMPK 활성제인 AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside)을 한 시간 동은 전처리한 후, 50 ng/ml rh레지스틴과 각 농도(0.05, 0.5 μg/ml)별 mFc-CAP1을 4시간 동안 함께 처리하였다.
그 결과 도 6e에 나타난 바와 같이, AICAR에 의한 AMPK의 활성화가 레지스틴에 의해 억제되었으며, 이는 mFc-CAP1의 처리에 의해 다시 활성화됨을 확인하였다.
또한, 배양 중인 HepG2 세포를 기본 DMEM 배지로 바꿔준 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하고, 50 ng/ml rh레지스틴과 각 농도(0.1, 1 μg/ml 또는 0.05, 0.15, 0.5 μg/ml)별 mFc-CAP1을 동시에 처리한 경우, 도 6f에 나타난 바와 같이 rh레지스틴 단독 처리에 의해 LDL 수용체의 분해가 촉진되었던 것이, mFc-CAP1의 동시 처리에 의해 분해가 억제됨을 확인하였다.
실시예 8. 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC)에서 CAP1의 넉다운(knock-down)은 LDL-콜레스테롤의 흡수를 억제한다.
본 발명에 따른 mFc-CAP1의 LDL 콜레스테롤 흡수 억제 효과를 직접 확인하기 위해, 본 발명자들은 shRNA를 이용하여 인간 탯줄 정맥 내피세포에서의 CAP1 유전자 발현을 억제시켰다. CAP1 유전자를 타겟하도록 디자인된 하기 서열번호 9의 shCAP1은 pLL3.7 렌티바이러스 벡터의 HpaI 및 XhoI 제한효소 부위로 클로닝하여 제조하였다.
CAP1 shRNA, 5'- AGATGTGGATAAGAAGCAT-3' (서열번호 9).
혈중 LDL-콜레스테롤은 동맥 혈관의 내피세포를 통과하여 동맥경화를 유발한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 상기 8.1에서 제조한 shCAP1을 이용하여 CAP1의 발현을 억제한 경우, LDL-콜레스테롤의 흡수에 변화가 나타나는지 확인하였다. 그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 정맥 내피세포 HUVEC에서 PCSK9을 처리하면 LDL-콜레스테롤이 혈관벽을 통과하여 유입되는데, 이때 CAP1을 넉다운(knock-down)한 혈관 내피세포에서는 LDL-콜레스테롤이 내피세포로 들어오지 못하는 것으로 나타났다. 상기와 같은 결과는 CAP1이 동맥경화를 유발할 수 있는 LDL-콜레스테롤의 세포 내 흡수에 중요한 역할을 하며, 따라서 CAP1의 결합 저해 또는 발현 억제를 통해 동맥경화를 비롯한 각종 심혈관 대사질환을 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 의하면, PCSK9과 직접 결합하여 LDL 수용체의 생활주기를 조절하는 CAP1이 PCSK9 또는 레지스틴과 결합하는 것을 저해하거나, CAP1 유전자의 발현을 억제함으로써 콜레스테롤 수치를 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 CAP1과 PCSK9 또는 레지스틴 사이의 결합 저해제 또는 CAP1 유전자의 발현 억제제 등은 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 이에 따라 혈중 콜레스테롤의 비정상적 수준과 관련되거나 그로 인해 발병하는 각종 심혈관 대사질환을 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 염증 억제 효과도 있다는 점에서 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Pharmaceutical composition for lowering cholesterol in blood or preventing or treating cardiometabolic diseases <130> MPCT20-074 <150> KR 10-2020-0026073 <151> 2020-03-02 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 475 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp Met Gln Asn Leu Val Glu Arg Leu Glu Arg Ala Val Gly 1 5 10 15 Arg Leu Glu Ala Val Ser His Thr Ser Asp Met His Arg Gly Tyr Ala 20 25 30 Asp Ser Pro Ser Lys Ala Gly Ala Ala Pro Tyr Val Gln Ala Phe Asp 35 40 45 Ser Leu Leu Ala Gly Pro Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ile Ser Lys Glu 50 55 60 Ile Gly Gly Asp Val Gln Lys His Ala Glu Met Val His Thr Gly Leu 65 70 75 80 Lys Leu Glu Arg Ala Leu Leu Val Thr Ala Ser Gln Cys Gln Gln Pro 85 90 95 Ala Glu Asn Lys Leu Ser Asp Leu Leu Ala Pro Ile Ser Glu Gln Ile 100 105 110 Lys Glu Val Ile Thr Phe Arg Glu Lys Asn Arg Gly Ser Lys Leu Phe 115 120 125 Asn His Leu Ser Ala Val Ser Glu Ser Ile Gln Ala Leu Gly Trp Val 130 135 140 Ala Met Ala Pro Lys Pro Gly 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tctgcttccc gctcagcact gttcgcgcag 780 attaatcagg gggagagcat tacacatgcc ctgaaacatg tatctgatga catgaagact 840 cacaagaacc ctgccctgaa ggctcagagt ggtccagtac gcagtggccc caaaccattc 900 tctgcaccta aaccccaaac cagcccatcc cccaaacgag ccacaaagaa ggagccagct 960 gtacttgaac tggagggcaa gaagtggaga gtggaaaatc aggaaaatgt ttccaacctg 1020 gtgattgagg acacagagct gaaacaggtg gcttacatat acaagtgtgt caacacgaca 1080 ttgcaaatca agggcaaaat taactccatt acagtagata actgtaagaa acttggcctg 1140 gtattcgatg acgtggtggg cattgtggag ataatcaaca gtaaggatgt caaagttcag 1200 gtaatgggta aagtgccaac catatccatc aacaaaacag atggctgcca tgcttacctg 1260 agcaagaatt ccctggattg tgaaatagtc agtgccaaat cttccgagat gaatgtcctc 1320 attcctacag aaggcggtga ctttaatgaa ttcccagttc ctgagcagtt caagacccta 1380 tggaacgggc agaagttggt caccacagtg acagaaattg ctggaggcca ggccggccag 1440 gagcccaaat ctagcgacaa aactcacaca agcccaccga gcccagacaa aactcacaca 1500 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1560 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1620 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1680 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1740 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1800 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1860 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1920 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1980 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 2040 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 2100 tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2160 ggtaaa 2166 <210> 6 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mFc-CAP1 <400> 6 Met Ala Asp Met Gln Asn Leu Val Glu Arg Leu Glu Arg Ala Val Gly 1 5 10 15 Arg Leu Glu Ala Val Ser His Thr Ser Asp Met His Arg Gly Tyr Ala 20 25 30 Asp Ser Pro Ser Lys Ala Gly Ala Ala Pro Tyr Val Gln Ala Phe Asp 35 40 45 Ser Leu Leu Ala Gly Pro Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ile Ser Lys Glu 50 55 60 Ile Gly Gly Asp Val Gln Lys His Ala Glu Met Val His Thr Gly Leu 65 70 75 80 Lys Leu Glu Arg Ala Leu Leu Val Thr Ala Ser Gln Cys Gln Gln Pro 85 90 95 Ala Glu Asn Lys Leu Ser Asp Leu Leu Ala Pro Ile Ser Glu Gln Ile 100 105 110 Lys Glu Val Ile Thr Phe Arg Glu Lys Asn Arg Gly Ser Lys Leu Phe 115 120 125 Asn His Leu Ser Ala Val Ser Glu Ser Ile Gln Ala Leu Gly Trp Val 130 135 140 Ala Met Ala Pro Lys Pro Gly Pro Tyr Val Lys Glu Met Asn Asp Ala 145 150 155 160 Ala Met Phe Tyr Thr Asn Arg Val Leu Lys Glu Tyr Lys Asp Val Asp 165 170 175 Lys Lys His Val Asp Trp Val Lys Ala Tyr Leu Ser Ile Trp Thr Glu 180 185 190 Leu Gln Ala Tyr Ile Lys Glu Phe His Thr Thr Gly Leu Ala Trp Ser 195 200 205 Lys Thr Gly Pro Val Ala Lys Glu Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Pro 210 215 220 Ser Ala Gly Ser Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro 225 230 235 240 Pro Val Ser Thr Ser Ser Gly Ser Asp Glu Ser Ala Ser Arg Ser Ala 245 250 255 Leu Phe Ala Gln Ile Asn Gln Gly Glu Ser Ile Thr His Ala Leu Lys 260 265 270 His Val Ser Asp Asp Met Lys Thr His Lys Asn Pro Ala Leu Lys Ala 275 280 285 Gln Ser Gly Pro Val Arg Ser Gly Pro Lys Pro Phe Ser Ala Pro Lys 290 295 300 Pro Gln Thr Ser Pro Ser Pro Lys Arg Ala Thr Lys Lys Glu Pro Ala 305 310 315 320 Val Leu Glu Leu Glu Gly Lys Lys Trp Arg Val Glu Asn Gln Glu Asn 325 330 335 Val Ser Asn Leu Val Ile Glu Asp Thr Glu Leu Lys Gln Val Ala Tyr 340 345 350 Ile Tyr Lys Cys Val Asn Thr Thr Leu Gln Ile Lys Gly Lys Ile Asn 355 360 365 Ser Ile Thr Val Asp Asn Cys Lys Lys Leu Gly Leu Val Phe Asp Asp 370 375 380 Val Val Gly Ile Val Glu Ile Ile Asn Ser Lys Asp Val Lys Val Gln 385 390 395 400 Val Met Gly Lys Val Pro Thr Ile Ser Ile Asn Lys Thr Asp Gly Cys 405 410 415 His Ala Tyr Leu Ser Lys Asn Ser Leu Asp Cys Glu Ile Val Ser Ala 420 425 430 Lys Ser Ser Glu Met Asn Val Leu Ile Pro Thr Glu Gly Gly Asp Phe 435 440 445 Asn Glu Phe Pro Val Pro Glu Gln Phe Lys Thr Leu Trp Asn Gly Gln 450 455 460 Lys Leu Val Thr Thr Val Thr Glu Ile Ala Gly Gly Gln Ala Gly Gln 465 470 475 480 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Val 485 490 495 Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val 500 505 510 Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile 515 520 525 Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val 530 535 540 Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 545 550 555 560 Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu 565 570 575 Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala 580 585 590 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro 595 600 605 Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys 610 615 620 Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr 625 630 635 640 Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr 645 650 655 Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu 660 665 670 Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser 675 680 685 Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser 690 695 700 His Ser Pro Gly Lys 705 <210> 7 <211> 2130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mFc-CAP1 <400> 7 atggctgaca tgcaaaatct ggtagaaaga ttggagaggg cagtgggccg cctggaggca 60 gtatctcata cctctgacat gcaccgtggg tatgcagaca gtccttcaaa agcaggagca 120 gctccatatg tgcaggcatt tgactcgctg cttgctggtc ctgtggcaga gtacttgaag 180 atcagtaaag agattggggg agacgtgcag aaacatgcgg agatggtcca cacaggtttg 240 aagttggagc gagctctgtt ggttacagct tctcagtgtc aacagccagc agaaaataag 300 ctttccgatt tgttggcacc catctcagag cagatcaaag aagtgataac ctttcgggag 360 aagaaccgag gcagcaagtt gtttaatcac ctgtcagctg tcagtgaaag tatccaggcc 420 ctgggctggg tggctatggc tcccaagcct ggcccttatg tgaaagaaat gaatgatgcc 480 gccatgtttt atacaaaccg agtcctcaaa gagtacaaag atgtggataa gaagcatgta 540 gactgggtca aagcttattt aagtatatgg acagagctgc aggcttacat taaggagttc 600 cataccaccg gactggcctg gagcaaaacg gggcctgtgg caaaagaact gagcggactg 660 ccatctggac cctctgccgg atcaggtcct cctccccctc caccaggccc ccctcctccc 720 ccagtctcta ccagttcagg ctcagatgag tctgcttccc gctcagcact gttcgcgcag 780 attaatcagg gggagagcat tacacatgcc ctgaaacatg tatctgatga catgaagact 840 cacaagaacc ctgccctgaa ggctcagagt ggtccagtac gcagtggccc caaaccattc 900 tctgcaccta aaccccaaac cagcccatcc cccaaacgag ccacaaagaa ggagccagct 960 gtacttgaac tggagggcaa gaagtggaga gtggaaaatc aggaaaatgt ttccaacctg 1020 gtgattgagg acacagagct gaaacaggtg gcttacatat acaagtgtgt caacacgaca 1080 ttgcaaatca agggcaaaat taactccatt acagtagata actgtaagaa acttggcctg 1140 gtattcgatg acgtggtggg cattgtggag ataatcaaca gtaaggatgt caaagttcag 1200 gtaatgggta aagtgccaac catatccatc aacaaaacag atggctgcca tgcttacctg 1260 agcaagaatt ccctggattg tgaaatagtc agtgccaaat cttccgagat gaatgtcctc 1320 attcctacag aaggcggtga ctttaatgaa ttcccagttc ctgagcagtt caagacccta 1380 tggaacgggc agaagttggt caccacagtg acagaaattg ctggaggcca ggccggccag 1440 gagcccaaat ctagcgacaa aactcacaca agcccaccga gcccagtccc agaagtatca 1500 tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 1560 gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 1620 gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc 1680 actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag 1740 ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1800 accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg 1860 gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact tcttccctga agacattact 1920 gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca agaacactca gcccatcatg 1980 gacacagatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg tgcagaagag caactgggag 2040 gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc tgcacaacca ccatactgag 2100 aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 2130 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence for CAP1 <400> 8 aaaccgagtc ctcaaagagt a 21 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA sequence for CAP1 <400> 9 agatgtggat aagaagcat 19 <210> 10 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CAP1 SH3 binding domain <400> 10 Leu Ala Trp Ser Lys Thr Gly Pro Val Ala Lys Glu Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 Pro Ser Gly Pro Ser Ala Gly Ser Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly 20 25 30 Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Thr Ser Ser Gly Ser Asp Glu Ser Ala 35 40 45 Ser Arg Ser Ala Leu Phe Ala Gln Ile Asn Gln Gly Glu Ser Ile Thr 50 55 60 His Ala Leu Lys His Val Ser Asp Asp Met Lys Thr His Lys Asn Pro 65 70 75 80 Ala Leu Lys Ala Gln Ser Gly Pro Val Arg Ser Gly Pro Lys Pro Phe 85 90 95 Ser Ala Pro Lys Pro Gln Thr Ser Pro Ser Pro Lys Arg Ala Thr Lys 100 105 110 Lys Glu Pro Ala Val Leu Glu Leu Glu Gly Lys Lys Trp Arg 115 120 125 <210> 11 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(272) <223> cystein-rich domain <400> 11 Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gln Arg Val Leu 1 5 10 15 Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly 20 25 30 Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr 35 40 45 Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu 50 55 60 Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met 65 70 75 80 Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly 85 90 95 Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala 100 105 110 Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr 115 120 125 Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser 130 135 140 His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg 145 150 155 160 Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile 165 170 175 His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu 180 185 190 His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu 195 200 205 Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val 210 215 220 Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp 225 230 235 240 Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala 245 250 255 Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln 260 265 270 <210> 12 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(79) <223> M1 domain <400> 12 Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr 1 5 10 15 Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu 20 25 30 Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met 35 40 45 Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly 50 55 60 Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln 65 70 75 <210> 13 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(89) <223> M3 domain <400> 13 Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln 1 5 10 15 Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys 20 25 30 Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp 35 40 45 Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr 50 55 60 Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His 65 70 75 80 Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln 85

Claims (47)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(adenylyl cyclase-associated protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3(Src homology 3) 결합 도메인 및 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인(cysteine rich domain; CRD)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 CAP1의 SH3 결합 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 M1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 PCSK9의 시스테인-풍부 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 M3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 CAP1의 SH3 결합 도메인에 존재하는 34B번 아스파르트산(aspartic acid)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 PCSK9의 M1 도메인에 존재하는 494번 라이신(lysine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 PCSK9의 M3 도메인에 존재하는 659번 아르기닌(arginine)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  17. 제1항 또는 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 LDL(Low-density lipoprotein) 수용체의 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  18. 제1항 또는 제13항에 있어서,
    상기 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤인 것을 특징으로 하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 약학적 조성물.
  19. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하용 건강기능식품 조성물.
  20. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 CAP1 또는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 siRNA인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  27. 제20항에 있어서,
    상기 심혈관 대사질환은 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 통풍, 뇌졸중, 동맥경화증, 심근경색증, 협심증, 말초혈관 질환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  28. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  29. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 항염용 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 (i)의 결합 저해제는 PCSK9에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 (ii)의 결합 저해제는 레지스틴에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 (i) 또는 (ii)의 결합 저해제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린 중쇄의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 (iii)의 발현 억제제는 CAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  35. 제29항에 있어서,
    상기 조성물은 NF-κB의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항염용 약학적 조성물.
  36. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단용 조성물.
  37. 환자의 시료 중 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1;과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 사이의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단을 위한 정보제공방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 환자의 시료는 간 조직, 간 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 진단을 위한 정보제공방법.
  39. 하기의 단계를 포함하는 고콜레스테롤혈증 또는 심혈관 대사질환 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1 단백질 또는 이의 단편; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴 단백질 또는 이의 단편;을 포함하는 시료에 피검물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 CAP1; 및 PCSK9 단백질 또는 이의 단편, 또는 레지스틴 단백질 또는 이의 단편; 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계.
  40. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(adenylyl cyclase-associated protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하 방법.
  41. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1(adenylyl cyclase-associated protein 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9) 사이의 결합 저해제의, 혈중 콜레스테롤 저하 용도.
  42. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1(adenylyl cyclase-associated protein 1) 유전자의 발현 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈중 콜레스테롤 저하 방법.
  43. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1(adenylyl cyclase-associated protein 1) 유전자의 발현 억제제의, 혈중 콜레스테롤 저하 용도.
  44. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료 방법.
  45. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물을 포함하는 조성물의, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료 용도.
  46. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 억제 방법.
  47. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9 사이의 결합 저해제;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CAP1과 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 레지스틴(resistin) 사이의 결합 저해제; 및
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 CAP1 유전자의 발현 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 염증 억제 용도.
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